一種提純的雪菊黃酮片劑及其制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種提純的雪菊黃酮片劑及其制備方法。以粉碎的雪菊為原料，將雪菊粉加水后超聲處理，在55℃,15min，160W，再加入2.5%（G/G）生物復合酶，經50-55℃酶解3h，經滅酶、離心、后經AB-8大孔樹脂吸附解析，AB-8大孔樹脂用量為雪菊黃酮提取液的1/15（G/V）倍進行吸附，再用15倍的70%乙醇解析洗脫收集洗脫液，液濃縮后加入β-環糊精，麥芽糊精，β-環糊精和麥芽糊精（1:1）的與固形物的質量比為2:3，粉粒中加的物質與粉粒的質量比為7:3,其中β-環糊精占70%，麥芽糊精占30%，再加入2%的木糖醇和1%的硬脂酸鎂，制備的雪菊黃酮片劑具有抑菌、抗氧化作用及增強免疫力。
【專利說明】一種提純的雪菊黃酮片劑及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及片劑制備【技術領域】。具體的說，本發明涉及一種高效提純雪菊黃酮并制成片劑方法【技術領域】。
【背景技術】
[0002]新疆昆侖雪菊學名雙色金雞菊，屬菊科金雞菊屬一年生草本植物，又名“血菊”，維吾爾語“古麗恰爾”，是目前新疆唯一與雪蓮齊名，具有獨特功效的稀有高寒植物。昆侖雪菊富含有黃酮類、皂甙類、氨基酸類物質，還含有蛋白質、糖類、生物堿、有機酸、酚類、蒽醌類、揮發油、油脂、內酯及香豆素類等活性成分，具有調節三高、消除疲勞、減肥養顏、抗菌消炎、調節免疫力、抗氧化衰老、營養心肌、改善睡眠質量等功效。雪菊是藥食兩用植物，除藥用外，也可以被作為食品工業的原料，加工成各種高級飲料和各種營養保健食品。雪菊的功效與其所含的黃酮成分有很大的關系。近年隨著人民生活水平的提高，在崇尚自然的今天，人們對于天然植物有效成分的需求日益增多。雪菊與黃酮的功效有很大的相關性，多數藥理研究表明雪菊的藥理功效就是雪菊黃酮的作用，揭示了雪菊黃酮類成分就是雪菊的主要活性成分。
[0003]目前，雪菊提取的研究主要集中在乙醇回流法，近年來出現了超聲、微波新型輔助提取技術的研究，未見報道有生物復合酶解聯用超聲處理技術提取雪菊黃酮；黃酮純化的研究主要集中在柱層析技術的研究，主要利用大孔樹脂柱，純度高，但以雪菊黃酮為主的相應的產品在市場上很少出現，特別是片劑，本研究開發一種效率高、成本低的新提取方法與片劑產品具有重要意義。
【發明內容】
[0004]針對目前國內外未見采用生物復合酶解聯用超聲處理技術提取雪菊功能性黃酮的現狀。本發明的目的是采用生物復合酶解聯用超聲處理技術提取并采用AB-8大孔樹脂靜態吸附解析技術純化雪菊黃酮并制成片劑的方法，不僅解決了目前提取方法提取率低、產品生物活性低、無以黃酮為主的片劑產品等問題，還為雪菊加工企業提升技術水平提供了切實可行的方法。
[0005]本發明采用的技術方案:
選用清洗干凈的雪菊經粉碎加水后進行超聲處理后，加入復合酶酶解，酶解后進行滅酶，離心取上清液，得到黃酮粗提取液；取AB-8大孔樹脂放入粗提取液中，在搖床上一定時間吸附，取出大孔樹脂再用70%乙醇解析洗脫收集洗脫液；洗脫液濃縮后加入β -環糊精，麥芽糊精，β-環糊精與麥芽糊精的壁材能夠有效的保護提取液的有效成分，經噴霧干燥，得粉粒獲得微膠囊的主要成分，粉粒中加入β -環糊精，麥芽糊精，木糖醇，硬脂酸鎂，進行壓片制備獲得雪菊黃酮片劑。
