抗豬瘟病毒感染的siRNA及其應用的制作方法

抗豬瘟病毒感染的siRNA及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了抗豬瘟病毒感染的siRNA及其應用，屬于抗豬瘟病毒siRNA的鑒定及其應用領域。本發明首先公開了分別靶向豬瘟病毒基因組Npro、P7、NS5A和NS5B基因的抗豬瘟病毒感染的siRNA，其核苷酸序列分別為SEQ?ID?NO.1-12所示。本發明進一步利用構建的重組豬瘟病毒篩選出對豬瘟病毒干擾或抑制活性最強的siRNA，其核苷酸序列分別為SEQ?ID?NO.1、SEQ?ID?NO.7或SEQ?ID?NO.12所示。本發明還公開了含有所述抗豬瘟病毒感染的siRNA的表達載體及其應用。本發明抗豬瘟病毒感染的siRNA對豬瘟病毒抑制活性強，具有制備成預防或治療豬瘟的藥物或試劑的潛力。
【專利說明】抗豬瘟病毒感染的S i RNA及其應用

【技術領域】
[0001] 本發明涉及抗豬瘟病毒siRNA，尤其涉及靶向豬瘟病毒基因組的抗豬瘟病毒感染 的siRNA，本發明進一步涉及靶向豬瘟病毒基因組的具有抗豬瘟病毒感染活性的siRNA在 制備預防或治療豬瘟的藥物或試劑中的應用，屬于抗豬瘟病毒siRNA的鑒定及其應用領 域。

【背景技術】
[0002] 豬癌（classical swine fever，CSF)是由豬癌病毒（classical swine fever virus，CSFV)引起的一種接觸性、致死性傳染病，以高熱和出血為其典型特征，發病率和死 亡率極高，被世界動物衛生組織（0ΙΕ)列為必須申報的動物疫病。
[0003] 豬瘟病毒（CSFV)是黃病毒科（Flaviviridae)瘟病毒屬（Pestivirus)的成 員，為單股正鏈線性RNA分子。CSFV基因組大小為12.3kb，兩端分別為5'端非翻譯區 (untranslated region，UTR)和 3'端 UTR，中間包含一個大的開放閱讀框（Open reading frame，0RF)，其中0RF編碼一個由3898個氨基酸殘基組成的多聚蛋白。該多聚蛋白在病毒 感染的宿主細胞內，受宿主或病毒特有的蛋白酶的水解作用，可裂解為11種病毒特異性蛋 白，包括4種病毒結構蛋白（C、E ms、El和E2)和7種非結構蛋白（NpM、P7、NS2-3、NS4A、NS4B、 NS5A和NS5B) (Moennig，V.，2000. Introduction to classical swine fever:virus, disease and control policy. Vet. Microbiol. 73, 93 - 102.) 〇
[0004] RNA干擾（RNA interference, RNAi)是抗病毒感染最有效的方法之一。應用 RNAi技術可以減少病毒RNA的數量、阻斷病毒蛋白的表達以及抑制病毒的復制等，此技 術已在多種疾病的基因治療研究中，發揮出了巨大的潛力和獨特的效果。現有的研究表 明，靶向豬瘟病毒N p' NS3、NS4A和NS5B基因的siRNA可以抑制CSFV的復制（Xu，X.，Gu ο, Η. , Xiao, C. , Zha, Υ. , Shi, Ζ. , Xia, X. , Tu, C. , 2008. In vitro inhibition of classical swine fever virus replication by siRNAs targeting Npro and NS5B genes. Antiviral Res. 78，188 - 193 ;Li，J.，Dai，Y.，Liu，S.，Guo, H.，Wang，T.，Ouyang，H.，Tu，C.，2011. In vitro inhibition of CSFV replication by multiple siRNA expression. Antiviral Res. 91, 209 - 216.) 〇
