一種具有靶向定位釋藥的介孔碳納米粒系統及其應用的制作方法

一種具有靶向定位釋藥的介孔碳納米粒系統及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明屬于醫藥【技術領域】，涉及一種由葉酸受體介導的葉酸-聚乙烯亞胺修飾的碳納米粒的胃腸道粘附促吸收給藥系統。葉酸-聚乙烯亞胺修飾的碳納米粒為首先通過硬模板法以球形介孔硅為模板制得均一化介孔碳球，再通過濕法氧化給均一化介孔碳球添加羧基，然后利用簡單的靜電聚合作用將葉酸-聚乙烯亞胺復合物修飾在羧基化的碳球表面，即得葉酸-聚乙烯亞胺修飾的碳納米粒。葉酸-聚乙烯亞胺復合物是利用經典的DCC-NHS酰胺反應制得。本發明以均一化介孔碳球作為載體，以葉酸作為靶向分子，實現藥物的胃腸道粘附及促吸收。本發明能提高水難溶性藥物溶出速率，增加粘附時間，促進藥物的跨膜轉運，提高藥物的生物利用度，在口服給藥領域有著廣闊的應用前景。
【專利說明】一種具有靶向定位釋藥的介孔碳納米粒系統及其應用
[0001]【技術領域】
本發明屬于醫藥【技術領域】，涉及一種具有靶向定位釋藥的介孔碳納米粒系統及其應用，具體涉及由葉酸受體介導的葉酸-聚乙烯亞胺修飾的碳納米粒的胃腸道粘附及促吸收給藥系統及其制備。
[0002]
【背景技術】
[0003]眾所周知，口服給藥因用藥方便，易于被病人接受，已成為目前應用最廣泛的給藥方式，也是大多數藥物的首選給藥途徑。據統計，在收錄藥品最多的美國藥典中有1/3以上的藥物被列為難溶性藥物；在創新藥物研究中，約有40%的藥物為難溶性藥物；高通量篩選獲得的活性物質中也有約40%的藥物是水難溶性藥物。提高該類活性物質的生物利用度是當前藥物制劑發展過程中面臨的具有挑戰性且亟待解決的一大難題。對于該類藥物，我們可以增大藥物在胃腸道內 的溶出速率，增加藥物以被動擴散的形式進入血液循環的幾率或增大制劑的胃腸道主動轉運，再進行釋放藥物等方式來提高口服給藥藥物生物利用度。
[0004]新興的納米技術為解決難溶性藥物的溶解和吸收問題帶來了極好的機遇，納米技術可以降低藥物粒子大小至納米級，顯著增加粒子的比表面積，從而可以增加水難溶藥物的溶出速率；藥物粒子粒度的下降和比表面積的增高還會促進納米粒子與生物膜的接觸，使得已溶解的藥物分子與特殊大小的納米粒子在胃腸道被高效吸收。目前，用納米技術提高難溶性藥物口服吸收的研究主要集中在:納米結晶、固體脂質納米粒及微乳等制劑的制備。這些研究存在的主要不足，包括:載體疏水性強、比表面積低、載藥量低(通常不能滿足臨床用藥劑量)、不能抑制藥物再結晶或再聚積等。
[0005]無機多孔材料的出現，為納米藥物給藥系統的研發開辟了蹊徑。根據國際純粹與應用化學聯合會(IUPAC)的定義，無機多孔材料按照孔徑的大小分為三類:孔徑小于2nm的稱為微孔材料，孔徑介于2nm-50nm之間的稱為介孔(mesopore)材料,孔徑大于50nm的稱為大孔材料。介孔材料作為藥物載體的研究起步較晚，Vallet-Regi等于2001年率先報道了以介孔分子篩作為藥物載體的研究，開辟了介孔材料在醫藥領域的應用研究。這一報道很快引起介孔材料和醫藥領域研究者的關注和興趣。不久相繼有幾個研究小組分別報道了以介孔分子篩作藥物載體的安全性、生物相容性、藥物分子的組裝及基因轉換器等方面的研究成果。
[0006]介孔孔徑的均一有序及特殊的孔道結構，作為難溶性藥物的載體所具有的獨特優勢如下:1:納米級別的孔徑載藥后能夠限制難溶性藥物粒子的生長，使藥物以納米粒的形式存在，維持較高的藥物的比表面積；f:空間網絡結構的孔道能夠維持藥物粒子的分散狀態，阻止藥物粒子的再聚積，提高藥物的物理穩定性納米級別的孔道能夠抑制藥物的再結晶過程，降低藥物的結晶度，使藥物以無定形或者亞穩定型的狀態存在，提高藥物的溶解度；:1相互連通、開放的三維孔道可降低難溶性藥物的擴散阻力，可以使藥物以一定的規律溶出或釋放后，迅速被機體所吸收(BCS II類藥物)。
