一種銅綠假單胞菌噬菌體及其在水貂出血性肺炎預防中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明屬于生物【技術領域】，一種銅綠假單胞菌噬菌體及其在水貂出血性肺炎預防中的應用。該銅綠假單胞菌噬菌體2014年4月14日保藏于“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，保藏號為CGMCC?No.9102，分類命名為銅綠假單胞菌噬菌體。該銅綠假單胞菌噬菌體在水貂出血性肺炎預防中的應用，假設每只水貂的生活空間為1m3；采用超聲噴霧方式：銅綠假單胞菌噬菌體的效價為109PFU/ml，每只水貂用量為10ml；在疾病暴發期每1個月施用1次，即可預防水貂出血性肺炎。采用超聲噴霧的施用方式，噬菌體可直接到達致病菌定植的肺部，提高噬菌體控制動物肺部細菌性感染的效率，提高養殖經濟效益。
【專利說明】一種銅綠假單胞菌噬菌體及其在水貂出血性肺炎預防中的應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物【技術領域】，涉及一株能夠特異性裂解銅綠假單胞菌菌株的噬菌體分離物及采用超聲噴霧方式施用該噬菌體在水貂出血性肺炎預防中的應用。
【背景技術】
[0002]水貂是全球主要的毛皮經濟動物養殖品種，具有較高的經濟價值。近年來，我國對裘皮的需求日益增加，已從原來的裘皮出口國轉化為主要裘皮進口及消費大國。國內裘皮市場的巨大發展潛力，也使得支撐裘皮工業發展的毛皮動物養殖業迅速發展。銅綠假單胞菌是一種條件性致病菌，在夏秋交替季節，該菌引起的水貂出血性肺炎，死亡率高達70%左右，給水貂養殖業帶來了巨大的經濟損失。
[0003]噬菌體是一種可以感染 細菌，不侵染動物和植物細胞的病毒。裂解性噬菌體(以下簡稱噬菌體)在感染細菌后，能引起宿主細胞破裂，利用這一特性可以應用噬菌體控制細菌感染。上世紀70-80年代，細菌耐藥性問題，特別是超級細菌的出現，有關噬菌體作為抗菌制劑的研究受到普遍關注。目前，在美國以及一些東歐國家，噬菌體已經成功應用于動物性食品生產過程中，并有一些產品上市，在控制動物細菌性疾病方面彰顯優勢。
[0004]吸入給藥可以將藥物直接送至肺部，是治療肺部疾病較為簡單有效的給藥途徑。肺部給藥新劑型和制劑主要有定量吸入劑、噴霧劑、干粉吸入劑、微球和脂質體。其中，超聲噴霧采用高振動強度和低通風水平能有效地將藥物送入肺深部，所需設備簡單、制備費用較低等原因，是動物生產過程中治療細菌肺部感染的最適給藥方式。
[0005]本發明中的噬菌體分離物是從自然界分離得到裂解性噬菌體，對銅綠假單胞菌有較強的裂解作用；采用噴霧方式施用后，能夠預防水貂出血性肺炎。
【發明內容】
[0006]本發明提供了一種應用裂解性噬菌體，采用超聲噴霧的施用方式，降低出血性肺炎引起的死亡率，提高水貂養殖企業經濟效益的技術方法。
[0007]技術方案
[0008]本發明提供了一種采用超聲噴霧方式施用裂解性噬菌體，預防水貂養殖過程中由銅綠假單胞菌引起的出血性肺炎，降低由該病引起的死亡率，可提高水貂養殖企業經濟效益的技術方法。
[0009]本發明的技術方案是提供了一種銅綠假單胞菌卩遼菌體Pseudomonas aeruginosabacteriophage,該卩遼菌體于2014年4月14日保藏于“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，保藏號為CGMCC N0.9102，分類命名為銅綠假單胞菌噬菌體。中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，郵編:100101。該噬菌體屬短尾噬菌體科，頭部直徑約為40nm，頭部長約為5nm。采用超聲噴霧方式施用該銅綠假單胞菌噬菌體裂解液，對水貂出血性肺炎有較好的預防效果。