一種注射用桂皮醛亞微乳劑的制備方法及其應用的制作方法

一種注射用桂皮醛亞微乳劑的制備方法及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種桂皮醛的亞微乳注射劑的制備方法及應用，所述組成成分按重容百分比計為：油為5.1％-30.6％，乳化劑為0.5％-3.0％，滲透壓調節劑為1％-4％，穩定劑為0.1％-0.3％，抗氧化劑為0.05％-0.2％，其余成分為蒸餾水。該亞微乳注射劑具有良好的穩定性、生理相容性和安全性；制備方法簡單、質量可控并可工業化生產；本藥物可以用于治療腫瘤等疾病。
【專利說明】一種注射用桂皮醛亞微乳劑的制備方法及其應用

【技術領域】
[0001]本發明涉及一種桂皮醛亞微乳注射劑的制備方法及其應用。

【背景技術】
[0002]桂皮醒(cinnamaldehyde, CA)亦稱肉桂醒、桂醒、β -苯丙烯醒、3_苯基_2_丙烯醛，廣泛存在于肉桂油、桂皮油、藿香油、風信子油和玫瑰油等精油中；目前桂皮醛已可以化學合成。桂皮醛的分子式為C9H8O,分子量132.16，CAS號:104-55-2，EINECS號:203-213_9，FEMA:2286 ;其密度:1.046-1.520，熔點:~7.5°C，折光率:1.619-1.623，沸點:2530C0 桂皮醛常溫下為無色或淡黃色液體；具有強烈的桂皮油和肉桂油的香氣，溫和的辛香氣，其香氣強烈、持久。桂皮醛難溶于水、甘油和石油醚，易溶于乙醇、乙醚中，能隨水蒸氣揮發；在強酸性或者強堿性介質中不穩定，易導致變色，在空氣中易氧化。桂皮醛有順式和反式二種異構體，目前，商用的桂皮醛無論是天然的還是合成的桂皮醛均為反式異構體。
[0003]桂皮醛具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒、降血糖、解熱、鎮痛等多種藥理作用。
[0004] 黃敬群等[中國新醫藥，2004，3 (9):61-63]研究發現桂皮醛對體外培養的多種腫瘤細胞，如人皮膚黑色素瘤A375細胞、肝細胞瘤HCC-9727細胞、腎癌GRC-1細胞、乳腺癌SKBr-2HL細胞、宮頸癌Hela細胞、胃癌SGC-7901細胞、食道癌Eca_109細胞等均具有不同程度的增殖抑制作用；Moon等[Drug Chem Toxieol.1983,6 (6):521-535]證實桂皮醛對小鼠白血病L1210細胞的活性抑制率可達到50% ;劉黎瓊等[中國醫藥導報，2011 ；13(6) =1044-1045]研究發現，桂皮醛呈時間和劑量依賴性抑制慢性髓細胞白血病細胞株K562增殖，使細胞周期阻滯于G2/M期并誘導細胞凋亡；桂皮醛還可顯著抑制急性髓系白血病細胞株U937細胞增殖、誘導其凋亡；桂皮醛抑制細胞增殖與其阻滯細胞周期有關；研究表明抑制U937細胞VEGF分泌可能是桂皮醛抗白血病重要機制之一[臨床血液學雜志，2011 ;24(11):665-671] ? Shux[B1chem Pharmacol.2012 ;83 (9):1229-1240]和Warner [Melanoma Res.2010 ；20 (2):85-96]的研究亦證明桂皮醒具有明顯抗腫瘤作用。曹桂芬[國口腔醫學雜志，2013 ；40(1):10-13]等證實，256mg/L、128mg/L、64mg/L、32mg/L 桂皮醛對人口腔鱗狀癌細胞的增殖表現出明顯抑制作用，且抑制作用隨著藥物濃度的升高而加強，呈現明顯的劑量-效應關系；藥物作用24小時，16mg/L組對人舌鱗狀細胞癌Tca8113細胞的抑瘤率達到58.33% ；32mg/L組對KB細胞及人頰黏膜鱗狀細胞癌BCa⑶885細胞株的抑制率分別為66.08%,76.61%，其抑制率隨著藥物作用時間的延長而增加。