用于治療神經變性癥狀的人類神經細胞的移植的制作方法

用于治療神經變性癥狀的人類神經細胞的移植的制作方法
【專利摘要】提供了治療神經變性癥狀的方法。可以在神經元變性區域和/或遠離神經元變性區域移植神經干細胞。方法包括從生成與要替換的神經元相對應的特定類型神經元的區域中分離出神經干細胞。方法包括分離出分泌影響特定類型神經元的生長和/或再生的生長因子的神經干細胞。在本發明中，我們公開了通過移植外部培養和擴增的神經祖細胞來治療這類病癥的方法，該病癥包括由于缺乏在神經回路中產生特定神經遞質的細胞而出現的數種神經變性病癥，上述神經祖細胞在移植到神經組織中時分化成能夠以足以制服神經變性相關癥狀的量和方式結合和制造神經遞質的神經元。
【專利說明】用于治療神經變性癥狀的人類神經細胞的移植
[0001] 本申請是申請號為200580039450. 0、發明名稱為"用于治療神經變性癥狀的人類 神經細胞的移植"的申請的分案申請，該母案申請是2005年11月17日提交的PCT申請PCT/ US2005/041631進入中國國家階段的申請。

【技術領域】
[0002] 本發明所公開的方法涉及通過特別有益于這類治療方法的細胞的移植治療病癥 的方法。特別地，所公開的方法提供了用神經干細胞（NSCs)治療神經變性病癥的方法。

【背景技術】
[0003] 神經變性病癥以伴有由疾病、遺傳性癥狀或創傷（例如外傷性或缺血性脊髓或腦 損傷）引起的神經元退化的癥狀為特征。
[0004] 控制肢干骨骼肌收縮的脊髓回路包括激感運動神經元和抑制性GABA能（即生成 GABA的）和甘氨酸能（即生成甘氨酸的）中間神經元。運動神經元是源自脊髓灰質前角的 神經。運動神經元的軸突作為刺激肌肉纖維的傳出運動纖維自脊髓節段中出現。運動神經 元進行的搏動刺激肌肉纖維收縮。GABA，γ-氨基丁酸，是哺乳動物神經系統的天然生成的 代謝物，其充當神經遞質以抑制或壓制電勢的神經傳導。GABA能中間神經元的缺失導致運 動神經元引起的肌肉收縮的抑制性調節異常（dysregulation)。在沒有抑制性中間神經元 對興奮性神經元的控制的情況下，發生興奮性神經元的燒毀，這導致肢干肌肉的痙攣性不 受控收縮或不受控僵硬。運動神經元的缺失導致馳緩性截癱，在該疾病中，患者不能收縮肌 肉并因此不能移動。
[0005] GABA能中間神經元在脊髓中受損的一個例子包括與胸降或胸腹主動脈的暫時阻 斷相關的并發癥。這種阻斷是血管手術中修復胸腹主動脈的動脈瘤所必須的步驟。在阻斷 持續期間，部分脊髓不能獲得血液循環并可能變成缺血性的。根據缺血間隔的持續時間，隨 后的神經變性機能障礙可能神經變性地表現為下肢輕癱或完全形成的痙攣性或馳緩性截 癱。
[0006] 盡管只部分了解引起缺血誘發性神經變性的機制且可能涉及興奮性氨基酸、前列 腺素和/或氧自由基的過度釋放/活性，受暫時缺血性損害影響的脊髓神經元種群是確定 的。例如，從具有完全形成的痙攣性截癱的動物中取出的脊髓的組織病理學分析表現出小 抑制性神經元的選擇性損失；但是，α-神經運動元仍然存在于之前缺血的脊柱節段中。已 經描述了具有脊柱缺血性損傷的人類對象中類似的脊柱神經元病理學。
[0007] 相反，在患有馳緩性截癱的動物中，看出pan-necrotic神經變性變化，這影響了 小的抑制性和興奮性中間神經元以及腹側運動神經元。在脊柱局部缺血后的神經元變性期 間，如同在病灶性或全面腦缺血中那樣，也觀察到局部小神經膠質的損傷依賴型活化和炎 性變化，例如被巨噬細胞浸潤。根據損傷程度，炎性變化通常在缺血性損傷后兩天至七天達 到頂峰，然后在兩周至四周的后缺血性期間表現出炎性成分的逐漸喪失。
[0008] 在過去二三十年，已經作出相當大的努力以在動物模型中評估各種材料的脊柱移 植的治療潛力。因此，已經在數種脊柱損傷（包括機械外傷性損傷、化學損傷的脊髓）的模 型或具有進行性α-運動神經元變性的遺傳控制動物（ALS轉基因小鼠或大鼠）中使用直 接脊柱基因療法改善神經變性機能障礙。
[0009] -般而言，研究證實神經元表型在由胎兒組織，而不是由已經在體外擴增的神經 前體生成的移植物中的長期存活和保存。實際上，體外擴增并移植到機械或化學損傷脊髓 中的神經前體的僅僅有限的神經元分化和成熟已經得到證實。細胞優先分化成非神經元細 胞類型。盡管這種優先的非神經元分化的機制沒有被完全了解，但假設可能涉及促炎細胞 因子（例如TNF a、TGF β )在先前損傷位置的局部釋放。
[0010] 神經變性代表細胞療法的特別具有挑戰性的生物環境，且既定神經變性疾病中存 在的細胞死亡信號（Rothstein等人，1992 ;Howland等人，2002 ;Turner等人，2005)可能與 移植物存活不相容。此外，成人脊髓被視為缺乏允許再生的細胞和/或信號（Park等人， 2002)，且大部分NSC移植研究已經表現出差的或有限的分化（Cao等人，2002 ;Yan等人， 2003 ;Yan 等人，2004)。
[0011] 細胞療法中的主要問題之一是移植的細胞的低細胞存活（低于5% )。迄今所有 移植的細胞在體內注射后不久就產生顯著的細胞死亡。因此，為了輸送有效劑量的細胞，最 終劑量必須以至少20倍注射。這又要求大得多的細胞制造規模，這引起更進一步的規章和 經濟障礙。此外，這類細胞在體內的存活率不能保持。不能證明有效劑量的細胞療法的可 再現施用就不能被政府和其它管理機構（例如食品和藥品管理局）批準使用。
[0012] 當治療神經變性疾病和在大面積的身體、組織或器官（例如整個神經系統）而非 單個局部區域上散布的癥狀時，產生更多挑戰。例如，在ALS中，神經變性涉及沿整個脊髓 的運動神經元以及運動皮層中的那些神經元的緩慢死亡。同樣，在多數溶酶體病中，神經元 破壞牽涉腦和脊髓的多數區域。阿爾茨海默氏癥牽涉大腦的大部分。即使在更局部的神經 變性疾病，例如帕金森癥和亨廷頓氏舞蹈病中，受影響的紋狀體面積也相當大，比手術可以 到達的移植區域大得多。因此，神經變性疾病的細胞療法預計需要更寬的移植程序。
[0013] 因此，需要改進的治療神經變性癥狀的方法。還需要改進的培養和移植動物神經 干細胞和人類神經祖細胞的方法，這類細胞一經移植，就可以克服之前發現的所有限制并 提供功能益處。因此，這種治療神經變性癥狀的方法在體內產生強勁的神經元分化，能夠實 現在各種變性條件下的長期神經元存活和在缺乏發育信號（developmental cues)的成人 組織中成熟成與治療相關的神經元亞種群，并提供比細胞本身的位置寬的治療范圍。


【發明內容】

[0014] 所公開的方法包括治療神經變性癥狀的方法。特別地，所公開的方法包括將已經 體外擴增的NSCs、神經祖細胞或神經前體移植到需要它們的對象體內，從而使這些細胞可 以改善神經變性癥狀。在一個實施方案中，所公開的方法包括確認、分離、擴增并制備要用 于治療神經變性癥狀的供體細胞。可以選擇要移植的供體細胞以對應于對該癥狀、其征候 和/或其效應有作用的單元或其欠缺。
[0015] 所公開的方法的細胞包括在移植時產生足以結合到神經元下部結構中以改善病 狀或癥狀的量的神經元的細胞。在一個實施方案中，所公開的方法包括通過移植從哺乳動 物的中樞神經系統中分離出的并已經在體外擴增的多能神經祖細胞或神經干細胞來治療 神經變性疾病或癥狀。例如，擴增的神經干細胞的移植可用于在患有各種形式脊髓病（伴 有痙攣狀態、僵硬、抽搐、麻痹或任何其它肌肉活動過度的征候）的對象中改進行走功能。
[0016] 治療方法可以包括經由移植向受損神經區域供應適當數量的NSCs，其可以分化成 足量的GABA能神經元和/或甘氨酸能神經元以減弱有缺陷的神經回路，包括活動過度的神 經回路。
[0017] 在一個實施方案中，所公開的方法包括在運動神經元疾病中恢復運動功能。可以 向至少一個神經變性區域，例如神經變性脊髓供應能夠分化成運動神經元的適當數量或治 療有效量的NSCs或神經祖細胞以恢復運動功能。NSCs通過取代變性的神經肌肉接點來發 揮其治療效果。
[0018] 協同地或替代性地，NSCs通過表達和釋放出保護變性組織的神經元以使它們更多 地存活更長時間的營養分子來發揮其治療效果。可以促使NSC源神經元投射到脊神經前根 中并刺激肌肉，其中NSCs參與患有變性運動神經元疾病的患者體內與宿主運動神經元的 廣泛相互聯系。因此，在一個實施方案中，來自人類胎兒脊髓的NSCs可以移植到腰索中，在 此這些細胞可以分化成與宿主神經元形成突觸性接觸并表達和釋放出運動神經元生長因 子的神經元。
[0019] 在一個實施方案中，所公開的方法包括提供神經干細胞或神經祖細胞，它們與宿 主組織結合并為宿主神經元提供一種或多種生長因子以保護它們免受組織中存在的變性 影響。該方法包括在脊髓區域中引入足量的NSCs或神經祖細胞以使NSCs分泌有效量的至 少一種生長因子。
[0020] 在一個實施方案中，所公開的方法包括提供在神經變性癥狀中進行細胞替換的干 細胞的臨床前評測中使用動物模型的方法。
[0021] 在一個實施方案中，所公開的方法包括提高移植的NSCs分化成神經元的效力。該 方法包括使高度富集的NSCs或神經祖細胞以其未分化狀態擴增，從而在移植時，移植物中 足量（例如20% )的細胞選定神經元方向（fate)。
[0022] 在一個實施方案中，所公開的方法包括在不提高要移植的NSCs或神經祖細胞數 量的情況下提高分化細胞的數量。在一個實施方案中，該方法包括以下述方式制備擴增的 供體種群--一經移植，NSCs或神經祖細胞就高達十倍地在體內分裂且不形成腫瘤，由此 有效地提高輸送細胞的總數。
[0023] 所公開的方法的細胞可以分離自或獲自非人類的哺乳動物的胎兒、新生兒、青少 年、成人或死后組織。所公開的方法的細胞可以分離自或獲自中樞神經系統、血液或分化成 神經元的干細胞的任何其它合適來源。細胞也可以獲自胚胎干細胞。例如，在一個實施方 案中，細胞包括從發育中的胎兒脊髓中分離出的神經上皮細胞。在某些例子中，神經前體細 胞可以是從中樞神經系統的特定子區域中分離出的神經祖細胞。
[0024] 根據所公開的方法，神經干細胞在培養時擴增。在一個實施方案中，神經前體細胞 可以是能夠在培養時擴增并能夠在分化時生成神經元和神經膠質的多能NSCs。
[0025] 在移植時，細胞可以是未分化的、在體外預分化或完全分化的。在一個實施方案 中，誘導細胞分化成神經譜系（lineage)。所公開的方法的細胞可以在促炎細胞因子和受損 組織中存在的其它環境因子的存在下就地進行神經元分化。
[0026] 使用本方法，可以通過將細胞移植或引入適合改善疾病、失調或癥狀的區域來處 理神經回路。通常，移植到支持移植細胞存活的神經組織或非神經組織中。在所公開的方 法中使用的NSC移植物在神經變性環境中良好地存活，在此NSCs可以以延緩神經變性癥狀 或疾病的發作和推進的形式發揮有力的臨床作用。
[0027] 在一些情況下，可以移植到身體的邊遠（remote)區域中，且細胞可以遷移到其預 計靶點。相應地，所公開的方法也可以包括人類NSCs的部分移植。本文所用的術語"部分 移植"是指在部分神經變性區域中移植擴增的NSCs。例如，將人類NSCs部分移植到脊髓的 腰段中。NSCs對變性運動神經元的至少部分作用包括將神經營養素和營養細胞因子經由典 型細胞機制輸送到變性宿主運動神經元中。為此，使用所公開的方法部分移植到脊髓腰段 中的NSCs在患有運動神經疾病的轉基因動物模型中表現為存活、產生大量神經元分化、促 進運動神經元存活并在移植臨近區域以及遠離移植區域的區域中發揮作用。
[0028] 相應地，所公開的方法提供了治療痙攣狀態、僵硬或肌肉活動過度癥狀的方法。該 方法包括從哺乳動物中分離出至少一個神經干細胞并使神經干細胞體外擴增成擴增種群。 該方法還包括使擴增種群濃縮并將治療有效量的擴增種群引入接受者脊髓的至少一個區 域。至少20%的擴增種群能夠在接受者脊髓中生成神經元。
[0029] 在一個實施方案中，癥狀源自外傷性脊髓損傷、缺血性脊髓損傷、外傷性腦損傷、 中風、多發性硬化、大腦性麻痹、癲癇、亨廷頓氏舞蹈癥、肌萎縮性脊髓側索硬化癥、慢性局 部缺血、遺傳性癥狀、或它們的任意組合。
[0030] 在一個實施方案中，從選自中樞神經系統、外周神經系統、骨髓、周圍血液和臍帶 血中分離出神經干細胞。
[0031] 在一個實施方案中，哺乳動物是發育中的非人類的哺乳動物（developing mammal)〇
[0032] 在一個實施方案中，發育中的非人類的哺乳動物的胎齡為大約6. 5至大約20周。
[0033] 在一個實施方案中，從人類胎兒脊髓中分離出神經干細胞。
[0034] 在一個實施方案中，擴增神經干細胞包括在不存在血清的情況下培養神經干細 胞。
[0035] 在一個實施方案中，擴增神經干細胞包括使神經干細胞接觸至少一種生長因子。
[0036] 在一個實施方案中，生長因子選自bFGF、EGF、TGF- a、aFGF和它們的組合。
[0037] 在一個實施方案中，治療有效量的擴增種群能夠在體內生成至少1000個GABA能 神經元。
[0038] 在一個實施方案中，治療有效量的擴增種群能夠在體內生成至少1000個甘氨酸 能神經元。
[0039] 在一個實施方案中，至少40 %的擴增種群能夠在脊髓中生成神經元。
[0040] 在一個實施方案中，引入治療有效量的擴增種群包括將治療有效量的至少一部分 注入接受者脊髓的多個區域。
[0041] 在一個實施方案中，至少30 %的擴增種群能夠在體外分化成神經元。
