氫分子固態載體在制備抑制肥胖的保健品和藥物中的應用的制作方法
【專利摘要】氫分子固態載體在制備抑制肥胖的保健品和藥物中的應用，其特征在于，氫分子固態載體對膳食結構失衡所致的肥胖發生有抑制作用，所述的氫分子固態載體是以鈣、鎂的碳酸鹽為主占固態物質含量的50％以上，形態為粉末狀、顆粒狀、無定形狀類型的固態形式，該物質溶解或混懸于液體后，可在溶液中釋放出氫分子的物質，溶液中氫的含量為0.1ppm以上且飽和濃度以下，該物質包括但不僅僅是氫化珊瑚鈣；本發明提供了氫分子固態載體在制備抑制肥胖的保健品和藥物中的應用，在正常飲食的情況下攝入氫分子固態載體，通過氫分子固態載體在體內遇水釋放氫分子而靶向不同部位擴散，清除活性氧自由基，緩解氧化損傷而達到的疾病防治目的。
【專利說明】氫分子固態載體在制備抑制肥胖的保健品和藥物中的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物學和醫藥學【技術領域】，特別涉及氫分子固態載體在制備抑制肥胖的保健品和藥物中的應用。
【背景技術】
[0002]肥胖是體內脂肪堆積過多并多伴有血糖，血脂，血壓異常，胰島素抵抗，慢性炎癥的慢性疾病，是動脈粥樣硬化、原發性高血壓、2型糖尿病及脂肪肝病等高發疾病的危險因素。近30年來，肥胖呈全球化流行趨勢，幾乎所有國家居民的平均體重指數都在不斷增加，2008年全球超重和肥胖成人分別高達14.6億和5億，已成為影響全人類健康的重要因素。
[0003]隨著近年人們生活水平的提高和生活習慣的改變，高脂肪高熱量的食物在飲食結構中不斷加大，同時更多的多坐少動，導致肥胖問題不斷凸顯。由于目前對于該問題的致病機理尚未完全明確，缺乏完善有效的治療方法，同時在諸多因素使高脂飲食難以避免的情況下，積極探索有效緩解膳食結構失衡所致的肥胖、脂肪肝病等問題的防治方法具有重要意義。已有大量研究表明當長期高脂飲食導致肥胖，并使肝臟脂肪過載、出現糖脂代謝障礙時，肝臟以及其它器官處于氧化應激、能量代謝障礙狀態而產生的大量活性氧是造成組織細胞的進一步損傷的重要原因。
[0004]氫氣的生物學研究認為氫是一種弱還原劑，可在生物體系內選擇性抑制以羥自由基、過氧化亞硝酸陰離子為代表的破壞性較強的自由基。同時，氫是小分子物質，易于在體內自由擴散，可越過許多藥物無法越過的人體屏障，到達病灶的優點。目前已有的研究表明，以特定的氫分子攝入方式，如富氫水或富氫生理鹽水等，可顯著緩解以氧化損傷為共性的疾病模型的病程進展。
[0005]氫分子固態載體在水中能夠緩慢、穩定釋放氫氣，與普通的氫攝入方法如富氫水、富氫生理鹽水等相比，氫分子固態載體的氫氣緩釋效應優勢明顯。基于富氫液體的氫耗散問題，攝入氫分子固態載體更有利于氫分子到達病灶發揮生理效應。
【發明內容】
[0006]本發明的目的在于提供氫分子固態載體在制備抑制肥胖的保健品和藥物中的應用，在正常飲食的情況下攝入氫分子固態載體，通過氫分子固態載體在體內遇水釋放氫分子而靶向不同部位擴散，清除活性氧自由基，緩解氧化損傷而達到的疾病防治目的。
[0007]為了達到上述目的，本發明所采用的技術方案是:
[0008]氫分子固態載體在制備抑制肥胖的保健品和藥物中的應用，其特征在于，氫分子固態載體對膳食結構失衡所致的肥胖發生有抑制作用，所述的氫分子固態載體是以鈣、鎂的碳酸鹽為主占固態物質含量的50%以上，形態為粉末狀、顆粒狀、無定形狀類型的固態形式，該物質溶解或混懸于液體后，可在溶液中釋放出氫分子的物質，溶液中氫的含量為
0.1ppm以上且飽和濃度以下，該物質包括但不僅僅是氫化珊瑚鈣。
[0009] 氫分子固態載體對肥胖發生的抑制作用的有效攝入濃度范圍為每天每公斤體重10-50毫克。
[0010]氫分子固態載體能夠有效改善肥胖發生過程中的體重增加。
