相反細胞分化程序（ocdp）用于治療處于病理狀態的退化器官的用途

相反細胞分化程序（ocdp）用于治療處于病理狀態的退化器官的用途
【專利摘要】本發明涉及通過使用細胞治療退行性和/或處于病理狀態的器官的方法，所述細胞就發育而言是處于表型穩定分化中或已分化的但不一定是根本上預決定的，其來自根據相反細胞分化程序(OCDP)的原則而選擇的供體器官；本發明還涉及此類型細胞用于治療的用途或者用于生產治療同樣疾病之藥物的用途。此外，本發明還涉及包含合適的表型穩定細胞的藥劑，由此使用第一器官的細胞，所述第一器官在器官類型方面不同于第二器官，在預定的表達基因和/或表型性能之組合方面處于正常生理狀態的所述第一器官的細胞具有與正常生理狀態下第二細胞相反的性能。
【專利說明】相反細胞分化程序（OCDP)用于治療處于病理狀態的退化 器官的用途
[0001] 本申請是申請號為200880114912. 4、發明名稱為"相反細胞分化程序（0CDP)用于 治療處于病理狀態的退化器官的用途"的中國專利申請的分案申請，該母案申請是2008年 4月18日提交的PCT國際專利申請PCT/EP2008/003146進入中國國家階段的申請。

【技術領域】
[0002] 本發明涉及通過使用細胞來治療退化和/或處于病理狀態的器官的方法， 所述細胞在發育方面是處于表型穩定分化中或已分化的但不一定是根本上預決定 (predetermined)的，其來自根據相反細胞分化程序（0CDP)的原則選擇的供體器官，本發 明還涉及此類型細胞用于治療的用途或者用于生產治療同樣疾病之藥物的用途。此外，本 發明還涉及包含合適表型穩定細胞的藥劑。

【背景技術】
[0003] 目前，對于西方世界大多數廣泛分布的退行性疾病來說，基于細胞的治療是關注 白勺焦;點(Slack JMW. Metaplasia and transdifferentiation ：from pure biology to the clinic. Nature Rev. 2007 ;8 :369-378)。這些疾病包括神經退行性疾病（阿爾茨海默病、 帕金森病、亨廷頓病等）、慢性肝病（肝炎、纖維化和肝硬化）、糖尿病、心臟疾病、關節炎以 及許多其它疾病。這些基于細胞的治療的基本原理是替換受損和受限制或失去再生能力 的細胞，或者通過營養因子協助其替換，所述營養因子由移植的天然或生物技術改造的細 胞產生（Slack JMW· Metaplasia and transdifferentiation :from pure biology to the clinic, Nature Rev. 2007；8 :369-378)〇
[0004] 討論了有可能獲得治療上成功的合適細胞：胚胎千細胞、成體干細胞細胞的轉分 化（例如造血干細胞分化為相應器官細胞），以及連續或瞬時使用通過產生細胞因子和生 長因子促進受體器官中再生的細胞（Slack JMW. Metaplasia and transdifferentiation: from pure biology to the clinic, Nature Rev. 2007 ；8 :369-378) 〇
[0005] 在這方面最早的實驗也是臨床試驗得到了令人失望的結果（Jeffrey DR Failure of allogeneic bone marrow transplantation to arrest disease activity in multiple sclerosis· Mult· Scler.2007;Julyl0(Epub ahead of print))，并同時表明了該 治療方法的固有缺陷。


【發明內容】

[0006] 根據本發明的"相反細胞分化程序"（0CDP)的原理超越了前述為細胞替換而設計 的治療方法，并且采取了不同的策略。
[0007] 基于細胞治療患慢性病器官的現代方法基于以下應用：
[0008] 1.具有分化成患病器官細胞之性能的不同來源的千細胞和/或
[0009] 2.細胞，特別是遺傳操作的細胞，其具有可對患病器官的再生起到積極影響的性 能（例如產生營養因子）。
[0010] 對于治療患慢性病器官的可能性來說，這些方法中的每一個都獲得了具有希望的 根本性進展或者已經得到實現，但是同時，其伴有一系列重大且尚未解決的缺點。
[0011] 就干細胞治療來說，使用多能（pluripotent或multipotent)(未分化的）供體 細胞（胚胎或成體千細胞（SC)、間充質（mesenchymal)或上皮造血SC、骨髓細胞、來自脂 肪組織和皮膚或者發根及其它器官的干細胞）（Wobus AM，Boheler KR. Embryonic Stem Cells ：prospects for developmental biology and cell therapy. Physol. Rev. 2005 ；85 ： 635-678)。本申請是基于以下的發現：未分化的干細胞具有能夠在有限次細胞分裂中轉化 為不同的器官特異性分化細胞的性能。其實例有干細胞轉化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細 胞、抗原呈遞樹突細胞。但是，也討論了通過合適的方法將已分化器官細胞轉化為其它己 分化器官細胞的可能性，例如通過轉染轉錄因子的基因（轉分化；Slack JMW. Metaplasia and transdifferentiation ：from pure biology to the clinic. Nature Rev. 2007 ；8 ： 369-378)。根據其表型可塑性（phenotypical flexibility)(多能性，pluripotency 或 multipotency)，認為千細胞可植入幾乎所有器官中以替代有功能的器官細胞。然而，應用 千細胞或轉分化確實具有下列缺點：