周凌等[第三軍醫大學學報，34(7) =602-604]發現10 μ mol/L桂皮醛作用24h即能抑制A375細胞增殖，10 μ mol/L、20 μ mol/L、40 μ mol/L桂皮醛的抑制強度具有統計學意義(P < 0.01)；40 μ mol/L桂皮醛作用72h的細胞增殖抑制率最高達(88.91±4.5) % ;隨桂皮醛作用時間延長，A375細胞分泌VEGF的量逐漸減少，72h后各濃度間的抑制作用具有統計學意義(P<0.01) ;40ymol/L桂皮醛作用72h后A375細胞分泌的VEGF含量最低，為9.55pg/mL。王躍新等[中國微生態學雜志，2011 ；23 (6) 516-524]研究證實，桂皮醛能上調宮頸癌HeLa細胞P21蛋白表達和下調⑶K4蛋白表達。我們早年的實驗研究發現，以小鼠移植性腫瘤為模型，桂皮醒25mg/kg,50mg/kg和100mg/kg三個劑量組對鼠源性肉瘤S18tl的生長均具有明顯抑制作用，其瘤重抑制率分別為7.69%,33.08%和46.92%，而且桂皮醛對荷瘤小鼠胸腺和脾臟指數無明顯影響[中國臨床康復，2006 ;10 (11):107-110] ;50mg/kg、100mg/kg桂皮醛對SGC-7901人源性胃癌的瘤重抑制率分別為41.67%,60.61% [解放軍藥學學報，2006 ；22 (5) =343-346]。我們近期研究證實，桂皮醛原料藥及亞微乳對人源性A549肺癌細胞的IC50 分別 1.476 μ g/mL 和 0.149 μ g/mL ；500mg/kg 和 250mg/kg 桂皮醒原料藥對 A549 裸鼠移植瘤的瘤重抑制率分別為82.91%和48.72%，而順鉬注射液(lmg/L)為70.94%。桂皮醛具有抗腫瘤作用是肯定的，但其作用機制尚不完全清楚。Wu等[Life Sc1.2005 ；77(8):938-951]發現，桂皮醛通過Bcl-2蛋白家族中部分具有促進凋亡活性的蛋白和激活促分裂素原活化蛋白激酶信號通路誘導人肝癌細胞PLC/PRF/5凋亡；Ka等[Cancer Lett.2003 ；196(2):143-152]認為桂皮醛通過活性氧介導的線粒體通透性轉換以及由此產生的細胞色素C的釋放誘導人早幼粒白血病HL-60細胞凋亡，同時還證實給小鼠長期服用桂皮醛可延緩肝癌的發生，抑制腫瘤細胞的增殖；其機制可能與桂皮醛誘發機體活性氧簇(ROS)介導線粒體膜滲透性轉換并促使細胞色素C釋放有關。
[0005]桂皮醛對大腸桿菌、枯草桿菌、金黃色葡萄球菌、白色葡萄球菌、傷寒和副傷寒甲桿菌、肺炎球菌、產氣桿菌、變形桿菌、炭疽桿菌、腸炎沙門氏菌，霍亂弧菌等均有明顯抑制活性，且對革蘭氏陽性菌殺菌效果顯著，可用于治療多種細菌感染而引起的疾病[廣東飼料，2012;21(12):29-32] ? 馮雅君等[河北醫藥，2011 ；33(21) =3324-3325]研究桂皮醛了的抗菌活性，結果發現桂皮醛組在第3天將糞腸球菌全部殺死，與甲醛甲酚組、氫氧化鈣丙二醇糊劑組無差別，提示桂皮醛對口腔根管內糞腸球菌有很強的抗菌作用，其作為一種新型根管消毒藥物具有良好應用前景。劉蓉等[中藥藥理與臨床，2012，28 (2):75-78]證實，桂皮醛能夠明顯抑制甲型流感病毒(H1N1)在犬腎傳代細胞中的增殖，并對流感病毒株感染小鼠有較好的治療作用；同年該團隊的湯奇等[時珍國醫國藥，2012，23(7) =1622-1624]進一步發現桂皮醛在雞胚內具有良好的抗流感病毒作用；之后，劉蓉團隊[中藥藥理與臨床，2013 ；29(4):33-36]發現0.264mg/kg、0.132mg/kg桂皮醛可有效減少病毒性肺炎小鼠的死亡；還證實桂皮醛抗H1N1作用機制可能與其激活TLR7信號通路、活化IRAK-4、誘導IFN-B高表達有關[劉蓉，等.