[0042] 在另一實施方案中，提供神經干細胞。該神經干細胞能夠治療痙攣狀態、僵硬和肌 肉活動過度癥狀。該神經干細胞分離自哺乳動物中并在體外擴增成擴增種群。將包括該神 經干細胞的擴增種群濃縮，并將治療有效量的擴增種群引入接受者脊髓的至少一個區域。 至少20%的擴增種群能夠在接受者脊髓中生成神經元。
[0043] 在所公開的方法的另一實施方案中，提供了治療慢性疼痛的方法。該方法包括從 哺乳動物中分離出至少一個神經干細胞并將神經干細胞體外擴增成擴增種群。該方法還包 括使擴增種群濃縮并將治療有效量的擴增種群引入接受者脊髓的至少一個區域。至少20% 的擴增種群能夠在接受者脊髓中生成神經元。
[0044] 在一個實施方案中，慢性疼痛源自外傷性脊髓損傷、缺血性脊髓損傷、外傷性腦損 傷、中風、多發性硬化、大腦性麻痹、癲癇、亨廷頓氏舞蹈癥、肌萎縮性脊髓側索硬化癥、慢性 局部缺血、遺傳性癥狀、或它們的任意組合。
[0045] 在一個實施方案中，治療有效量的擴增種群能夠生成至少1000個GABA能神經元。
[0046] 在一個實施方案中，治療有效量的擴增種群能夠生成至少1000個甘氨酸能神經 J Li 〇
[0047] 在一個實施方案中，至少40 %的擴增種群能夠在脊髓中生成神經元。
[0048] 在一個實施方案中，引入治療有效量的擴增種群包括將治療有效量的至少一部分 注入接受者脊髓的多個區域。
[0049] 在一個實施方案中，這些區域包括背角。
[0050] 在一個實施方案中，這些區域包括鞘內空間。
[0051] 在進一步實施方案中，提供神經干細胞。該神經干細胞能夠治療慢性疼痛。該神 經干細胞分離自哺乳動物中并在體外擴增成擴增種群。將包括該神經干細胞的擴增種群濃 縮，并將治療有效量的擴增種群引入接受者脊髓的至少一個區域。至少20%的擴增種群能 夠在接受者脊髓中生成神經元。
[0052] 在所公開的方法的另一實施方案中，提供了治療運動神經元變性的方法。該方法 包括從哺乳動物中分離出至少一個神經干細胞并將神經干細胞體外擴增成擴增種群。該方 法還包括使擴增種群濃縮并將治療有效量的擴增種群引入接受者脊髓的至少一個區域。至 少20%的擴增種群能夠在接受者脊髓中生成神經元。
[0053] 在一個實施方案中，運動神經元變性源自外傷性脊髓損傷、缺血性脊髓損傷、外傷 性腦損傷、中風、多發性硬化、大腦性麻痹、癲癇、亨廷頓氏舞蹈癥、肌萎縮性脊髓側索硬化 癥、慢性局部缺血、遺傳性癥狀、或它們的任意組合。
[0054] 在一個實施方案中，該方法包括從富含至少一種神經元亞型的區域中分離出神經 干細胞，其中該神經元亞型產生能夠有效改善運動缺陷的生長因子。
[0055] 在一個實施方案中，擴增種群包括一定量的能夠分化成足以分泌治療有效量的至 少一種生長因子的神經元的神經干細胞。
[0056] 在一個實施方案中，該方法包括從富含運動神經元的區域中分離出神經干細胞。
[0057] 在進一步實施方案中，提供能夠治療脊髓空洞癥的神經干細胞。該神經干細胞分 離自哺乳動物并在體外擴增成擴增種群。將包括該神經干細胞的擴增種群濃縮，并將治療 有效量的擴增種群引入接受者脊髓的至少一個區域。至少20%的擴增種群能夠在接受者脊 髓中生成神經元。
[0058] 在所公開的方法的另一實施方案中，提供了治療脊髓空洞癥的方法。該方法包括 從哺乳動物中分離出至少一個神經干細胞并使神經干細胞在體外擴增成擴增種群。該方法 還包括使擴增種群濃縮并將治療有效量的擴增種群引入接受者脊髓的脊髓空洞。至少20% 的擴增種群能夠在接受者脊髓的脊髓空洞中生成神經元。
[0059] 在一個實施方案中，脊髓空洞癥源自外傷性脊髓損傷、缺血性脊髓損傷、外傷性腦 損傷、中風、多發性硬化、大腦性麻痹、癲癇、亨廷頓氏舞蹈癥、肌萎縮性脊髓側索硬化癥、慢 性局部缺血、遺傳性癥狀、或它們的任意組合。
[0060] 在一個實施方案中，該方法包括從富含至少一種神經元亞型的區域中分離出神經 干細胞，其中該神經元亞型產生能夠有效改善脊髓空洞癥的生長因子。
[0061] 在一個實施方案中，包括從富含運動神經元的區域中分離出神經干細胞。
[0062] 在一個實施方案中，擴增種群包括一定量的能夠分化成足以分泌治療有效量的至 少一種生長因子的神經元的神經干細胞。
[0063] 在一個實施方案中，治療有效量的擴增種群能夠生成至少1，000個神經元。
[0064] 在一個實施方案中，將擴增種群的至少100, 000個神經干細胞引入接受者脊髓的 脊髓空洞中。
[0065] 在再一實施方案中，提供能夠治療脊髓空洞癥的神經干細胞。該神經干細胞分離 自哺乳動物并在體外擴增成擴增種群。將包括該干細胞的擴增種群濃縮，并將治療有效量 的擴增種群引入接受者脊髓的脊髓空洞。至少20%的擴增種群能夠在接受者脊髓的脊髓空 洞中生成神經元。
[0066] 在所公開的方法的再一實施方案中，提供了將至少一個神經干細胞擴增成神經干 細胞的擴增種群的方法。每次神經干細胞擴增在不分化的情況下超過30次細胞倍增。該 方法包括從中樞神經系統組織中離解神經干細胞并向培養皿提供至少一種細胞外蛋白質。 細胞外蛋白質包括至少大約10微克/毫升的聚-D-賴氨酸和大約1毫克/毫升纖連蛋白。 該方法還包括在培養皿中在不存在血清的情況下培養離解的神經干細胞并在培養皿中添 加至少一種生長因子。生長因子選自bFGF、EGF、TGF-α、 aFGF和它們的組合。該方法進一 步包括使培養的細胞在匯合之前傳代（passaging)。
[0067] 在一個實施方案中，擴增的神經干細胞能夠分化成神經元。
[0068] 在一個實施方案中，將神經干細胞擴增包括將纖連蛋白作為可溶因子添加到培養 基中。
[0069] 在一個實施方案中，離解細胞并使細胞傳代包括酶促離解。
[0070] 在一個實施方案中，酶促離解包括用胰蛋白酶處理細胞。
[0071] 在一個實施方案中，將治療有效量的擴增種群引入接受者神經系統的至少一個區 域中以治療神經變性癥狀。
[0072] 因此，所公開的方法優于現有藥理學方案的優點是提供促進移植的NSCs分泌營 養分子的能力的方法，這些營養分子可以在最佳生物利用率的條件下輸送到變性運動神經 元中。
[0073] 所公開的方法的再一優點包括提供實現NSCs種群的更高比例的神經元分化的方 法。
[0074] 所公開的方法的再一優點包括實現來自NSCs的部分移植的臨床作用。
[0075] 在本發明和附圖的下列詳述中描述并容易看出所公開的方法的其它特征和優點。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0076] 圖1.人類脊柱干細胞的擴增。從7-8周大的死后胎兒脊髓組織中分離出人類脊 柱祖細胞（a. k. a. NSC)系，并連續傳代大約130天的純培養期。在每次傳代時，將收取時回 收的細胞數除以平板接種時的初始細胞數以獲得細胞數的增加倍數。將每次傳代時增加的 倍數相乘，由此獲得累積增加倍數（左Y軸）。將細胞數量的增加倍數除以每一培養期（X 軸），由此計算每次傳代時的細胞倍增次數（右Y軸）。將該方法重復三次（連續擴增1、2 和3)。
[0077] 圖2.擴增的人類脊柱干細胞的形態。（A)固定的未染色擴增培養物的相襯圖，20x 物鏡，（B)抗巢蛋白（anti-nestin)抗體染色。
[0078] 圖3.獲自擴增的人類脊柱干細胞的分化培養物的表征。使第15-16代的擴增細 胞在培養時分化大約14天，固定并用各種神經元特異性抗體染色。（A) Tau和MAP2 ; (B) 3型 β微管蛋白；(C) GABA; (D)乙酰膽堿轉移酶。
[0079] 圖4.人類中腦干細胞的擴增。從7-8周大的死后胎兒中腦組織中分離出人類中 腦祖細胞（a. k. a. NSC)系并連續傳代大約170天的純培養期。在每次傳代時，將收取時回 收的細胞數除以平板接種時的初始細胞數以獲得細胞數的增加倍數。將每次傳代時增加的 倍數相乘，由此獲得累積增加倍數（Y軸）。
[0080] 圖5.擴增的人類中腦干細胞的多巴胺吸收（uptake)活性。活細胞中的多巴胺轉 運體活性（DAT)由中腦干細胞系及其一種無性亞系（其在檢定時分化22或44天）決定。 在存在⑴或不存在（-)DAT抑制劑諾米芬辛（10 μ M)的情況下，用放射性同位素標記的 多巴胺培養細胞。洗滌細胞以去除未并入的多巴胺并溶解在液態閃爍體（scintillation cocktail)中。然后使用閃爍計數器測定總細胞放射性（dpm)。
[0081] 圖6.外因對人類中腦干細胞系的神經元分化和多巴胺能分化的影響。將來自兩 個人類中腦干細胞系（527RMB和796RMB)的冷藏神經干細胞解凍并以40,000個細胞/孔 的密度在存在bFGF的4孔小室載玻片中平板接種，使其增殖6天。隨后，取出細胞并使細 胞再分化8天。細胞根據與塞爾托利細胞條件培養基（SCCM，在N2中稀釋1 : 1)接觸的 時機和持續時間分成四組。一組在增殖和分化過程中接觸SCCM(條件1);第二組僅在增 殖過程中接觸（條件2);第三組僅在分化過程中接觸（條件3);第四組不接觸SCCM(對照 物，Cont.)。每隔一天改變培養基，并在增殖階段每天添加促細胞分裂劑。每種條件維持 四個孔以允許對多個標記物進行染色。在分化時，將細胞使用4%低聚甲醛固定，并使用抗 MAP2ab (圖6A)和酪氨酸羥化酶（圖6B)的抗體以及GFAP和Gale免疫染色。使用40x物 鏡計數免疫染色細胞，且每個孔計數至少三個視場。在分析保持在任何條件下的細胞時都 幾乎或完全沒有檢測到GFAP+或GalC+，因此從分析中排除這些抗原。
[0082] 圖7.人類脊柱干細胞移植引起的大鼠痙攣狀態/僵硬和運動缺陷的降低。通過 腰脊髓的缺血性損害制造痙攣大鼠。在一組（black circle)中，用培養時擴增的人脊柱干 細胞（16代）移植大鼠 （η = 9)，而另一對照組（white circle, η = 7)僅接受沒有細胞的 培養基。在研究持續期間（8周），每天以1毫克/千克向兩組施用免疫抑制劑FK506。每 周一次用ΒΒΒ評分法評估各個動物的運動協調。
[0083] 圖8.人類脊柱干細胞移植引起的大鼠痙攣狀態/僵硬和運動缺陷的降低。通過 腰脊髓的缺血性損害制造痙攣大鼠。在一組（black circle和black squire)中，用培養時 擴增的人脊柱干細胞（16代）移植大鼠 （η = 13)，而另一對照組（filled triangle,η = 6) 僅接受沒有細胞的培養基。在研究持續期間（12周），每天以3毫克/千克向兩組施用免疫 抑制劑FK506。每周一次用BBB評分法評估各個動物的運動協調。
[0084] 圖9.在使用活細胞（L，紅）和死細胞（對照物，C)移植物（藍）的情況下，用臨 床和病理學測量的級數（A-B)以及終點（C-E)分析表示的人類NSC治療對G93AS0D1大鼠 運動神經元疾病嚴重性的作用。
[0085] A-B.圖A是顯示在整個觀察過程中實驗和對照動物之間的顯著區別的 Kaplan-Meier 圖（P = 0· 0003)。圖 B 顯示了兩組之間（P 分別=0· 00168 和 0· 00125)肌 肉衰弱的兩個主要測量標準（BBB和斜面分數）的區別。
[0086] C-E.實驗和對照大鼠中的存活（C)、疾病發作時間（time-to-disease-onset) (D) 和運動神經元數（E)。圖C顯示了兩組之間（P = 0. 0005)顯著的11天壽命差異。圖D顯 示了兩組之間（P = 0. 0001)疾病發作時間顯著的7天差異。圖E顯示了活和死NSC組（P =0. 01)之間腰部隆突中3, 212個細胞的差異。（E)底部的插頁顯示了 128天大的代表性 實驗（上）和對照（下）大鼠之間運動神經元存活的差異；箭頭代表側向運動神經元組。 Size bars :150 微米。

【具體實施方式】
[0087] 所公開的方法涉及治療神經變性癥狀。此外，所公開的方法包括移植到有需要的 對象中的神經干細胞的制備方法。制備移植用的細胞可以包括在體外將特定細胞種群擴增 至足以作為神經變性癥狀的治療方法進行商業應用的程度。在一個實施方案中，變性或受 損神經區域的治療方法包括向該區域供應有效數量的足以改善神經變性癥狀的神經干細 胞。
[0088] 本文所用的神經變性癥狀可以包括伴有神經元的損傷或退化的任何疾病或病 癥或征候或其病因或影響。神經變性癥狀可以包括，但不限于，亞歷山大病、AlpeW s Disease、阿爾茨海默氏癥、肌萎縮側索硬化癥、共濟失調毛細血管擴張、腦白質海綿 狀變性、科凱恩綜合征、皮質基底節變性、克-雅氏病，亨廷頓氏舞蹈病、Kennedy' s Disease、克拉伯病、路易體癡呆、馬查多-約瑟夫病、多發性硬化、帕金森氏病、佩-梅氏 病、Niemann-Pick^ s Disease、原發性側索硬化、Refsum' s Disease、山德霍夫氏病， Schilder' s Disease、Steele-Richardson_01szewski Disease、脊髓瘦與受損神經兀有關 的任何其它癥狀。其它神經變性癥狀可以包括或由外傷性脊髓損傷、缺血性脊髓損傷、中 風、外傷性腦損傷和遺傳性癥狀引起。
[0089] 所公開的方法包括使用NSCs改善神經變性癥狀。本文所用的術語"NSCs"也可以 指神經或神經元祖蛋白，或神經上皮前體。可以根據它們分化成三種主要CNS細胞類型（神 經元、星形細胞和少突膠質細胞）的能力在功能上定義NSCs。
[0090] 在一個實施方案中，NSCs是多能的以使各個細胞具有分化成神經元、星形細胞或 少突膠質細胞的能力。在一個實施方案中，NSCs是雙能的以使各個細胞具有分化成三種 CNS細胞類型中的兩種的能力。在一個實施方案中，NSCs包括在體外生成神經元和星形細 胞的至少雙能細胞并包括在體內生成神經元的至少單能細胞。