[0010]本發明中以水貂來源的銅綠假單胞菌為宿主，分離得到I株銅綠假單胞菌強裂解性噬菌體，一步生長曲線表明，其潛伏期、裂解期分別約為25min、35min，裂解量為115PFU/感染細胞，裂解能力較強；對15株銅綠假單胞菌中的14個菌株有裂解作用，有較寬的裂解譜；經滴鼻的方式，接種噬菌體裂解液，與對照組相比，小鼠行為未出現異常，肺部、肝臟、脾臟均未出現病理變化，表明銅綠假單胞菌裂解性噬菌體裂解液安全、無毒副作用；使用超聲噴霧霧化該噬菌體，對噬菌體的效價無顯著影響；采用超聲噴霧方式:銅綠假單胞菌噬菌體的效價為> 109PFU/ml，每只水貂的密閉空間為lm3，用量為IOml ;在疾病暴發期每I個月施用I次，即可預防水貂出血性肺炎。
[0011]本發明的有益效果:
[0012](1)分離獲得一株銅綠假單胞菌強裂解性噬菌體，且裂解譜較寬，可應用于體內外控制銅綠假單胞菌感染；
[0013](2)采用超聲噴霧的施用方式，噬菌體可直接到達致病菌定植的肺部，提高噬菌體控制動物肺部細菌性感染的效率，提高養殖經濟效益；
[0014](3)應用該噬菌體控制銅綠假單胞菌，替代抗生素防治動物肺部細菌感染，可減少抗生素在水貂養殖過程中的使用量，降低耐藥菌株的出現幾率，提高抗生素治療其他疾病的作用效果，降低飼養成本。
【具體實施方式】
[0015]實施例1
[0016]曬菌體的篩選和純化
[0017]1.銅綠假單胞菌的制備
[0018]采集水貂養殖場患出血性肺炎的水貂病料，使用選擇性培養基分離銅綠假單胞菌。采用分子生物學方法，確定該致病菌為銅綠假單胞菌。使用LB培養基擴增，留分離噬菌體用。
[0019]2.水樣的處理
[0020]取醫院廢水，加入CaClJ*濃度為lmol/L，5000rpm離心10min，去除污水中的沉淀顆粒。取上清用0.22 μ m濾膜濾過除菌。取濾液20ml，與20ml2 X LB培養基混合，按1%的接種量，接種400 μ I的銅綠假單胞菌，37°C富集培養12h。取5ml的上述菌液，4°C，5000rpm離心10min，取上清用0.22 μ m濾膜濾過除菌，即得噬菌體原液。
[0021]3.噬菌體的分離
[0022]采用雙層瓊脂平板法，分離噬菌體，具體方法如下:將噬菌體原液，10倍梯度稀釋，分別取300ul稀釋液與300ul相應的對數期銅綠假單胞菌混合，37°C孵育15min，與5ml55°C保溫的完全熔化頂層瓊脂(瓊脂濃度為0.5% )混合，均勻鋪在下層瓊脂(瓊脂濃度1.5%)平皿上，冷卻15min后倒置37°C過夜培養。次日，觀察噬菌斑的出現情況。挑取單個噬菌斑，重復3次雙層瓊脂平板實驗，得到單一的噬菌體。在挑取單個噬菌斑溶解Iml的生理鹽水中。
[0023]4.噬菌體的擴增
[0024]挑銅綠假單胞菌單個菌落，接種于50ml液體LB培養基中，37 °C、140rpm振蕩培養至對數生長期早期；加入1ml含有噬菌斑的生理鹽水，37°C、160rpm振蕩培養過夜；4°C、5000rpm離心10min,去菌體沉淀,取上清。加入到500ml的銅綠假單胞菌對數期菌液中，待菌液澄清后，4°C、5000rpm離心10min，取上清。反復擴增，使用0.22 μ m濾膜過濾，得到所要體積的噬菌體裂解液。
[0025]5.噬菌體的純化
[0026]向噬菌體裂解液中加入NaCl，終濃度為lmol/L，冰浴Ih后，4°C、8000rpm離心lOmin，沉淀菌體碎片，收集上清；根據上清的體積，加入PEG，終濃度為10% (m/v)，4°C、1000Og離心10min，去上清，用等體積生理鹽水溶解沉淀的噬菌體，即得到初步純化的噬菌體裂解液。
[0027]實施例2
[0028]噬菌體的生物學特性
[0029]1.噬菌體的電鏡觀察
[0030]取超速離心提純的噬菌體懸液滴于覆有聚乙烯甲醛膜的銅網上少許，以2%磷鎢酸(pH7.0)染色5-10min，將銅網放于干燥濾紙上，自然干燥。然后用日立JEM2100C型電鏡觀察。