[0006]一種提純的雪菊黃酮片劑及其制備方法
本發明具體提供了一種提純的雪菊黃酮片劑的制備方法，具體步驟如下:(I)把干凈雪菊放入粉碎機中粉碎30s過60目的篩子，以質量體積比1:30將雪菊粉加入水，后進行超聲處理，經在55°C，15min, 160W超聲處理后。
[0007](2)超聲處理后，加入復合酶酶解，按重量百分比計加入2.5%生物復合酶，在50-55°C的條件下酶解3h，酶解后進行滅酶，滅酶在100°C沸水浴中5min，離心取上清液，得到雪菊黃酮粗提取液。
[0008](3)取AB-8大孔樹脂放入上述步驟(2)制備的雪菊黃酮粗提取液中，AB-8大孔樹脂用量與雪菊黃酮提取液的用量按質量體積比1:15混勻，樹脂吸附提取液的有效成分，吸附在搖床上115r/min，37°C，吸附10h，取出大孔樹脂再用70%的乙醇解析洗脫收集洗脫液。
[0009](4)將洗脫液濃縮后加入β -環糊精和麥芽糊精，經噴霧干燥，得粉粒，此粉粒是微膠囊的成分，粉粒中加入β_環糊精、麥芽糊精、木糖醇和硬脂酸鎂，通過進行壓片制備獲得雪菊黃酮片劑。
[0010](5) β-環糊精和麥芽糊精的用量總質量與濃縮液中的黃酮及有效成分的質量比為2:3，β-環糊精和麥芽糊精按質量比1:1配比混合，環糊精與麥芽糊精的壁材能夠有效的保護提取液的有效成分，混合液經噴霧干燥得到粉粒中加人β -環糊精，麥芽糊精，木糖醇，硬脂酸鎂與粉粒的質量比為7:3，其中β-環糊精占70%，麥芽糊精占30%，再加入2%的木糖醇，加入1%的硬脂酸鎂。
[0011]本發明中，生物復合酶按照纖維素酶、果膠酶和木瓜蛋白酶按照質量比計以2:2:3混合。
[0012]同時，本發明提供一種提純的雪菊黃酮片劑，通過如上方式制備方法獲得，具體而言，按照重量百分比計，雪菊黃酮片劑含有總黃酮13.8%、β -環糊精53.3%、麥芽糊精26.2%、木糖醇2%、硬脂酸鎂1%、另有3.7%為多糖生物堿蛋白質類物質，具體為提取中殘留的多糖、蛋白質、生物喊等。
[0013]本發明采用生物復合酶解聯用超聲處理技術提取，并采用ΑΒ-8大孔樹脂靜態吸附解析技術純化雪菊黃酮并制成片劑的方法，不僅解決了目前提取方法提取率低、產品生物活性低、無以黃酮為主的片劑產品等問題，還為雪菊加工企業提升技術水平提供了切實可行的方法。
[0014]本發明采用的粉碎、溫水提取、酶處理、超聲處理、離心分離、靜態吸附、解析、旋轉蒸發濃縮、噴霧干燥、壓片等等技術環節具有上下一體，緊密不可分割的特點，特別是黃酮提取率技術，由于雪菊特有的結構在提取中經粉碎有利于提取，經過單因素多因素和響應面實驗，總黃酮的提取率大幅度的提高，特別在超聲復合酶聯用的技術更能增加提取率，黃酮大多數在細胞內部，經超聲可以破壞細胞結構大大的釋放黃酮，在超聲中由于不完全，可能造成浪費，再加入復合酶可以有效提高細胞的破碎，增大總黃酮的提取率。整個提取過程中溫度控制在50度左右不會破壞黃酮的有效成分，純化采用了技術較為成熟的靜態吸附解析，動態純化耗時長費用高，經多次實驗證明ΑΒ-8大孔樹脂吸附解析效果好，純化率高，有利于反復利用，節約成本，能達到預期的效果。