[0012] ?致腫瘤性（尤其是對于胚胎千細胞來說）
[0013] ?去分化的可能性增加（使用成體千細胞，產生腫瘤干細胞）
[0014] ?在細胞培養物中以及移植之后轉化成器官以外的細胞
[0015] ?在遺傳操作基礎上細胞退化或者細胞喪失不可或缺的能力和/或可被環境調控 的能力
[0016] ?所獲得干細胞的數量有限
[0017] ?成體或已差不多分化的干細胞的增殖速率低
[0018] ?倫理上的顧忌（對于胚胎和胎兒干細胞來說）
[0019] 之前基于細胞治療（慢性）退行性疾病的策略是基于在疾病晚期機體、功能性細 胞的自發或藥物誘導性的固有保護和再生無效時使用干細胞或其它具有治療潛力的細胞。 因此，疾病的慢性特性是指在器官背景下（病理）調節系統占優勢，其導致不可避免地迫使 保持病理狀態。神經和非神經組織連續暴露于致病因素引發器官特異性穩態并干擾在健康 背景中實現或控制損傷補償的代謝途徑和信號轉導途徑。這些強迫不僅阻止（阻斷）固有 的機體再生，還迫使移植細胞向病理方向發展。此外，致病環境可促進分化，并因此促進老 化和功能喪失，其源自于植入的干細胞。所使用干細胞的表型可塑性越大，它們就越容易屈 服于病理壓力，即錯誤分化、腫瘤形成紊亂或者這些細胞由于細胞死亡被除去的危險就越 大。
[0020] 目前還未實現利用干細胞實現供體細胞持久功能性表型的目標，所述供體細胞對 退行性環境有抗性。因此，本發明的目的是克服在基于細胞的治療情況下使用遺傳修飾細 胞所導致的以及不同來源干細胞所導致的已知缺點。根據本發明獨立權利要求的方法和藥 劑實現了此目的。從屬權利要求中顯示了有利的實施方案。
[0021] 針對此目的的解決方案在于應用相反細胞分化程序（0CDP)的原理。0CDP源自 兩個基本前提，它們是在所有其它基于細胞的治療方法中未曾考慮過的。一個基本前提是 在不同器官中存在細胞群體（細胞類型），其在表達基因之特異性組合方面或表型性能之 特異性組合方面潛在地具有相反（反向）或逆向的性能和/或控制機制-(例如，應提到 對于組織穩態的維持、不同區室間的物質轉移（例如：血液/組織；空氣/組織）、解毒和 再生來說實施不可或缺之功能的細胞群體-（縮寫為"GPC"、GFAP產生細胞）（Danielyan L, Tolstonog G, Traub P, Salvetter J, Gleiter CH, Reisig D, Gebhardt R, Buniatian GH. 4. 6Colocalization of glial fibrillary acidic protein,metallothionein,and MHC II in human, rat NOD/SCID，and nude mouse skin keratinocytes and fibroblasts. J Invest Dermatol. 2007Mar. ;127(3) :555-63)。第二個前提是以下認識：這些細胞存在 于不同活化狀態或調控狀態的不同器官中，這些狀態主導了各自的組織類型，其對于疾病 來說盡管不一定但通常呈現出恰好相反的活化狀態（或分化狀態）或調控狀態，特別是對 于重要的功能性蛋白質和/或調控機制來說更是如此（Buniatian G.H.，H-J Hartmann， P.Traub, U. Weser, H. Wiesinger, R.Gebhardt (2001). Acquisition of blood-tissue barrier supporting features by hepatic stellate cells and astrocytes of myofibroblastic phenotype. Inverse dynamics of metallothionein and glial fibrillary acidic protein expression. Neurochem. Int. 38, 373-383 ;Buniatian G. H., Hartmann H. -J.，Traub P.，Wiesinger H.，Albinus M.，Nagel W.，Shoeman R.，Mecke D.， Weser U. (2002) .Glial Fibrillary Acidic Protein-Positive Cells of the Kidney are Capable of Raising a Protective Biochemical Barrier Similar to Astrocytes ： Expression of Metallothionein in Podocytes.Anat.Rec. 267,296-306)?現在，OCDP 的 概念以新的且出人意料地方式來自于下列事實：當移植代表性細胞群時，定向于治療患病 組織的細胞移植是特別成功的，所述細胞群的天然活化狀態或表型相對于供體器官中所述 重要抗原（蛋白質）或調控機制來說是與受體器官中"相關"細胞的表型相反的。