一種治療腫瘤的藥物組合物及用途
【專利摘要】本發明提供一種用于治療腫瘤的組合藥物，由吖啶黃或藥學上可接受的鹽、美法侖或藥學上可接受的鹽和藥用載體組成，其中吖啶黃以及美法侖的摩爾配比為1∶100到1∶10，所述腫瘤包括血液性腫瘤及實體瘤。藥物形式選用將吖啶黃及美法侖分別制成單一的制劑，或者藥物形式選用將吖啶黃及美法侖制成復方制劑。本發明制備的組合藥物，可以提高腫瘤治療效果，并可以降低其毒性，減緩腫瘤生長的速度。
【專利說明】一種治療腫瘤的藥物組合物及用途
【技術領域】
[0001]本發明屬于藥物用途領域，涉及用于治療腫瘤的聯合用藥物組合物，尤其涉及用于治療腫瘤的吖啶黃和美法侖的藥物組合物，及其制藥用途。
【背景技術】
[0002]腫瘤是世界嚴重的公共衛生問題，根據2012年中國腫瘤年報的數據，目前我國腫瘤的發病率為285.91/10萬，全國每年新發腫瘤病例估計約為312萬例，平均每天每分鐘有6人被診斷為惡性腫瘤。我國居民一生罹患腫瘤的概率為22%。全國腫瘤死亡率為180.54/10萬。估計每年因癌癥死 亡病例達270萬例。我國居民因癌癥死亡的幾率為13%。
[0003]烷化劑是臨床常用的化療藥物，其在體內能形成缺電子中間體，使生物大分子富電子基團烷基化，從而改變生物大分子的結構域功能，使細胞的分裂增殖受到抑制或引起細胞死亡。烷化劑對快速分裂增殖的惡性腫瘤細胞最為敏感，但由于其還影響體內增值較快的正常細胞，因此存在著一定的毒性。以多發性骨髓瘤及晚期卵巢癌的一線用藥美法侖(又名馬法蘭、米爾法蘭或左旋苯丙氨酸氮芥等)為例，其能夠引起患者的骨髓抑制，導致白細胞及血小板下降。因此臨床上大多采取聯合用藥的方案，以在保持和提高抗腫瘤藥物療效的同時，減少其毒性作用。
[0004]吖啶黃是由鹽酸3，6- 二氨基-10-甲基吖啶及3，6- 二氨基吖啶所組成的混合物，是一類煤焦油中提取的染料。它于1921年被德國科學家Paul Ehrlich發現可用作抗菌藥，并在第一次世界大戰期間被廣泛應用于睡眠病的治療。此外其稀水溶液還被用作表面抗菌劑或口服尿路抗菌藥；隨著抗生素的問世及應用，吖啶黃逐漸退出臨床，目前多被當做獸藥使用。長期的臨床應用顯示，給予病人吖啶黃五個月以上，未發現有明顯的毒副作用反應，這顯示了其在臨床應用中良好的前景。目前，尚未有將吖啶黃同烷化劑聯合使用用于治療腫瘤的報道。
【發明內容】
[0005]本發明的目的是針對上述現有技術存在的不足，提供一種用于治療腫瘤的藥物組合物，由吖啶黃或藥學上可接受的鹽、美法侖或藥學上可接受的鹽組成，其中吖啶黃以及美法侖的摩爾配比為1:100到1:10。和藥用載體
所述的吖啶黃為鹽酸3，6- 二氨基-10-甲基吖啶及3，6- 二氨基吖啶的混合物，CAS號為 8048-52-0。
[0006]所述的可藥用的鹽為與酸加成的鹽，選用的酸為鹽酸、富馬酸、馬來酸、檸檬酸或琥珀酸。
[0007]本發明的另一個目的是提供所述的組合藥物在制備治療腫瘤的藥物中的應用。所述吖啶黃的有效體外治療濃度為0.1-lOMmol/L，優選0.5-1.5Mmol/L，有效體內治療濃度為l_50mg/kg體重(裸鼠),優選5-20mg/kg體重(裸鼠)。所述的腫瘤包括血液性腫瘤及實體瘤。[0008]所述可藥用載體為本領域技術人員所公知和常用的，如丸劑、片劑、膠囊劑等中的填充物或載體物質，這些物質通常被保健專家認可用于這一目的且作為藥劑的非活性成分。
[0009]所述組合藥物可以制成任意劑型。
[0010]應當理解，本發明所述的藥物使用包括以下兩種方式:
一是將吖啶黃及美法侖分別制成單獨的制劑，兩種制劑的劑型可以不同，并且可聯合使用的藥物可以采用其現有劑型。在使用時可以將這兩種藥物先后使用，也可以同時使用。將兩種藥物先后使用時，吖啶黃的單獨制劑可以首先服用。依次給藥時，給予第二種組分時第一種組分應該還未喪失其在體內的有效作用。