中草藥，2013 ;44(11):1460-1464]。汪昆等[食品與發酵工業，2012，38(3):68-72]發現桂皮醛具有顯著抗真菌作用，特異性抑制真菌細胞壁葡聚糖和幾丁質的合成是其抑制真菌生長的主要機制之一。王剛生等[中國中醫藥信息雜志，2013 ；20 (6):41-43]比較了桂皮醛等三種中藥單體成分對肺念珠菌體外的抗菌活性，發現桂皮醛對白色念珠菌、熱帶念珠菌的最低抑菌濃度為0.02 μ g/mL，對克柔氏念珠菌的最低抑菌濃度為0.04 μ g/mL，對白色念珠菌、熱帶念珠菌的最低殺菌濃度為0.04μ g/mL，對克柔氏念珠菌的最低殺菌濃度為0.08 μ g/mL，顯示其抗真菌作用最強。代立娟等[中國老年學雜志，2013 ;33 (6) =1309-1312]證實，桂皮醛在一定濃度范圍內可通過直接滅活病毒、抑制病毒復制及作用于病毒吸附階段而發揮抗呼吸道合胞病毒的作用。我們的研究證實，桂皮醛還具有明顯抗柯薩奇病毒[丁媛嬡，等.中國病原生物學雜志，2010 ;5 (5) =321-326/Yuanyuan Ding, etc.Am J Med Sc1.2010 ；340 (2):114-20]作用。
[0006]Subash等[Phytomedicine.2007 ；14(1):15_22]對鏈脲佐菌素誘發的糖尿病大鼠給予5mg/kg、10mg/kg和20mg/kg桂皮醒(從肉桂中提取)，I次/d,連續45d,治療組大鼠血糖明顯下降且呈劑量依賴性(63.29% )，同時高劑量組大鼠的糖化血紅蛋白、總膽固醇、三酰甘油水平均顯著降低(P <0.05)，血漿胰島素、肝糖原、高密度脂蛋白水平明顯升高。Kim等[J Ethnopharmacol.2006 ； 104 (1-2) =119-123]將肉桂提取物(主要含桂皮醛)灌胃給藥 6 周，50mg/kg/d、100mg/kg/d、150mg/kg/d 和 200mg/kg/d 劑量組均能顯著降低 C57BL/Ks db/db型小鼠的血糖水平，其中以高劑量組降血糖作用最明顯。李鳴一等[武漢大學學報(醫學版)，2009;30(6):723-731]研究證實，桂皮醛的降糖調脂作用可能與升高糖尿病大鼠腓腸肌中IRS-1和降低P85a水平有關。
[0007]在Shu 等[J Asian Nat Prod Res.2010，12 (I):76_82]研究證實桂皮醛具有顯著解熱和鎮痛作用的基礎上，張暢斌等[中國中藥雜志，2012 ;37 (9) =1274-1278]進一步確證桂皮醛是肉桂抗炎解熱的主要活性成分之一，抑制PGE2生成是其主要作用機制，而桂皮醛抑制mPGES-1表達，是其下調C0X-2之外，抑制PGE2生成是另一分子機制；我們近期研究證實桂皮醛具有保護心肌缺血再灌注損傷等作用[Fan Song, etc.JEthnopharmacology.2013 ；150: 125-130]。
[0008]桂皮醛還在食品、衛生制品和農業防治病蟲害等領域具有廣泛的用途。如Michael [Annu.Rev.Food Sc1.Technol.2013.4: 163-90]綜述富含桂皮醒的桂皮油作為天然抗菌劑用于食品防腐。Sparagano[Annu.Rev.Entomol.2014.59:447-66]報道,桂皮醒可能成為新型家禽殺蝴劑等。