因此，所 移植的天然細胞群是否具有干細胞性能，它是作為營養因子來源還是具有促進受體器官再 生的其它性能，這些都是不相關的。相反細胞分化程序之下隱含的是許多（如果不是全部 的話）器官中有"相關"細胞，其分化狀態以具有成對器官叢的形式而不同，其中各相關細 胞的分化狀態可被稱為相反或反向的。本文中的"相關"細胞不一定指相同來源意義上的 相關，而是可以簡單地表示這些細胞具有有限的相同表達基因 A、B、C等的組合，使得一個 器官中的這些細胞可以通過例如下述性能來表征："基因 A高表達，基因 B低表達"以及在 另一些"相反"性能的器官中："基因 A低表達，基因 B高表達"。參照隨后的兩個實例，在不 限制本發明的情況下再次對其進行闡明。
[0022] A)在每個器官中都有一群對于組織穩態的維持、不同區室（例如：血液/組織；空 氣/組織）間物質轉移、解毒和再生來說發揮不可或缺的功能的細胞群體（例如產生GFAP 的細胞）。除了中間絲蛋白GFAP(神經膠質纖維酸性蛋白）以外，這些細胞還可同時產生 其它細胞骨架蛋白，例如SMM(平滑肌α -肌動蛋白）（一種微絲蛋白）。近幾年來的認識 表明，這些細胞存在于處于不同活化狀態的多種器官中，其在各個類型的組織中占優勢。因 此，例如正常腦中的星形細胞特征是高SMM表達和低GFAP表達，而肝星狀細胞（h印atic stellate cell，HSC)的特征是GFAP高表達和SMM低表達。這種不同類型的基因表達是 與正常星形細胞（astrocyte)參與高度不通透性血腦屏障構建的情況相關聯的，而HSC在 肝臟中參與或者決定高度通透性血液肝臟組織界面的構建。在疾病的情況下，此表達狀態 分別被逆轉，并由此也逆轉了受影響的血腦組織屏障的通透性，以及與維持組織穩態、解毒 和再生有關的其它性能。這意味著，在退化的腦區域中，星形細胞減少了 SMAA的高表達并 增加了 GFAP的表達，而肝臟中的HSC降低了 GFAP的表達并增加了 SMAA的表達。因此，具 有與正常狀態相反之表型的細胞的特征不限于蛋白質GFAP和SMAA的實例。GPC的治療性 能也可以由其它表達模式來表明，例如由谷氨酰胺合成酶、金屬硫蛋白或MHC II類分子的 表達來表明，并決定相反表型。在這種情況下，解毒反應處于所述組織功能的最前列。
[0023] B)第二個例子將調控方面放在更前列。在許多（如果不是全部的話）成體組織 中，hedgehog-和Wnt/β-連環蛋白（catenin)信號轉導的雙重性在組織的亞結構中特別 重要，一部分細胞更多地受到hedgehog的影響，另一部分細胞更多地受到Wnt/ β -連環蛋 白的影響。這方面的一個實例可以是腸，在其隱窩中Wnt/ β -連環蛋白的影響占優勢，而在 絨毛頂端則是hedgehog的影響占優勢。甚至在肝臟也有這樣的雙重性。在沒有這些相反 信號通路的恒定拮抗作用以及在提供某些組織特異性代謝平衡的情況下，所述組織會逐漸 產生多種類型的病態，包括腫瘤形成。相反，在病態情況下，這些信號通路之一的影響以另 外一個為代價進行擴展，因此，非常類似于上文所述的GPC實例，誘導細胞的相反或逆向表 型，但其實質上比各自的天然表型更加不穩定。
[0024] 因此，0CDP使得可以鑒定適合的細胞和/或以鑒定合適的細胞為前提，所述合適 的細胞尤其符合移植的標準：首先確定患病器官中主要損傷或變化的細胞類型或者最初對 病理狀況來說起更重要作用的細胞類型。假定在關鍵性能方面病態表型與正常表型具有相 反的表現。當然，這在這些細胞的整個蛋白質組方面并不是普遍適用的，而是僅適用于上 述含義的關鍵性能方面。第二步，鑒定含有所述"相關"細胞類型的器官，所述細胞類型對 應于在關鍵性能方面的病理表型，如果必要則顯示與病理器官的正常細胞類型相反的分化 模式。分化中或已分化的供體細胞（具有相反的分化特征）應來源于具有相反生理功能 以及血液-組織（例如肝臟和腦）界面特征的健康供體器官。移植此細胞類型之后，由于 供體細胞在供體器官的生命過程中獲得的經驗和記憶（Ghazarian A，Garner WL, Ehrlich HP. Memory of past exposure to the chemokine IL-8inhibits the contraction of fibroblast-populated collagen lattices. Exp Mol Pathol. 2000Dec ；69(3) :242-7 ； Huang C, Kim Y, Caramori ML, Moore JH, Rich SS, Mychaleckyj JC, Walker PC, Mauer M.Diabetic nephropathy is associated with gene expression levels of oxidative phosphorylation and related pathways· Diabetes. 2006Jun;55 (6): 1826-31·)，其可更 好地適合病理環境并更好地抵抗其致病壓力。所以，可以通過該細胞類型更有效地引入再 生。因此，該細胞類型是具有多能干細胞的特定性能（例如轉變為受體器官相關細胞類型 的性能）還是僅具有促進再生的性能和作用（例如表達營養因子）并不重要。
