來自丁酸梭菌的脂磷壁酸在調節水產動物免疫應答中的用途

來自丁酸梭菌的脂磷壁酸在調節水產動物免疫應答中的用途
【專利摘要】本發明公開一種來自丁酸梭菌的脂磷壁酸在調節水產動物免疫應答中的用途，該脂磷壁酸來自丁酸梭菌細胞壁，該脂磷壁酸與其他革蘭氏陽性菌的細胞壁脂磷壁酸結構存在差異。本發明具有能夠改善水產動物的腸道免疫功能，抑制病原菌對水產動物的感染，降低發病率的優點。
【專利說明】來自丁酸梭菌的脂磷壁酸在調節水產動物免疫應答中的用途

【技術領域】
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[0001]本發明涉及調節水產動物免疫應答的丁酸梭菌細胞壁脂磷壁酸，具體為來自丁酸梭菌的脂磷壁酸在調節水產動物免疫應答中的用途。

【背景技術】
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[0002]細菌性疾病是水產養殖業的主要傳染病，嚴重威脅水產養殖動物的健康。目前，使用高劑量的抗菌藥物仍然是防治魚類細菌性疾病的主要方式。高劑量的抗菌藥物會導致水產品產生藥物殘留，危害消費者健康。同時，長期使用抗菌藥物還引起細菌產生耐藥性，進而導致細菌性疾病更加難以防治。在這一背景下，篩選益生菌株，利用細菌的益生作用來防治病原菌就成為水產動物疾病防控新的發展方向。近年來，已有多種新型微生態制劑在生產中應用并取得了較好的效果。然而，在水產動物養殖生產中使用益生菌也存在著諸多局限:(1)益生菌對環境要求較高，養殖水體不能滿足其生長增殖的需要，導致其存活率較低，效果欠佳；(2)益生菌在水產動物腸道中不能長期定植，很難持久發揮抑菌作用；(3)益生菌在水產動物腸道中的密度太低，無法充分發揮免疫調節功能，對病原菌的抑制作用較弱。因此，在充分解析益生菌免疫調節機制的基礎上，分離純化益生菌菌體有效成分，用以防治水產動物細菌性疾病就成為新的發展趨勢。
[0003]脂磷壁酸是革蘭氏陽性菌細胞壁的重要成分，是一類由多聚磷酸甘油酯或多聚磷酸核糖醇構成的陰離子聚合物，其鏈上羥基往往被丙氨酸(Ala)或N-乙酰葡萄糖胺(N-Acetylglucosamine, GlcNAc)修飾,故通常還帶有一定量的正電荷,形成正負電荷交替出現的鏈狀聚合物結構。磷壁酸對革蘭氏陽性菌具有十分重要的生理功能，主要包括:(I)保護細菌免受抗生素、表面活性劑、抗菌肽、溶菌酶和熱應激等的損傷；(2)維持細菌細胞壁中陽離子的濃度平衡；(3)參與細菌細胞分裂；(4)參與細菌自溶過程；(5)參與宿主細胞相關受體的識別與互作，在革蘭氏陽性菌與宿主細胞的互作及免疫調節過程中發揮著十分重要的作用。
[0004]革蘭氏陽性菌細胞壁脂磷壁酸的結構和性質隨著細菌菌株的不同而呈現極大差異。金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌的脂磷壁酸能夠導致小鼠出現肺膿腫，并刺激人單核淋巴細胞 IL-6、TNF-α 等炎癥因子的分泌(Weidenmaier 等，2010，PLOS One, 56: el3227)。干酪乳酸桿菌脂磷壁酸能夠刺激巨噬細胞炎癥因子IL-12的產生，嗜酸乳桿菌脂磷壁酸也能夠誘導宿主細胞IL-12等促炎癥因子的分泌(Kaji等，2010，TheJournal ofImmunology, 184:3505-3513 ；Duncker 等，2008, Neurogastroenterology&Motility, 20:843-850)。也有研究發現，植物乳桿菌磷壁酸能夠刺激巨噬細胞一氧化氮(NO)的產生，從而發揮抗炎癥作用(Kang 等，2011, Molecular Immunology, 48:2170-2177)。