[0009]2.5mmol/kg桂皮醛給大鼠灌胃后24小時內，62 %從尿中、16 %從糞便中排出，72小時累積排泄量分別增加至86 %和24%;以相同劑量給小鼠腹腔注射24至72小時后，尿和糞便排出量依次由54%增至63%、15%至26%。采用250mg/kg14C_標記桂皮醛給大鼠腹腔注射24小時后，雄鼠的尿和糞便中分別檢出89%和86%，雌鼠分別為90%和79%。Peters團隊采用250mg/kg桂皮醛分別給大鼠和小鼠灌胃24小時后，發現該劑量的98%和85%桂皮醛經尿和糞便中排出；該結果在二名自愿受試成年人體內得到驗證，口服0.7mg/kg桂皮醒 8 小時，在尿中獲得 100%檢出[Bickers, etc.Food and Chemical Toxicology.2005 ；43:799-836]。Yingrong 等[Euro J.Drug Metabolism and Pharmacokinetics.2009 ；34(1):51-56]進一步研究了桂皮醛的藥代動力學，發現桂皮醛灌胃給予大鼠后部分在胃和小腸迅速代謝成桂皮酸，而絕大部分在肝臟中幾乎完全代謝成桂皮酸。而我們采用GC-MS研究證實[Hang Zhao, etc.J Pharmaceut B1med.2014 ；89:150-157],桂皮醒給大鼠灌胃后，有少量桂皮醛進入血液，其半衰期為6.7±1.5小時；研究還證實其在肺、心等組織中具有分布；該結果說明，桂皮醛雖然在進入體內后大部分很快被代謝成桂皮酸，但還有少部分以原型形式進入血液循環并發揮藥理作用。
[0010]桂皮醛的體內毒性較小，經口 LD5tl大鼠為2220mg/kg，豚鼠1160mg/kg ;小鼠腹腔注射的LD5tl為460mg/kg ;分別灌胃給大鼠和小鼠200mg/kg/d和550mg/kg/d桂皮醒2年無動物死亡，觀測食物消耗量、體重、生化和組織病理學等指標，綜合評價具有安全性；目前的研究資料尚未發現桂皮醒具有遺傳毒性和致癌性[Bickers, etc.Food and ChemicalToxicology.2005；43:799-836]。
[0011]富含桂皮醛的桂皮油已在醫藥輔料、食品和輕化工業中應用十分廣泛，但桂皮醛作為重要的醫藥原料藥至今尚未見新藥或制劑應用于臨床。易醒等[肉桂油納米乳注射劑的制備方法(201010273216.7)]提出肉桂油納米乳注射劑的制備方法，主要由肉桂油、復合乳化劑、助乳化劑、去離子水等組分構成的一種肉桂油納米乳注射劑體系。每100毫升納米乳注射劑液中含有肉桂油2-17克，復合乳化劑20-35克，助乳化劑10-15克，分散劑2_18克。在20°C-60°C下磁力攪拌均勻即得納米乳注射劑，封裝后進行滅菌。本乳化劑粒徑在25鹽-4011111之間，載藥量在2%-17%，包封率80%。歐陽五慶等[一種水包油型肉桂醛納米乳藥物(201110246102.8)]公開了一種水包油型肉桂醛納米乳藥物，該納米乳的粒徑在1-1OOnm之間，其原料組成為表面活性劑18.09% -37.19%、助表面活性劑0-6.86%、油0-8.62 %、肉桂醛0.10% -8.31%。彭雪萍[食品工業科技，2012 ；33(1) =138-140]采用飽和水溶液法制得肉桂醛-β -環糊精包合物，并研究了包合前后抗氧化及抑菌效果，證實包合物的抑菌強度分別是肉桂醛的1.10倍，山梨酸鉀的1.36倍，對酵母菌而言，分別是1.15和1.24倍，說明包合后比包合前的抑菌效果有所提高，且明顯好于山梨酸鉀。張清峰[食品與發酵工業，2006 ；32(8):60-71]采用懸浮液法，向100mg/mL的β -環糊精(⑶)懸浮溶液中加入摩爾比為1:1的桂皮醛，攪拌或振蕩數小時，混合物在4°C冰箱中存放12小時，使包合物結晶析出，過濾得包合物粗品用體積分數30%乙醇溶液洗2次，以便完全洗去吸附在β_⑶表面的桂皮醛，60°C真空干燥3小時，即得包結物。此外，王四旺團隊針對桂皮醛的藥理作用進行了較系統的研究，證實其具有抗柯薩奇病毒和抗非小細胞肺癌等藥理作用，并先后申報了中國發明專利[桂皮醛系列制劑及其制備工藝(200410073298.5)/肉桂油及其主成分肉桂醛抗肺癌的新用途(201210346901.7)]。