[0031]2.噬菌體的一步 生長曲線
[0032]加入噬菌體及對數早期的宿主菌使MOI = 0.1，37°C孵育15min后，1000OXg離心lOmin，棄上清，LB培養基懸浮菌體，再次離心、懸浮沉淀，洗滌2次后，用5ml預熱的LB培養基混懸沉淀并充分混勻，迅速置于37°C搖床(140rpm/min)中培養，開始計時，于O時刻和每個IOmin取樣100 μ 1，10000 Xg離心5min，吸取上清，10倍梯度稀釋測定噬菌體滴度。各時間點均作雙份復管取平均值，同時以不加噬菌體的宿主菌和不加宿主菌的噬菌體為對照，實驗重復3次。最后以感染時間為橫坐標，感染體系中噬菌體的滴度為縱坐標繪制一步生長曲線，得出噬菌體的潛伏期、裂解期和裂解量。其中裂解量計算公式:裂解量=爆發末期噬菌體滴度/感染初期宿主菌濃度。
[0033]3.噬菌體的裂解譜
[0034]取300μ I的純化后10倍梯度稀釋的噬菌體溶液，分別與300ul新分離得到的15株待測的銅綠假單胞菌混合，37°C孵育15min后，加入5ml、55°C保溫的已完全熔化的頂層瓊脂混勻，迅速傾注在底層瓊脂的LB培養皿上。冷卻20min后，倒置37°C培養箱培養10-12h后，觀察噬菌斑的出現情況。根據噬菌斑的出現與否，分別判斷噬菌體的裂解譜。
[0035]實施例3
[0036]噬菌體的安全性實驗
[0037]選擇12只體重為25~30g的雄性昆明小鼠，隨機分為實驗組和空白對照組，分別鼻腔接種純化的噬菌體裂解液(IOkiPFUAiI)和生理鹽水20ul，連續接種3天后，觀察小鼠的行為表現，并去肺、肝、腎做病理切片，確定純化的噬菌體裂解液是否對小鼠有毒副作用。
[0038]實施例4
[0039]超聲噴霧對曬菌體效價無顯著影響
[0040]根據超聲霧化器說明，霧化純化的噬菌體裂解液，收集霧化后的噬菌體液滴，測定其效價，比較霧化前后噬菌體效價的變化。
[0041]實施例5
[0042]采用超聲噴霧方式施用銅綠假單胞菌噬菌體預防水貂出血性肺炎實驗I[0043]在出血性肺炎爆發高峰期間(8月-11月)，即8、9、10、11月的每月月初，使用超聲霧化器以超聲霧化方式，施用噬菌體裂解液預防水貂出血性肺炎。
[0044]試驗時間:2012年8月I日；9月I日；10月I日；11月I日；
[0045]材料與方法:遼寧省某大型水貂養殖場，選取美國黑貂54只，隨機分成兩組，每組27只，各置入2個密閉空間內(均為27m3)。以PPA-ABTNL (效價為109PFU/ml)噬菌體裂解液270ml作為吸入液，使用霧化器在50min內將吸入液全部霧化，霧化后讓水貂吸入lh。對照物吸入液為270ml的純凈水，霧化條件同上。每月初連續進行4次實驗，詳細記錄水貂死亡情況，對疑似出血性肺炎的死亡病貂進行剖檢，計算由出血性肺炎引起的死亡率。
[0046]表1超聲霧化噬菌體混合制劑對水貂出血性肺炎死亡率的影響
【權利要求】
1.一種銅綠假單胞菌噬菌體，其特征在于，該銅綠假單胞菌噬菌體于2014年4月14日保藏于“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，保藏號為CGMCC N0.9102，分類命名為銅綠假單胞菌噬菌體。
2.—種銅綠假單胞菌噬菌體在水貂出血性肺炎預防中的應用，其特征在于，采用超聲噴霧方式:銅綠假單胞菌噬菌體的效價為> 109PFU/ml，每只水貂的密閉空間為lm3，用量為10ml ;在疾病暴發期每I個月施用I次，即可預防水貂出血性肺炎。
【文檔編號】A61P31/04GK103981154SQ201410235510
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年5月28日 優先權日:2014年5月28日
【發明者】徐永平, 曹振輝, 張建城, 李振, 李曉宇, 王麗麗, 李紀彬, 李淑英, 徐樂 申請人:大連理工大學