【發明內容】

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[0005]本發明針對現有技術的上述不足，提供一種能夠改善水產動物的腸道免疫功能，抑制病原菌對水產動物的感染，降低發病率的來自丁酸梭菌的脂磷壁酸在調節水產動物免疫應答中的用途。
[0006]本發明將脂磷壁酸用于調節水產動物免疫應答，該脂磷壁酸來自丁酸梭菌細胞壁。
[0007]本發明將來自丁酸梭菌的脂磷壁酸成分用于水產動物養殖中即來自丁酸梭菌的脂磷壁酸在調節水產動物免疫應答中的用途，脂磷壁酸在水產動物飼料中的添加量以丁酸梭菌的量計為106cfu/g-10ncfu/g (是“ 106cfu/g-10ncfu 丁酸梭菌菌體中的磷壁酸成分”的意思；也就是說，原來是直接添加菌體的，現在改為添加同樣數量菌體中的磷壁酸成分，以下亦同)。
[0008]本發明將來自丁酸梭菌的脂磷壁酸成分在大黃魚、鱸魚等海水養殖魚類飼料中的添加量以丁酸梭菌的量計為106cfu/g?109cfu/g(含義同上述脂磷壁酸在水產動物飼料中的添加量以丁酸梭菌的量計為106CfU/g-10nCfU/g表示的含義)。
[0009]本發明將來自丁酸梭菌的脂磷壁酸成分在南美白對蝦飼料中的添加量以丁酸梭菌的量計為108cfu/g?101(lCfU/g(含義同上述脂磷壁酸在水產動物飼料中的添加量以丁酸梭菌的量計為106cfu/g-10ncfu/g表示的含義)。
[0010]本發明用于調節水產動物免疫應答的脂磷壁酸，該脂磷壁酸來自丁酸梭菌細胞壁；該脂磷壁酸與其他革蘭氏陽性菌的細胞壁脂磷壁酸結構存在差異；能夠刺激大黃魚、鱸魚等海水魚血清；能夠刺激南美白對蝦酚氧化酶、酸性磷酸酶和超氧化物歧化酶等非特異性免疫因子的分泌。
[0011]本發明上述來自丁酸梭菌的脂磷壁酸的制備方法，步驟包括:
[0012](I)用 50mmol/L、ρΗ6.5Tris 緩沖液加 TX-114(TRITON X-114CAS:9036_19_5)配制成質量百分比為2%的TX-114榮譽，4°C冰箱保存，備用；
[0013](2)分別各取1ml經48h培養的菌液于若干支已知質量的塑料離心管中，常溫5000r/min離心30min，去除上層培養液后再稱各管質量，計算得到濕菌質量；每Ig濕菌混懸于預冷的10ml2% TX-114溶液中，磁力攪拌器攪拌裂解菌體30min，4°C過夜；4°C 5000r/min離心30min，去除細胞碎片，收集上層提取物；
[0014](3)提取物50°C水浴30min,常溫5000r/min離心30min,使提取物分成兩層，輕輕收集上層水相，即為脂磷壁酸的粗提取物；制備2X20cm(直徑X長度)的DEAE-纖維素層析柱，用0.lmol/L、pH4.7的醋酸銨緩沖液預平衡；脂磷壁酸粗提取物中加入5倍其體積的醋酸銨緩沖液，稀釋后過柱；用0.1ΜρΗ4.7的醋酸銨緩沖液洗脫，直到洗脫液275nm吸光度A275低于0.01 ;然后用lmol/L、pH4.7醋酸銨緩沖液洗脫結合于柱上的脂磷壁酸，整個過程用試管收集洗脫液，A275監測磷壁酸洗脫峰，得到純化后的脂磷壁酸。
[0015]本發明的丁酸梭菌為日本米雅利桑株式會社的MIYAIRI II 588菌株。
[0016]本發明步驟(2)的丁酸梭菌液培養條件為:37°C厭氧培養，其培養基為MRS培養基，MRS培養基配方:酪蛋白胨10g、牛肉浸膏10g、酵母粉5g、葡萄糖20g、乙酸鈉5g、吐溫_801g、磷酸氫二鉀2g、七水硫酸錳0.2g、七水硫酸錳0.05g、碳酸鈣20g、蒸餾水100mL,ρΗ7.0。