[0025] 就GPC來說，發生例如下列情況：在退化的腦中以及在細胞結構慣常老化的情況 下，在腦中對最多變化類型的有毒物質發揮強保護作用的星形細胞失去其活化的可收縮表 型并逐漸獲得功能性降低的擴張表型。腦中的此病理狀況通過提供表型穩定分化中或已分 化的來自肝臟的活化肝星狀細胞（HSC)或來自腎臟的系膜細胞（MC)而得到改善。
[0026] 例如，HSC和MC被編程以呈現活化的可收縮表型，并且在其分化過程中逐漸增強 此表型（即功能性星形細胞的性能）。結果是，由表型穩定分化中或已分化的活化HSC或MC 所產生的多種保護性因子（促紅細胞生成素和/或BDNF(腦來源的神經營養性因子）和/ 或金屬硫蛋白和/或谷氨酰胺合成酶和/或NGF (神經生長因子）和/或I型膠原和/或 GPR49(G-蛋白偶聯受體49)和/或其它）的這些細胞可改善受損的穩態以及受體器官細胞 的存活和功能（就腦來說）。此外，類似于在培養條件下的干細胞，HSC/MCW獲得神經元的 性能（形成突觸、產生神經元特異性標志物、神經遞質和參與形成神經遞質的酶）。為此，在 植入退化腦中的情況下，HSC/MC(除了其穩態改善功能和對于神經元和星形細胞的保護功 能之外）可代替損失的和退化的神經元的功能。表1顯示了（僅作為舉例）作為各細胞類 型分化狀態之函數的所選因子的表達量。
[0027] 由于屬于腦、肝臟和腎臟中GFAP陽性的血管周圍細胞的星形細胞、肝星狀細胞 (HSC)與系膜細胞（MC)的解剖學和功能相關性（"親和性"），后者具有針對血源信號的類 似保護機制。腦退行性疾病的主要標志是神經元的損失和腦特異性穩態的重大變化，后者 受星形細胞調控。用于神經退行性疾病的基于細胞治療的HSC和MC的特征在于這些非神 經GFAP-PC是天然編程的，在其分化（活化）過程中獲得并提高年輕星形細胞（抗細胞毒 性功能）、神經SC(巢蛋白產生）和神經元（β-III微管蛋白、神經介質（neuromediator)、 神經營養性因子）特征性性能。它們在體外和體內快速增殖，因為它們表型已分化，所以在 受體器官的患病組織中保持穩定的形式。星形細胞與HSC/MC恰好相反地進行分化程序使 得能夠使用表型穩定分化中或己分化的HSC/MC治療神經退行性疾病。
[0028] 用于基于細胞治療神經退行性疾病的穩定分化中的或已分化的HSC產生ΕΡ0(促 紅細胞生成素）、GS(谷氨酰胺合成酶）和MT(金屬硫蛋白）。它們的細胞骨架由巢蛋白、 β-微管蛋白、結蛋白和SMAA支持。就這些細胞來說,可以少量存在核周圍或者核（但不是 在突起（protrusion)中）表達的GFAP。
[0029] 因此，HSC和/或MC可用于一系列神經退行性疾病的基于細胞的治療，例如阿爾 茨海默病、帕金森病、多發性硬化、中風及特征在于神經元數量和功能損失以及腦特異性穩 態反常的其他疾病。
[0030] 就HSC/MC(或者具有類似分化程序的另一種細胞類型）來說，通過植入、靜脈內施 用或者其它類型的施用將所述細胞提供給患病腦。因此，可以對患有上述疾病晚期的患者 進行HSC植入。HSC和/或MC的輸注旨在：
[0031] 1)通過其顯著的解毒功能永久改善受損組織中的腦特異性穩態（產生谷氨酰胺 合成酶、促紅細胞生成素、金屬硫蛋白）
[0032] 2)增加受體固有神經元的存活率以及其再生（例如軸突再生）。
[0033] 3)通過將HSC/MC轉變為可產生功能蛋白（例如乙酰膽堿、酪氨酸羥化酶）的神經 元類型細胞改善神經傳導
[0034] 4)改善受體器官中細胞的功能（HSC/MC的存在誘導星形細胞/神經元中乙酰膽 堿、酪氨酸羥化酶的產生）。
[0035] 5)增加根據2)、3)、4)的神經元的數目。
[0036] 在分化和活化的狀態下，HSC不表達II類MHC蛋白，因此它們很弱幾乎不表現出 抗原呈遞功能。因此，就HSC植入來說，消除或者減少了干細胞出現排斥反應以及植入物存 活率低的問題。肝臟退化的特征在于肝細胞損失，因此降低了由肝細胞進行的解毒功能，以 及由靜息HSC控制的肝臟特異性穩態的重大變化，和活化HSC進行的肝竇狀隙的結構性修 飾。靜息HSC強烈表達GFAP (-種促進細胞外基質降解酶產生的中間纖維蛋白），所述降解 酶促進通過肝臟毛細血管中經開孔進行的血液-肝臟交換。儲存維生素A的靜息HSC產生 抗原的II類MHC復合物，其對于抗原呈遞到歸巢淋巴細胞來說非常重要。此功能也通過靜 息HSC控制的肝臟開孔大小來實現。肝臟纖維化的特征在于由GFAP損失所表現的HSC活 化、ECM蛋白消化減少以及適于腦毛細血管的血管類型的連續發育。
[0037] 相反地，星形細胞的成熟和分化導致大量GFAP、MHC-II和金屬蛋白酶的積累，換 言之，獲得了健康肝臟和腎臟中未分化HSC以及其它非神經器官中類似細胞的特征。在神 經退行性疾病過程中已經顯示出此抗原組合（Markowitz CE. Interferon-beta :mechanism of action and dosing issues_Neurology.2007Junl2;68(24Suppl4) :S8-11·)，阿爾 茨海默病的血管壁中頻繁出現凹點和空隙（Scheibel AB，Duong T. On the possible relationship of cortical microvascular pathology to blood brain barrier changes in Alzheimer, s disease· Neurobiol Aging. 1988Jan_Feb;9(l) :41_2·)證明提供以下情 形之機制的普遍性：受促進的血液-組織相互作用和富含GFAP的血管周圍細胞支持細胞旁 通路開放的能力。星形細胞的分化在成體腦中終止，或者它可以在神經細胞培養中實現。