[0091] 生長條件可以影響細胞向一種或另一種細胞類型分化的方向，這意味著細胞沒有 被限定為單一譜系。在有利于神經元分化的培養條件中，細胞，特別是來自人類CNS的細胞 大部分對于神經元和星形細胞是雙能的，且極少分化成少突膠質細胞。因此，所公開的方法 的分化細胞培養物可以產生神經元和星形細胞。在一個實施方案中，神經元與星形細胞的 比率可以達到50 : 50比率。
[0092] 所公開的方法包括獲得位于哺乳動物CNS區域（例如神經上皮）中的NSCs。其它 可以分離出NSCs的CNS區域包括CNS的腦心室和subventricular區域和包括有絲分裂前 體以及后有絲分裂神經元的其它CNS區域。在一個實施方案中，所公開的方法可以使用位 于發育中的哺乳動物CNS區域中的NSCs。
[0093] 在一個實施方案中，NSCs獲自對所需神經元種群天然為神經原性的區域。所需細 胞種群可以包括特定神經元表型的細胞，其可以取代或增補在神經病癥狀中缺失或失活的 這類表型。
[0094] 通過從CNS的不同區域并跨越胎兒發育期間的不同胎齡分離出NSCs，可以獲得各 種不同的神經元亞型，包括可用于治療特定神經變性疾病或癥狀的那些。針對最佳擴增和 神經元分化能力，從CNS的不同區域并跨越不同胎齡分離出的NSCs。哺乳動物CNS的標志 之一是神經元亞型的多樣性。單一的NSCs種群可能在培養時自發產生僅僅少數截然不同 的神經元亞型。此外，來自特定胎兒胎齡的細胞可以建立培養的細胞的生理相關性。
[0095] 在所公開的方法的一個實施方案中，要移植到對象中的細胞源自受損神經區域 的人類胎兒對應物。在一個實施方案中，NSCs分離自胎齡大約6. 5至大約20周的人類 胎兒CNS區域。在一個實施方案中，在大約7至大約9周的胎齡分離來自胎兒脊髓的細 胞。應該認識到，可分離神經干細胞種群的比例可以隨供體年齡而變。細胞種群的擴增 能力也可以隨供體年齡而變。NSCs的這類區域和時間特異性表明NSCs起到命運限制性 (fate-restricted)祖細胞而非空白細胞或單一細胞種群的作用。
[0096] 包括GABA能神經元的體外種群的比例通常恒定在大約5-10%。
[0097] 腹側中腦的NSCs與獲自相同妊娠期的脊髓的NSCs不同。特別地，來自腹側中腦 的NSCs只產生表達酪氨酸-羥化酶的多巴胺能神經元，而來自脊髓的NSCs只產生生成乙 酰膽堿的膽堿能神經元。但兩種細胞類型均同時生成更普遍存在的gluamate能和GABA能 神經元。因此，在一個實施方案中，所公開的方法包括從腹側中腦中獲得NSCs以治療通過 表達酪氨酸-羥化酶的多巴胺能神經元的移植至少部分改善或減緩的癥狀。
[0098] 因此，對于運動障礙，例如以多巴胺能神經元缺失為特征的帕金森病的治療，所公 開的方法的一個實施方案包括使用源自腹側中腦之類區域（在此，多巴胺能神經元的神經 發生充足）的NSCs。此外，NSCs可以在人類胎兒發育中多巴胺能神經元的神經發生充足的 胎齡獲得。因此，在一個實施方案中，所公開的方法包括從來自大約7至大約9周胎齡的腹 側中腦中獲得NSCs以治療運動障礙。
[0099] 為了治療由腹側運動神經元缺失引起的運動神經元疾病，例如肌萎縮性脊髓側索 硬化癥或馳緩性截癱，所公開的方法的一個實施方案包括使用源自脊髓之類區域（在此， 腹側運動神經元的神經發生充足）并獲自人類胎兒發育中腹側運動神經元的神經發生充 足的胎齡的NSCs。因此，在一個實施方案中，從大約7至大約9周胎齡的脊髓中分離出NSCs 以治療運動神經元疾病。
[0100] 但是，應該理解的是，在一些情況下，這類區域特異性的限制對于實際用途而言相 當寬。因此，來自脊髓各個區域，例如頸部、胸部、腰部和骶骨節段的NSCs可以互換使用以 移植并治療NSCs相應來源以外的位置。例如，源自頸部脊髓的NSCs可通過將這些細胞移 植到患者腰段中來治療痙攣狀態和/或僵硬。
[0101] 也可以從出生后的和成人的組織中分離出NSCs。源自出生后和成人組織的NSCs 在量上與其分化成神經元和神經膠質的能力以及其生長和分化特征相當。但是，來自各種 出生后和成人CNS的NSCs的體外分離效力遠低于來自胎兒組織的NSCs的分離效力，后者 含有更豐富的NSCs種群。無論如何，與胎兒源NSCs相同，所公開的方法能夠使至少大約 30 %的源自新生兒和成人來源的NSCs體外分化成神經元。因此，出生后和成人組織可如上 文在胎兒源NSCs的情況中所述的那樣使用，但胎兒組織的使用是優選的。
[0102] 可以從在培養中擴增的胚胎干細胞的操作中獲得各種神經元亞型。因此，根據所 公開的方法，可以根據需要從其它不相關或不需要的細胞中分離并提純特定的神經元亞型 以改進結果，并可用于治療相同的神經變性癥狀。
[0103] 所公開的方法中的NSCs可以來自一個位置并作為自體移植物移植到相同對象體 內的另一位置。此外，所公開的方法中的NSCs可以源自遺傳相同的供體并作為同系移植物 移植。再進一步，所公開的方法中的NSCs可以源自遺傳不相同的同種成員，并作為同種異 體移植物移植。或者，NSCs可以獲自非人類來源并作為異種移植物移植。隨著有力的免疫 抑制劑的發展，同種異體移植物和非人類神經前體的異種移植物，例如豬來源的神經前體， 可以移植到人類對象種。
[0104] 樣品組織可以通過任何標準方法離解。在一個實施方案中，組織通過溫和機械研 制使用吸移管和不含二價陽離子的鹽水緩沖液離解以形成離解細胞的懸浮液。需要足以獲 得主要單細胞的離解以避免過高的局部細胞密度。
[0105] 對于NSCs的成功商業應用，保持強勁一致的培養是合意的，其具有通過許多連續 傳代而穩定擴增和分化的能力。如上所述，培養方法可以被優化以實現來自不同區域和CNS 發展期的各個NSCs細胞系的長期穩定擴增，同時保持它們截然不同的祖細胞性質。
[0106] 為此，已經令人驚訝地發現，促進NSCs (NSCs)與底物的粘合有助于加速NSC或祖 細胞的有絲分裂速率，從而提供顯著改進--即更強勁的NSC或祖細胞培養。特別地，除了 避免過高的局部細胞密度和保持促細胞分裂劑濃度外，已經發現，細胞外基質蛋白的濃度 影響NSCs的長期有絲分裂和分化能力。細胞外基質蛋白可以包括聚-D-賴氨酸、聚-L-賴 氨酸、聚-D-鳥氨酸、聚-L-鳥氨酸、纖連蛋白和它們的組合。其它細胞外基質蛋白可以包 括纖連蛋白、核纖層蛋白、膠原蛋白及其組合的各種同種型、片段、重組形式或合成模擬物。 或者或此外，應該認識到，所公開的方法可以包括能夠促進有效細胞粘合的任何其它合適 的物質，從而使各個單獨的細胞在不會毒害細胞或阻礙細胞分裂的情況下在整個培養期間 粘附到培養底物上。
[0107] 盡管細胞外基質蛋白可以有效地促進細胞粘合，但不同的氨基酸聚合物，例如 聚-L/D-鳥氨酸或聚-L/D-賴氨酸可能在某些濃度下對各個細胞系的細胞是毒性的。培養 持續時間也會影響沉積在盤表面上的聚合物的最終量，這影響了細胞的存活力。對于所公 開的方法中使用的NSCs，聚合物的濃度可以在大約0. 1微克/毫升至大約1毫克/毫升的 范圍內。在一個實施方案中，將100微克/毫升聚-D-賴氨酸溶于中性pH值的0. 01M HEPES 緩沖液或水中并施加到培養皿上。將培養皿在室溫培養1小時。然后將培養皿用水充分漂 洗并在使用前干燥。
[0108] 所公開的方法也可以包括用細胞外基質蛋白兩次涂布培養皿。在一個實施方案 中，將培養皿用纖連蛋白或纖連蛋白衍生物處理，然后如上所述施加聚-L/D-鳥氨酸或 聚-L/D-賴氨酸。在一個實施方案中，使用由人類血漿制成的纖連蛋白。但是，應該認識到， 可以使用任何其它合適形式或來源的纖連蛋白，例如豬或牛纖連蛋白、重組纖連蛋白、纖連 蛋白片段、合成肽或纖連蛋白的其它化學模擬物。在一個實施方案中，可以施加大約〇. 1微 克/毫升至大約1毫克/毫升的纖連蛋白。
[0109] 在包括來自人類脊髓的NSCs的擴增的一個實施方案中，用100微克/毫升 聚-D-賴氨酸將培養皿處理足以使細胞外蛋白質粘合到培養皿上并涂布培養皿的時長。該 時長可以為大約5分鐘至大約3小時。然后用水洗滌培養皿。在將培養皿風干后，將培養 皿在室溫下用大約25毫克/毫升纖連蛋白處理大約5分鐘至數小時或在37 °C用大約1毫 克/毫升纖連蛋白處理大約1小時至數天。隨后，取出纖連蛋白并將培養皿洗滌至少一次 或儲存在PBS中直至使用。
[0110] 或者，可以將纖連蛋白作為直接供應給細胞的可溶因子添加到生長培養基中。在 該實施方案中，可以通過在用纖連蛋白處理培養皿之外或代替這種處理在生長培養基中添 加1微克/毫升纖連蛋白來使NSCs擴增。由于涂有纖連蛋白的器皿的相對較短的貯存期 限，在細胞平板接種時將附著蛋白作為可溶因子供應到生長培養基中對于NSCs的商業大 規模培養特別有利。該方法還可用于制造要求相當精確的條件和可再現性（如在cGMP規 程下所要求的那樣）的神經干細胞系和用于制造治療用神經干細胞系。
[0111] 在一個實施方案中，將分離出的NSCs以大約1，000至大約20, 000個細胞/平方 厘米的密度添加到培養皿中。這種密度有利于各個細胞在培養皿中的均勻分布和粘合，避 免細胞的局部密集，來富集NSCs的培養。
[0112] 在一個實施方案中，NSCs在不存在血清的情況下擴增。在一個實施方案中，NSCs 在指定的無血清培養基中培養以避免NSCs暴露在足以使NSC的有絲分裂和分化能力失穩 的血清濃度下。此外，NSCs與某些生長因子，例如白血病抑制因子（LIF)或睫狀神經營養 因子（CNTF)的接觸也會使NSCs失穩并應該避免。
[0113] 可以在培養過程的任何階段向培養物中添加促細胞分裂劑以增強NSCs的生長。 促細胞分裂劑包括堿性成纖維細胞生長因子（bFGF)、酸性成纖維細胞生長因子（aFGF)、表 皮生長因子（EGF)、轉化生長因子-a (TGFa)和它們的組合。
[0114] 所公開的方法的NSCs可以以至少兩種不同的培養形式生長和擴增。一種培養形 式包括被稱作懸浮培養的聚集形式，通常被稱作簇生聚集形式。另一培養形式包括被稱作 粘附培養的分散的非聚集形式。
[0115] 在所公開的方法的NSCs的分散粘附培養中，細胞形成單層，其中各個細胞最初直 接接觸培養底物。最后，在培養周期后，細胞可以零星形成簇，其中在底層上形成至少一層 附加細胞層，即使底層中的細胞單獨粘附到底物上。當培養物以高細胞密度培養或允許達 到高細胞密度時，尤其發生這種簇生，這在一種實施方案中被最小化以實現NSCs或祖細胞 的最佳擴增或NSCs多能能力的最佳保持。在所公開的方法的一個實施方案的分散粘附培 養中，對于每次細胞分裂，能夠使人類NSCs在少于大約4天內分裂。
[0116] 分散粘附培養的另一顯著特征在于，所公開的方法的NSCs分裂以生成各自保持 其多能能力的子細胞。在一個實施方案中，所公開的方法的NSCs的分散粘附培養包括在不 存在顯著分化情況下至少20次細胞倍增的擴增能力。多數NSCs可以在損失其神經原性潛 能之前擴增超過至少50次細胞倍增。在一個實施方案中，在所公開的方法的分散粘附培養 中擴增的NSCs表現出改進的神經元分化，其在一個實施方案中產生至少大約30%的神經 元分化。在許多情況下，至少50%的NSCs分化成神經元。盡管分散粘附形式的培養是更優 選的培養形式，但不同培養方法能夠分離在體外或體內具有不同分化潛能的先天不同的細 胞種群。
[0117] 本發明還能夠在沒有基因變異或飼養細胞并入的情況下從各種來源中無性分離 NSCs。因此，可以在如上制成的細胞培養皿中接種非常低量，優選少于1000個細胞/平方 厘米的細胞。
[0118] 在NSCs接種后的數天，細胞可以形成充分分離的群落。群落生長至所需尺寸，例 如至少大約250至大約2000個細胞。在一個實施方案中，手工選取至少一個細胞群落并單 獨接種到新的細胞培養皿，例如多孔板上。
[0119] 分離的無性系種群可以通過連續傳代擴增并用于建立多個神經干細胞系。已經從 人類CNS的各個區域（包括脊髓、中腦和后腦）中分離出許多這類無性細胞系。無性細胞 系可用于富集特定細胞表型，例如更高比例的神經元亞型。例如，可以用所公開的方法分離 使表達酪氨酸羥化酶的多巴胺能神經元、GABA能神經元、膽堿能神經元和其它特異性表型 的神經元富集的無性細胞系。
[0120] 在一個實施方案中，多克隆或單克隆神經干細胞系可以被誘導以進一步富集神經 元的特定亞型。已經篩選出許多生長因子、化學品和天然物質以從中腦或脊髓的NSCs中識 別特定神經元（例如表達酪氨酸羥化酶的多巴胺能神經元和生成乙酰膽堿的膽堿能神經 元）的有效誘導劑。該因子或化學品或其組合可以在NSCs的有絲分裂階段和/或分化階 段中引入。在一個實施方案中，多巴胺能表型的神經干細胞系作為供體種群進一步富集以 治療帕金森病。
[0121] 可以由具有所需體外分化型式（pattern)的干細胞的分離獲得各種神經元亞型。 體外結果可以在體內基本再現。這意味著干細胞的體內潛在效力可以通過干細胞的體外分 化型式預測。在注入活的出生后對象中時，未分化或預分化狀態的NSCs在很大程度上在體 內產生在體外觀察到的分化型式。因此，在體外產生生成酪氨酸羥化酶的神經元的NSC也 會在體內產生生成酪氨酸羥化酶的神經元。相反，在體外不組成性地產生生成酪氨酸羥化 酶的神經元的NSC也不會在體內產生生成酪氨酸羥化酶的神經元。