[0017]本發明的優點和有益效果:
[0018]本發明從水產動物的免疫機能調節機制出發，研究了丁酸梭菌脂磷壁酸對大黃魚溶菌酶、IgM等免疫因子水平的影響，分析了丁酸梭菌脂磷壁酸對南美白對蝦酚氧化酶、超氧化物歧化酶和抗菌能力的影響，證明丁酸梭菌脂磷壁酸能夠抑制致病菌誘導的大黃魚炎癥因子的表達，顯著提高南美白對蝦酚氧化酶、超氧化物歧化酶等非特異性體液免疫因子的水平及其抗菌能力，具有開發成為水產動物免疫調節劑的潛力，具有良好的市場前景。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1 丁酸梭菌脂磷壁酸的1HNMR譜圖
[0020]圖2植物乳桿菌脂磷壁酸的1HNMR譜圖
[0021]圖3金黃色葡萄球菌脂磷壁酸的1HNMR譜圖
[0022]圖4不同細菌來源的脂磷壁酸對大黃魚血清溶菌酶活性的影響。
[0023]圖5不同細菌來源脂磷壁酸對大黃魚血清IgM水平的影響。
[0024]圖6不同細菌來源磷壁酸對哈維氏弧菌所致大黃魚死亡率的影響。
[0025]圖7 丁酸梭菌脂磷壁酸對南美白對蝦血清酚氧化酶活性的影響。
[0026]圖8 丁酸梭菌脂磷壁酸對南美白對蝦血清超氧化物歧化酶活性的影響。
[0027]圖9 丁酸梭菌脂磷壁酸對南美白對蝦血清酸性磷酸酶活性的影響。
[0028]圖10 丁酸梭菌菌脂磷壁酸的紅外光譜圖。

【具體實施方式】
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[0029]下面通過實施例進一下詳細描述本發明，但本發明不僅僅局限于以下實施例。
[0030]1、脂磷壁酸的提取制備方法
[0031]用50mmol/L、ρΗ6.5Tris 緩沖液加 TX-114 配制成 2% TX-114，4°C冰箱保存，備用；分別各取1ml經48h培養的菌液于若干支已知質量的塑料離心管中，常溫5000r/min離心30min，去除上層培養液后再稱各管質量，計算得到濕菌質量；每Ig濕菌混懸于預冷的10ml2% 了乂-114溶液中，磁力攪拌器攪拌裂解菌體3011^11，41:過夜；41: 5000r/min離心30min，去除細胞碎片，收集上層提取物；提取物50°C水浴30min，常溫5000r/min離心30min，使提取物分成兩層，輕輕收集上層水相，即為磷壁酸的粗提取物；制備2X20cm的DEAE-纖維素層析柱，用0.1ΜρΗ4.7的醋酸銨緩沖液預平衡；細菌磷壁酸粗提取物中加入5倍體積的醋酸銨緩沖液，稀釋后過柱；用同一種緩沖液洗脫，直到洗脫液275nm吸光度A275低于0.01 ;用1ΜρΗ4.7醋酸銨緩沖液洗脫結合于柱上的磷壁酸，整個過程用試管收集洗脫液，A275監測磷壁酸洗脫峰。通過紅外和核磁檢測，如圖1和10所示，得出本發明上述方法獲得了丁酸梭菌脂磷壁酸。
[0032]2、丁酸梭菌、植物乳桿菌及金黃色葡萄球菌脂磷壁酸的結構比較
[0033]600兆NMR對三種菌來源的脂磷壁酸進行結構分析，結果如圖1_3所示。
[0034]本發明利用SooM1HNMR對所得三種菌脂磷壁酸進行定性，結果發現，三種脂磷壁酸的結構并不完全相同，存在著差異，這提示這三種脂磷壁酸在功能上也可能存在較大差別。
[0035]3、按照相當于細菌106cfu/g、107cfu/g、109cfu/g的量,在大黃魚飼料中添加丁酸梭菌、植物乳桿菌和金黃色葡萄球菌脂磷壁酸，經過35天試驗后，取大黃魚血液樣品，分析其溶菌酶、IgM等免疫因子的水平。結果如圖4、5。