[0038] 根據本發明，分化中的和表型穩定分化的星形細胞可用于治療患有纖維化或基本 上由紊亂造成的其它疾病的非神經器官。這方面的實例有肝硬化和腎纖維化。
[0039] 將分化的星形細胞（或具有類似分化程序的另一種細胞類型）提供給非神經器官 (例如提供給在肝纖維化、肝硬化情況下的肝臟）。還可以使用表型穩定分化中的星形細 胞。
[0040] 與千細胞和基因治療相比，基于HSC/MC治療神經退行性疾病和基于神經膠質細 胞治療非神經器官（肝臟、腎臟）的纖維化疾病提供了一系列的優點。
[0041] 1)移植細胞的表型穩定性和它們對受體器官中占優勢的病理條件的抗性。在移 植到腦中之后，已分化的HSC/MC可優選地轉分化為神經樣和神經膠質樣細胞類型，因此與 干細胞相反其保持表型穩定。這為在患病環境中的植入提供了關鍵性優勢：移植的細胞a) 不會采取退化細胞的表型；以及b)作為其天然編程和高度解毒功能的結果，不僅在有毒條 件下存活，而且還會改善穩態。
[0042] 2)無需倫理上的顧忌（與胚胎干細胞不同）以及分離方法的低復雜性。例如HSC/ MC可以大于成體干細胞的量自受體固有（自體）的肝臟或腎臟獲得，并且可以通過誘導增 殖在細胞培養中擴增。其它可能性是由血液來源的間充質干細胞制備它們，即誘導間充質 千細胞轉化為HSC和MC。
[0043] 3)待移植的細胞量不受限制（因為它們的高增殖能力和由供體器官獲得這些細 胞的可能性）。
[0044] 4)由于其免疫原性低，受體組織中植入的HSC/MC細胞的存活率高。它們僅有微 弱顯示的（至少在細胞培養條件下）抗原呈遞功能，因為它們幾乎不表達任何MHC II類蛋 白。
[0045] 總之，穩定分化中或已分化的血管周圍GFAP陽性細胞（HSC、MC和星形細胞）可分 別提供在受體器官中更高的植入存活率，改善穩態，受體器官中的表型穩定性以及獲取和 植入前處理這些細胞的簡便性。
[0046]另外，作為0CDP應用的另一個實例，可提到的是腎小球足細胞和皮膚角化細胞的 相互替換。
[0047] 表型穩定分化中或已分化的細胞的施用以已知方式進行。例如，它們可通過靜脈 內、鞘內（、沿脊椎骨）、盧頁內、腦室內、腹膜內、肌內和/或皮下施用或植入。 _8]施用量有利地為SXKfSlXlO1。個細胞。因此，所述量可取決于：!）疾病的階 段；2)患者年齡；3)疾病類型；幻施用途徑（靜脈內、腹膜內等）；4)刪時間（長期、一次 或數次）；5)之前所患疾病和/或伴隨疾病。 _9]施用-有麵為單次顧、具有不_注頻軸雛_的輸注、多次或長期 施用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0050]圖1顯示了與HSC-T6細胞系或原代MC共培養之后，14天星形神經膠質細胞培養 物中β-ΠΙ微管蛋白陽性細胞數目的變化。
[0051]圖2顯示與56天星形神經膠質細胞單培養物（ΑΡ2)相比，傳代后星形神經膠質細 胞（Ρ2)與傳代后MC(P1)的共培養物（AP2+MC Ρ1)中GS陽性細胞的數目增加600%。
[0052]圖3顯示星形神經膠質細胞與52天星形神經膠質細胞培養物的共培養物中PCNA 陽性細胞增加370%。
[0053]圖4表明，相比于GFAP在HSC-T6 (第2列）或星形神經膠質細胞原代培養物（第 3列和第4列）單獨培養物中的表達,星形神經膠質細胞與HSC_T6的共培養物中幾乎不存 在GFAP的表達（圖4第1列）。
[0054]圖5中列出了神經病學狀況的中間狀態。
[0055]圖6·在MS動物的小腦（圖6A)、前額葉皮層（圖6B)和海馬（圖6C)中鑒定了許 多細胞群，而對于未實驗大鼠（無 M0G施用）則僅在海馬中發現了僅個別細胞（圖6D)。

【具體實施方式】
[0056]下述實施例解釋本發明，并且不對其構成限制。
[0057] 1.體外試驗
[0058] 隨后使用以下縮寫：HSC-肝星狀細胞;MC-系膜細胞；GFAP-PC-神經膠質纖維酸 性蛋白陽性的血管周圍細胞；AP-星形神經膠質細胞原代培養物；P-傳代；ΕΡ0-促紅細胞 生成素；GS-谷氨酰胺合成酶;MT-金屬硫蛋白；PCNA-增殖細胞核抗原；0CDP-相反細胞分 化程序。
[0059] 在單個單培養物以及與來自大鼠的星形神經膠質細胞原代培養物的共培養物中， 通過不同功能特異性和細胞類型特異性的標志物蛋白的免疫細胞化學分析表征了 HSC、 HSC-T6細胞系和MC的保護性能。在體外模型中評價了 0CDP治療的效率，所述體外模型來 自分化程度很大的來源于腦的原代培養物與非神經GFAP-PC的共培養物。下列細胞中包含 非神經GFAP-PC :
[0060] 1.來自成體腎臟和新生大鼠腎臟的系膜細胞
[0061] 2.成體活化HSC (原代培養物）
[0062] 3. HSC-T6細胞系（活化的HSC細胞系）
[0063] 在不同培養年齡（培養物中最多150天）和彼此間不同定量條件下以及在不同細 胞密度下，單獨以及在與星形神經膠質細胞的共培養物中分析了所有這些細胞類型。