[0122] 但是，體外存在的分化信號與體內的相比是有限的。因此相當一部分的分化神經 元可能不表達主要神經遞質表型。在NSCs的有絲分裂階段中或在其分化過程中可以使用 其它信號（例如來自傳入或傳出神經元的信號或模擬這類天然信號的試劑）重構分化表 型。NSCs具有響應體內以及體外存在的信號的能力。因此，一旦移植到缺血性損傷的脊 髓中，脊柱NSCs與在體外相比，生成比例高得多的GABA能神經元。因此，NSCs是可塑的。 NSCs的這種可塑性質是它們的多能性的特征，因此，這種可塑性可用于識別表型誘導劑和 識別可以進一步與NSC種群結合以改變其性質的方向的條件。
[0123] 在一個實施方案中，這種改編程序包括處理來自脊髓組織的NSCs以獲得運動神 經元表型的增強的表達。處理條件包括與各種肌肉細胞或外圍神經系統衍生細胞（例如神 經嵴細胞或神經節的神經元）一起培養NSCs或其分化細胞。也可以用已知在運動神經元 或在脊髓中表達并生成的分子的cocktails處理NSCs以增強運動神經元表型的NSC表達。
[0124] 為了誘導人類中腦的多巴胺能表型的NSC表達，用來自塞爾托利細胞之類細胞或 通過其篩選或組合獲得的任何其它合適的化學品或細胞的分子（例如鋰、GDNF、BDNF、多效 蛋白、促紅細胞生長素、條件培養基）處理NSCs。這種誘導能夠使移植的NSCs在體內表達 并保持多巴胺表能表型。
[0125] 在一個實施方案中，所公開的方法的NSCs可以包括用于移植的預分化細胞。為 了細胞的最大產量和為了程序的簡化，收取主要包含未分化細胞種群的匯合培養物用于移 植。應該認識到，由于提高的細胞密度，也可以存在次要的剛開始自發分化的細胞種群。
[0126] 在一個實施方案中，使NSCs傳代包括從底物中收取或分離細胞。在一個實施方案 中，所公開的方法包括使用至少一種酶從底物中收取或分離細胞。當NSCs的細胞周期時間 短到足以使細胞表面上的促細胞分裂劑受體失活時，就要避免酶處理。但是，人類NSCs的 細胞周期時間比嚙齒動物NSCs長得多，因此人類NSCs對酶處理沒有那么敏感。因此，在所 公開的方法中，使用酶處理收取來自人類的NSCs。盡管人類NSCs可以在酶處理存在下變得 臨時對促細胞分裂劑不起反應，但促細胞分裂劑受體的反復失活會導致NSCs比例的降低。
[0127] 在一個實施方案中，在收取細胞時，通過簡短離心來濃縮細胞。細胞可以進一步在 最終臨床可用溶液（例如鹽水、緩沖鹽水）中洗滌并再懸浮，或者再懸浮在儲存或休眠溶液 (hibernation solution)中。或者，細胞可以再懸浮在冷凍介質，例如加有二甲亞砜的介 質，或任何其它合適的冷凍保護劑中，并冷凍儲存。
[0128] 配制休眠溶液以更長時間保持活細胞的存活力。在一個實施方案中，可以改造儲 存溶液以便將活性細胞在即用制劑中船運到移植手術地點以立即使用。適合將活細胞船運 到遙遠地點的條件還包括可以將大約〇°C至大約20°C的溫度范圍保持至少24小時的保溫 設備。在大約〇°C至大約8°C儲存大約24小時至大約48小時的活細胞能夠移植以治療疾 病或癥狀。
[0129] 在一個實施方案中，在溶液，例如如上所述的臨床上可用的休眠或冷凍溶液中濃 縮細胞。在一個實施方案中，將細胞濃縮至可以與細胞施用時的細胞密度相同或不同的適 當細胞密度。在一個實施方案中，施用時的細胞密度可以為大約1，〇〇〇個細胞/毫升至大 約1，000, 000個細胞/毫升，這取決于諸如注射位置、注射位置的神經變性狀況、產生有益 效果所必須的最小劑量和毒副作用考慮因素之類的因素。在一個實施方案中，所公開的方 法包括以大約5, 000至大約50, 000個細胞/毫升的細胞密度注射細胞。
[0130] 用于使擴增的細胞懸浮以輸送到治療區域的介質體積在此被稱作注射量。注射量 取決于注射位置和組織的變性狀況。更具體地，注射量的下限可以由高細胞密度的粘性懸 浮液的實際液體操作以及細胞的簇生趨勢決定。注射量的上限可以由注射量所施加的避免 損傷宿主組織所必須的壓力限度以及實際手術時間決定。
[0131] 使用已知方法的供體細胞的低細胞存活導致必須將大量細胞輸送到相對較小的 區域上以努力實現有效治療。但是，注射量是施加在宿主組織上的靜水壓力，與高注射量聯 系在一起的長注射時間加劇了手術風險。此外，供體細胞的過量注射導致宿主薄壁組織的 受壓和隨后的損傷。在試圖補償體積限制時，已知方法要求制備高細胞密度的注射用懸浮 液。但是，高細胞密度促進了移植的細胞的緊密簇生并抑制了細胞遷移或擴散，從而使有效 治療不能超出有限區域并損害了無縫結合到宿主組織中。
[0132] 相反，由于通過本公開的方法制成的細胞的改進的體內存活，每次注射需要較少 數量的細胞。實際上，在從注射時間開始六個月后，已經證明存在多達三至四倍的注射細胞 數，這表明使用本公開的方法顯著的量化存活。此外，由于這種量化存活，可以實現所需細 胞劑量的可再現施用。相應地，在一個實施方案中，細胞濃縮至大約1，〇〇〇至大約200, 000 個細胞/毫升的密度。在一個實施方案中，對于有效移植，使用大約5, 000至大約50, 000 個細胞/毫升。在另一實施方案中，使用大約10, 〇〇〇至30, 000個細胞/毫升。在一個實 施方案中，細胞可以以每個注射位置小于大約100毫升的注射量懸浮輸送到治療區域。例 如，在人類對象的神經變性癥狀的治療中，可以沿脊柱束雙側進行多次注射，可以使用每個 注射位置0. 1和大約100暈升的注射量。
[0133] 在所公開的方法中可以使用任何適用于將細胞注入所需區域的器件。在一個實施 方案中，使用能夠隨時間經過以基本恒定的流速輸送亞微升量的注射器。細胞可以通過針 或軟管或任何其它合適的輸送裝置裝載到該器件中。
[0134] 在一個實施方案中，用于治療神經變性癥狀的所需注射位置包括至少一個脊髓區 域。在一個實施方案中，將細胞移植到脊髓的至少一個特定節段或區域中，例如脊髓的頸 部、胸部或腰部區域。在腰部區域中，例如，僅有5對神經根橫穿椎骨的多骨管道，其中每對 神經根在大范圍分布的每一腰部level處離開脊柱。由于脊髓腰部區域中較低的神經根密 度，腰部區域特別適合提供細胞注射的安全位置。在一個實施方案中，細胞在脊髓薄壁組織 的中間區域中移植。
[0135] 在一個實施方案中，細胞在大約5至大約50個位置注射。在一個實施方案中，細 胞在脊髓每側各大約10至大約30個位置注射。至少兩個位置可以相隔大約100微米至大 約5000微米。在一個實施方案中，注射位置之間的距離為大約400至大約600微米。可以 根據在整個脊柱段中生成基本不間斷和鄰接的供體細胞和根據經證實在大鼠或豬之類的 動物模型體內實現大約2-3個月存活的注射平均量來確定注射位置之間的距離。在一個實 施方案中，沿脊髓中線的兩側注射細胞以跨越可用于治療痙攣癥狀/僵硬或運動神經元存 活的至少數個腰段的長度。可以由動物模型中的結果推斷在人體內的確切注射量。
[0136] 在一個實施方案中，注射的目標位置是脊髓的灰質。在灰質內，可以插入針尖，從 而在特定的薄層（lamina)位置沉積NSCs。例如，為了輸送GABA/甘氨酸能神經元以治療痙 攣狀態/僵硬，將NSC輸送到包含薄層V-VII的區域中。或者，可以將NSC輸送到各種脊柱 節段（從頸部到腰部）的灰質的背角中或其附近，以治療神經性疼痛或慢性疼痛。或者，可 以將NSCs輸送到各種脊柱節段（從頸部到腰部）的灰質的腹角中或其附近，以治療運動神 經元疾病，例如ALS。
[0137] 所公開的方法的細胞可以在體內生成大量神經元。當NSC在移植之前沒有明顯 預分化時，NSCs可以在分化之前在體內增殖多達2至4次細胞分裂，由此進一步增加有效 供體細胞的數量。在分化時，神經元分泌特定神經遞質。此外，神經元將生長因子、酶和對 不同癥狀有益的其它蛋白質或物質分泌到體內移植物周圍的環境（mileu)中。因此，因為 移植的細胞在體內生成大量神經元的能力和由于神經變性癥狀可以由包括神經元衍生成 分（element)在內的成分缺失引起或導致這種成分缺失，可以通過所公開的方法治療多種 病癥。因此，通過所公開的方法可以有效地治療由于缺乏這類神經元衍生成分，例如生長因 子、酶和其它蛋白質而患有CNS組織變性的患者。
[0138] 與移植的神經元分泌的生長因子、酶和其它蛋白質或物質響應的癥狀包括遺傳性 溶酶體病，例如 Tay-Sach' s 病、Niemann-Pick' s 病、Batten' s 病、Crabb' s 病、共濟失調 和其它。
[0139] 此外，所公開的治療方法包括移植體外擴增的細胞，其可以替換受損或變性的神 經元，提供對其它神經元的抑制性或刺激性作用和/或釋放出有助于神經元再生的營養因 子。
[0140] -個實施方案包括供應其它運動神經元作為受損或變性神經元的替代物。例如， 所公開的方法包括在脊髓空洞內提供充足的神經下部構造以填充空穴。神經下部構造如果 能夠減緩與由外傷性脊柱損傷、遺傳性癥狀或任何其它病因引起的脊髓空洞癥有關的脊髓 空洞擴大，其就是適當的。應該認識到，提供適當的神經下部構造也有助于緩解變性脊髓引 起的其它并發癥。
[0141] 并非所有NSCs都可治療給定疾病。在不同疾病中受影響的神經元種群的類型可 以不同。因此，治療有效性的NSCs供體種群有助于替換缺失的神經單元。例如，痙攣狀態、 癲癇發作、運動障礙和其它肌肉活動過度障礙的治療可以包括提供治療有效量的能夠分化 成生成GABA或甘氨酸的抑制性神經元的細胞。通過檢查分化的神經元表型，可以在體外評 估NSCs的不同種群。然后不僅在適當的神經遞質表型方面，還在神經元的適當形態、遷移 和其它表型特征方面，使用體外分化型式預測細胞在體內產生適當表型的效力。
[0142] 在一個實施方案中，移植能夠生成與癥狀病因相關性受損或受傷神經元亞型相對 應的神經元亞型的NSCs。例如，對象中激感回路的活動過度可能由遺傳癥狀或神經元損傷 引起--該神經元損傷來自脊髓外傷、胸/胸腹主動脈手術、中風、癲癇、腦外傷、亨廷頓氏 舞蹈癥、膀胱失禁、活動過度的腸運動和由受傷或遺傳性癥狀引起的肌肉的任何其它不受 控收縮。與脊髓不同地，痙攣狀態、癲癇發作或其它活動過度在腦中由于許多不同的病源而 出現。病灶性癲癇被認為起因于缺乏對回路的GABA exerting tonal控制而引起的失調活 動過度。為此，公開的方法包括通過移植體外擴增的NSCs在受影響的區域中提供抑制性神 經遞質，例如GABA或甘氨酸。在痙攣狀態、癲癇發作和其它活動過度的情況下，在體內生成 能夠分化成抑制性神經元，例如GABA能或甘氨酸能神經元的許多NSC以待移植，從而減弱 與痙攣狀態、癲癇發作和其它神經活動過度相關的至少一條活動過度的神經回路。所公開 的方法因此可用于治療癲癇癥和類似的癲癇發作癥狀。
[0143] 所公開的方法還可用于治療由腦缺血引起的局部麻痹、麻痹、痙攣狀態、僵硬或任 何其它運動、表達或認知征候。腦缺血可以由于腦部中風引起或由心臟病發作引起，在此腦 血液循環中斷相當長的時間。因此，其與上述脊髓缺血類似。一些中風患者產生中樞來源 的發作以及其它缺陷，例如記憶喪失、麻痹或局部麻痹。這些來自腦缺血的缺陷也可能由于 海馬狀突起和/或腦區域中抑制性中間神經元的選擇性缺失引起。因此，所公開的方法可 用于治療患有局部麻痹、麻痹、痙攣狀態或其它運動、表達或認知征候的中風患者。
[0144] 在局部麻痹、馳緩性截癱和其它與肌肉收縮控制的損失相關的癥狀（例如由ALS、 外傷性脊髓損傷、缺血性損傷或遺傳性癥狀引起的那些）中，所公開的方法包括提供神經 元移植以發揮充足的營養影響，從而減緩運動神經元的損失。特別地，所公開的方法促進 了移植的NSCs分泌營養分子的能力，這些營養分子可以在最佳生物利用率的條件下輸送 到變性運動神經元中。這類營養分子包括exocitosed超氧化物歧化酶，例如超氧化物歧 化酶（S0D1)、溶酶體酶、和非proteinatious分子，例如細胞生成的抗氧化劑。移植的細胞 分泌的其它營養因子可以包括global細胞源性神經營養因子（GDNF)、腦源性神經營養因 子（BDNF)、血管表皮生長因子（VEGF)、多效蛋白、血管內皮生長因子（VEGF)、促紅細胞生長 素、midkine、胰島素、胰島素樣生長因子1 (IGF-1)、和胰島素樣生長因子2 (IGF-2)或任何 其它有益的營養成分。
[0145] 對所公開的方法治療多種神經變性癥狀的能力有所幫助的另一因素包括NSC分 化細胞沿現有神經元纖維大面積遷移的能力。移植細胞的遷移導致供體神經元和/或神經 膠質的全面分布和結合以及這類細胞分泌的治療成分的全面或分散性供應。
[0146] 細胞的廣泛遷移能夠使關鍵的治療性蛋白質和物質全面和穩定地輸送到有需要 的對象的整個神經系統和體內。由此，所公開的細胞是治療性蛋白質和物質的有效輸送載 體。對于這類輸送目的，所公開的方法包括將細胞移植到神經系統內的各個位置，包括CNS 薄壁組織、心室、硬膜下、鞘內和硬膜外腔、外圍神經系統位置，以及移植到神經系統外的區 域中，例如腸、肌肉、血管內系統和皮下位置。
[0147] 實施例1.人類脊髓神經干細胞/祖細胞的擴增
[0148] 獲得來自大約7-8. 5周胎齡的至少一個供體的脊髓。使用機械研制在不合Ca++ 和Mg++的磷酸鹽緩沖鹽水中離解該脊髓的單一連續組織。然后將所得細胞懸浮液接種到 用聚-L-鳥氨酸或聚-D-賴氨酸和人類纖連蛋白或其它細胞外基質蛋白預涂的組織培養板 中。將組織培養物處理過的板或燒瓶用100微克/毫升聚-D-賴氨酸在室溫培養1小時。 然后將它們用水洗滌三次并干燥。然后將它們用25毫克/毫升在室溫培養5分鐘。有時， 在室溫使用10毫克/毫升纖連蛋白1小時。有時，在37°C使用1毫克/毫升纖連蛋白18小 時。用1種人重組堿性成纖維細胞生長因子（bFGF)補充由N2(DMEM/F12加上胰島素、轉鐵 蛋白、硒、腐胺和孕酮）構成的培養基。在一個實施方案中，可以使用〇. 1納克/毫升-100 納克/毫升的范圍。在一個實施方案中，最好使用10納克/毫升的bFGF。