[0007]口服緩控釋制劑可使藥物按一定規律緩慢或恒速地釋放，即可按需要在預定的期間內向人體提供適宜的血藥濃度。具有降低給藥頻率；方便用藥，提高病人的順應性；吸收完全，提高藥物療效；減小血藥濃度波動；降低毒副作用；降低藥物對胃腸道的刺激；降低全程治療費用及適于兒童及吞咽困難的老年患者等特點。我國于二十世紀八十年代初開始研制緩釋控釋制劑，在過去的二十年里，由于緩控釋制劑開發的復雜性及其所需費用較大，至今上市的緩/控釋制劑數量有限。因此，近年來口服緩控釋制劑的研制已成為國內外醫藥發展的重要方向。
[0008]利用聚乙烯亞胺對介孔碳進行修飾后，形成優勢疊加:1:介孔碳具有較高的比表面積，載藥量明顯高于其他的載體；t通過調節聚乙烯亞胺吸附在介孔碳表面的用量可對藥物的釋放速率進行程序調控；:1聚乙烯亞胺帶有的強正電性易于吸附在帶有負電的胃腸道表面從而延長藥物的平均滯留時間，進而增加或促進藥物的吸收；④葉酸靶向因子能夠共價接枝在聚乙烯亞胺的氨基上，通過胃腸道表面的葉酸受體來促進納米粒的跨膜轉運，提高藥物的生物利用度。
[0009]因此，本項目制備了葉酸-聚乙烯亞胺修飾的碳納米粒，在增加胃腸道粘附時間的同時，對藥物進行緩慢釋放，降低給藥次數，并且通過葉酸受體的介導增加了制劑的跨膜轉運，多級提高候選活性物 質的口服生物利用度。
[0010]

【發明內容】

[0011]本發明的目的是提供一種具有靶向定位釋藥的介孔碳納米粒載藥系統，具體是制備一種由葉酸受體介導的葉酸-聚乙烯亞胺修飾的碳納米粒，以實現對裝載藥物的釋放速率進行調控及增加胃腸道粘附時間，促進藥物吸收。
[0012]所述的納米粒由荷正電的葉酸-聚乙烯亞胺復合物與荷負電的羧基化碳納米粒經簡單的靜電復合作用自組裝而成。
[0013]本發明所采用的技術方案如下:
I)球形介孔娃的制備:
利用球形介孔硅為模板，在其孔道中添加碳源糠醇和引發劑草酸溶解在三甲苯中的混合物，經過程序升溫，聚合、碳化得到碳硅復合物。
[0014]2)羧基化球形介孔碳的制備:
利用10-20%的氫氟酸進行硅模板出去，再利用濕法氧化即得羧基化的均一化介孔碳球。
[0015]3)葉酸-聚乙烯亞胺修飾的介孔碳納米粒的制備:
利用經典的DCC-NHS酰胺反應將葉酸分子接枝在聚乙烯亞胺上，然后將該葉酸-聚乙烯亞胺復合物與荷負電的羧基化碳球通過靜電復合作用自組裝成葉酸-聚乙烯亞胺-介孔碳納米粒。
[0016]本發明所述的葉酸-聚乙烯亞胺修飾的介孔碳納米粒的制備中:
I)球形介孔娃的制備:本發明利用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)形成膠束作為致孔劑，正硅酸乙酯(TEOS)作為硅源，室溫下水解制得。
[0017]具體純化步驟如下所述:
精確稱取0.5-0.8 g CTAB于200 mL的燒杯中，分別加入50-100 mL去離子水和10_30mL無水乙醇,500-1000 rpm磁力攪拌至透明狀態,之后在上述混合溶液中加入10-30 mL無水乙醚,800-1200 rpm磁力攪拌至均勻分散乳液,隨后加入0.6-1.0 mL氨水,繼續攪拌2_6 h后逐滴加入2.0-3.0 mL TEOS,常溫下繼續攪拌12-24 h。之后過濾得到白色固體，蒸餾水充分洗滌后，于40-80° C烘箱內充分干燥，最后，在500-700° C馬弗爐內煅燒6_18 h除去有機組分，過80-120目篩，得白色產物即為介孔二氧化硅納米球(SW)。
[0018]2)羧基化球形介孔碳的制備:
本發明選用糠醇作為碳源試劑，具體制備方法如下所述:
首先利用比表面積分析測試球形介孔硅的比表面積和孔容，然后根據球形介孔硅的孔容乘以取得的球形介孔硅的質量，得出一定質量的球形介孔硅的總孔容，采用初濕浸潤法添加其總孔容1.0-1.2倍體積的糠醇的草酸溶液(ImL糠醇中加入IOmg草酸)。經過60-80°C的程序聚合后，在700-1200°C，氮氣氣氛下碳化，制得碳硅復合物，用10-20%氫氟酸除去硅模板，得均一化介孔碳球，再通過濕法氧化得羧基化的球形介孔碳。具體過程是將300-700mg均一化介孔碳球放入20-50mL的0.5-1M過硫酸銨的硫酸(1-2M)溶液中，50-70°C回流反應4-8小時，回流反應結束后利用大量的去離子水和無水乙醇沖洗，即得羧基化球形介孔碳。Z eta電位結果顯示羧基化的介孔碳球帶有較強的負電性。 [0019]3)葉酸-聚乙烯亞胺修飾的介孔碳納米粒的制備:
葉酸-聚乙烯亞胺復合物的制備:
具體的制備步驟如下:
葉酸溶解在二甲基亞砜(DMSO)中，分別加入葉酸摩爾量1.0-1.5倍的N，N’ - 二環己基碳二亞胺(DCC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)在室溫下攪拌過夜，進行羧基活化，然后過濾，除去不溶的副產物二環己基脲，加入聚合物聚乙烯亞胺進行酰胺化反應。
[0020]將葉酸-聚乙烯亞胺和羧基化碳納米粒按質量比為(0.5-2):1的比例接枝在碳納米粒的表面。
[0021]具體的制備步驟如下:
將0.2mg的羧基化介孔碳球加入10-40mL的0.1%的葉酸-聚乙烯亞胺的復合物水溶液中進行超聲5-15min，攪拌2-4h，然后經過離心、洗滌、干燥制得葉酸-聚乙烯亞胺修飾的碳納米粒。
[0022]本發明制備了葉酸-聚乙烯亞胺修飾的碳納米粒,粒徑分布為380_450nm,Zeta電位為+20-28mV在pH=7.2條件下。
[0023]本發明選用葉酸作為靶向分子，賦予納米粒主動靶向的功能，增加納米粒的跨膜轉運幾率，提高藥物的生物利用度。所述的藥物可以為:阿霉素，喜樹堿，紫杉醇等
以紫杉醇為例:
可以將紫杉醇裝載入步驟2)制備的羧基化球形介孔碳，然后再按照步驟3)制備含藥的葉酸-聚乙烯亞胺修飾的介孔碳納米粒。
[0024]紫杉醇裝載入羧基化球形介孔碳的制備:稱取10-30 mg紫杉醇溶于10-20 mL的二氯甲燒中，稱取10-30 mg羧基化介孔碳載體加入到紫杉醇的二氯甲烷溶液中；超聲分散5-10 min后，置于電磁恒溫攪拌儀，攪拌子轉速為 100-300 rpm，恒溫 20°C攪拌 12_24h后，將混懸液于 12000-15000 rpm 離心 10_20min，沉淀納米粒子。棄去上層有機層，將沉淀納米粒子減壓干燥10-20 h后除去有機溶劑，既得載藥納米粒。
[0025]本發明制備的由葉酸受體介導的葉酸-聚乙烯亞胺修飾的碳納米粒在模擬小腸上皮細胞的Caco-2細胞的攝取實驗中，修飾葉酸后被攝取量明顯增加。
[0026]共聚焦顯微鏡成像表明，本發明制備的由葉酸受體介導的葉酸-聚乙烯亞胺修飾的碳納米粒可較大量的進入表面表達有葉酸受體的Caco-2細胞,該結果與流式細胞術結果相符。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0027]圖1.實施例6制備的均一化介孔碳球的掃描電鏡結果(A)和透射電鏡結果(B)。
[0028]圖2.實施例6制備的球形介孔碳及羧基化球形介孔碳，實施例12制備的葉酸-聚乙烯亞胺修飾的碳納米粒的氮吸附吸附等溫線
?為均一化介孔碳球(UMCS)，.為羧基化的均一化介孔碳球(C00H-UMCS)，秦為葉酸-聚乙烯亞胺復合物修飾的均一化介孔碳球(FA-PE1-UMCS)。
[0029]圖3.實施例6制備的球形介孔碳及羧基化球形介孔碳，實施例12制備的葉酸-聚乙烯亞胺修飾的碳納米粒的氮吸附孔徑分布
?為均一化介孔碳球(UMCS)，f為羧基化的均一化介孔碳球(C00H-UMCS)，-去.為葉酸-聚乙烯亞胺復合物修飾的均一化介孔碳球(FA-PE1-UMCS))。