選擇合適的壁材有利于保護有效成分提高包埋率，選擇的環糊精、麥芽糊精經實驗證明包埋率高，進行噴霧干燥的選擇有利于保護有效成分，壓片中加入β -環糊精，麥芽糊精，木糖醇，硬脂酸鎂，其中各物質的含量一定，能保持片劑的狀態和口感。通過選用合適的工藝和相應的技術參數，利用技術手段合理的提取方式，以及通過采用合理的工藝制備片劑具有重要的作用，對于本領域普通技術人員不通過科學的試驗，合理的科學組配，隨意采用常見的提取方法、純化技術、加入壁材影響總黃酮的含量及功效、成本等。本發明依據現有技術通過不斷科學研究及無數次實驗得出制備本發明提供的雪菊黃酮片劑，本發明制備的雪菊黃酮片劑具有如下典型的質量指標及相應的口感指標:
1.感官指標:色澤為褐色，具有雪菊特有的香味，片劑形態完整，表面光滑，組織細膩緊密。
[0015]2.理化指標:雪菊黃酮片劑含有總黃酮13.8%、環糊精53.3%、麥芽糊精26.2%、木糖醇2%、硬脂酸鎂1%、其中有3.7%為提取中殘留的水、多糖、蛋白質、生物堿等。
[0016]本發明提供的雪菊黃酮片劑的方法具有純度高和功效好等多種優越性，對開發一種雪菊黃酮片劑具有重要意義；對于物質的效價分析，目前的研究多集中在某種物質中單一成分具有的功能性，而對于產品具有的功效的研究很少見，但是進入市場的是以產品的方式，因此本發明制備的雪菊黃酮片劑產品的功效更加具有價值。本發明具體采用本發明提供的工藝制備的雪菊黃酮片劑產品的效價分析:
一是本發明制備的雪菊黃酮片劑具有明顯的抑菌作用:將片劑粉碎加入水溶解制成溶液，在涂布有均勻的黑曲霉平板和涂布有均勻的金黃色葡萄球菌的平板內，將浸有片劑溶解液的濾紙片貼在平板上以浸有無菌生理鹽水的濾紙片作為對照。帶有金黃色葡萄球菌的平板在37°C下培養24h，黑曲霉在28°C下培養48h。通過觀察并測定抑菌圈的直徑來比較抑菌效果。實驗結果表明，本發明制備的雪菊黃酮片劑的抑菌作用顯著(P < 0.05)。
[0017]二是本發明制備的雪菊黃酮片劑的增強機體免力:首先采用環磷酰胺(cyclophosphamide , Cy ) 50mg/kg腹腔給藥,每天I次,連續2天,誘導大鼠免疫低下模型。然后對大鼠進行30d的 灌胃實驗，片劑粉碎加入水中溶解得到雪菊黃酮溶解液，實驗大鼠灌胃雪菊黃酮溶解液，對照組灌胃生理鹽水。30d后測定各項免疫指標:體重及免疫器官/體重的檢驗，NK細胞活性檢驗，單核-巨噬細胞吞噬功能檢測。實驗結果表明:本發明制備的雪菊黃酮片劑具有提高機體免疫力的能力。
[0018]三是本發明制備的雪菊黃酮片劑的抗氧化作用:測定了雪菊黃酮片劑對自由基DPPH、羥基自由基的清除能力，以及雪菊黃酮片劑的還原能力。以Vc作為對照。實驗中Vc的氧化能力與雪菊黃酮片劑相當，說明雪菊黃酮片劑對自由基DPPH、羥基自由基具有一定的清除能力以及一定的還原能力。實驗結果表明:本發明制備的雪菊黃酮片劑對自由基DPPH、羥基自由基具有明顯的清除能力和還原能力。
[0019]通過上述提供的技術方案，與現有技術相比，本發明的具體
【發明內容】
可以達到以下顯著的技術效果:
通過本發明提供的雪菊黃酮片劑制備方法，利用生物復合酶解聯用超聲處理提取技術提純的黃酮得率為13.8%，較傳統水浴浸提技術的得率9%，有明顯的提高。采用本發明提供的雪菊黃酮片劑制備方法獲得雪菊黃酮片劑能最大保持有效成分，經提取、純化、噴霧干燥、壓片，在提取、純化中沒有經過高溫，不會破壞有效成分，在液體中加入壁材，再經過噴霧干燥與壓片中最大程度的保護有效成分，經過此工藝能最大的提取和保留有效成分。此片劑經功能性實驗證明:具有抑菌、抗氧化作用及增強免疫力。