[0012]綜上，桂皮醛具有諸多肯定的藥理作用而且安全，為將其開發成治療腫瘤、炎癥(包括由細菌、病毒和真菌誘發的感染性疾病)、心腦血管和代謝等疾病的藥物奠定了重要基礎。但是，桂皮醛由于水溶性差、體內代謝不穩定，口服或靜脈給藥后迅速氧化為肉桂酸(cinnamic acid,⑶)，使得桂皮醒在血中的濃度很低,血管外給藥生物利用度不高(低于20% )，嚴重制約著桂皮醛的臨床應用。
[0013] 亞微乳(submicro emuls1n)是以植物油為基質，由油相、乳化劑(磷脂)、水相制成粒徑在10-1OOOnm范圍的穩定的0/W型分散體系。藥物可包封于油相和磷脂界面膜中，外觀呈不透明的渾濁或乳狀。作為一種新型藥物轉運系統，它可選擇性地蓄積于炎癥及腫瘤部位，使治療藥物在靶區濃度超出傳統制劑的數倍至數百倍，明顯提高療效。同時能夠延長藥物的半衰期，減少藥物在正常組織分布量，減輕不良反應，達到高效低毒的效果。
[0014]靜脈注射亞微乳從載藥與否的角度可分為兩類:一類是以提供高能量與人體必需脂肪酸為目的的營養型靜脈注射脂肪乳劑，它以植物油脂為主要成分，經加入乳化劑與注射用水而制成水包油型乳劑，可與氨基酸輸液、維生素、電解質適當配伍，是一種比較理想的靜注營養劑。各國靜脈注射脂肪乳劑的處方基本相同，多以長鏈甘油三酸酯(LCT)為油相，精制天然卵磷脂為乳化劑，甘油為等滲劑，經高壓均質制成的0/W型乳劑，如Intralipid、LiposynI1、Lipofundin等。另一類是以提高難溶性藥物的溶解度、減少靜脈刺激性、提高藥物靶向性等為目的制成的載藥型靜脈注射用脂肪乳劑。近年來上市的品種主要有地西泮、異丙酚、依托咪酯、前列腺素E、棕櫚酸地塞米松和脂溶性維生素、前列地爾等靜脈注射乳劑，它們多以Intralipid、LiposynI1、Lipofundin脂肪乳注射液為基本處方改進制得。目前還有很多藥物處于研究中，如鹽酸布比卡因、鴉膽子油乳、粉防己堿、大蒜油、紫杉醇、伊曲康唑、兩性霉素B、替拉扎特等。
[0015]羥基喜樹堿對動物及人體實體瘤均有較好的療效，但由于其水不溶、脂難溶的性質，使得目前市售羥基喜樹堿注射液抗腫瘤活性降低、給藥頻繁，胃腸道不良反應嚴重，在一定程度上限制了其應用。將羥基喜樹堿制成乳劑靜脈給藥后，顯著延長了羥基喜樹堿在體內的循環時間，同時顯著改變了藥物的組織分布，使得藥物在吞噬細胞比較豐富的肝、脾內高濃度蓄積，在治療RES系統腫瘤時能提高局部藥物濃度，減小全身的毒副作用[吳泊.羥基喜樹堿靜脈注射脂肪乳的研究.碩士學位論文，2009]。
[0016]因此，本發明旨在創制一種注射用桂皮醛亞微乳新型制劑，使其在藥物組成、制備方法等關鍵技術區別于現有制劑的基礎上，同時具備聞選擇性和聞效低毒特性，用于治療腫瘤、炎癥(包括由細菌、病毒和真菌誘發的感染性疾病)、心腦血管和代謝等疾病，以期產生巨大的社會和經濟效益。
[0017]現有的專利文獻CN201110246102.8公開了一種水包油型肉桂醛納米乳藥物，處方為每100克納米乳中表面活性劑的重量百分比為18.09-37.19%，助表面活性劑的重量百分比為0-6.86%，油的重量百分比為0-8.62%，肉桂醛的重量百分比為0.10-8.31%，余量為蒸餾水。其制備方法并沒有明確寫出，只是在實施例中提到制備方法為先將吐溫-80和無水乙醇、1，2_丙二醇混合、攪拌均勻，將肉桂醛和維生素E油混合、攪拌均勻，然后將這兩個溶液混合，攪拌均勻，再緩慢向混合物中滴加蒸餾水，邊加邊攪拌,加蒸餾水和攪拌過程中該混合物體系會出現由稀變粘稠，又由粘稠變稀的一系列變化，直至形成水包油型納米乳。