[0149] 所得初始培養物由后有絲分裂和增殖NSCs以單層形式構成。隨后，在培養大約5 至大約20天后，分裂的巢蛋白陽性NSCs在培養物中超過未分裂的神經元或緩慢分裂的神 經膠質。在這些培養條件下，NSCs選擇性地偏向擴增。通過溫和酶處理，例如使用胰朊酶， 使擴增的NSC種群傳代。將細胞在不含血清或基本不含血清的培養基中培養。盡管細胞可 以忍受低濃度血清，但最好避免使細胞接觸血清，因為血清含有許多促進NSCs的神經膠質 分化的細胞因子，例如LIF和CNTF。由此，在傳代過程中，通過添加特定酶抑制劑，例如胰朊 酶抑制劑而非血清，終止所用的酶。在每次傳代時，計數收取細胞的數量，并將一部分重新 接種以進一步擴增。如圖1中所示，使用本發明的方法，人類NSCs可以在數量上擴增1018 倍，同時保持其生長和分化性能。細胞可以可再現地擴增。如圖1中所示，以細胞的可再現 生長曲線和倍增時間將細胞的連續傳代重復三次。在擴增過程中，幾乎所有細胞都表達巢 蛋白--有絲分裂神經上皮細胞的體內標記物，且不含分化神經元和神經膠質的抗原，例 如3型β微管蛋白和GFAP。該細胞通過免疫染色對PSA-NCAM(committed神經元族蛋白 的一種可能的標記物）、〇4和GalC (少突膠質細胞的標記物）和RC2 (放射神經膠質的標記 物）呈陰性。因此，通過免疫染色測定，NSCs在整個延長的擴增周期內穩定地保持它們的 抗原profile表達。形態和桌蛋白表達的例子分別顯不在圖2A和B中。
[0150] 實施例2.人類脊髓神經干細胞/祖細胞的分化
[0151] 在NSCs擴增過程中的任何時候，通過提取培養物中的促細胞分裂劑，例如bFGF， 可以使培養物分化。NSCs的分化在去除促細胞分裂劑后大約1-3天發生，并表現出獨特 的異源（heterogeneous)細胞形態。到分化大約4-7天，可以通過免疫染色使非特異性抗 原，例如MAP2c、tau和III型β微管蛋白直觀化。到大約12-14天，在整個培養物中明顯 表現出細長的束狀軸突以及亞細胞蛋白質運輸的清楚極化。到大約28天，突觸蛋白，例如 synapsin和synaptophysin，局限到軸突終端，表現為點狀染色。可以提供星形細胞的另一 飼養層以進一步促進神經元的長期成熟。如圖3中所示，人類脊柱NSCs的分化產生神經元 與神經膠質的混合培養物,其中神經元強勁地表達神經元特異性抗原，例如tau、MAP2ab (A) 和3型β微管蛋白（B)，并構成培養物的大約50%。如圖3B中所示，培養物自發生成伸長 數厘米的長的成束的軸突束。如圖3C中所示，相當大比例的神經元是GABA能的。培養物 中也存在膽堿能的運動神經元（圖3D)。培養物中明顯存在GABA神經元預示了人類脊柱 NSCs用于治療由特定回路中GABA生成量的降低引起的各種神經病癥狀的有用性。同樣地， 膽堿能神經元的存在表明人類脊髓NSCs能夠進行運動神經元分化并預示了其用于治療由 運動神經元的逐漸變性引起的各種運動神經元疾病的有用性。對治療而言，使NSC在有或 沒有進一步表型增強狀況的情況下擴增，收取并注入有缺陷的神經區域。
[0152] 實施例3.人類中腦神經干細胞/祖細胞的擴增
[0153] 獲得7-8. 5周胎兒胎齡的一個中腦組織。如實施例1所述獲得來自中腦組織的 NSCs。細胞經過160天純培養期連續傳代，且所得擴增顯示在圖4中。在整個擴增期間，NSCs 穩定地保持其多能性和神經原性潛能以及它們的分化潛能，從而產生多巴胺能神經元。通 過酪氨酸羥化酶（TH)和多巴胺轉運體（DAT)的神經元表達評定多巴胺能神經元。
[0154] DAT表達是多巴胺能神經元的標志。通過測量其穿過培養中的分化神經元的突觸 膜輸送放射性同位素標記的多巴胺的作用，可以評定神經元中的DAT表達。通過放射性同 位素標記的多巴胺吸收（uptake)檢定法，評定DAT在來自分化人類中腦NSCs和單克隆衍 生人類中腦NSCs的培養物中的作用。檢定結果表明了人類中腦NSCs的強勁的功能性多巴 胺能活性。此外，其表明，特別傾向于在分化時產生更高比例多巴胺能神經元的分離出的 NSC單克隆種群可以使多巴胺能表型富集（圖5)。
[0155] 產生富集的多巴胺能神經元的NSCs特別可用于治療帕金森病。類似地，在從用于 特定表型的增強的分化的組織中分離出來時預編程的NSCs可用于分離其它特定的所需神 經元，例如可用于治療阿爾茨海默氏癥的前腦膽堿能神經元、可用于治療神經元疾病（例 如ALS)的脊柱膽堿能神經元、可用于治療抑郁的血清素能神經元、和可用于治療癲癇和亨 廷頓氏舞蹈病的GABA能神經元。
[0156] 實施例4.人類中腦神經干細胞/祖細胞的分化。
[0157] 人類中腦NSCs/祖細胞可以如實施例2中所述分化。在NSCs的有絲分裂過程中或 在其分化過程中，可以通過用含有各種外源因子的培養物處理來增加所需表型的比例。能 夠增加來自人類中腦NSCs的多巴胺能表型的這類因子的例子是如圖6A和6B所示的來自 塞爾托利細胞的條件培養基。
[0158] 在圖6A和6B所示的研究中，將冷藏的神經干細胞解凍并以每孔40, 000個細胞 的密度在存在促細胞分裂劑的4-孔室載玻片中平板接種，并使其增殖6天，此時取出促細 胞分裂劑并使細胞分化8天。細胞根據與塞爾托利細胞條件培養基（SCCM，在N2a中稀釋 1 : 1)接觸的時機和持續時間分裂成四組。一組在增殖和分化期間與SCCM接觸（條件 1);第二組僅在增殖期間接觸（條件2);第三組僅在分化期間接觸（條件3);第四組不接 觸SCCM(對照物或cont.)。每隔一天更換培養基，并在增殖階段每天添加促細胞分裂劑。 每種條件維持四個孔以允許對多個標記物進行染色，并測試三個細胞系：796MB、527MB和 566SC。來自脊髓的566SC細胞不具有可測得的TH陽性神經元，從圖中省略。
[0159] 在分化時，使用4%低聚甲醛固定細胞并使用抗MAP2抗體[AP20無性系（Sigma)， 其識別MAP2ab亞型]、神經元特異性β -微管蛋白[Tujl (Covance)]和酪氨酸輕化酶 (Pel-Freez)以及GFAP(Dako)和GalC(Chemicon)免疫染色。使用40x物鏡計數免疫染色 的細胞，且對于每個孔，計數至少三個視場。在分析保持在任何條件下的細胞時都幾乎或完 全沒有檢測出GFAP+或GalC+細胞，因此這些抗原從分析中排除。此外，566SC細胞在保持 在所述條件下之后太密而不能測定數量，其不包括在最終分析中。
[0160] 分析表明，用外源因子處理可以影響人類中腦NSCs，從而搜尋有用的蛋白質因子 或化學品以進一步富集多巴胺能神經元。由此，可以使用人類NSCs有效篩選新型合成/天 然化學品和蛋白質因子以獲得特別有用的用于治療特定適應癥（例如帕金森氏病）的種 群。
[0161] 實施例5.通過人類脊柱神經干細胞/祖細胞的移植治療大鼠的痙攣狀態和僵硬
[0162] 為了引發暫時脊髓缺血，使用之前在Taira，（1996)中所述的技術。Sprague Dawley(SD)大鼠在氟烷（1. 5% )中麻醉。將2Fr Fogarty 導管穿入左股動脈并經降主 動脈到達左側鎖骨下動脈位置。為了測量主動脈血流阻斷下方的遠端動脈壓力（DBP)，在尾 動脈中插入聚乙烯（PE-50)導管。
[0163] 在用0. 05毫升鹽水充填主動脈內氣囊導管時引發脊髓缺血。通過從插有PE-50 導管的頸動脈中抽取一部分動脈血（10. 5-llcc)，再現主動脈血流阻斷期間的全身低血壓。 用此方法可以引發大約40mm Hg的全身低血壓。血流阻斷的效力表現為在尾動脈中測得的 DBP的立即和持續下降。在引發脊髓缺血大約10分鐘后，使氣囊癟塌，重新輸入從頸動脈中 提取的血液。當動脈血壓穩定（在回流后大約20-30分鐘內），去除動脈管路，并將創口封 閉。
[0164] 在引發脊髓缺血后，以大約2天間隔使用改性21點戶外運動標準（BBB標準）評 定運動功能的恢復。僅選擇BBB分數為0-4的動物進行實驗組的移植研究。
[0165] 在缺血性損害后的大約7-21天，將BBB分數為0-4的痙攣大鼠在室內空氣中用 1.5-2%氟烷麻醉并放在脊柱裝置上。然后進行Thll-L2椎骨的部分椎板切除術。將頂圓 直徑為80至100微米的玻璃毛細管連接到壓控微量注射器上。每次注射時對大鼠注射0. 5 微升含有5, 000、10, 000、15, 000或20, 000個人類神經干細胞/組細胞的細胞懸浮液。每 一大鼠在脊髓各側（左側和右側）上接受總共6-8次注射，它們均勻分布在暴露出的L2-L6 節段之間。注射中心定為中心灰質（薄層V-VII)(與L3位置的脊髓背部表面的距離：1毫 米）。在移植之后，用3% H202和青霉素/鏈霉素混合物清洗并用2層封閉。然后使大鼠 恢復。
[0166] 在脊柱移植之前大約3天，在所有動物中開始用FK_506(Prograf ;Fujisawa ;1毫 克/千克；腹腔內注射）進行免疫抑制治療。在移植之后，動物在整個存活期內每天接受 免疫抑制治療。可以用FK-506有效防止這些移植物的免疫排斥。大鼠存活大約2或7周 (對于每個時間點，η = 5)。
[0167] 在存活期結束時，將大鼠用戊巴比妥（40毫克/千克；腹腔內注射）麻醉并用肝素 化鹽水經心臟灌注1-2分鐘，然后用在0. 1M磷酸鹽緩沖液（PB)中的4%低聚甲醛經心臟灌 注。切開脊髓并在相同的固定劑中在4°C后固定過夜。在后固定之后，將脊髓組織冷藏在分 級蔗糖溶液（10、20和30%)中總共三天。然后切割冷凍的冠狀、縱側或水平切片（10-20微 米）。對于免疫組織化學，將自由浮動切片（30微米）在含有5 %正常羊血清（NGS)，0. 2 % TritonXlOO(TX)的PBS，0. 1Μ(ρΗ = 7.4)中在室溫下放置2小時以阻斷非特異性蛋白質活 性。然后在4°C用各種人類特異性一抗培養過夜。
[0168] 在用一抗培養之后，將切片在PBS中洗滌3遍，并用結合到熒光標記（Alexa488或 594 ;4微升/毫升；Molecular Probes)上的第二羊抗兔或鼠抗體培養。所有阻斷和抗體 制品在0. 1M PBS/0. 2% TX/5% NGS中制造。對于雙標記實驗，同時施用來自不同物種的一 抗，然后施用與不同熒光標記結合的二抗。在對照實驗中，省略一抗。對于普通核染色，將 DAPI (3微升/毫升）添加到最終二抗溶液中。在染色后，將切片在室溫干燥并用Prolong anti-fade 試劑盒（Molecular Probes)覆蓋。
[0169] 使用Leica突光顯微鏡分析載玻片。用Olympus數碼相機捕捉圖象（512X512象 素）并用 Adobe Photoshop5. 5 (Adobe Systems，MountainView，CA)加工。為了證實不同 抗體在雙重染色切片中的共位性，用包括安裝在Nikon顯微鏡（Applied Precision, Inc.) 上的PhotometricsCO)的DeltaVision deconvolution顯微鏡系統捕捉圖象。一般而言， 截取相隔〇. 1或〇. 2微米的六十個光學切面。所用透鏡是2〇X、4〇X和60x(NA1.3)。使用 SoftWorx 軟件（Applied Precision, Inc)在 Silicon Graphics Octane 工作站上將數據組 去卷積和進行分析。
[0170] 使用體視學無偏見和系統的采樣，評估對人類核NUMA抗體呈免疫反應性的 移植神經元的總數。在應用fractionator采樣方案后，使用取自L2-L6脊柱節段 的各個第十預先染色的切片進行體視學量化。使用數值孔徑1. 3的ΙΟΟχ油浸物鏡 通過Leica DMLB顯微鏡獲得光學圖象（1微米厚）。使用與StagePro-control led motorized Z stage (MediaCybernetics) 一起供應的數碼相機（Olympus)和 ImagePro 軟 件（MediaCybernetics)捕捉光學圖象。然后米用 fractionator 公式 N = QX 1/hsf X 1/ asf X 1/ssf計算移植細胞數，其中N是陽性核總數，Q是計數的細胞總數，hsf是height sampling fraction, asf 是 area sampling fraction, ssf 是 slice sampling fraction。
[0171] 為了提供移植人類NSCs在缺血性脊髓中的三維重建視圖，使用取自連續切割的 脊髓的預存圖象。對于三維重建，平均使用大約60-100個連續切片。在第一步驟中，使用 Ellipase軟件打開一堆連續圖象，并使用客戶研發的排列組件（custom developed Align module) (VidiTo，SK)排列。排列方法包括在所有連續脊髓圖象中確定兩個形態參考點（第 一點：中央管的中心；第二點：背角的內側緣），隨后進行所有圖象的電腦加工的排列。為了 確定背角和腹角的邊緣，使用Laminar Mapmodule (Ellipse)在預先排列的圖象堆上畫出線 條。最后，使用3-D構造器（Media Cybernetics)將這堆預先排列和laminar maps標記過 的圖象用于三維重建。