[0036]溶菌酶的測定方法:取各組魚血清樣品各0.1mL,置25°C水浴鍋中預熱5min，然后加入2.8mL已預熱的溶壁微球菌液，立即計時，至2min時加入I滴5mol/LK0H溶液以終止反應，立即用0.5cm比色皿于640nm波長測其透光率Tl %。再取各組魚溶菌酶樣品各0.1mL,加入I滴5mol/LK0H溶液搖勻后重復以上步驟，測定其透光率T0%。AT= (Τ1%-Τ0%)為透光率的差值，即溶菌酶透光率的變化。從標準曲線上可計算血清中溶菌酶含量(活性)。
[0037]IgM的測定方法:用雙抗體夾心法測定標本中魚免疫球蛋白M(IgM)水平。用純化的魚免疫球蛋白M(IgM)抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入免疫球蛋白M(IgM)，再與HRP標記的免疫球蛋白M(IgM)抗體結合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的免疫球蛋白M(IgM)呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度(0D值)，通過標準曲線計算樣品中魚免疫球蛋白M(IgM)濃度。
[0038]由圖4-5可知，添加丁酸梭菌、植物乳桿菌和金黃色葡萄球菌脂磷壁酸菌能夠顯著刺激大黃魚血液中溶菌酶的活性升高，而且隨著磷壁酸添加量的升高，大黃魚血清溶菌酶的活性也逐漸提高。從三種脂磷壁酸的效果比較來看，丁酸梭菌脂磷壁酸對大黃魚血液溶菌酶活性的刺激作用最為顯著。
[0039]由圖5可知，添加不同革蘭氏陽性菌來源的脂磷壁酸均能夠刺激大黃魚血清IgM水平升高，而且隨著磷壁酸添加濃度的升高，血清IgM的水平也不斷上升。
[0040]從上述二種非特異性免疫因子的變化可以看出，三種菌來源的脂磷壁酸成分均能誘導非特異性免疫因子水平升高，但其效果存在一定差異。
[0041]4、按照相當于106CfU/g到109cfu/g的菌量，在大黃魚飼料中添加丁酸梭菌和植物乳桿菌脂磷壁酸，隨機抽取10尾大黃魚放于室內水族箱中進行攻毒試驗。對每尾實驗魚腹腔注射0.4mL(濃度為6.7X107cell/mL)哈維氏弧菌進行感染，并記錄攻毒后1d的死亡率，確定不同來源脂磷壁酸對大黃魚的保護作用，結果如圖6。
[0042]由圖6可知，丁酸梭菌脂磷壁酸能夠使哈維氏弧菌導致的大黃魚死亡率從68.7%降低至24.3%，效果極為顯著。植物乳桿菌脂磷壁酸也可使大黃魚死亡率由70.2%降低至40.6%,這說明該脂磷壁酸也具有一定的保護作用，但其效果不及丁酸梭菌脂磷壁酸，這可能是由于丁酸梭菌是來源于腸道的益生菌而植物乳桿菌則是外源性益生菌，二者的磷壁酸結構和性質也存在差異。而金黃色葡萄球菌磷壁酸則不僅不會降低大黃魚死亡率，還會導致其死亡率提高，這可能是由于金黃色葡萄球菌本身即為致病菌，其細胞壁脂磷壁酸是其致病因子之一。
[0043]5、按照相當于108cfu/g、109cfu/g、101Qcfu/g的菌量,在南美白對奸飼料中添加丁酸梭菌，進行為期35天的飼養試驗。Tl組添加脂磷壁酸的量相當于飼料中添加108cfu/g丁酸梭菌，T2組添加脂磷壁酸的量相當于飼料中添加109cfu/g 丁酸梭菌，T3組添加脂磷壁酸的量相當于飼料中添加101(lCfU/g丁酸梭菌。飼養試驗結束后，以無菌注射器抽取對蝦心臟血液，用于分析酚氧化酶、超氧化物歧化酶、酸性磷酸酶等非特異性免疫因子的水平。