該專利文獻公開的是肉桂醛納米乳制劑，其除了使用維生素E作為油相之外，還使用了吐溫-80、聚氧乙烯氫化蓖麻油、聚氧乙烯蓖麻油等表面活性劑；此外，還加入了一定的助表面活性劑，所制備的產品與我們申請制備的注射劑亞微乳在配方、制備工藝、劑型等方面具有本質區別。另外，該專利文獻所制備的肉桂醛納米乳制劑用于外用和口服，其主要用途為抗菌；而我們申請制備的制劑給藥途徑為靜脈注射，主要用于腫瘤等疾病的治療，配方中不含吐溫類表面活性劑，有效克服了吐溫可能產生的過敏性和溶血性[張美玉.中國中藥雜志，2011 ；36(14):1911-1915]和生殖毒性[王慶利等.毒理學雜志，2006 ；20(4):262-264]等不良反應。


【發明內容】

[0018]本發明針對桂皮醛水難溶、生物利用度低的特點，提供一種水包油型、具有良好水溶性、制劑穩定并兼優緩釋性能的桂皮醛亞微乳注射劑。
[0019]本發明的技術方案:一種桂皮醒亞微乳注射劑，包含桂皮醒、油、乳化劑、穩定劑、抗氧化劑。油的重容百分比為5.1% -30.6%，乳化劑的重容百分比為0.5% -3.0%，滲透壓調節劑的重容百分比為1% _4%，穩定劑的重容百分比為0.1%-0.3%，抗氧化劑的重容百分比為0.05% -0.2% ;其余成分為蒸餾水。
[0020]所述亞微乳注射劑pH值為6.0-8.0,優選為6.5-7.5。亞微乳注射劑的平均粒徑范圍為 150-200nm。
[0021]所述的油為精制大豆油、花生油、魚油、椰子油、麻油、中鏈甘油單酯、中鏈甘油雙酯、中鏈甘油三酯中的I種或I種以上。
[0022]所述的乳化劑為大豆磷脂或蛋黃卵磷脂，其中磷脂酰膽堿的含量為80%以上。
[0023]所述的穩定劑為油酸或其鹽、膽酸或其鹽、脫氧膽酸或其鹽的一種或一種以上。
[0024]所述的滲透壓調節劑為丙三醇。
[0025]所述的抗氧化劑為維生素E。
[0026]本發明提供一種桂皮醛亞微乳注射劑的制備方法，包括以下步驟:
[0027](I)油相的制備:油中分別加入乳化劑和桂皮醛，攪拌使其溶解，作為油相；
[0028](2)水相的制備:將穩定劑和滲透壓調節劑加入到水中，攪拌使其溶解，作為水相；
[0029](3)初乳的制備:將步驟(1)油相加入步驟(2)水相中，高速剪切分散，形成初乳；
[0030](4)高壓勻化:將步驟(3)初乳調pH至6.0-7.5，高壓勻化，得精乳；
[0031](5)灌裝:將精乳灌封至10ml西林瓶中；
[0032]說明:Α.步驟(1)-(5)均在氮氣保護下操作；
[0033]B.將灌裝好的精乳在高壓滅菌鍋中進行滅菌。
[0034]C.步驟(3)所述的高速剪切分散時間為10-30分鐘，剪切速度為8000-20000rpm，溫度為55-65°C;步驟(4)所述的高壓勻化壓力為600-2000bar，勻化次數為5_8次，溫度為15-300C ;步驟(7)所述的滅菌條件為121°C，15分鐘。
[0035]本亞微乳注射劑主要特征在于:(I)本亞微乳注射劑制備工藝科學、適于工業化生產；(2)配方原料來源豐富、使用安全且價格便宜，直接成本低廉；(3)本亞微乳注射劑的粒徑為150-200nm，包封率高(大于97% )，制劑穩定性好；(4)生物利用度較原料藥平均提高3倍，藥物活性以抗腫瘤作用為例平均提高5倍。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0036]圖1桂皮醛亞微乳注射劑成品照片。
[0037]圖2桂皮醛亞微乳注射劑粒徑測定分布結果示意圖。
具體實施方法