[0005] CSFV P7為II類離子通道蛋白，在瘟病毒的生命周期中起著至關重要的作用，并 與病毒的致病性有關（Gladue, D. P.，Holinka, L. G.，Largo, E.，Sainz, I. F.，Carrillo, C. ,0' Donnell, V. , Baker-Branstetter, R. , Lu, Z. , Ambroggio, X. , Risatti, G. R. , Nieva, J. L. , Borca, Μ. V. , 2012. Classical swine fever virus p7 protein is a viroporin involved in virulence in swine. J. Virol. 86, 6778 - 6791.)。NS5A 在 CSFV 生命周期的確切功能知 之甚少，迄今尚無靶向CSFV P7和NS5A基因的抗豬瘟病毒siRNA的報道。


【發明內容】

[0006] 本發明要解決的技術問題是提供分別靶向豬瘟病毒基因組Np' P7、NS5A和NS5B 基因的具有抗豬瘟病毒感染活性的siRNA，這些siRNA具有應用于預防或治療豬瘟的藥物 或試劑的潛力，實現對豬瘟的有效防治。
[0007] 本發明所要解決的技術問題是通過以下技術方案實現的：
[0008] 本發明根據豬瘟病毒基因組Np?基因的編碼序列，設計靶向豬瘟病毒基因組N PM 基因的抗豬瘟病毒siRNA，其核苷酸序列為SEQ ID NO. 1-3所示。
[0009] 本發明根據豬瘟病毒基因組P7基因的編碼序列，設計靶向豬瘟病毒基因組P7基 因的抗豬瘟病毒siRNA，其核苷酸序列為SEQ ID N0. 4-6所示。
[0010] 本發明根據豬瘟病毒基因組NS5A基因的編碼序列，設計靶向豬瘟病毒基因組 NS5A基因的抗豬瘟病毒siRNA，其核苷酸序列為SEQ ID N0. 7-9所示。
[0011] 本發明根據豬瘟病毒基因組NS5B基因的編碼序列，設計靶向豬瘟病毒基因組 NS5B基因的抗豬瘟病毒siRNA，其核苷酸序列為SEQ ID N0. 10-12所示。
[0012] 本發明為了鑒定所設計的這些SiRNA是否具有抗豬瘟病毒感染的活性，本發明構 建了表達螢火蟲熒光素酶基因的重組豬瘟病毒CSFV-N pjr°Fluc，其微生物保藏編號為：CGMCC No. 9058 ;分類命名為：表達螢火蟲熒光素酶基因的重組豬瘟病毒。保藏單位：中國微生物 菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏時間是2014年04月11日；保藏地址：中國北京 朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所。本發明利用所構建的表達螢火蟲 熒光素酶（Flue)基因的重組豬瘟病毒評估靶向豬瘟病毒基因組N p'P7、NS5A和NS5B基因 的12條抗豬瘟病毒siRNA分子，檢測結果證實，siNpM-108(SEQ ID NO. 1)、siNS5A-239(SEQ ID NO. 7)和siNS5B-1234 (SEQ ID NO. 12)是對豬瘟病毒的干擾或抑制活性最強的siRNA分 子。
[0013] 其中，本發明提供了 1個靶向CSFV基因組Np?基因的具有抗豬瘟病毒活性的 siRNA，其對豬瘟病毒的干擾或抑制活性較強，其核苷酸序列為SEQ ID NO. 1所示。本發明還 提供了利用重組豬瘟病毒CSFV-Npjr°Fluc篩選出的1個靶向CSFV基因組P7基因的抗豬瘟 病毒siRNA，對豬瘟病毒具有較強干擾效果，其核苷酸序列為SEQ ID N0. 4所示；所述siRNA 是本發明首次公開的靶向CSFV基因組P7基因的抗豬瘟病毒siRNA。
[0014] 本發明同時利用CSFV-NpMFluc及其親本病毒Shimen株評估了篩選獲得的靶向四 種基因的干擾能力由強到弱的4個siRNA分子在不同濃度的抗病毒效果。所述抗豬瘟病 毒 siRNA 為 siNpr°-108、siNS5B-1234、siNS5A-734 和 siP7-55,分別靶向豬瘟病毒基因組的 NPM、NS5B、NS5A 和 P7 基因，其核苷酸序列分別為 SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 12、SEQ ID N0. 9 或 SEQ ID NO. 4 所示。