[0011 ] 氫分子固態載體能夠有效改善肥胖發生過程中的脂肪積累。
[0012]氫分子固態載體能夠有效改善肥胖發生過程中的脂代謝紊亂的產生。
[0013]氫分子固態載體能夠有效改善肥胖發生過程中的肝臟脂肪變的產生。
[0014]氫分子固態載體能夠有效改善肥胖發生過程中的脂肪性肝炎的產生。
[0015]氫分子固態載體能夠有效降低血液中甘油三酯含量。
[0016]氫分子固態載體能夠有效降低肝臟中的甘油三酯和自由脂肪酸的含量。
[0017]氫分子固態載體能夠有效降低肝臟中的炎性因子，如腫瘤壞死因子，白介素-6和單核細胞趨化蛋白-1的含量。
[0018]本發明的主要優點在于:1、首次研究出氫分子固態載體在防治肥胖發生的保健食品和藥物中應用。2、氫為小分子物質，相比其它抗氧化物質或藥物，更易于透過細胞膜結構、清除自由基而緩解病理進展。
【專利附圖】
【附圖說明】 [0019]圖1是氫化珊瑚鈣對高脂飲食誘導的體重增加的抑制作用。其中:橫坐標為氫化珊瑚鈣的攝入濃度，縱坐標為大鼠的體重。
[0020]圖2是氫化珊瑚鈣對高脂飲食誘導的附睪脂肪和腎周脂肪組織增加的抑制作用，圖2A是對附睪脂肪的抑制作用，圖2B是對腎周脂肪的抑制作用。其中:橫坐標為氫化珊瑚鈣的攝入濃度，縱坐標為大鼠脂肪組織的重量。
[0021]圖3是氫化珊瑚鈣對高脂飲食誘導的血清中甘油三酯含量上升的抑制作用。其中:橫坐標為氫化珊瑚鈣的攝入濃度，縱坐標為血清中甘油三酯的含量。
[0022]圖4是氫化珊瑚鈣對高脂飲食誘導的肝臟中甘油三酯含量上升的抑制作用。其中:橫坐標為氫化珊瑚鈣的攝入濃度，縱坐標為肝臟中甘油三酯的含量。
[0023]圖5是氫化珊瑚鈣對高脂飲食誘導的肝臟中自由脂肪酸含量上升的抑制作用。其中:橫坐標為氫化珊瑚鈣的攝入濃度，縱坐標為肝臟中自由脂肪酸的含量。
[0024]圖6是氫化珊瑚鈣對高脂飲食誘導的肝臟中炎癥因子的抑制作用。圖6A是對腫瘤壞死因子的抑制作用，圖6B是對白介素-6的抑制作用，圖6C是對單核細胞趨化蛋白-1的抑制作用。其中:橫坐標為氫化珊瑚鈣的攝入濃度，縱坐標為肝臟中炎癥因子的含量。
【具體實施方式】
[0025]下面結合附圖及【具體實施方式】對本發明做詳細闡述。
[0026]1.實驗材料
[0027]氫化珊瑚鈣(coral calcium hydride, CCH)從上海全人生物科技有限公司購買；腫瘤壞死因子，白介素-6酶聯免疫吸附測定試劑盒，甘油三酯，自由脂肪酸測定試劑盒從南京建成生物工程研究所購買；TRIzol試劑從Invitrogen公司購買；RNA逆轉錄試劑盒，SYBR熒光染料從大連寶生物公司購買。RNA引物序列從北京奧科鼎盛生物科技有限公司訂購合成。
[0028]2.實驗動物飼養及模型建立[0029]SD雄性大鼠是從上海斯萊克動物有限責任公司購買。大鼠飼養在可控溫度(22度到28度)和濕度(60%)的房間內，房間的燈光維持在12小時白天、12小時黑夜的循環中，在實驗進行中大鼠能夠自由進食和進水。實驗大鼠一共分為四組，每組12只。四組分別為:(1)正常飲食組；(2)高脂飲食組(3)高脂飲食組同時每天灌胃10mg/kg的氫化珊瑚鈣；(4)高脂飲食組同時每天灌胃50mg/kg的氫化珊瑚鈣。實驗周期為3個月。
[0030]3.實驗方法
[0031]甘油三酯檢測
[0032]血清和肝臟的甘油三酯水平均采用商業甘油三酯檢測試劑盒并按檢測說明書進行測定。
[0033]自由脂肪酸檢測
[0034]采用商業自由脂肪酸檢測試劑盒并按檢測說明書進行測定。
[0035]炎癥因子檢測
[0036]采用逆轉錄RNA-實時熒光定量PCR的方法進行檢測。具體方法如下:
[0037]RNA 提取