[0172] 人類脊柱NSCs在大鼠星形細胞上培養2至3周，這表現出多數培養物中神經元表 型的時間依賴型成熟和發育。這通過用抗NSE或M0C的人類特異性抗體染色來證實。還識 別出具有充分形成的軸樹的許多神經元。多數（85-90% )NSE陽性神經元是GABA陽性的。 在一些MOC陽性神經元中觀察到在軸突和樹突中的突觸體素表達。
[0173] 觀察到在缺血性損傷后21天移植的細胞的強勁存活。這表現為清楚識別出的對 NUMA、M0C或NSE，所有人類特異性抗體呈免疫反應性的雙側移植物。取自移植脊髓節段的 水平切片的分析顯示出NUMA陽性細胞在各個注射位置之間的清楚遷移。大部分NUMA陽性 細胞表現出共位性以及M0C免疫反應性。
[0174] 用共焦顯微術分析的帶有NUMA和GABA抗體的脊髓切片的雙標記顯露出平均 25-35% GABA陽性細胞。在存活七周的所有移植動物中看到GABA能表型的一致表達。
[0175] 在相同時間點（S卩，移植后七周），用突觸體素和NUMA抗體的雙重染色顯示移植物 內致密的突觸體素陽性網絡。
[0176] NUMA陽性細胞只偶爾表現出與GFAP抗體的共位性。這些細胞通常局限在移植物 外圍。
[0177] NUMA陽性細胞的體視學評測表明在各個移植物中平均75, 460±5, 697個持久介 質細胞。這表明比最初注射的細胞多了平均3-3. 6倍。細胞周期抗原，Ki67,是積極有絲 分裂細胞的標記物。在移植后2或7周時脊髓節段的染色僅在移植后2周時表現出hKi67 免疫反應性。在存活7周時，細胞只偶爾為Ki67陽性的。這些結果表明，移植的人類脊柱 NSCs和它們的后代以等于最初兩周的平均大約三次細胞倍增的數量擴增，其隨后變成后有 機分裂性的并穩定地并入。
[0178] 使用取自用M0C抗體和DAPI染色的40微米厚連續脊髓切片（總數為150-200個 切片）的圖象進行移植的LE-L5區段的體積重建。三維移植物重建顯示出分布在灰質范圍 內的充分識別的rostrocaudally取向M0C陽性移植。如圖7和圖8中所示，移植細胞并用 BBB評分測量恢復運動益處，由此評估人類脊髓NSCs的功能作用。
[0179] 對于在本研究中觀察到的行為恢復程度，我們已經在移植后觀察了三個主要組。 第一，表現出最強勁的恢復和行走能力的動物（BBB < 16)，第二，下肢所有3個關節的積極 運動性表現出改進但不能站立的動物（BBB大約8)，和第三組，沒有表現出任何恢復的動物 (即，無響應者）。盡管對移植的響應性不同的原因尚不清楚，但我們推測，與dysinhibited 初級神經末端和/或α-運動神經元相對的移植位置的差異可能起到一定作用。此外，應 該指出，動物在本研究中僅存活3個月。我們推測，移植后的長期存活和持續身體康復可能 與較高的功能恢復程度相關。無論如何，與治療組相反，在僅注射介質的任何動物中都沒有 觀察到顯著的恢復。
[0180] 實施例6.通過人類脊柱NSCs的移植治療運動神經元疾病
[0181] 所公開的方法的NSCs提供了有力和顯著的臨床和生物學益處。為此，所公開的 方法能夠治療在整個中樞神經系統中散布的癥狀，例如ALS，以及局限在特定區域中的癥 狀，例如上述脊髓缺血。在ALS中，盡管腰索中的移植可能省略節段性運動系統的其它重要 部分，即負責呼吸運動的頸部運動神經元柱，但所公開的在脊髓中移植NSCs的方法促進了 BDNF和⑶NF和其它因子從移植細胞中釋放到CSF中，在此對整個脊髓中的宿主運動神經元 產生更廣的作用。
[0182] 已經令人驚訝地發現，移植到神經變性脊髓環境的腰段的人類NSCs的部分移植 物存活，進行大量的神經元分化并促進運動神經元存活和在移植位置和其它位置發揮作 用。NSCs顯著延緩癥狀的發作并延長S0D1G93A大鼠，人類ALS (肌萎縮性側索硬化癥）模 型的壽命。
[0183] S0D1G93A大鼠代表了尤其積極形式的ALS的神經病理學和臨床癥狀的綜合模 型。[(Nagai等人，2001;H0wland等人，2002)]。來自人類胎兒脊索的NSCs可以移植到 S0D1G93A大鼠和小鼠的腰索中，在此發生神經元的大量分化，且在此分化的神經元隨后與 宿主神經元形成突觸接觸并表達和釋放⑶NF和BDNF。表現出急性運動神經元疾病的大鼠 S0D1G93A模型可用于研究和證實NSCs在疾病中的有益作用。為此，所公開的方法中使用的 NSC移植物在神經變性環境中很好地存活并發揮有力的臨床作用。
[0184] 這些作用至少一部分與這些移植物表達和釋放運動神經元生長因子的能力有關。 因此，所公開的方法的移植NSCs延緩了急性運動神經疾病的發作并將這些動物的壽命延 長了 10天以上，盡管移植方案受限--其被限定至腰部隆突。
[0185] 來自8周胎齡的死后人胎兒的脊髓組織的人類HSCs(NSI_566RSC)在含有成纖 維細胞生長因子（FGF-2)的無血清培養基中擴增大約12-12代，然后移植。用抗人體核 抗原（Hnu)的抗體可靠地追蹤這些細胞的命運（fate) (Johe等人，1996)。使用這些細 胞的所有手術程序均根據 Animal Care and Use Committee of the JohnsHopkins Medical Institution s批準并經此引用并入本文的規程進行，使用氣體麻醉（安氟醚：氧：一氧化 二氮=1 : 33 : 66)和無菌法進行。
[0186] 在顯微鏡引導下，將活和死NSCs移植到放在Kopf脊柱立體定位裝置上的9周 大（220-300克）混合性別S0D1G93A大鼠的腰部隆突（L4&L5)中。死細胞通過在移植之 前反復冷凍和解凍來制備。用經由硅橡膠管連接到10微升Hamilton微量注射器上的 pulled-beveled玻璃微量吸移管，將細胞懸浮液在無菌條件下經由對腹角兩側上的腹角的 大約8次注射（每個注射位置5X10 4NSC，每側四個注射位置）輸送。根據實驗數據（其表 明在未治療的動物或接受環孢菌素的動物中，移植物存活不超過一個月），所有大鼠均接受 FK-506(1毫克/千克，腹腔注射）以防止免疫排斥。
[0187] 每周兩次測試大鼠的運動強度和重量。運動強度試驗包括basso、Beattie和 Bresnahan(BBB)運動評分標準（Basso 等人，1995)，和斜面標準（Rivlin 和 Tator，1977)。 對于BBB分數測試，在戶外測試動物大約4或5分鐘。所有運動性能均根據標準記錄和分 級。對于斜面測試，將大鼠放在斜面氈子上，并將角度調節至使它們的位置穩定大約5秒的 最大角度。然后記錄該角度作為動物的斜面分數。通過MAN0VA然后通過Fisher LSD post hoc試驗分析BBB和斜面分數。疾病發作是指體重開始急劇降低的時點。通過在兩組之間 比較疾病發作時的年齡和死亡年齡（用學生實驗）以及用Kaplan-Meier存活分析然后用 long-rank試驗，分析受移植物類型（活或死細胞移植物）影響的疾病進程。
[0188] 當BBB分數（見下文）低于3時--此時只有一個關節具有運動性或完全沒有運 動性且動物被視為垂死，用灌流固定對大鼠實施安樂死。
[0189] 從用4%中性緩沖低聚甲醛灌注的動物上制備組織。通過在相同固定劑中再浸漬 4小時，進一步固定帶有連接的根部和腰神經的胸-腰脊髓節段。將含有整個移植區域加上 該區段上下1毫米的邊緣的區段冷藏并冷凍以進一步加工。L3-S1根部作為整標本制品單 獨加工或在用玻璃吸移管的熱凝頂端分離支根后進行加工。在橫剖面或矢面將這些區段切 片（35微米）。用雙標記免疫熒光（其在多數情況下將Hnu (-種人特異性標記物）與另一 細胞標記物結合）研究NSC存活和分化，并如Yan等人，2004中所述進行。
[0190] 使用在來自我們的免疫熒光制品的任選高放大率（ΙΟΟχ)視場上計數HNu(+)細 胞以及用HNu和表型標記物雙重標記的細胞總數的非體視學方法研究NSC分化。在每一 動物中，在被移植區域隔開大約1毫米的六個切片中各使用一個視場。HNu(+)與雙重標記 profiles的數量匯集自在每種情況中計數并根據實驗規程分組的所有六個視場。對于每一 治療組（η = 6/組），生成單和雙重標記的細胞的平均數。
[0191] 為了在移植活或死細胞（η = 4)的大鼠中評估運動神經存活，評測在128天大時 犧牲的動物的組織。根據體視學要求在來自每一動物的L3-S1區域中每6個切片進行一次 采樣（Yan等人，2004)，并用如Yan等人，2004中所述的光學fractionator計數α -運動神 經元，其被確定為具有明確的核和大于35微米的體細胞直徑的多級細胞。用學生t試驗分 析移植活細胞與死細胞的動物之間的差別。
[0192] 對于運動神經營養因子的ELISA測定，用25G注射器從氣體麻醉下的動物的第四 室中進行CSF取樣。從1毫米厚的新鮮脊髓切片上橫向切下含有移植位置和與其相鄰的區 域的組織樣品。處理CSF或組織樣品，并如Sheng等人，2003中所述首先測量總蛋白質。在 CSF 和脊髓樣品中使用 E-MAX ImmunoAssay 系統（Promega，Madison，WI)測量⑶NF 和 BDNF 含量。在450納米讀取TMB-色原體吸光度。來自活移植物、與移植物相鄰的區域和死細胞 移植物的樣品之間的濃度差異用one-way AN0VA然后用Tukey's Multiple Comparison post hoc test分析。用學生t試驗分析移植活細胞與死細胞的動物之間的CSF濃度差異。
[0193] 對于運動神經營養因子的免疫印跡法，用分子量標記物使如對于ELISA那樣 制成的來自CSF活脊髓的蛋白質樣品發生電泳，并轉移到硝化纖維素膜上。在含有5% 驢血清的TBS，pH7. 4中阻斷印跡，然后首先在⑶NF和BDNF抗體中（1 : 500;過夜， 4°C)，然后在HRP-linked驢抗羊IgG(對于⑶NF)和抗兔IgG(對于BDNF)中（1 : 200; 如〇1^〇1111111]11111〇1^8631'〇11)(1小時，室溫）培養。所有抗體均在含有5(%驢血清的1133中 稀釋。將印跡用 SuperSignal Chemiluminescent Substrate (Pierce)顯影并曝光到 Kodak-XAR底片（EastmanKodak，Rochester，NY)上。然后去除（strip)印跡并用 β-肌動蛋 白抗體（1 : 500，Sigma)和 HRP-linked 驢抗鼠 IgG(l : 10000，JacksonImmunoResearch) 重新印跡。用 Bio-Rad Quantity One 軟件（Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)分析免 疫反應帶。對每個動物計算帶密度比率（⑶NF活BDNF : β -肌動蛋白），且如在ELISA實驗 中那樣，輸入組平均值進行統計分析。
[0194] 通過用人特異性HNu抗體進行免疫染色，識別移植后22周的SOD 1G93A大鼠的脊 髓中的人NSCs。HNu(+)細胞表現為存活在腹角（A)中，并極大部分被神經元譜系標記物， 例如微管相關性表位TUJ-1染色。通過人類核蛋白（HNu)標記識別人類NSCs，且對于HNu 和對神經前體、神經元和神經膠質細胞特異性的表位，用雙重免疫細胞化學追蹤它們的表 型命運。在S0D1G93A大鼠中實驗的最后，人類NSCs表現出強勁的移植和優異的長期存 活。大部分HNu (+)細胞（70. 4±6. 4% )基于它們的TUJ-1共位性分化成神經元譜系。大 約1/5(19.2±5.6%)!^1^+)細胞與巢蛋白共位且非常少（1.3±0.9%)的!^11(+)細胞為 GFAP陽性。
[0195] 用移植物/宿主細胞的perikaryal標記物和對宿主或移植末端呈選擇性的標 記物測試人類NSCs結合到宿主回路中的能力。將切片進行HNu染色以建立移植物來源， 進行TUJ-1染色以建立神經元分化，以及識別大鼠和小鼠表位而非人類表位的突觸前蛋白 Bassoon(BSN)的單克隆抗體。據發現，大鼠來源的突觸小結接觸到薄壁組織位置的大量 HNu(+)、TUJ-l(+)細胞。
[0196] 在共焦顯微法中，帶有HNU(+)核和TUJ-1 (+)細胞質的NSC源神經元細胞被大鼠 末端接觸。相反，用TUJ-1和人特異性突觸體素染色的制品表現出與宿主神經元，尤其是大 和小運動神經元并置的小突觸小結的致密末端場。大量來自移植物的突觸小結接觸宿主運 動神經元。針對HNu和人NF-70染色的水平切片顯示出大量來自移植物的軸突，移植物留 在左側并優先沿腹索的白質運行。使用具有ChAT免疫反應性的細胞/處理法從腹角中的 白質中描繪出灰質。與移植位置相聯地發現用抗神經絲表位NF70的人特異性抗體標記的 大量軸突，表明許多人類NSCs分化成投射神經元；這些軸突對腹角的白質表現出優選性。
[0197] 移植到S0D1G93A大鼠腹索中的NSC移植物延長了壽命并延緩了運動神經元死亡 和疾病發作和發展。在活細胞（L)和死細胞（對照物，C)移植物的情況下，臨床和病理學 測量的進程分析顯示在圖9中。通過Kaplan-Meier和端點分析，移植活NSCs的動物表現 出顯著提高的存活。Kaplan-Meier圖（圖9A)表明在整個觀察期（P = 0. 0003)實驗和對 照動物之間的顯著區別。BBB戶外和斜面試驗分數的時間圖（圖9B)表明與接受死NSCs的 動物相比，移植活NSCs的動物的肌肉軟弱的發展明顯緩慢。