[0064] 下面顯示通過分化獲得的非神經已分化GFAP-PC(即活化的HSC和MC)的神經元 特異性、形態學和抗原性性能。
[0065] GFAP-PC細胞（HSC和MC)的神經元和干細胞特異性性能
[0066] 對不同年齡培養物（第7天；第14天和第21天）中來自新生大鼠的MC以及不同 傳代的成體HSC和MC來說，可以在MC中觀察到GFAP的逐漸減少和神經元標志物β -III 微管蛋白高度調節表達的增加。另外，千細胞標志物巢蛋白也高度表達。成體MC和HSC也 表達高水平的巢蛋白和-ΠΙ微管蛋白。在MC中，可觀察到在細胞培養物中3次傳代之后 β-III微管蛋白的表達受到極高程度的調節。
[0067] 具有解毒和保護功能的蛋白質（GS、MT、EP0)以及參與神經傳導的蛋白質（突觸蛋 白和突觸素）以及GFAP-PC中乙酰膽堿的表達
[0068] MC和來自大鼠的成體活化的HSC表達高水平的GS，其為將過量的谷氨酸鹽和NH3 轉化為谷氨酰胺的酶。在GS陽性的MC中觀察到由于其與自由基有關的"清除劑"功能而 公知的金屬硫蛋白（MT)。另外，成體已分化的HSC共表達GS和EPO。GS和ΕΡ0也在活化 的MC中表達。成體活化的MC甚至在9次傳代之后仍顯示出高增殖能力。這由PCNA的表 達而表明。活化的MC還表達功能性活化神經元的標志物：乙酰膽堿、突觸蛋白和突觸素。
[0069] HSC和MC的神經元樣形態
[0070] 還在MC和HSC中發現了對于神經元來說典型的突觸終球。同樣對于神經元來說 典型的長軸突樣突起也由MC和HSC形成。此外，對ΕΡ0和GS的復染顯示HSC中樹突狀棘 (spike)的形成。
[0071] HSC_T6(HSC細胞系）與來自大鼠的星形神經膠質細胞原代培養物的共培養物中 神經元標志物（β -III微管蛋白）和GFAP的表達
[0072] 為了表明退化的CNS組織中0DCP治療的效力，將星形神經膠質細胞原代培養物用 作神經退化體外模型，其中大的部分包括星形細胞，并且具有非常小數量的神經元。該模型 反映了患病腦中的情況，其中神經元的數目顯著減少，而星形細胞的數目增加。因為特定腦 區域中的星形細胞具有前體細胞的性能并可用作新細胞群體（包括神經元）的來源，所以 使用了不同年齡的細胞培養物。除了年輕的七天齡細胞和中年星形細胞（培養14天）之 夕卜，還使用了老年星形細胞（培養30、48、90天），其失去了其原始的性能。
[0073] 圖1顯示了與HSC-T6細胞系或原代MC共培養之后，14天星形神經膠質細胞培養 物中β-ΙΙΙ微管蛋白陽性細胞數目的變化。從圖中明顯得知，14天時星形神經膠質細胞 (Αο)與HSC-T 6的共培養物（Αο+Τ6)或者與MC的共培養物（Ao+MC)導致β-ΙΙΙ微管蛋白 陽性細胞相比于星形神經膠質細胞對照培養物（Α 〇14天）增加幾乎三倍。在第28天，星形 神經膠質細胞培養物僅含有很少的β-ΠΙ微管蛋白陽性細胞。將5X10 4HSC-T6細胞施用 給14天的星形神經膠質細胞培養物導致共培養7天后β-III微管蛋白陽性細胞群的大量 擴增。共培養14天后，觀察到β-ΙΙΙ微管蛋白陽性細胞數量顯著增加。在這些β-in微 管蛋白陽性細胞中，大量顯示神經元形態，即個體延伸出軸突樣突起以及環繞細胞體的許 多短的樹突。在使用低5倍細胞密度的培養物中觀察到了此效果。β-?π微管蛋白陽性細 胞組織成網絡。這些細胞高水平地表達β-III微管蛋白，但非常低水平地表達GFAP。來自 新生大鼠的MC與星形神經膠質細胞原代培養物的共培養中神經元標志物（β -ΠΙ微管蛋 白）和GFAP的表達
[0074] 將來自新生大鼠的星形神經膠質細胞與MC共培養：
[0075] 1.從新生大鼠新分離出MC細胞，隨后與14天星形神經膠質細胞共培養14天。
[0076] 2.從新生大鼠新分離出星形神經膠質細胞，隨后與Η天MC細胞共培養14天。
[0077] 3.將來自新生大鼠的14天星形神經膠質細胞培養物與14天MC在培養基中傳代， 隨后共培養14天。
[0078] 4.將來自新生大鼠的21天MC與21天星形神經膠質細胞培養物在培養基中傳代， 隨后共培養14天。
[0079] 5.隨后將傳代1中的31天的MC細胞與46天的星形神經膠質細胞共培養14天。
[0080] 在所有上述列出的5種共培養條件中，β -III微管蛋白陽性細胞的數目均大大增 力口。此外，在60天星形神經膠質細胞培養物中的對照條件下，僅可通過核染色而檢測到的 沉默細胞的數目顯著高于共培養物中的沉默細胞的數目。因為共培養物中β-III微管蛋 白陽性細胞的數目大大增加，所以可認為這些沉默細胞轉變為神經元。
[0081] 140天的星形神經膠質細胞培養物與來自大鼠的成體HSC或MC的共培養物中 β-III微管蛋白的表達
[0082] 在此系列實驗中，觀察超過140天星形神經膠質細胞培養物作為對照。相比于對 照培養物，149天星形神經膠質細胞（ΡΙ)與來自8次傳代的成體MC或來自7次傳代的成體 活化HSC的28天共培養物導致β-III微管蛋白陽性細胞顯著增加。共培養API-和HSC-T6 細胞系導致細胞從培養皿底部顯著脫離。但是，剩余的貼壁細胞群顯示出比對照培養物更 高的β-III微管蛋白陽性細胞數目。
[0083] HSC-T6的抗細胞毒性性能