[0011]二是將上述吖啶黃及美法侖制成單一的復方制劑，使用時同時服用。
[0012]配置藥物組合物及使用時，需要產生作用的吖啶黃及美法侖的劑量可以改變，且最終由醫務人員決定，所考慮的因素包括患者年齡及疾病性質和嚴重程度。[0013]本發明做了一系列相關實驗研究證明，將吖啶黃與美法侖聯合使用的藥物聯合用藥，可以提高腫瘤治療效果，并可以降低其毒性，減緩腫瘤生長的速度。所述的腫瘤包括血液性腫瘤及實體瘤。
[0014]吖啶黃本身曾在臨床上作為抗菌藥使用，未曾見其被用于臨床治療腫瘤的相關報道。同時吖啶黃與烷化劑美法侖的聯合用藥也未見報道。
[0015]本發明公開了一種用于治療腫瘤的吖啶黃-美法侖聯合用藥物，包括抗菌藥吖啶黃以及烷化劑美法侖或其藥學上可接受的鹽且任選的可以包括一種或多種可藥用載體。本申請的發明人做了一系列相關實驗研究，結果表明，將未曾在臨床上用于腫瘤治療的抗菌藥吖啶黃與雙功能烷化劑美法侖聯合用藥后，可以顯著提高腫瘤治療效果，而不增加其毒性，表現出顯著的藥理學協同作用。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0016]圖1為體外通過磺酰羅丹明B (Sulforhodamine B, SRB)比色法或水溶性四唑鹽-WST-8比色法測定的對宮頸癌、結腸癌及多發性骨髓瘤細胞系的增值影響。其中在結腸癌HCT116細胞中所使用吖啶黃的濃度為0.5Mmol/L，在宮頸癌Hela及多發性骨髓瘤RPM1-8226細胞中所使用吖啶黃的濃度為0.75Mmol/L。
[0017]圖2為體外通過PI單染結合流式細胞術測定的吖啶黃與美法侖聯合用藥物對宮頸癌、結腸癌及多發性骨髓瘤細胞系凋亡的影響示意圖。其中在宮頸癌Hela上，對照組凋亡率3.88 ± 1.29%，吖啶黃單用組凋亡率6.65 ± 1.82%，美法侖單用組凋亡率24.82土 1.48%，合用組凋亡率40.35±0.01% ;在結腸癌HCTl 16上，對照組凋亡率
5.60±0.38%，吖啶黃單用組凋亡率13.16±0.61%，美法侖單用組凋亡率17.69±1.65%，合用組凋亡率38.49±1.97% ;在多發性骨髓瘤RPM1-8226上，對照組凋亡率0.04±0.02%,吖啶黃單用組凋亡率0.09±0.09%,美法侖單用組凋亡率26.52± 1.57%，合用組凋亡率50.33 ±2.72%。
[0018]圖3為體內裸鼠實驗中，吖啶黃與美法侖聯合用藥物對宮頸癌細胞移植瘤的影響示意圖。
[0019]圖4為體內裸鼠實驗中，吖啶黃與美法侖聯合用藥物對結腸癌細胞移植瘤的影響示意圖。
[0020]圖5為體內裸鼠實驗中，利用TUNEL標記法測定的宮頸癌細胞凋亡示意圖。正在凋亡的細胞因連接上的辣根過氧化酶HRP與二氨基聯苯胺DAB發生反應而呈現深棕色。
【具體實施方式】
[0021]本發明結合附圖和實施例作進一步的說明。
[0022]實施例1:結腸癌此1'116、宮頸癌抱1&及多發性骨髓瘤1?^1-8226細胞株中，吖啶黃與美法侖單用及合用對細胞增殖的影響。
[0023]實驗材料:結腸癌HCT116、宮頸癌Hela及多發性骨髓瘤RPM1-8226細胞株購自中科院上海細胞庫；吖啶黃、美 法侖及磺酰羅丹明B購自Sigma公司；水溶性四唑鹽-WST-8試劑盒購自Dojindo東仁化學科技公司。
[0024]實驗方法:
Cl)細胞處理:細胞以0.5X104個細胞每孔的密度接種于96孔板，加入吖啶黃DMSO溶液(終濃度0.5或0.75μΜ)預處理8小時后再加入梯度濃度的美法侖，處理24小時。