[0198] 在接受活或死NSCs并在128天大時安樂死的一小組動物中，檢查NSCs對Tg 大鼠的腰部隆突（L3-S1)中運動神經存活的影響。移植死NSCs的動物的平均壽命 為138天，而移植活NSCs的大鼠的平均壽命為149天。因此，在實驗和對照大鼠 （P = 0.0005)之間存在11天的顯著壽命差異。對于接受死細胞的動物，平均疾病發作時間 (time-t〇-disease-〇nset)為115天，而對于移植活NSCs的動物則為122天。在兩組之間 (P = 〇. 0001)觀察到疾病發作時間的7天的顯著差異。
[0199] α -運動神經元的體視學評估數量對于接受活NSCs的動物而言為6, 418,對于移 植死NSCs的大鼠而言為3, 206,即實驗組的腰部隆突中神經元的數量為相同年齡的對照動 物的兩倍之多。在128天大的代表性實驗大鼠和對照大鼠中，在活和死NSC組之間觀察到 在腰部隆突中3, 212個細胞的差異（P = 0. 01)。
[0200] 人類NSCs對變性運動神經提供的神經保護的可能機制包括表達和釋放出兩種 對哺乳動物運動神經元具有典型營養作用的肽，[BDNF和⑶NF] (Henderson等人，1994 ; Koliatsos等人，1993)。測定⑶NF和BDNF在移植S0D1G93A大鼠的脊髓中的表達和釋放。 通過免疫印跡法和ELISA評測脊髓制品和CSF樣品的BDNF和⑶NF。通過ELISA測定移植 活細胞的大鼠（L1和L2)和移植死細胞的動物（C)的薄壁組織和CSF中的GDNF濃度。L1 代表通過移植位置的濃度，而L2反映高或低一節段的組織中的濃度。各組之間的差異是顯 著的，并由L1或L2與C組之間的極大不同引起。
[0201] 通過t試驗，實驗（活細胞，L)和對照（死細胞，C)組之間的CSF濃度差異也是明 顯的。在移植活NSC的動物中，ELSA表現出在移植位置0. 912±0. 050pg/μ g的濃度和在 脊髓中相距一節段的位置0. 819±0. 115pg/y g的濃度。在移植死NSCs的動物中，含移植 物的脊髓節段中的這些濃度為〇. 368±0. 026pg/μ g的濃度。在CSF中，實驗組中⑶NF濃 度為0. 027±0. 012pg/y 1和0. 006±0. 002pg/y 1。這些數據表明⑶NF在脊髓中的表達和 釋放增加三倍，且在帶有活NSCs的動物的CSF中⑶NF分泌增加五倍。
[0202] 免疫印跡法也顯示了移植活NSCs的動物中較高的標準化GDNF濃度。GDNF免疫印 跡法通過檢測16kDa蛋白質證實ELISA的提高狀況。免疫印跡法還表現出在活細胞移植物 中0. 860 ±0. 007和在死細胞移植物中0. 708 ±0. 052的標準化⑶NF密度。
[0203] 測定實驗鼠和對照組的薄壁組織和CSF中BDNF的ELISA染色。ELISA分析表現 出在移植位置（L1)0. 086±0. OHpg/μ g的濃度和在實驗動物中與移植物相距一節段的位 置α2)0.054±0.009ρ8/μ8的濃度。在對照大鼠中，含移植物的節段中的BDNF濃度為 O.OlOiO.OOSpg/yg的濃度。實驗和對照CSF濃度之間的差異明顯。在CSF中，實驗動物 中BDNF濃度為(λ 041±(X 013pg/y 1，在對照物中為(λ 010±(X 008pg/y 1。這些發現表明 BDNF濃度在脊髓中增加八倍且在實驗動物的CSF中增加四倍。同時，ELISA數據表明在移 植活NSCs的動物中，尤其是在CSF中，⑶NF與BDNF相比具有分布更廣的分泌。
[0204] 免疫細胞化學還表明，極大部分的移植HNu(+)細胞表達GDNF。帶有活移植物的動 物中的⑶NF源是移植細胞本身。在HNu (紅色）和⑶NF(綠色）的雙重染色制品中，顯示 出移植NSCs的細胞質內GDNF免疫反應性的充足性。在接受活移植物的動物中，在宿主運 動神經元內類似分泌泡囊的細胞質結構周圍具有強烈的GDNF免疫反應性，
[0205] 用⑶NF和人突觸體素（后者用于標記源自移植物的末端）染色的宿主運動神經 元的共焦顯微術表明⑶NF局限在泡囊結構中而非位于所示宿主運動神經元表面上的源自 移植物的末端中。用人突觸體素抗體（用于標記刺激宿主運動神經元的所有移植物末端） 和GDNF染色的片段表明，在接觸宿主運動神經元的突觸小結中缺乏兩種蛋白質的任何共 位性。
[0206] 帶有活移植物的大鼠表現出起源于移植物并刺激中央管中及其周圍的結構的精 密通路。與接觸宿主運動神經元的末端中不存在GDNF蛋白質的情況相反，極大部分的刺激 中央管的NSC源軸突末端與GDNF免疫反應性共位（co-localize)。在刺激中央管中的室管 膜細胞的源自移植物的末端中，觀察到人類突觸體素和GDNF的廣泛共位。這些解剖學狀況 表明，⑶NF可能經由逆轉運被刺激移植物的宿主運動神經元吸收且不經由跨突觸傳輸而被 輸送到這些神經元上（Rind等人，2005)。
[0207] 移植NCSs對SOD 1G93A大鼠腹角中正在進行的變性過程的明顯抵抗尤為具有發展 前景。在此報道的NSCs的存活和大量分化有利地表明，與含S0D1G93A的運動神經元有關的 炎性/興奮毒性信號傳輸（Rothstein等人，1992 ;Howland等人，2002 ;Turner等人，2005) 對細胞沒有明顯毒性。這種因素本身提高了對使用移植物恢復變性運動神經元疾病中的運 動功能的未來細胞策略的信心。
[0208] 實施例7.通過移植人脊髓神經干細胞/祖細胞治療外傷性脊髓損傷.治療脊髓 空洞癥
[0209] 將擴增的人脊柱干細胞注入免疫抑制的成熟雌性Sprague-Dawley或免疫缺陷的 無胸腺裸鼠中。在移植前1個月，在兩組中均制造 C4-5挫傷。移植物受體（η = 24)在移 植后存活60-150天。人源NSCs形成由神經元、星形細胞和少突膠質細胞構成的大的細胞 聚集體。這些移植物總是完全填充每一損傷。Immature-appearing,NeuN+/人類核+神經 元通常構成供體細胞種群的50 %。這些神經元將人類神經絲+過程輸送通過與移植物位置 相距至少2厘米的灰質核白質。在宿主和移植物神經元附近均注意到強烈的人特異性突觸 體素免疫反應性，且似乎非反應性的GFAP+細胞與供體神經元并置。此外，這些移植物支持 似乎來自宿主來源的TH+和5HT+纖維的生長。這種NSC' s系由此似乎具有有利于脊柱內 灰質修復的類似初生胎兒CNS的質量。
[0210] 應該理解的是，對本文所述的優選實施方案的各種變動和修改是本領域技術人員 顯而易見的。這類變動和修改可以在不背離所公開的方法的精神和范圍且不減損其預期優 點的情況下進行。因此，所附權利要求覆蓋了這類變動和修改。
[0211] 以下內容對應本申請母案的原始權利要求書
[0212] 1.治療痙攣狀態、僵硬或肌肉活動過度癥狀的方法，包括：a)從哺乳動物中分離 出至少一個神經干細胞；b)將所述神經干細胞體外擴增成擴增種群；c)濃縮該擴增種群； 和d)將治療有效量的所述擴增種群引入接受者脊髓的至少一個區域，其中至少20%的擴 增種群能夠在接受者脊髓中生成神經元。
[0213] 2.項1的方法，其中所述癥狀源自外傷性脊髓損傷、缺血性脊髓損傷、外傷性腦損 傷、中風、多發性硬化、大腦性麻痹、癲癇、亨廷頓氏舞蹈癥、肌萎縮性脊髓側索硬化癥、慢性 局部缺血、遺傳性癥狀、或它們的任意組合。
[0214] 3.項1的方法，其中從選自中樞神經系統、外周神經系統、骨髓、周圍血液、臍帶血 和至少一個胚胎的來源中分離出神經干細胞。
[0215] 4.項3的方法，其中所述哺乳動物是發育中的哺乳動物。
[0216] 5.項4的方法，其中所述發育中的哺乳動物的胎齡為大約6. 5至大約20周。
[0217] 6.項4的方法，其中從人類胎兒脊髓中分離出神經干細胞。
[0218] 7.項1的方法，其中擴增神經干細胞包括在不存在血清的情況下培養神經干細 胞。
[0219] 8.項1的方法，其中擴增神經干細胞包括使神經干細胞接觸至少一種生長因子。
[0220] 9.項8的方法，其中生長因子選自bFGF、EGF、TGF- a、aFGF和它們的組合。
[0221] 10.項1的方法，其中治療有效量的擴增種群能夠在體內生成至少1000個GABA能 神經元。
[0222] 11.項1的方法，其中治療有效量的擴增種群能夠在體內生成至少1000個甘氨酸 能神經元。
[0223] 12.項1的方法，其中至少40%的擴增種群能夠在脊髓中生成神經元。
[0224] 13.項1的方法，其中引入治療有效量的擴增種群包括將治療有效量的至少一部 分注入接受者脊髓的多個區域。
[0225] 14.項1的方法，其中至少30%的擴增種群能夠在體外分化成神經元。
[0226] 15.能夠治療痙攣狀態、僵硬和肌肉活動過度癥狀的神經干細胞，其中所述神經干 細胞分離自哺乳動物中并在體外擴增成擴增種群，其中將包括該神經干細胞的所述擴增種 群濃縮，且其中將治療有效量的所述擴增種群引入接受者脊髓的至少一個區域，其中至少 20 %的擴增種群能夠在接受者脊髓中生成神經元。
[0227] 16.治療慢性疼痛的方法，包括：a)從哺乳動物中分離出至少一個神經干細胞；b) 將所述神經干細胞體外擴增成擴增種群；c)濃縮擴增種群；和d)將治療有效量的所述擴增 種群引入接受者脊髓的至少一個區域，其中至少20%的擴增種群能夠在接受者脊髓中生成 神經元。
[0228] 17.項16的方法，其中慢性疼痛源自外傷性脊髓損傷、缺血性脊髓損傷、外傷性腦 損傷、中風、多發性硬化、大腦性麻痹、癲癇、亨廷頓氏舞蹈癥、肌萎縮性脊髓側索硬化癥、慢 性局部缺血、遺傳性癥狀、或它們的任意組合。
[0229] 18.項16的方法，其中從選自中樞神經系統、外周神經系統、骨髓、周圍血液、臍帶 血、至少一個胚胎和它們的任意組合的來源中分離出神經干細胞。
[0230] 19.項18的方法，其中哺乳動物是發育中的哺乳動物。
[0231] 20.項19的方法，其中發育中的哺乳動物的胎齡為大約6. 5至大約20周。
[0232] 21.項19的方法，其中從人類胎兒脊髓中分離出神經干細胞。
[0233] 22.項16的方法，其中擴增神經干細胞包括在不存在血清的情況下培養神經干細 胞。
[0234] 23.項16的方法，其中擴增神經干細胞包括使神經干細胞接觸至少一種生長因 子。
[0235] 24.項23的方法，其中生長因子選自bFGF、EGF、TGF- a、aFGF和它們的組合。
[0236] 25.項16的方法，其中治療有效量的擴增種群能夠生成至少1000個GABA能神經 J Li 〇
[0237] 26.項16的方法，其中治療有效量的擴增種群能夠生成至少1000個甘氨酸能神經 J Li 〇
[0238] 27.項16的方法，其中至少40%的擴增種群能夠在脊髓中生成神經元。
[0239] 28.項16的方法，其中引入治療有效量的擴增種群包括將治療有效量的至少一部 分注入接受者脊髓的多個區域。
[0240] 29.項28的方法，其中這些區域包括背角。
[0241] 30.項28的方法，其中這些區域包括鞘內空間。
[0242] 31.項16的方法，其中至少30%的擴增種群能夠在體外分化成神經元。
[0243] 32.能夠治療慢性疼痛的神經干細胞，其中所述神經干細胞分離自哺乳動物中并 在體外擴增成擴增種群，其中將包括該神經干細胞的所述擴增種群濃縮，并將治療有效量 的所述擴增種群引入接受者脊髓的至少一個區域，其中至少20%的擴增種群能夠在接受者 脊髓中生成神經元。
[0244] 33.治療運動神經元變性的方法，包括：a)從哺乳動物中分離出至少一個神經干 細胞；b)將所述神經干細胞體外擴增成擴增種群；c)濃縮擴增種群；和d)將治療有效量的 所述擴增種群的至少一個神經干細胞引入接受者脊髓的一個區域，其中至少20%的擴增種 群能夠在接受者脊髓中生成神經元。
[0245] 34.項33的方法，其中運動神經元變性源自外傷性脊髓損傷、缺血性脊髓損傷、外 傷性腦損傷、中風、多發性硬化、大腦性麻痹、癲癇、亨廷頓氏舞蹈癥、肌萎縮性脊髓側索硬 化癥、慢性局部缺血、遺傳性癥狀、或它們的任意組合。
[0246] 35.項33的方法，其中從選自中樞神經系統、外周神經系統、骨髓、周圍血液、臍帶 血和至少一個胚胎的來源中分離出神經干細胞。
[0247] 36.項35的方法，其中哺乳動物是發育中的哺乳動物。
[0248] 37.項36的方法，其中發育中的哺乳動物的胎齡為大約6. 5至大約20周。
[0249] 38.項36的方法，其中從人類胎兒脊髓中分離出神經干細胞。
[0250] 39.項33的方法，包括從富含至少一種神經元亞型的區域中分離出神經干細胞， 其中所述神經元亞型產生能夠有效改善運動缺陷的生長因子。
[0251] 40.項33的方法，其中擴增種群包括一定量的能夠分化成足以分泌治療有效量的 至少一種生長因子的神經元的神經干細胞。
[0252] 41.項33的方法，其包括從富含運動神經元的區域中分離出神經干細胞。
[0253] 42.項33的方法，其中擴增神經干細胞包括在不存在血清的情況下培養神經干細 胞。
[0254] 43.項33的方法，其中擴增神經干細胞包括使神經干細胞接觸至少一種生長因 子。
[0255] 44.項43的方法，其中生長因子選自bFGF、EGF、TGF- a、aFGF和它們的組合。
[0256] 45.項33的方法，其中治療有效量的擴增種群能夠生成至少1000個GABA能神經 J Li 〇