[0030]圖4.羧基化介孔碳及葉酸-聚乙烯亞胺修飾的碳納米粒的Zeta電位隨著pH變化的測試結果。
[0031]圖5.球形介孔碳(a)，羧基化球形介孔碳(b)與葉酸-聚乙烯亞胺修飾的碳納米粒(C)的紅外圖譜
結果表明球形介孔碳經羧基化修飾后在1725CHT1出現羰基特征峰，經葉酸-聚乙烯亞胺復合物修飾后，在leOO-HOOcnT1出現了明顯的酰胺鍵伸縮振動峰。
[0032]圖6.紫杉醇原料藥(a)與羧基化球形介孔碳制劑組(b)，紫杉醇與羧基化球形介孔碳物理混合物(c)及空白載體(d)的X射線衍射圖譜
結果表明，與原料藥相比，載藥后制劑中藥物的全部以無定形的形式存在。
[0033]圖7.紫杉醇原料藥(a)與羧基化球形介孔碳制劑組(b)，紫杉醇與羧基化球形介孔碳物理混合物(C)及空白載體(d)的差示掃描量熱分析圖譜
結果表明，與原料藥相比，載藥后制劑中藥物的全部以無定形的形式存在。
[0034]圖8.紫杉醇的不同制劑在pH7.4的磷酸鹽緩沖液中的釋放曲線。(a)市售紫杉醇制劑Taxof，(b)紫杉醇裝載于羧基化介孔碳制劑，(C)紫杉醇裝載于葉酸-聚乙烯亞胺修飾的碳納米粒制劑，葉酸-聚乙烯亞胺復合物和介孔碳納米粒的質量比為0.5:1, (d)紫杉醇裝載于葉酸-聚乙烯亞胺修飾的碳納米粒制劑，葉酸-聚乙烯亞胺復合物和介孔碳納米粒的質量比為1:1，(e)紫杉醇裝載于葉酸-聚乙烯亞胺修飾的碳納米粒制劑，葉酸-聚乙烯亞胺復合物和介孔碳納米粒的質量比為2:1，(f)紫杉醇原料藥。[0035]圖9.FA-PE1-FITC-UMCS和PEI_FITC_UMCS納米粒被Caco-2細胞攝取實驗的共聚焦成像結果。
[0036]圖10.不同的紫杉醇制劑的表觀滲透系數(Papp)，N=3，數據為平均值土標準差，*P〈0.05是與Taxol?比較，# Ρ〈0.05是與Taxol?和維拉帕米混合物及PTX-PE1-UMCS比)。
[0037]
【具體實施方式】
[0038]實施例1
精確稱取0.5 g CTAB于200 mL的燒杯中，分別加入50 mL去離子水和10 mL無水乙醇，500 rpm磁力攪拌至透明狀態,之后在上述混合溶液中加入20 mL無水乙醚,800 rpm磁力攪拌至均勻分散乳液，隨后加入0.6 mL氨水，繼續攪拌2 h后逐滴加入2.0 mL TEOS,常溫下繼續攪拌12h。之后過濾得到白色固體，蒸餾水充分洗滌后，于40° C烘箱內下充分干燥，最后，在500° C馬沸爐內煅燒6 h除去有機組分，過80目篩，得白色產物即為介孔二氧化硅納米球(SNM)。
[0039]實施例2
精確稱取0.6 g CTAB于200 mL的燒杯中，分別加入60 mL去離子水和20 mL無水乙醇，600 rpm磁力攪拌至透明狀態,之后在上述混合溶液中加入20 mL無水乙醚,900 rpm磁力攪拌至均勻分散乳液，隨后加入0.8 mL氨水，繼續攪拌4 h后逐滴加入2.5 mL TEOS,常溫下繼續攪拌18 h。之后過濾得到白色固體，蒸餾水充分洗滌后，于60° C烘箱內下充分干燥，最后，在600° C馬沸爐內煅燒12 h除去有機組分，過100目篩，得白色產物即為介孔二氧化硅納米球(SW)。
[0040]實施例3
精確稱取0.7 g CTAB于200 mL的燒杯中，分別加入80 mL去離子水和20 mL無水乙醇，800 rpm磁力攪拌至透明狀態,之后在上述混合溶液中加入20 mL無水乙醚,900 rpm磁力攪拌至均勻分散乳液，隨后加入0.8 mL氨水，繼續攪拌4 h后逐滴加入2.5 mL TEOS,常溫下繼續攪拌18 h。之后過濾得到白色固體，蒸餾水充分洗滌后，于60° C烘箱內下充分干燥，最后，在600° C馬沸爐內煅燒12 h除去有機組分，過100目篩，得白色產物即為介孔二氧化硅納米球(SW)。
[0041]實施例4