[0038]取50mg組織加入ImL of TRIzol試劑，用組織采用超聲破碎，將破碎好的物質放入離心管中，12，OOOg, 40C，離心10分鐘。留上清，棄去沉淀。加入200ul氯仿(1/5總體積)抽提蛋白，劇烈混勻15秒，室溫放置15分鐘后，12，000g，4°C，離心10分鐘。將上層水相轉移至另一 Ep管中，加入等體積異丙醇，混勻后_20°C放置Ih后，12，OOOg, 4°C，離心10分鐘,棄上清。加入ImL預冷的75%乙醇,顛倒混勻，7500rpm, 4°C,離心5分鐘。棄上清，超凈工作臺放置30min，使乙醇揮發完全揮發掉，溶于50ul DEPC水中。用紫外分光光度計檢測測定其濃度，用于反轉錄。
[0039]RNA反轉錄
[0040]轉錄體積為25ul，取出2ug RNA，加入隨機引物0.5ug，置于70°C，5分鐘，破壞其二級結構。之后立即置于冰上，避免二級結構恢復。加入3ul dNTPlOmM，5ul反轉錄緩沖液(M-MLV5X React1n Buffer)，200 單位反轉錄酶(M-MLVRT)，用 DEPC 水補充至 25ul 體積，37°C孵育60分鐘。置于_20°C備用。
[0041 ]實時熒光定量 PCR (Real-time PCR)
[0042]用SYBR Green法進行，反應體系包括Iul cDNA，
5ul 2X SYBR_? Premix ExTaqra 11,0.5ul上下游引物混合液(1uM),加滅菌水至
1ul0反應條件依照說明書，95°C解鏈lOmin，進行40個循環PCR(每個循環包括95°C 30s，55°C 30s, 72°C 20s)，最后觀測融解曲線(95°C 15s，60°C 15s，95°C 15s)。a-tubulin 作為內參，實驗所用的引物序列為:腫瘤壞死因子，forward:5’ -TCGTAGCAAACCACCAAGCA-3’
[0043]reverse:5’ -CCCTTGAAGAGAACCTGGGAGTA-3，；白介素 _6，forward:5’ -TCCTACCCCAACTTCCAATGCTC-3’ reverse:5’ -TTGGATGGTCTTGGTCCTTAGCC-3’ ；單核細胞趨化蛋白-1，forward:5’ -ATGCAGGTCTCTGTCACGCT-3’ reverse:5’ -GGTGCTGAAGTCCTTAGGGT-3’ ；
[0044]a -tubulin, forward:5' - TGCTGCCATTGCCACCATCA-3’ reverse:5’ -CTCACCCTCACCCTCCACCG-3，。
[0045]統計分析
[0046]結果以Mean土S.E.M形式表示，統計結果代表9只大鼠的統計結果；數據分析使用One Way-ANOVA 分析方法，顯著統計學意義為 *ρ〈0.05, **ρ〈0.01, ***ρ〈0.001。
[0047]實施例一
[0048]氫化珊瑚鈣對高脂飲食誘導的體重增加的抑制作用。
[0049]分別在實驗開始前和結束后測量大鼠的體重，使用實驗結束后的大鼠體重減掉實驗開始時的體重，得出三個月大鼠增加的體重。圖1顯示高脂飲食誘導了體重的顯著增加，攝入氫化珊瑚鈣能夠有效抑制大鼠體重的增加。
[0050]實施例二
[0051]氫化珊瑚鈣對高脂飲食誘導的附睪脂肪和腎周脂肪組織增加的抑制作用。
[0052]實驗結束后，處死大鼠，取出附睪脂肪及腎周脂肪并稱重，圖2Α和圖2Β分別顯示附睪脂肪和腎周脂肪大量的積累，而氫化珊瑚鈣的攝入能夠有效降低脂肪的積累。
[0053]實施例三
[0054]氫化珊瑚鈣對高脂飲食誘導的脂代謝紊亂的抑制作用。
[0055]圖3顯示高脂飲食誘導血液中甘油三酯含量明顯上升，而氫化珊瑚鈣的攝入能夠有效降低甘油三酯的含量。
[0056]實施例四
[0057]氫化珊瑚鈣對高脂飲食誘導的肝臟脂肪變的抑制作用。