[0044]酚氧化酶活性的測定方法:以L-多巴為底物，96孔酶標板中加入10 μ L血清，然后向各孔中加入200 μ L0.lmol/L pH6.0磷酸鹽緩沖液，再各樣品孔中加入10 μ L0.0lmol/L的L -多巴溶液，在酶標儀中振蕩5次，每隔5min讀取490nm處的OD值。酶活力以試驗條件下，I分鐘內A490增加0.001定義為I個酶活力單位。結果如圖。
[0045]從圖7中可以看出，添加脂磷壁酸的試驗組南美白對蝦血清中酚氧化酶的活性呈顯著升高趨勢。酚氧化酶原激活系統在甲殼動物的防衛機制中發揮著重要作用，酚氧化酶的高活力有助于增強對蝦的非特異性免疫力，對維持對蝦機體健康具有重要意義。本試驗中，我們發現丁酸梭菌脂磷壁酸能夠刺激南美白對蝦血清酚氧化酶活性升高，這提示丁酸梭菌脂磷壁酸能夠通過某種機制提高南美白對蝦的非特異性免疫機能。
[0046]超氧化物歧化酶活性的測定方法:采用改進的鄰苯三酚自氧化法進行測定，在25°C下于4.5mL50mmol/LPH8.3的磷酸鉀鹽緩沖液中加入10μ L50mmol/L鄰苯三酚，迅速搖勻，倒入光徑Icm的比色杯內，在325nm波長下每隔30s測A值一次，要求自氧化速率在0.0700D/min左右。酶活單位定義:每毫升反應液中，每分鐘抑制鄰苯三酚自氧化速率達50%的酶量定義為I個酶活力單位(U/mL)。
[0047]由圖8可知，日糧中添加丁酸梭菌脂磷壁酸能夠提高南美白對蝦血清中超氧化物歧化酶的活性，隨著日糧中脂磷壁酸水平的提高，對蝦血清中超氧化物歧化酶活性成逐漸升高趨勢。該酶可以減少自由基對正常細胞的損傷，對細胞生理代謝過程中的活性氧有清除作用，從而提高機體的解毒免疫功能和防病抗病能力。超氧化物歧化酶活性與生物的免疫水平密切相關，其活性變化可以作為反映對蝦的機能健康狀況及衡量對蝦免疫狀態的指標。
[0048]采用磷酸苯二鈉法測定酸性磷酸酶(ACP)活性。ACP活力定義為:每10ml血清在37°C與底物作用60min，產生Img酚者為I個酶活力單位。結果如圖9所示。
[0049]由圖9可知，隨著脂磷壁酸添加量的增加，南美白對蝦血清酸性磷酸酶的活性逐漸升高，這說明丁酸梭菌脂磷壁酸能夠刺激南美白對蝦酸性磷酸酶合成，提升對蝦免疫機倉泛。
【權利要求】
1.一種脂磷壁酸在調節水產動物免疫應答中的用途，該脂磷壁酸來自丁酸梭菌細胞壁。
2.根據權利要求1所述的脂磷壁酸在調節水產動物免疫應答中的用途，該脂磷壁酸與其他革蘭氏陽性菌的細胞壁脂磷壁酸結構存在差異。
3.根據權利要求1所述的脂磷壁酸在調節水產動物免疫應答中的用途，該脂磷壁酸在水產動物飼料中的添加量以丁酸梭菌的量計為106cfu/g-10ncfu/g。
4.根據權利要求1所述的脂磷壁酸在調節水產動物免疫應答中的用途，所述的脂磷壁酸能夠刺激大黃魚、鱸魚的海水魚血清。
5.根據權利要求4所述的脂磷壁酸在調節水產動物免疫應答中的用途，所述的脂磷壁酸在大黃魚、鱸魚的海水養殖魚類飼料中的添加量以丁酸梭菌的量計為106cfu/g?109cfu/g。
6.根據權利要求1所述的脂磷壁酸在調節水產動物免疫應答中的用途，所述的脂磷壁酸能夠刺激南美白對蝦酚氧化酶、酸性磷酸酶和超氧化物歧化酶的非特異性免疫因子的分泌。
7.根據權利要求6所述的脂磷壁酸在調節水產動物免疫應答中的用途，所述的脂磷壁酸成分在南美白對蝦飼料中的添加量以丁酸梭菌的量計為108cfu/g?10lclcfu/g。
【文檔編號】A61P37/02GK104161775SQ201410235076
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2014年5月29日 優先權日:2014年5月29日
【發明者】王進波, 齊莉莉, 梅樂和, 周云曉 申請人:浙江大學寧波理工學院