精確稱取0.8 gCTAB于200 mL的燒杯中，分別加入100 mL去離子水和30 mL無水乙醇，1000 rpm磁力攪拌至透明狀態,之后在上述混合溶液中加入30 mL無水乙醚，1200 rpm磁力攪拌至均勻分散乳液，隨后加入1.0 mL氨水,繼續攪拌6 h后逐滴加入3.0 mL TEOS,常溫下繼續攪拌24 h。之后過濾得到白色固體，蒸餾水充分洗滌后，于80° C烘箱內下充分干燥，最后，在700° C馬沸爐內煅燒18 h除去有機組分，過120目篩，得白色產物即為介孔二氧化硅納米球(SW)。
[0042]實施例5
稱取實例I中合成的球形介孔硅74.5mg，利用比表面積分析儀測試，球形介孔硅的比表面積為1333.01m2/g和孔容為0.967cm3/g,0.967的1.0倍等于0.967。稱取球形介孔硅Ig,量取糠醇0.97mL,稱取草酸9.7mg,加到糠醇中溶解，混合均勻，采用初濕浸潤法將1.0倍量的糠醇、草酸溶液添加到球形介孔硅的孔道中。將混合物放入在馬弗爐中，空氣氣氛下經過60°C，15h和80°C，15h的程序聚合后，在700°C，氮氣氣氛下碳化3h，制得碳硅復合物，用40mL的10%氫氟酸除去硅模板，得均一化介孔碳球。掃描電鏡結果顯示納米粒呈均勻的單分散球形，投射電鏡結果顯示介孔碳球具有均勻的裂縫狀孔道。配制0.5M的過硫酸銨的硫酸(IM)溶液20mL,稱取均一化介孔碳球300mg,將碳球加入過硫酸銨溶液中，在50°C下回流反應4h，過濾，用大量的去離子水沖洗，最后用乙醇淋洗，干燥，即得羧基化介孔碳球。Zeta電位結果顯示羧基化的介孔碳球帶有較強的負電性。
[0043]實施例6
稱取實例I中合成的球形介孔硅74.5mg，利用比表面積分析儀測試，球形介孔硅的比表面積為1333.01m2/g和孔容為0.967cm3/g，0.967的1.1倍等于1.0637。稱取球形介孔硅lg，量取糠醇1.06mL，稱取草酸10.6mg，加到糠醇中溶解，混合均勻，采用初濕浸潤法將1.1倍量的糠醇、草酸溶液添加到球形介孔硅的孔道中。將混合物放入在馬弗爐中，空氣氣氛下經過60°C，15h和80°C，15h的程序聚合后，在900°C，氮氣氣氛下碳化3h，制得碳硅復合物，用40mL的15%氫氟酸除去硅模板，得均一化介孔碳球。掃描電鏡結果顯示納米粒呈均勻的單分散球形，投射電鏡結果顯示介孔碳球具有均勻的裂縫狀孔道。配制IM的過硫酸銨的硫酸(2M)溶液20mL，稱取均一化介孔碳球500mg，將碳球加入過硫酸銨溶液中，在60°C下回流反應6h，過濾，用大量的去離子水沖洗，最后用乙醇淋洗，干燥，即得羧基化介孔碳球。Zeta電位結果顯示羧基化的介孔碳球帶有較強的負電性。其均一化介質碳球的掃描電鏡結果和透射電鏡結果見圖1。
[0044]實施例7
稱取實例I中合成的球形介孔硅74.5mg，利用比表面積分析儀測試，球形介孔硅的比表面積為1333.01m2/g和孔容為0.967cm3/g,0.967的1.2倍等于1.1604。稱取球形介孔硅lg，量取糠醇1.16mL，稱取草酸11.6mg，加到糠醇中溶解，混合均勻，采用初濕浸潤法將
1.2倍量的糠醇、草酸溶液添加到球形介孔硅的孔道中。將混合物放入在馬弗爐中，空氣氣氛下經過60°C，15h和80°C，15h的程序聚合后，在1200°C，氮氣氣氛下碳化3h，制得碳硅復合物，用40mL的20%氫氟酸除去硅模板，得均一化介孔碳球。掃描電鏡結果顯示納米粒呈均勻的單分散球形，投射電鏡結果顯示介孔碳球具有均勻的裂縫狀孔道。配制IM的過硫酸銨的硫酸(2M)溶液20mL，稱取均一化介孔碳球700mg，將碳球加入過硫酸銨溶液中，在70°C下回流反應8h，過濾，用大量的去離子水沖洗，最后用乙醇淋洗，干燥，即得羧基化介孔碳球。Zeta電位結果顯示羧基化的介孔碳球帶有較強的負電性。
[0045]實施例8