【專利附圖】
【附圖說明】[0020]圖1顯示為雪菊黃酮片劑的制備工藝流程圖。
【具體實施方式】
[0021]本發明中涉及到的主要原輔材料、試劑和儀器設備:
主要原輔材料:雪菊、β_環糊精，麥芽糊精，木糖醇，硬脂酸鎂、木糖醇、硬脂酸鎂。
[0022]主要儀器與試劑:粉碎機、恒溫罐、超聲破碎儀、噴霧干燥機、壓片機、無水乙醇、纖維素酶、木瓜蛋白酶、果膠酶。
[0023]本發明中選用的所有試劑和儀器都為本領域熟知選用的，但不限制本發明的實施，其他本領域熟知的一些試劑和設備都可適用于本發明以下實施方式的實施。
[0024]實施例一:提純的雪菊黃酮片劑的制備
參見附圖1，雪菊黃酮片劑通過以下具體步驟制備獲得:
(I)把干凈雪菊放入粉碎機中粉碎30s過60目的篩子，以質量體積比1:30將雪菊粉加入水，后進行超聲處理，經在55°C，15min, 160W超聲處理后。
[0025](2)超聲處理后，加入復合酶酶解，按重量百分比計加入2.5%生物復合酶，在50-55°C的條件下酶解3h，酶解后進行滅酶，滅酶在100°C沸水浴中5min，離心取上清液，得到雪菊黃酮粗提取液。
[0026](3)取AB-8大孔樹脂放入上述步驟(2)制備的雪菊黃酮粗提取液中，AB-8大孔樹脂用量與雪菊黃酮提取液的用量按質量體積比1:15混勻，樹脂吸附提取液的有效成分，吸附在搖床上115r/min，37°C，吸附10h，取出大孔樹脂再用70%的乙醇解析洗脫收集洗脫液。
[0027](4)將洗脫液濃縮后加入β -環糊精和麥芽糊精，經噴霧干燥，得粉粒，此粉粒是微膠囊的成分，粉粒中加入β_環糊精、麥芽糊精、木糖醇和硬脂酸鎂，通過進行壓片制備獲得雪菊黃酮片劑。
[0028](5) β -環糊精和麥芽糊精的用量總質量與濃縮液中的黃酮及有效成分的質量比為2:3，β-環糊精和麥芽糊精按質量比1:1配比混合，環糊精與麥芽糊精的壁材能夠有效的保護提取液的有效成分，混合液經噴霧干燥得到粉粒中加人β -環糊精，麥芽糊精，木糖醇，硬脂酸鎂與粉粒的質量比為7:3，其中β-環糊精占70%，麥芽糊精占30%，再加入2%的木糖醇，加入1%的硬脂酸鎂。
[0029]本發明中，生物復合酶按照纖維素酶、果膠酶和木瓜蛋白酶按照質量比計以2:2:3混合。
[0030]通過上述提供的雪菊黃酮片劑制備方法，利用生物復合酶解聯用超聲處理提取技術提純的黃酮得率為13.8%，較傳統水浴浸提技術的得率9%，有明顯的提高。
[0031]經上述實施例制備的雪菊黃酮片劑，按照重量百分比計，雪菊黃酮片劑含有總黃酮13.8%、β -環糊精53.3%、麥芽糊精26.2%、木糖醇2%、硬脂酸鎂1%、另有3.7%為多糖生物喊蛋白質類物質，具體為提取中殘留的多糖、蛋白質、生物喊等。
[0032]實施例二:提純的雪菊黃酮片劑的制備 為了進一步說明本發明，以600g雪菊為例。
[0033](I)挑選600g勻整度高、花骨飽滿、花蕊花瓣色澤橙黃、不含葉梗、花蕊細末或其他非雪菊類的雜質的干制雪菊，將選好的600g雪菊在萬能粉碎機內粉碎，粉碎后的雪菊粉末的粒度在100目左右。[0034](2)在粉碎好的雪菊粉末中加入18L的蒸餾水，用攪拌機攪拌均勻，放入到已經加熱到55°C恒溫水浴鍋內預熱半小時。