[0084]圖2顯示與56天星形神經膠質細胞單培養物（ΑΡ2)相比，傳代后星形神經膠質細 胞（Ρ2)與傳代后MC(P1)的共培養物（AP2+MC Ρ1)中GS陽性細胞的數目增加600%。此 夕卜，在該圖中，顯示了來自加入或未加入HSC-T6 (活化的HSC細胞系）的星形神經膠質細胞 培養物中GS和MT表達的比較研究的結果。將HSC-Τ'6加入到 52天星形神經膠質細胞培養 物中導致GS、MT和結蛋白的顯著增加。所述細胞形成了神經元樣網絡，其具有大量設置的 突起，其中GS、MT和結蛋白強烈表達。
[0085] MC的抗細胞毒性性能
[0086]將來自新生大鼠的MC加入到14天共培養物中使得在58天星形神經膠質細胞培 養物中GS的表達和相應活性顯著增加。
[0087] 星形神經膠質細胞與HSC或MC的共培養物中神經元特異性功能的產生酪氨酸羥 化酶（TH)的表達
[0088]在第28天，均質培養物中大量星形細胞表達TH。在與來自大鼠的原代培養物的成 體分化的（活化的）MC或者與7-8次傳代的成體分化的HSC和MC共培養14天之后，TH陽 性細胞的數目保持約與星形神經膠質細胞對照培養物的相同。
[0089] 相當長培養時間后TH的表達
[0090]在星形神經膠質細胞原代培養物中，第40天與第28天相比，TH陽性細胞的數目 略微降低。TH染色的強度和表達TH的細胞的數目在第40和第52天之間甚至減少得更多。 與52天星形神經膠質細胞對照培養物相比， 4〇天星形神經膠質細胞培養物與來自大鼠的 成體活化的MC或成體活化的大鼠-HSC或者活化的 HSC_T6細胞系的共培養導致TH表達顯 著增加。
[0091] 神經絲蛋白（NF)的表達
[0092] 相比于星形神經膠質細胞對照培養物，將20000個HSC-T6細胞加入到14天星形 神經膠質細胞培養物中導致N F表達細胞的數目略微增加。HSC-T6細胞的數目增加10倍， 導致來自AP (星形細胞原代培養物）和HSC-T6的14天共培養物中NF陽性細胞的數目和 強度大大增加。
[0093] 星形神經膠質細胞（傳代2, AP2)和HSC-T6細胞系的共培養物中增殖細胞核抗原 (PCNA)的表達
[0094]圖3顯示星形神經膠質細胞與52天星形神經膠質細胞培養物的共培養物中PCNA 陽性細胞增加370%。
[0095] 與未傳代的原代培養物相比，傳代2的31天星形神經膠質細胞（AP2)的增殖活性 略微下降（通過PCNA的表達表明）。在AP2中加入HSC-T6細胞并另外共培養14天使得增 殖大大增加。如果將后者與AP2的細胞懸液混合并同時培養于培養皿中，則HSC-T6的作用 甚至更大。混合培養物中的高度增殖產生大量從培養皿底部脫離的細胞（可通過鄰近非常 致密或非常稀疏細胞分布之區域的大面積致密生長細胞來檢測）。盡管如此，在共培養物 中，即使在稀疏細胞分布的區域，PCNA陽性細胞的數目仍大于不含HSC的星形神經膠質細 胞培養物中的數目。
[0096] HSC-T6對星形神經膠質細胞老化過程的作用
[0097] 為了研究此作用，通過Western印跡分析了單獨的星形神經膠質細胞培養物中以 及與HSC-T6的共培養物中的GFAP表達。圖4表明，相比于GFAP在HSC-T6 (第2列）或星 形神經膠質細胞原代培養物（第3列和第4列）單獨培養物中的表達，星形神經膠質細胞 與HSC-T6的共培養物中幾乎不存在 GFAp的表達（圖4第丨列）。這表明了非常強的分化， 因此HSC對星形神經膠質細胞有延緩老化的作用。
[0098] 在共培養物中星形神經膠質和HSC-T6細胞對缺氧的抗性
[0099] 在此系列實驗中，使星形神經膠質細胞經受下列條件：
[0100] 1·將來自初次傳代（P1)的43天培養物在含氧量正常條件下（NC)單獨培養。含 氧量正常對照
[0101] 2·將來自初次傳代（P1)的43天星形神經膠質細胞培養物在NC下再培養10天， 然后轉移到低含氧條件下（HC)再培養48小時（1% 02、10% C02、89% N2)。低含氧對照。
[0102] 3.向P1的31天星形神經膠質細胞培養物中添加150000HSC-T6細胞，并在NC下 另外共培養12天。
[0103] 4.向P1的31天星形神經膠質細胞培養物中添加150000HSC-T6細胞，并在NC下 另外共培養10天。然后，使共培養物另外經受HC484、時。
[0104] 巢蛋白表達
[0105] 在含氧量正常條件下的初次傳代（API)中觀察到了巢蛋白在GFAP陽性的星形神 經膠質細胞中的中等表達。在這些培養物中，低含氧條件下巢蛋白表達過度降低。在NC下 與HSC-T6共培養12天后，巢蛋白的表達速率大大增加。在50%的總細胞群中，巢蛋白表達 的強度大于GFAP表達。在HC下，巢蛋白染色的強度甚至高于NC下不含HSC的星形神經膠 質細胞的對照培養物。在API和HSC-T6細胞的共培養物中，保持了表達乙酰膽堿的能力， 甚至在低含氧條件下亦如此。
[0106] β-III微管蛋白的表達
[0107] β-III微管蛋白和GFAP同時染色以及用抗β-III微管蛋白的單克隆抗體單獨染 色僅顯示含氧量正常和低含氧條件下API中單獨的β-III微管蛋白陽性細胞。在與HSC-T6 共培養12天之后，在NC和HC條件下β-III微管蛋白陽性細胞的數目都顯著增加。這些 細胞中的一些顯示典型的神經元表型（通過β-III微管蛋白的存在和GFAP的不存在而表 明）。在HC中，β-III微管蛋白染色的強度和β-III微管蛋白陽性細胞的數目在NC和HC 條件下均相同，但是比NC下API單獨培養物中的高得多。