13mg葉酸溶解在二甲基亞砜(DMSO)中，分別加入葉酸摩爾量1.0倍的N，N’ - 二環己基碳二亞胺(DCC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)在室溫下攪拌過夜，進行羧基活化，然后過濾，除去不溶的副產物二環己基脲，加入45mg聚合物聚乙烯亞胺，室溫攪拌12h，進行酰胺化反應，然后利用S^hadex G-100柱進行純化，即得葉酸-聚乙烯亞胺復合物。
[0046]實施例9
13mg葉酸溶解在二甲基亞砜(DMSO)中，分別加入葉酸摩爾量1.1倍的N，N’ - 二環己基碳二亞胺(DCC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)在室溫下攪拌過夜，進行羧基活化，然后過濾，除去不溶的副產物二環己基脲，加入45mg聚合物聚乙烯亞胺，室溫攪拌12h，進行酰胺化反應，然后利用S^hadex G-1OO柱進行純化，即得葉酸-聚乙烯亞胺復合物。
[0047]實施例10
13mg葉酸溶解在二甲基亞砜(DMSO)中，分別加入葉酸摩爾量1.5倍的N，N’ - 二環己基碳二亞胺(DCC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)在室溫下攪拌過夜，進行羧基活化，然后過濾，除去不溶的副產物二環己基脲，加入45mg聚合物聚乙烯亞胺，室溫攪拌12h，進行酰胺化反應，然后利用S^hadex G-100柱進行純化，即得葉酸-聚乙烯亞胺復合物。
[0048]實施例11
配制葉酸-聚乙烯亞胺復合物的0.1%的去離子水溶液10mL，稱取羧基化介孔碳球20mg加入上述溶液中，超聲混合物5min，然后攪拌0.5h,離心，用大量的去離子水洗，再離心，干燥，得葉酸-聚乙烯亞胺修飾的碳納米粒。
[0049]實施例12
配制葉酸-聚乙烯亞胺復合物的0.1%的去離子水溶液20mL，稱取羧基化介孔碳球20mg加入上述溶液中，超聲混合物lOmin，然后攪拌0.5h，離心，用大量的去離子水洗，再離心，干燥，得葉酸-聚乙烯亞胺修飾的碳納米粒。
[0050]實施例13
配制葉酸-聚乙烯亞胺 復合物的0.1%的去離子水溶液40mL，稱取羧基化介孔碳球20mg加入上述溶液中，超聲混合物15min，然后攪拌0.5h，離心，用大量的去離子水洗，再離心，干燥，得葉酸-聚乙烯亞胺修飾的碳納米粒。
[0051]實施例14
取球形介孔碳、羧基化球形介孔碳和葉酸-聚乙烯亞胺復合物修飾的碳納米粒利用比表面積儀分析，結果如圖2和圖3，比表面積在經葉酸-聚乙烯亞胺復合物修飾后明顯下降而孔徑大小分布不變，說明聚乙烯亞胺成功的包覆在羧基化球形介孔碳表面，而不是介孔孔道內。分別取羧基化介孔碳球、和葉酸-聚乙烯亞胺修飾的羧基化介孔碳球lmg，分散在10_3mOl/L的氯化鈉溶液中，利用納米粒度及動電電位測定儀馬爾文Nano ZS90測定其在不同PH條件下的動電電位，結果如圖2。在羧基化介孔碳球表面修飾上葉酸-聚乙烯亞胺復合物后，電位有負逆轉為正，說明葉酸-聚乙烯亞胺復合物成功地接枝在羧基化介孔碳球表面。球形介孔碳，羧基化球形介孔碳與葉酸-聚乙烯亞胺修飾的碳納米粒的紅外圖譜(圖5)結果表明球形介孔碳經羧基化修飾后在1725CHT1出現羰基特征峰，經葉酸-聚乙烯亞胺復合物修飾后，在leOO-HOOcnT1出現了明顯的酰胺鍵伸縮振動峰，說明葉酸-聚乙烯亞胺復合物成功地接枝在羧基化介孔碳球表面。
[0052]實施例15—采用溶劑揮發法載藥
取實施例6制備得到的羧基化球形介孔碳30mg。精密稱取約IOmg紫杉醇、溶解于IOml 二氯甲烷中，得到藥物的二氯甲烷溶液。將30mg羧基化球形介孔碳加入到IOml藥物二氯甲烷溶液，使藥物:載體比例分別為1:3攪拌混合平衡12h，加熱至40°C揮發除去有機溶劑，真空干燥，得到載藥的羧基化球形介孔碳給藥系統。
[0053]實施例16—藥物在載體中存在狀態的表征