[0025](2)細胞增殖測定:對于貼壁細胞，棄去上清液后加入100μL三氯乙酸，4°C固定I小時后三蒸水沖洗、晾干；加入100μL乙酸溶液配制的磺酰羅丹明B作用15分鐘后，用10%乙酸溶液沖洗，晾干。加入150μL Tris堿溶液，振蕩溶解后用酶標儀測定Α540并計算增殖抑制率。對于懸浮細胞，直接加入20μL水溶性四唑鹽WST-8，37°C孵育2到4小時后用酶標儀測定A450并計算增殖抑制率。
[0026]實驗結果:加入吖啶黃預處理能夠顯著增加美法侖對腫瘤細胞的增值抑制作用，根據國際通用的合用協同指數Cl計算，證明兩藥之間存在良好的協同作用。增殖抑制率參見圖1。
[0027]實施例2:吖啶黃增加美法侖引起的腫瘤細胞凋亡。
[0028]實驗材料:細胞株及藥品來源同實施例1。溴化乙錠(PI)購自BD公司。
[0029]儀器:FACSCalibur流式細胞儀購自BD公司。
[0030]實驗方法:貼壁細胞以每孔IO6個的密度接種于Corning 6孔細胞培養板，懸浮細胞以IO6每mL培養液的密度接種于3mL細胞培養瓶。過夜后加入吖啶黃預處理8小時，然后加入美法侖共同培養。24小時后將離心收集得到的細胞用PBS洗3次，加入75%酒精在-20°C固定2小時，離心并洗滌3次后加入含RNA酶的PBS溶液消化30分鐘，加入溴化乙錠染色并用流式細胞儀測定sub-Gl期細胞百分比，從而確定細胞凋亡率。
[0031]實驗結果:吖啶黃與美法侖合用組細胞凋亡率對比單用組有顯著增加，參見圖2。
[0032]實施例3:吖啶黃可以增加美法侖對于裸鼠移植瘤的作用
實驗材料:藥物來源同實施例1，裸鼠來自上海斯萊克公司，均為雌性，2-3周齡。
[0033]實驗方法:裸鼠隨機分為4個實驗組，分別為對照組、吖啶黃組、美法侖組合吖啶黃美法侖合用組，每組5只，皮下接種Hela細胞株或HCT116細胞株，IO7個細胞每只，每天或隔天測定瘤體積并記錄。待腫瘤長至70mm3時，對照組給予生理鹽水，吖啶黃組給予IOmg/kg，美法侖組給予0.25mg/kg,隔天給藥，合用組兩種藥物都給。實驗周期約為2周。
[0034]實驗結果:合用組腫瘤生長明顯慢于其他3組，實驗結束后取出腫瘤并稱量，瘤重也顯著小于其他3組。參見圖3、圖4及表1、表2。
【權利要求】
1.一種用于治療腫瘤的藥物組合物，其特征在于，由吖啶黃或藥學上可接受的鹽、美法侖或藥學上可接受的鹽組成，其中吖啶黃或藥學上可接受的鹽與美法侖或藥學上可接受的鹽的摩爾配比為1:100到1:10，所述的吖啶黃為鹽酸3，6-二氨基-10-甲基吖啶及3，6-二氨基吖啶的混合物，CAS號為8048-52-0，所述的腫瘤包括血液性腫瘤及實體瘤。
2.根據權利要求1所述的一種用于治療腫瘤的藥物組合物，其特征在于，所述的可藥用的鹽為與酸加成的鹽，選用的酸為鹽酸、富馬酸、馬來酸、檸檬酸或琥珀酸。
3.根據權利要求1或2所述的一種用于治療腫瘤的藥物組合物在制備治療腫瘤藥物中的應用，其特征在于，藥物形式選用將吖啶黃及美法侖分別制成單一的制劑，或者藥物形式選用將吖啶黃及美法侖制成復方制劑。
4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于，單一制劑使用選擇同時服用或按順序服用，按順序服用時先服吖啶黃制劑再服美法侖制劑，且服用美法侖制劑需在吖啶黃制劑在體內任然保持有效濃度范圍時。
5.根據權利要 求4所述的應用，其特征在于，吖啶黃的有效體內治療濃度為l-50mg/kg體重。
【文檔編號】A61K31/196GK103933044SQ201410190126
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年5月7日 優先權日:2014年5月7日
【發明者】楊波, 何俏軍, 曹戟, 朱虹, 應美丹, 林冠宇 申請人:浙江大學