[0035](3)將上述步驟(2)處理后的溶液利用超聲波破碎儀進行超聲處理，超聲處理時的溫度為55。。，時間15min，功率160w ；
(4)將上述步驟(3)處理后的雪菊溶液倒入到恒溫罐，在恒溫罐內加入纖維素酶、果膠酶和木瓜蛋白酶同時攪拌。纖維素酶為6g，果膠酶的用量6g，木瓜蛋白酶的用量為7.5g，酶促反應3h，溫度55 °C，pH值自然。
[0036](5)酶反應結束后將酶反應器內的雪菊溶液滅酶處理，滅酶的溫度為100°C,時間為5min，使溶液內的酶失活。
[0037](6)將步驟(5)結束后的浸提液進行離心處理，取上清液。
[0038](7)吸附與解析:稱取1.2kg的AB-8大孔樹脂，放入18L的提取液中，并不斷的搖動，搖動12h后，過濾取樹脂加入70%的乙醇18L解析，再過濾取上清液。
[0039](8)濃縮:將18L解析液旋轉蒸發，并不斷測液體的固體含量，達到15%即可。
[0040](9)干燥:將液濃縮后加入35gi3 -環糊精，35g麥芽糊精，進行噴霧干燥得177g的粉粒。 [0041](10)制片:將粉粒中加的物質與粉粒的質量比為7:3，加入289.1gP-環糊精、123.9g麥芽糊精，再加入12.2g木糖醇，加入6g硬脂酸鎂，在壓片機中得壓片608g。
[0042]實施例三:提純的雪菊黃酮片劑的效價分析實驗 提純的雪菊黃酮片劑具有抑菌作用:
將上述實施例制備的雪菊黃酮片劑粉碎融入水中得溶解液，在無菌操作臺上將金黃色葡萄球菌均勻的涂布在盛有牛肉膏蛋白胨的平板培養基上，將平板分成四份，在一對對角的位置將浸有溶解液的濾紙片貼在平板上，另一對對角的位置將浸有無菌生理鹽水的濾紙片貼在平板上。做三個平行。將平板在37°C下的恒溫培養箱內培養24h。通過觀察并測定抑菌圈的直徑來比較抑菌作用的大小。實驗結果表明，雪菊黃酮片劑溶液的抑制金黃色葡萄球菌生長的作用顯著(P <0.05)。同理，處理黑曲霉。黑曲霉的培養基為馬鈴薯蔗糖培養基。黑曲霉在28°C下培養48h。實驗結果表明，雪菊黃酮片劑溶液的抑制黑曲霉生長的作用顯著(P < 0.05)。因此，本發明制備的雪菊黃酮片劑就有明顯的抑菌作用。
[0043]提純的雪菊黃酮片劑的提高機體免疫力的動物實驗:
大鼠為昆明種大鼠，體重在150_200g,首先采用環磷酰胺(cyclophosphamide , Cy )50mg/kg腹腔給藥，每天I次，連續2天，誘導大鼠免疫低下模型。將IOg雪菊黃酮片劑粉碎溶解20ml水中制成渾濁液，每天給小鼠灌胃20ml的渾濁液，連續灌胃30d，陰性對照組給予去離子水。實驗測定的指標:免疫器官、半數溶血值及PFC的測定:給小鼠腹腔注射2% (v/V)綿羊紅細胞5d后，摘其眼球取血，進行血清半數溶血值的測定，然后處死動物，取胸腺，脾臟稱重，計算臟/體的比值；脾淋巴細胞的轉化實驗:小鼠無菌取脾，制成脾細胞懸液，用RPMI1640完全培養液調整細胞濃度為2 X 1000000個/ml，按照MTT法在570nm波長測定吸光度值，用加ConA孔的吸光度值減去不加ConA孔的吸光度值代表淋巴細胞的增殖能力；腹腔內巨噬細胞吞噬功能的測定:給小鼠腹腔注射2% (v/v)綿羊紅細胞4d后，經腹腔注射給予小鼠2mlHanks液，立即處死動物，輕柔腹部30s，拋開腹壁，暴露腹腔。取腹腔洗液0.25ml滴于載玻片上，與油鏡下對每只動物計數100個巨噬細胞，計算吞噬率和吞噬指數。實驗結果表明:細胞免疫功能、體液免疫功能、單核-巨噬細胞功能三方面結果為陽性。因此本發明制備的雪菊黃酮片劑可以提高機體的免疫功能。