取實施例15中藥物與載體比例為1:3的載藥樣品，原料藥，物理混合物，空白載體做粉末X射線衍射，考察載體裝載藥物后，藥物結晶度的變化，詳細數據見附圖6。
[0054]取實施例15中藥物與載體比例為1:3的載藥樣品，原料藥，物理混合物，空白載體做差示掃描量熱分析，考察載體裝載藥物后，藥物結晶度的變化，詳細數據見附圖7。
[0055]實施例17—葉酸-聚乙烯亞胺修飾載藥后羧基化介孔碳納米粒
取實施例15中藥物與載體比例為1:3的載藥樣品，再按照實施例11、12、13將葉酸-聚乙烯亞胺復合物和羧基化球形介孔碳質量比為0.5:1、1: 1、2:1的量修飾在載藥后羧基化球形介孔碳表面。
[0056]實施例18—葉酸受體介導的葉酸-聚乙烯亞胺修飾的碳納米粒裝載紫杉醇的體外釋放結果
取實施例17的葉酸-聚乙烯亞胺復合物和羧基化球形介孔碳質量比為1:1的葉酸-聚乙烯亞胺修飾的PTX-介孔碳載藥顆粒適量，精密稱取一定量(約相當于PTX 0.5 mg )，以含有0.1%的tWeen80的200 mL pH7.4的磷酸鹽緩沖液作為溶出介質，在溫度37±0.5 V,攪拌速率100±1 rpm，分別于預先設定的0.5、l、2、4、6、8、12、24h取樣200 μL，并同時補充等量等溫的溶出介質；所取樣品經13000 rpm離心后，吸取上清液，通過高效液相法，色譜柱為250mm的Kromasil C18柱，流動相為乙腈:水=65:35，于227 nm波長處測定吸光度值；按外標一點法進行紫杉醇的釋放度測定。釋放結果如圖8所示。
[0057]紫杉醇原料藥在2 4h內釋放緩慢，達不到有效的治療濃度，紫杉醇的市售制劑Taxol?在有機溶劑聚氧乙烯蓖麻油和乙醇的幫助下釋放迅速，但是聚氧乙烯蓖麻油具有較強的毒副作用，且Taxol?在胃腸道被P-gp的外排作用明顯。將紫杉醇包封在羧基化球形介孔碳中，由于藥物以無定型狀態存在，釋放速率明顯提高。將紫杉醇包封在葉酸-聚乙烯亞胺修飾的碳納米粒中，藥物具有一定的緩釋效果，且隨著葉酸-聚乙烯亞胺復合物和羧基化介孔碳納米粒質量的增加，紫杉醇釋放速率逐漸降低，緩釋給藥系統減少了給藥次數，且納米粒在生理條件下，具有較強的正電性，與腸道的負電性表面產生較強的粘附作用，增加了給藥時間，促進了藥效。
[0058]實施例19一葉酸受體介導的促進FA-PE1-UMCS納米粒被Caco-2細胞的攝取增加 將密度為5 X IO5的Caco-2細胞接種在12孔板上12h，然后移除培養液，用pH 7.2的
PBS洗三遍，將濃度為10 Pg/mL的FA-PE1-FITC-UMCS和PE1-FITC-UMCS納米粒分別加入孔板中，在37° C下培養2 h。然后用4° C緩沖液PBS洗3遍，用4%多聚甲醛固定10 min，羅丹明-鬼筆環肽將細胞膜著色，Hochst 33342將細胞核著色，送測共聚焦顯微鏡，結果見圖9。
[0059]圖9，I為藍色通道成像，可見被Hoechst 33342染成藍色的細胞核，2為異硫氰酸熒光素(FITC)綠色通道成像，可見葉酸修飾的碳納米粒組細胞膜內有大量的綠色熒光，而未被葉酸修飾的PE1-FITC-UMCS組顯示進入Caco-2細胞中的綠色微弱，即葉酸對納米粒的攝取促進作用顯著；3是肌動蛋白為被羅丹明-鬼筆環肽著色的紅色通道成像；圖9，4為藍色通道+綠色通道+紅色通道成像。共聚焦顯微鏡成像表明，本發明制備的由葉酸受體介導的葉酸-聚乙烯亞胺修飾的碳納米粒可較大量的被胃腸道細胞Caco-2吸收，提高裝載藥物的生物利用度。
[0060]實施例20—葉酸-聚乙烯亞胺修飾的碳納米粒促進紫杉醇的Caco-2細胞單層膜跨膜轉運