[0015] 本發明分析了上述抗豬瘟病毒siRNA在不同濃度（50nm、100nm和150nm)的抗病 毒效果。結果表明，所述4種siRNA在50nm、100nm和150nm均對豬癌病毒有顯著的抑制作 用。對于150nM的siScr處理的細胞，CSFV-N pi:°Fluc的Flue活性值為10 5 59,而150nM的 siNpM-108、siP7-55、siNS5A-734 和 siNS5B-1234 處理的細胞的 Flue 活性值分別為 103 °8、 1044°、104 °8和103·55,與siScr處理細胞相比，Flue活性分別降低了 332、15. 8、32. 45和 113. 2 倍。同時 150nm 的 siNpr〇-108、siP7-55、siNS5A-734 和 siNS5B-1234 處理細胞的親 本病毒Shimen株滴度分別為Κ^'Κ^'ΙΟ187和10154 TCID5Q/mL，與siScr處理細胞的 Shimen株的滴度相比，分別降低了 870. 9、44. 3、111. 3和313. 3倍，該結果與Flue活性測定 的結果一致，進一步證實本發明提供的siRNA具有應用于制備抗豬瘟病毒藥物或試劑的潛 力。
[0016] 本發明還提供了含有所述抗豬瘟病毒感染活性的siRNA的表達載體；所述表達載 體選自腺病毒載體、慢病毒載體、反轉錄病毒載體或質粒載體中的任意一種；由于質粒作為 載體，其投遞的有效性和在體內效用的持續性均不太理想；而慢病毒和反轉錄病毒載體雖 然能夠持久表達外源的shRNA，但會導致基因整合到宿主染色體上；腺病毒載體具有高效、 制備純化簡單、宿主范圍廣及穩定性好等優點，因此，本發明中的表達載體優選為腺病毒載 體。
[0017] 本發明還提供了所述抗豬瘟病毒SiRNA在制備預防或治療豬瘟的藥物或試劑中 的用途。
[0018] 本發明所篩選出的抗豬瘟病毒SiRNA對CSFV干擾或抑制活性強，可用于制備預防 或治療豬癌的藥物或試劑。
[0019] 本發明進一步提供了一種應用所述的SiRNA在預防或治療豬瘟病毒感染中的應 用，包括：將siRNA直接轉染到動物細胞內；或者通過構建siRNA表達載體，將單一 siRNA連 接至表達載體，轉染宿主；在宿主體內表達相應的siRNA，抑制豬瘟病毒的復制或者抑制靶 基因的表達，達到預防或治療豬瘟的作用。
[0020] 當靶向CSFV基因組一個基因位點的siRNA的抑制效果不顯著時，還可以聯合幾個 基因位點使用，即將靶向CSFV基因組不同基因的多個siRNA串聯在表達載體上，轉染宿主； 在宿主體內表達相應的siRNA，可以更好抑制豬瘟病毒的復制或者抑制靶基因的表達，能達 到更好的預防或治療豬瘟的效果。
[0021] 本發明的技術方案與現有技術相比，具有以下有益效果：
[0022] 本發明成功篩選出了分別靶向豬瘟病毒基因組的NPM、NS5A和NS5B基因的3個對 豬瘟病毒的干擾或抑制活性最強的siRNA(siN pM-108、siNS5A-239和siNS5B-1234);另外， 本發明首次公開了靶向豬瘟病毒基因組NS5A基因和P7基因的抗豬瘟病毒siRNA序列；本 發明公開的抗豬瘟病毒siRNA對豬瘟病毒的干擾或抑制活性強，用于制備預防或治療豬瘟 的藥物或試劑，可實現對豬瘟的有效防治。
[0023] 本發明所渉及到的術語定義
[0024] 除非另外定義，否則本文所用的所有技術及科學術語都具有與本發明所屬領域的 普通技術人員通常所了解相同的含義。
[0025] 術語"反向遺傳操作技術"意指通過構建RNA病毒的感染性分子克隆，在DNA分 子水平上對病毒基因組進行體外人工操作，如進行基因點突變、缺失、插入、顛換、轉位和互 補等改造，以此來研究RNA病毒的基因復制與表達調控機理、RNA編輯和自發重組與誘導重 組、病毒與宿主間的相互作用關系、抗病毒策略、基因治療研究，以及構建新型病毒載體來 表達外源基因和進行疫苗的研制等。
[0026] 術語"基因組"意指單倍體細胞中包括編碼序列和非編碼序列在內的全部DNA分 子（部分病毒是RNA)。