[0058]圖4顯示高脂飲食誘導肝臟中甘油三酯含量明顯上升，而氫化珊瑚鈣的攝入能夠有效降低甘油三酯的含量。圖5顯示高脂飲食誘導肝臟中自由脂肪酸含量明顯上升，而氫化珊瑚鈣的攝入能夠有效降低自由脂肪酸的含量。
[0059]實施例六
[0060]氫化珊瑚鈣對高脂飲食誘導的脂肪性肝炎的抑制作用。
[0061]脂肪性肝炎是非酒精性脂肪肝病理發生過程中的顯著特征，同時也是病理診斷的良好依據。圖6Α，圖6Β和圖6C分別顯示高脂飲食誘導肝臟中腫瘤壞死因子，白介素-6及單核細胞趨化蛋白-1水平明顯上升，這些指標都揭示了高脂飲食誘導的非酒精性脂肪肝病病理發展過程中伴隨炎癥反應，而氫化珊瑚鈣的攝入能夠有效降低炎癥因子的水平，揭示氫化珊瑚鈣的抗炎癥反應作用。
[0062]通過以上實驗結果證明氫化珊瑚鈣能夠有效的抑制高脂飲食誘導的肥胖發生，同時可有效控制伴隨肥胖產生的代謝紊亂，肝臟脂肪變及脂肪性肝炎。同理可證，與氫化珊瑚鈣具有同類特性的氫分子固態載體具有同樣的疾病防治作用。另外，氫分子結構簡單，中和自由基反應生成水，潛在副作用較小，體內耗散的氫由肺部呼出，對生理穩態影響較小，機體耐受性好，具有廣泛應用的市場前景，為防治膳食結構失衡所致的肥胖等系列問題開辟新的醫藥途徑。
【權利要求】
1.氫分子固態載體在制備抑制肥胖的保健品和藥物中的應用，其特征在于，氫分子固態載體對膳食結構失衡所致的肥胖發生有抑制作用，所述的氫分子固態載體是以鈣、鎂的碳酸鹽為主占固態物質含量的50%以上，形態為粉末狀、顆粒狀、無定形狀類型的固態形式，該物質溶解或混懸于液體后，可在溶液中釋放出氫分子的物質，溶液中氫的含量為0.1ppm以上且飽和濃度以下，該物質包括但不僅僅是氫化珊瑚鈣。
2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述氫分子固態載體對肥胖發生的抑制作用的有效攝入濃度范圍為每天每公斤體重10-50毫克。
3.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述氫分子固態載體能夠有效改善肥胖發生過程中的體重增加。
4.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述氫分子固態載體能夠有效改善肥胖發生過程中的脂肪積累。
5.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述氫分子固態載體能夠有效改善肥胖發生過程中的脂代謝紊亂的產生。
6.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述氫分子固態載體能夠有效改善肥胖發生過程中的肝臟脂肪變的產生。
7.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述氫分子固態載體能夠有效改善肥胖發生過程中的脂肪性肝炎的產生。
8.根據權利要求5所述的應用，其特征在于，所述氫分子固態載體能夠有效降低血液中甘油三酯含量。
9.根據權利要求6所述的應用，其特征在于，所述氫分子固態載體能夠有效抑制肝臟中的甘油三酯和自由脂肪酸的含量。
10.根據權利要求7所述的應用，其特征在于，所述氫分子固態載體能夠有效抑制肝臟中的炎性因子，如腫瘤壞死因子，白介素-6和單核細胞趨化蛋白-1的含量。
【文檔編號】A61K33/00GK104027350SQ201410239813
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年5月30日 優先權日:2014年5月30日
【發明者】劉健康, 龍建綱, 侯晨, 唐穎, 趙琳 申請人:西安交通大學