[0044]提純的雪菊黃酮片劑的抗氧化作用:
雪菊黃酮片劑對自由基DPPH、羥基自由基的清除能力，以及雪菊黃酮片劑的還原能力。以Vc作為對照。雪菊黃酮片劑的抗氧化能力與Vc相當，說明雪菊黃酮片劑對自由基DPPH、羥基自由基具有一定的清除能力以及一定的還原能力。實驗結果表明:本發明制備的雪菊黃酮片劑對自由基DPPH、羥基自由基具有明顯的清除能力和還原能力。
[0045]以上闡述本發明中的實施例，并不是對本發明作其它形式上的限制，本專業的人員可以對上述闡述的技術內容進行變更等效實施例。但是只要是沒有脫離本發明技術方案內容，根據本發明的技術實質，只是對以上實例進行簡單修改、等同變化與改型，仍然屬于本發明技術 的保護范圍。
【權利要求】
1.一種提純的雪菊黃酮片劑的制備方法，其特征在于，所述的具體制備方法步驟如下: (1)把干凈雪菊放入粉碎機中粉碎30s過60目的篩子，以質量體積比1:30將雪菊粉加入水，后進行超聲處理，經在55°C，15min, 160W超聲處理后； (2)超聲處理后，加入復合酶酶解，按重量百分比計加入2.5%生物復合酶，在50-55°C的條件下酶解3h，酶解后進行滅酶，滅酶在100°C沸水浴中5min，離心取上清液，得到雪菊黃酮粗提取液； (3)取AB-8大孔樹脂放入上述步驟(2)制備的雪菊黃酮粗提取液中，AB-8大孔樹脂用量與雪菊黃酮提取液的用量按質量體積比1:15混勻，樹脂吸附提取液的有效成分，吸附在搖床上115r/min，37°C，吸附10h，取出大孔樹脂再用70%的乙醇解析洗脫收集洗脫液； (4)將洗脫液濃縮后加入β-環糊精和麥芽糊精，經噴霧干燥，得粉粒，此粉粒是微膠囊的成分，粉粒中加入β -環糊精、麥芽糊精、木糖醇和硬脂酸鎂，通過進行壓片制備獲得雪菊黃酮片劑； (5)β_環糊精和麥芽糊精的用量總質量與濃縮液中的黃酮及有效成分的質量比為2: 3，β -環糊精和麥芽糊精按質量比1:1配比混合，β -環糊精與麥芽糊精的壁材能夠有效的保護提取液的有效成分，混合液經噴霧干燥得到粉粒中加人β -環糊精，麥芽糊精，木糖醇，硬脂酸鎂與粉粒的質量比為7: 3，其中β -環糊精占70%，麥芽糊精占30%，再加入2%的木糖醇，加入1%的硬脂酸鎂。
2.如權利要求1所述一種提純的雪菊黃酮片劑的制備方法，其特征在于，所述的生物復合酶按照纖維素酶、果膠酶和木瓜蛋白酶按照質量比計以2:2:3混合。
3.如權利要求1所述一種提純的雪菊黃酮片劑的制備方法制備的雪菊黃酮片劑，其特征在于，按照重量百分比計，所述的雪菊黃酮片劑含有總黃酮13.8%、β-環糊精53.3%、麥芽糊精26.2%、木糖醇2%、硬脂酸鎂1%、另有3.7%為多糖生物堿蛋白質類物質。
【文檔編號】A61P39/06GK104013659SQ201410249169
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年6月9日 優先權日:2014年6月9日
【發明者】陳安新, 馮彬, 吳旭 申請人:新疆生命核力高科股份有限公司