[0257] 46.項33的方法，其中治療有效量的擴增種群能夠生成至少1000個甘氨酸能神經 J Li 〇
[0258] 47.項33的方法，其中至少40%的擴增種群能夠在接受者脊髓中生成神經元。
[0259] 48.項33的方法，其中引入治療有效量的擴增種群包括將治療有效量的至少一部 分注入接受者脊髓的多個區域。
[0260] 49.項33的方法，其中至少30%的擴增種群能夠在體外分化成神經元。
[0261] 50.能夠治療運動神經元變性的神經干細胞，其中所述神經干細胞分離自哺乳動 物并在體外擴增成擴增種群，其中將包括該神經干細胞的所述擴增種群濃縮，且其中將治 療有效量的所述擴增種群引入接受者脊髓的至少一個區域，其中至少20%的擴增種群能夠 在接受者脊髓中生成神經元。
[0262] 51.治療脊髓空洞癥的方法，包括：a)從哺乳動物中分離出至少一個神經干細胞； b)將所述神經干細胞體外擴增成擴增種群；c)濃縮該擴增種群；和d)將治療有效量的所 述擴增種群引入接受者脊髓的脊髓空洞，其中至少20%的擴增種群能夠在接受者脊髓的脊 髓空洞中生成神經元。
[0263] 52.項51的方法，其中脊髓空洞癥源自外傷性脊髓損傷、缺血性脊髓損傷、外傷性 腦損傷、中風、多發性硬化、大腦性麻痹、癲癇、亨廷頓氏舞蹈癥、肌萎縮性脊髓側索硬化癥、 慢性局部缺血、遺傳性癥狀、或它們的任意組合。
[0264] 53.項51的方法，其中從選自中樞神經系統、外周神經系統、骨髓、周圍血液、臍帶 血、至少一個胚胎和它們的任意組合的來源中分離出神經干細胞。
[0265] 54.項53的方法，其中哺乳動物是發育中的哺乳動物。
[0266] 55.項54的方法，其中發育中的哺乳動物的胎齡為大約6. 5至大約20周。
[0267] 56.項54的方法，其中從人類胎兒脊髓中分離出神經干細胞。
[0268] 57.項51的方法，其包括從富含至少一種神經元亞型的區域中分離出神經干細 胞，其中所述神經元亞型產生能夠有效改善脊髓空洞癥的生長因子。
[0269] 58.項51的方法，其包括從富含運動神經元的區域中分離出神經干細胞。
[0270] 59.項51的方法，其中擴增神經干細胞包括在不存在血清的情況下培養神經干細 胞。
[0271] 60.項51的方法，其中擴增神經干細胞包括使神經干細胞接觸至少一種生長因 子。
[0272] 61.項60的方法，其中生長因子選自bFGF、EGF、TGF_a、aFGF和它們的組合。
[0273] 62.項51的方法，其中擴增種群包括一定量的能夠分化成足以分泌治療有效量的 至少一種生長因子的神經元的神經干細胞。
[0274] 63.項51的方法，其中治療有效量的擴增種群能夠生成至少1000個神經元。
[0275] 64.項51的方法，其中至少40%的擴增種群能夠在脊髓中生成神經元。
[0276] 65.項51的方法，其中引入治療有效量的擴增種群包括將治療有效量的至少一部 分注入接受者脊髓的多個區域。
[0277] 66.項51的方法，其中至少30%的擴增種群能夠在體外分化成神經元。
[0278] 67.項51的方法，其中將擴增種群的至少100, 000個神經干細胞引入接受者脊髓 的脊髓空洞中。
[0279] 68.能夠治療脊髓空洞癥的神經干細胞，其中所述神經干細胞分離自哺乳動物中 并在體外擴增成擴增種群，其中將包括該神經干細胞的所述擴增種群濃縮，且其中將治療 有效量的所述擴增種群引入接受者脊髓的脊髓空洞，其中至少20%的擴增種群能夠在接受 者脊髓的脊髓空洞中生成神經元。
[0280] 69.將至少一個神經干細胞擴增成神經干細胞的擴增種群的方法，其中每次神經 干細胞擴增在不分化的情況下超過30次細胞倍增，所述方法包括：從中樞神經系統組織中 離解神經干細胞；向培養皿提供至少一種細胞外蛋白質，其中該細胞外蛋白質包括至少大 約10微克/毫升的聚-D-賴氨酸和大約1毫克/毫升纖連蛋白；在所述培養皿中在不存在 血清的情況下培養離解的神經干細胞；在培養皿中添加至少一種選自bFGF、EGF、TGF-α、 aFGF和它們的組合的生長因子；和使培養的細胞在匯合之前傳代。
[0281] 70.項69的方法，其中擴增的神經干細胞能夠分化成神經元。
[0282] 71.項69的方法，其中將所述神經干細胞擴增包括將纖連蛋白作為可溶因子添加 到培養基中。
[0283] 72.項69的方法，其中離解細胞并使細胞傳代包括酶促離解。
[0284] 73.項72的方法，其中酶促離解包括用胰蛋白酶處理細胞。
[0285] 74.項69的方法，其中將治療有效量的所述擴增種群引入接受者神經系統的至少 一個區域中以治療神經變性癥狀。
【權利要求】
1. 分離自哺乳動物的至少一個神經干細胞在制備用于治療痙攣狀態、僵硬或肌肉活動 過度癥狀的藥物中的用途，其中： a) 將所述神經干細胞體外擴增成擴增種群； b) 濃縮該擴增種群；和 c) 治療有效量的所述擴增種群用于引入接受者脊髓的至少一個區域，其中至少20% 的擴增種群能夠在接受者脊髓中生成神經元。
2. 權利要求1的用途，其中所述癥狀源自外傷性脊髓損傷、缺血性脊髓損傷、外傷性腦 損傷、中風、多發性硬化、大腦性麻痹、癲癇、亨廷頓氏舞蹈癥、肌萎縮性脊髓側索硬化癥、慢 性局部缺血、遺傳性癥狀、或它們的任意組合。
3. 權利要求1的用途，其中所述神經干細胞分離自選自中樞神經系統、外周神經系統、 骨髓、周圍血液、臍帶血和至少一個胚胎的來源。
4. 權利要求3的用途，其中所述哺乳動物是發育中的哺乳動物。
5. 權利要求4的用途，其中所述發育中的哺乳動物的胎齡為大約6. 5至大約20周。
6. 權利要求4的用途，其中所述神經干細胞分離自人類胎兒脊髓。
7. 權利要求1的用途，其中擴增神經干細胞包括在不存在血清的情況下培養神經干細 胞。
8. 權利要求1的用途，其中擴增神經干細胞包括使神經干細胞接觸至少一種生長因 子。
9. 權利要求8的用途，其中生長因子選自bFGF、EGF、TGF-a、aFGF和它們的組合。
10. 權利要求1的用途，其中治療有效量的擴增種群能夠在體內生成至少1000個GABA 能神經元。
11. 權利要求1的用途，其中治療有效量的擴增種群能夠在體內生成至少1000個甘氨 酸能神經元。
12. 權利要求1的用途，其中至少40%的擴增種群能夠在脊髓中生成神經元。
13. 權利要求1的用途，其中引入治療有效量的擴增種群包括將治療有效量的至少一 部分注入接受者脊髓的多個區域。
14. 權利要求1的用途，其中至少30%的擴增種群能夠在體外分化成神經元。
15. 分離自哺乳動物的至少一個神經干細胞在制備用于治療慢性疼痛的藥物中的用 途，其中： a) 將所述神經干細胞體外擴增成擴增種群； b) 濃縮擴增種群；和 c) 治療有效量的所述擴增種群用于引入接受者脊髓的至少一個區域，其中至少20% 的擴增種群能夠在接受者脊髓中生成神經元。
16. 權利要求15的用途，其中慢性疼痛源自外傷性脊髓損傷、缺血性脊髓損傷、外傷性 腦損傷、中風、多發性硬化、大腦性麻痹、癲癇、亨廷頓氏舞蹈癥、肌萎縮性脊髓側索硬化癥、 慢性局部缺血、遺傳性癥狀、或它們的任意組合。
17. 權利要求15的用途，其中所述神經干細胞分離自選自中樞神經系統、外周神經系 統、骨髓、周圍血液、臍帶血、至少一個胚胎和它們的任意組合的來源。
18. 權利要求17的用途，其中哺乳動物是發育中的哺乳動物。
19. 權利要求18的用途，其中發育中的哺乳動物的胎齡為大約6. 5至大約20周。
20. 權利要求18的用途，其中所述神經干細胞分離自人類胎兒脊髓。
21. 權利要求15的用途，其中擴增神經干細胞包括在不存在血清的情況下培養神經干 細胞。
22. 權利要求15的用途，其中擴增神經干細胞包括使神經干細胞接觸至少一種生長因 子。
23. 權利要求22的用途，其中生長因子選自bFGF、EGF、TGF-a、aFGF和它們的組合。
24. 權利要求15的用途，其中治療有效量的擴增種群能夠生成至少1000個GABA能神 經元。
25. 權利要求15的用途，其中治療有效量的擴增種群能夠生成至少1000個甘氨酸能神 經元。
26. 權利要求15的用途，其中至少40%的擴增種群能夠在脊髓中生成神經元。
27. 權利要求15的用途，其中引入治療有效量的擴增種群包括將治療有效量的至少一 部分注入接受者脊髓的多個區域。
28. 權利要求27的用途，其中這些區域包括背角。
29. 權利要求27的用途，其中這些區域包括鞘內空間。
30. 權利要求15的用途，其中至少30%的擴增種群能夠在體外分化成神經元。
31. 分離自哺乳動物的至少一個神經干細胞在制備用于治療運動神經元變性的藥物中 的用途，其中： a) 將所述神經干細胞體外擴增成擴增種群； b) 濃縮擴增種群；和 c) 治療有效量的所述擴增種群的至少一個神經干細胞用于引入接受者脊髓的一個區 域，其中至少20%的擴增種群能夠在接受者脊髓中生成神經元。
32. 權利要求31的用途，其中運動神經元變性源自外傷性脊髓損傷、缺血性脊髓損傷、 夕卜傷性腦損傷、中風、多發性硬化、大腦性麻搏、癲癇、亨廷頓氏舞蹈癥、肌萎縮性脊髓側索 硬化癥、慢性局部缺血、遺傳性癥狀、或它們的任意組合。
33. 權利要求31的用途，其中所述神經干細胞分離自選自中樞神經系統、外周神經系 統、骨髓、周圍血液、臍帶血和至少一個胚胎的來源。
34. 權利要求33的用途，其中哺乳動物是發育中的哺乳動物。
35. 權利要求34的用途，其中發育中的哺乳動物的胎齡為大約6. 5至大約20周。
36. 權利要求34的用途，其中所述神經干細胞分離自人類胎兒脊髓。
37. 權利要求31的用途，其中所述神經干細胞分離自富含至少一種神經元亞型的區域 中，其中所述神經元亞型產生能夠有效改善運動缺陷的生長因子。
38. 權利要求31的用途，其中擴增種群包括一定量的能夠分化成足以分泌治療有效量 的至少一種生長因子的神經元的神經干細胞。
39. 權利要求31的用途，其中所述神經干細胞分離自富含運動神經元的區域。
40. 權利要求31的用途，其中擴增神經干細胞包括在不存在血清的情況下培養神經干 細胞。
41. 權利要求31的用途，其中擴增神經干細胞包括使神經干細胞接觸至少一種生長因 子。
42. 權利要求41的用途，其中生長因子選自bFGF、EGF、TGF-a、aFGF和它們的組合。
43. 權利要求31的用途，其中治療有效量的擴增種群能夠生成至少1000個GABA能神 經元。
44. 權利要求31的用途，其中治療有效量的擴增種群能夠生成至少1000個甘氨酸能神 經元。
45. 權利要求31的用途，其中至少40%的擴增種群能夠在接受者脊髓中生成神經元。
46. 權利要求31的用途，其中引入治療有效量的擴增種群包括將治療有效量的至少一 部分注入接受者脊髓的多個區域。
47. 權利要求31的用途，其中至少30%的擴增種群能夠在體外分化成神經元。
48. 分離自哺乳動物的至少一個神經干細胞在制備用于治療脊髓空洞癥的藥物中的用 途，其中： a) 將所述神經干細胞體外擴增成擴增種群； b) 濃縮該擴增種群；和 c) 治療有效量的所述擴增種群用于引入接受者脊髓的脊髓空洞，其中至少20%的擴 增種群能夠在接受者脊髓的脊髓空洞中生成神經元。
49. 權利要求48的用途，其中脊髓空洞癥源自外傷性脊髓損傷、缺血性脊髓損傷、外傷 性腦損傷、中風、多發性硬化、大腦性麻痹、癲癇、亨廷頓氏舞蹈癥、肌萎縮性脊髓側索硬化 癥、慢性局部缺血、遺傳性癥狀、或它們的任意組合。
50. 權利要求48的用途，其中所述神經干細胞分離自選自中樞神經系統、外周神經系 統、骨髓、周圍血液、臍帶血、至少一個胚胎和它們的任意組合的來源。
51. 權利要求50的用途，其中哺乳動物是發育中的哺乳動物。
52. 權利要求51的用途，其中發育中的哺乳動物的胎齡為大約6. 5至大約20周。
53. 權利要求51的用途，其中所述神經干細胞分離自人類胎兒脊髓。
54. 權利要求48的用途，其中所述神經干細胞分離自富含至少一種神經元亞型的區 域，其中所述神經元亞型產生能夠有效改善脊髓空洞癥的生長因子。
55. 權利要求48的用途，其中所述神經干細胞分離自富含運動神經元的區域。
56. 權利要求48的用途，其中擴增神經干細胞包括在不存在血清的情況下培養神經干 細胞。
57. 權利要求48的用途，其中擴增神經干細胞包括使神經干細胞接觸至少一種生長因 子。
58. 權利要求57的用途，其中生長因子選自bFGF、EGF、TGF-a、aFGF和它們的組合。
59. 權利要求48的用途，其中擴增種群包括一定量的能夠分化成足以分泌治療有效量 的至少一種生長因子的神經元的神經干細胞。
60. 權利要求48的用途，其中治療有效量的擴增種群能夠生成至少1000個神經元。
61. 權利要求48的用途，其中至少40%的擴增種群能夠在脊髓中生成神經元。
62. 權利要求48的用途，其中引入治療有效量的擴增種群包括將治療有效量的至少一 部分注入接受者脊髓的多個區域。
63. 權利要求48的用途，其中至少30%的擴增種群能夠在體外分化成神經元。
64.權利要求48的用途，其中擴增種群的至少100, 000個神經干細胞用于引入接受者 脊髓的脊髓空洞中。
【文檔編號】A61P25/02GK104042629SQ201410240718
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2005年11月17日 優先權日:2004年11月17日
【發明者】M·馬莎拉, K·K·喬, T·G·黑茲爾, 垣花修, V·科利亞索斯, 閻軍, P·J·賴爾, M·J·維拉多 申請人:神經干公司