[0027] 術語"核苷酸序列"意指DNA或RNA中堿基的排列順序。
[0028] 術語"病毒滴度"意指病毒的毒力或毒價，衡量病毒滴度的單位有最小致死量 (MLD)、最小感染量（MID)、半數致死量（LD 5CI)和半數組織感染量（TCID5(i)。
[0029] 術語"siRNA"意指一種小RNA分子（21-25核苷酸），由Dicer (RNase III家族中特 異性識別雙鏈RNA的酶）加工而成；siRNA是siRISC的主要組成成分，在RNAi過程中作為 指導特異性切割作用的"向導"，激發與之互補的目標mRNA的沉默。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0030] 圖1為CSFV-NpMFluc的免疫熒光試驗檢測結果；
[0031] 圖2為CSFV_NpMFluc的Flue基因表達的動力學；
[0032] 圖3為CSFV-Npi°Fluc用于抗病毒siRNA的篩選結果；#，p < 0. 01 ;
[0033] 圖4為CSFV_NpMFluc對于不同濃度抗病毒siRNA的劑量依賴性實驗結果；**，p < 0. 01 ；
[0034] 圖5為siRNA對親本病毒Shimen株的抑制效果驗證結果；**，p < 0· 01。

【具體實施方式】
[0035] 下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而 更為清楚。但是應理解所述實施例僅是范例性的，不對本發明的范圍構成任何限制。本領 域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節 和形式進行修改或替換，但這些修改或替換均落入本發明的保護范圍。
[0036] 1、實驗材料
[0037] CSFV石門（Shimen)株（GenBank登錄號AF092448. 2)和PK-15細胞由中國農業科 學院哈爾濱獸醫研究所獸醫生物技術國家重點實驗室保存；SK6細胞由瑞典國家獸醫研究 所Lihong Liu博士惠贈。
[0038] 包含Flue基因的質粒pGEM-luc購自Promega公司；CSFV Shimen株的全長感染性 克隆pBRCISM由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所獸醫生物技術國家重點實驗室構建和 保存。
[0039] 針對CSFV E2蛋白的單克隆抗體由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所獸醫生物技 術國家重點實驗室制備和保存；FITC標記的羊抗鼠 IgG購自Sigma公司。雙熒光素酶檢測 試劑盒購自Promega公司。
[0040] 實施例1抗豬瘟病毒SiRNA的設計及篩選
[0041] 1、試驗方法
[0042] 1. 1攜帶Flue基因的豬瘟重組病毒的拯救
[0043] 本發明通過重疊 PCR方法將螢火蟲熒光素酶基因克隆到豬瘟病毒Shimen株全 長感染性克隆pBRCISM的Np?編碼區內第412位堿基和第413位堿基之間（即N p?蛋白 第13位和第14位氨基酸之間），構建出含有Flue基因的CSFV全長感染性克隆，命名為 pBRCISM-Npr°Fluc。
[0044] 利用基于RNA聚合酶11的反向遺傳操作技術用pBRCISM-NpMFluc拯救出5株 攜帶 Flue 基因的重組豬瘟病毒，SP :CSFV-NpMFluc、CSFV-Np"°Fluc-l、CSFV-NpMFluc-2、 CSFV-NpMFluc-3 和 CSFV-NpMFluc-4,其中重組病毒 CSFV-Npi:°Fluc 在所表現出的 Flue 活性 以及遺傳穩定性方面明顯優于另外4株重組豬瘟病毒。
[0045] 本發明將性能最為優異的豬瘟重組病毒CSFV_NpMFluc提交專利認可的機構進行 保藏，其微生物保藏編號為：CGMCC No. 9058。
[0046] 1. 2重組病毒的間接免疫熒光試驗（IFA)