將密度為5 X IO5的Caco-2細胞接種在12孔板的聚碳酸酯插槽中，在孵箱中培養21天，前7天兩天換一次培養液，后14天每天換液，待測得的電阻值達到500 Ω/cm2，說明上皮細胞已形成，可以進行小腸上皮細胞的模擬，對紫杉醇的跨膜轉運進行考察。用PH 7.2的PBS對12孔板的上槽和下槽進行沖洗，然后將1500 μL的PBS加到孔板的下槽，在上槽中分別加入500 μL的紫杉醇濃度為10 μΜ的Taxol?，Taxol?和100 mM的維拉帕米的混合物，PTX-PE1-UMCS,PTX-FA-PE1-UMCS 等不同制劑。在 0.5h, lh，2h，4h 從下槽中取樣 100 μL,同時補加100 PL緩沖液PBS，將取出樣品采用高效液相法進行檢測。
[0061]圖10為不同紫杉醇制劑的表觀滲透系數實驗結果，在實驗過程中，電阻值沒有發生劇烈變化，說明制劑沒有打開Caco-2細胞單層膜的緊密連接，保持了其完整性，在下槽中測得的紫杉醇都是經過跨膜轉運得到。雖然表面活性劑聚氧乙烯蓖麻油對P-糖蛋白外排泵有一定的抑制作用，，Taxol?仍然表現出相當低的表觀滲透系數(Papp)。與維拉帕米(P-gp的抑制劑)聯合給藥后，紫杉醇的跨膜轉運得到了明顯的提高。PTX-PE1-UMCS納米粒制劑的PTX跨膜轉運量是Taxol?的3.2倍，由于納米顆粒表面的正電性更易于粘附在腸道粘膜(負電性)上，因此增加納米顆粒的胞吞的幾率。同時，納米粒保護裝載的紫杉醇分子繞過P-gp的外排。由于葉酸受體在腸道中的豐富表達，促進了 PTX-FA-PE1-UMCS納米顆粒攝取和轉運，藥物包封在葉酸修飾的納米粒中具有最好的滲透性，增加了 PTX的跨膜轉運達5.7倍和Taxol?相比。
【權利要求】
1.一種具有祀向定位釋藥的介孔碳納米粒系統，其特征在于，所述的納米粒由荷正電的葉酸-聚乙烯亞胺復合物與荷負電的羧基化碳納米粒經靜電復合作用自組裝而成。
2.根據權利要求1所述的納米粒系統，其特征在于，所述的靜電復合作用為:將葉酸-聚乙烯亞胺復合物和羧基化碳納米粒分別分散在去離子水中，混合后，經過超聲5-15min,制得納米粒。
3.根據權利要求1-2任何一項所述的納米粒系統，其特征在于，所述的聚乙烯亞胺重均分子量為20 kD-30KD。
4.根據權利要求1或2所述的納米粒系統，其特征在于，所述的葉酸-聚乙烯亞胺復合物是將3-6個葉酸分子接枝在一個聚乙烯亞胺分子上。
5.制備權利要求1-4任何一項所述的納米粒系統的方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)球形介孔娃的制備: (2)羧基化球形介孔碳的制備； (3)葉酸-聚乙烯亞胺修飾的介孔碳納米粒的制備。
6.根據權利要求5所述的納米粒系統，其特征在于，步驟(1)利用十六烷基三甲基溴化銨形成膠束作為致孔 劑，正硅酸乙酯作為硅源，室溫下水解制得； 步驟(2)的制備方法包括如下步驟:將300-700mg均一化介孔碳球放入20_50mL的0.5-1M過硫酸銨的硫酸(1-2M)溶液中，50-70°C回流反應4_8小時。
7.權利要求1-4任何一項所述的納米粒系統在促進藥物吸收中的應用。
8.根據權利要求7所述的應用，其特征在于，所述的藥物優選阿霉素，喜樹堿或紫杉醇。
9.根據權利要求7所述的應用，其特征在于，將藥物裝入權利要求5所述的步驟2)中的羧基化球形介孔碳中，然后按照步驟3)的方法制備含藥的葉酸-聚乙烯亞胺修飾的介孔碳納米粒。
10.如權利要求7所述的應用，其特征在于，取權利要求5所述的羧基化球形介孔碳，藥物、溶解于二氯甲烷中，得到藥物的二氯甲烷溶液，將羧基化球形介孔碳加入到藥物二氯甲烷溶液，使藥物:羧基化球形介孔碳比例分別為1:3攪拌混合平衡，加熱揮發除去有機溶劑，真空干燥，得到載藥的羧基化球形介孔碳給藥系統。
【文檔編號】A61K47/04GK103990133SQ201410191719
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年5月7日 優先權日:2014年5月7日
【發明者】王思玲, 姜同英, 萬龍 申請人:沈陽藥科大學