[0108] 谷氨酰胺合成酶（GS)和金屬硫蛋白（MT)的共表達
[0109] 在NC和HC7下，API單培養物中NC下的細胞都輕微表達GS，但幾乎不表達任何 MT。在NC下與HSC-T6共培養12天后，GS和MT被高度調控。大多數細胞共表達GS和MT。 在許多細胞中，GS或MT的表達占優勢。在HC下，共培養物中MT染色的強度略微小于在NC 下共培養物中的強度。盡管如此，在HC下GS和MT在共培養物中的表達基本上大于在含氧 量正常條件下在星形神經膠質細胞單培養物中的表達。
[0110] PCNA和半胱天冬蛋白酶3的共表達
[0111] 在含氧量正常條件下（NC)，初次傳代（API)的43天星形神經膠質細胞培養物中僅 少量細胞表達PCNA。大多數細胞也不包含半胱天冬蛋白酶3。在低含氧條件下API培養物 的細胞數目和PCNA強度進一步降低。與NC和HC下的API培養物相比，在含氧量正常和低 含氧量條件下API與HSC-Τ' 6共培養導致PCNA陽性細胞大量增加。共培養物中增殖增加產 生了大量從培養皿底部脫離的細胞，其通過大的PCNA陽性細胞集聚體（conglomerate)以 及相鄰的稀疏且單獨生長的細胞而變得明顯。在一些集聚體中，幾乎完全缺乏半胱天冬蛋 白酶3的表達。另一方面，在另一些中，顯示強半胱天冬蛋白酶和PCNA表達。這表明新的 有增殖能力的細胞群的產生，其通過凋亡而被抵消。
[0112] 這些結果驗證了 HSC、HSC_T6細胞系和MC對星形神經膠質細胞原代培養物的保護 性能。這些性能通過下列參數進行評價：
[0113] 1.共培養物中神經元數量增加 （β -III微管蛋白陽性神經元增加250-300% );
[0114] 2.沉默細胞的活化；
[0115] 3.酪氨酸羥化酶表達增加；
[0116] 4. GS和ΜΤ表達增加，即抗細胞毒性功能；
[0117] 5.細胞增殖增加；
[0118] 6·星形細胞群體的再生（通過巢蛋白染色強度增加和巢蛋白陽性細胞增加300% 而表明）；
[0119] 7.共培養物中神經元網絡的擴增；
[0120] 8.由于下列作用產生的對低含氧量條件的抗性增加：
[0121] a)低含氧條件下細胞增殖增加；
[0122] b)星形神經膠質細胞培養物再生（在氧正常和缺氧下與單培養物相比巢蛋白陽 性細胞增加超過300% );
[0123] c)GS和MT表達增加；
[0124] d)神經元的數目增加（通過β-III微管蛋白陽性細胞增加300%而表明）。
[0125] 非神經GFAP陽性細胞的這些保護性能是基于它們對CNS細胞的持久作用，其通 過：
[0126] 1.產生對神經元的分化和產生來說必需的物質；
[0127] 2.由于它們具有分化的星形細胞的功能而產生的對星形細胞的分化阻滯作用；
[0128] 3.通過增殖導致的神經細胞群再生；
[0129] 4.轉化為神經元樣細胞的固有能力。
[0130] 1體內試驗
[0131] 用于治療多發性硬化的HSC-T6細胞系的保護作用
[0132] 試驗設計：
[0133] 將人M0G(髓磷脂少突神經膠質細胞糖蛋白）以50 μ g/動物的濃度靜脈內施用給 18只約1月齡的GA大鼠。24小時后，將動物分為2個組：第1組靜脈內得到5000000個細 胞（在PBS溶液中），將熒光標記的細胞施用給該組的兩個動物；第2組（對照組）僅靜脈內 獲得PBS。將HSC-T6細胞系形式的肝星狀細胞用作對應于0CDP的細胞。對第1組的2只動 物，靜脈內施用熒光標記的細胞，以檢測所施用細胞在CNS中的可達到性（accessibility) 和持續性。11天后準備這些動物。另外，對于不通過M0G誘導EAE(實驗性自身免疫性腦脊 髓炎）的正常（未實驗）大鼠來說，靜脈內施用相同量的熒光標記的細胞。這些對照動物 在CNS中應具有較少的HSC-T6細胞群，這是因為這些動物中血腦屏障保持完好。根據下述 神經病學"評分"每日觀察M0G處理的動物。
[0134] 結果
[0135] 根據下列標準每天測試所述動物的打擊運動（striking motor)特征：
[0136]
[0137]

【權利要求】
1. 表型穩定分化中或已分化的肝星狀細胞和/或系膜細胞或者具有類似分化程序的 細胞用于生產用于治療神經退行性疾病的藥物的用途。
2. 表型穩定分化中或已分化的肝星狀細胞、系膜細胞、胰腺星狀細胞、脾臟樹突細胞和 /或皮膚成纖維細胞用于生產用于治療特征為神經元和/或其功能損失的疾病和/或器官 特異性穩態的疾病的藥物的用途。
3·表型穩定分化中或已分化的肝星狀細胞、系膜細胞、胰腺星狀細胞、脾臟樹突細胞和 /或皮膚成纖維細胞用于生產用于治療阿爾茨海默病的藥物的用途。
4.表型穩定分化中或已分化的肝星狀細胞、系膜細胞、胰腺星狀細胞、脾臟樹突細胞和 /或皮膚成纖維細胞用于生產用于治療帕金森病的藥物的用途。
5·表型穩定分化中或已分化的肝星狀細胞、系膜細胞、胰腺星狀細胞、脾臟樹突細胞和 /或皮膚成纖維細胞用于生產用于治療中風的藥物的用途。
【文檔編號】A61P25/16GK104189010SQ201410255112
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2008年4月18日 優先權日:2007年9月18日
【發明者】加婭納·布尼亞蒂安, 羅爾夫·格布哈特, 克里斯托夫·格萊特, 魯辛·達尼埃良, 芭芭拉·普羅克施 申請人:萊比錫大學