[0047] 將拯救的重組病毒CSFV_NpMFluc接種于生長至70%的SK6細胞中，2h后用磷酸 鹽緩沖溶液（PBS)洗2遍并換為新鮮的含4%胎牛血清的DMEM，在5% C02、37°C環境中繼 續培養，48h后用抗E2單克隆抗體進行IFA試驗，以未感染細胞做陰性對照（NT)。
[0048] 具體操作如下：棄掉培養液，用PBS清洗細胞2遍，然后用冷無水乙醇固定細胞， 30min后加入抗E2單克隆抗體，在室溫下作用2h后用PBS洗滌細胞5次，并加入1 :90稀 釋的FITC標記的羊抗鼠 IgG，于室溫中避光作用lh，用PBS洗滌細胞5次，5min/次，在倒置 熒光顯微鏡下觀察并拍照。
[0049] 1. 3重組病毒的熒光素酶活性分析
[0050] 將SK6細胞接種于24孔細胞培養板中，當細胞生長至80%時，分別用拯救的重組 病毒CSFV-N pMFluc和親本病毒Shimen株按Μ0Ι = 0· 1劑量感染SK6細胞，并置于5% C02、 37°C環境中繼續培養。在感染后1211、2411、3611、4811、6011和7211，將細胞培養上清棄掉，并用 PBS洗滌細胞1次，然后加入裂解液，每孔加入100 μ L裂解液，在冰上裂解15min后，將細胞 裂解液加入含有熒光素酶檢測試劑的白板中，立即放入熒光檢測儀讀數。
[0051] 1. 4RNA設計及干擾試驗
[0052] 本發明設計了 12種特異性干擾CSFV基因組編碼序列的siRNA分子，分別靶向 NPM、P7、NS5A和NS5B基因的編碼序列，siRNA分子核苷酸序列見表1。
[0053] RNA干擾試驗在48孔細胞培養板中進行，將ΙΟΟηΜ的各siRNA分子用X-tremeGENE siRNA干擾分子轉染試劑分別轉染長滿70 %單層的PK-15細胞，6h后換為含2 %胎牛血 清細胞〇1^，2處后每孔接501'(：105(|的重組病毒03?￥-#邛111(3，并換為含4%胎牛血清的 DMEM，48h后測定螢火蟲熒光素酶活性值。
[0054] 表1干擾性RNA分子名稱及序列
[0055]

【權利要求】
1. 靶向豬瘟病毒基因組Np?基因的具有抗豬瘟病毒感染活性的siRNA。
2. 按照權利要求1所述的siRNA，其特征在于：其核苷酸序列選自SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2 或 SEQ ID NO. 3。
3. 靶向豬瘟病毒基因組P7基因的具有抗豬瘟病毒感染活性的siRNA。
4. 按照權利要求3所述的siRNA，其特征在于：其核苷酸序列選自SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5 或 SEQ ID NO. 6。
5. 靶向豬瘟病毒基因組NS5A基因的具有抗豬瘟病毒感染活性的siRNA。
6. 按照權利要求5所述的siRNA，其特征在于：其核苷酸序列選自SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 8 或 SEQ ID NO. 9。
7. 靶向豬瘟病毒基因組NS5B基因的具有抗豬瘟病毒感染活性的siRNA。
8. 按照權利要求7所述的siRNA，其特征在于：其核苷酸序列選自SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 11 或 SEQ ID NO. 12。
9. 含有權利要求1-8所述具有抗豬瘟病毒感染活性的siRNA的表達載體，其特征在于： 所述表達載體選自腺病毒載體、慢病毒載體、反轉錄病毒載體或質粒載體中的任意一種；優 選為腺病毒載體。
10. 權利要求1-8所述的具有抗豬瘟病毒感染活性的SiRNA在制備預防或治療豬瘟的 藥物或試劑中的應用。
【文檔編號】A61K48/00GK104059914SQ201410252667
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2014年6月9日 優先權日:2014年6月9日
【發明者】仇華吉, 申梁, 李永鋒, 孫元, 李素, 羅玉子 申請人:中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所