[0038]下面結合實施例對本發明作進一步的說明，但不以任何形式限制本發明。
[0039](一 )實施例
[0040]實施例1:桂皮醛亞微乳注射劑的制備
[0041]【處方】桂皮醒1.0g,精制大豆油20.7g,蛋黃卵磷脂2.4g,丙三醇5.4g,油酸鈉
0.2g，維生素E0.2g，注射用水加至200ml
[0042]【制備方法】
[0043](I)油相的制備:將精制大豆油20.7g加熱至55°C，加入蛋黃卵磷脂2.4g溶解，加入桂皮醛1.0g，攪拌使其溶解；
[0044](2)水相的制備:將油酸鈉和丙三醇加入水中溶解，加熱至55°C ；
[0045](3)初乳的制備:將步驟(1)油相加入步驟(2)水相中，溫度55°C，高速剪切分散，剪切速度20000rpm，時間10分鐘，形成初乳，快速降溫至15_30°C ；
[0046](4)高壓勻化:將步驟(3)初乳經高壓勻化3次，壓力1300bar，溫度控制在20°C ；
[0047](5)灌裝:將精乳灌封至西林瓶中；
[0048](6)步驟(1)-(5)均在氮氣保護下操作；
[0049](7)將灌裝好的精乳在高壓滅菌鍋中進行滅菌。
[0050]以下通過藥效學實驗進一步說明本發明所述藥物的有益效果。
[0051]實施例2:桂皮醛亞微乳注射劑的中試制備
[0052]【處方】桂皮醛10.0g，精制大豆油200.(^，蛋黃卵磷脂24.(^，丙三醇50.(^，油酸鈉2.0g,維生素E2.0g,注射用水加至2000mL
[0053]【制備方法】同實施例1。
[0054]實施例3:桂皮醛納米粒的制備
[0055]【處方】桂皮醛8.0g,吐溫-8064.0g,無水乙醇6.0g, 1，2_丙二醇4.0g,維生素E4.0g，注射用水120mL
[0056]【制備方法】按照歐陽五慶等(一種水包油型肉桂醛納米乳藥物)制備方法制備。
[0057]( 二)桂皮醛亞微乳注射劑理化性質檢測及其優效特性比較研究
[0058]1、亞微乳注射劑的理化指標
[0059](I)亞微乳的穩定性:經影響因素試驗，發現所制備的亞微乳注射劑(說明書附圖1:成品照片)在高溫(60±2°C )，高濕(RH75±5%，25±2°C )，強光照射(4500±500LX)條件下，10天內均穩定。
[0060](2)亞微乳粒徑:取本品，用蒸餾水稀釋1000倍后，用激光粒度測定儀測定粒徑，(中國藥典2010年版二部附錄IX E)，粒徑應在150-200nm之間(說明書附圖2:桂皮醛亞微乳注射劑粒徑測定分布結果示意圖)。
[0061](3)亞微乳的包封率:取本品500 μ L，用超濾離心管5000rpm離心10min，取濾液至1mL容量瓶中，用乙腈定容，吸取10 μ L進樣。
[0062] 照含量測定項下肉桂醛的測定方法進行測定，用C18柱為填充劑，乙腈-水-乙酸(60: 40: 0.05)為流動相，紫外分光檢測器288nm檢測。所測得的包封率應在97%以上。
[0063]2、亞微乳注射劑中桂皮醒含量
[0064]照高效液相色譜法(中國藥典2010年版二部附錄VD)測定。
[0065](I)色譜條件與系統適用性試驗:用C18柱為填充劑，乙腈-水-乙酸(60: 40: 0.05)為流動相，紫外分光檢測器288nm檢測。
[0066](2)標準曲線的制備:取肉桂醛10mg，置于10ml棕色容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，即為對照品貯備溶液(此液在-20°C下保存，可使用2個月)。精密量取對照品貯備溶液lmL、2mL、5mL、1mL和20mL，分別置50ml容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。精密量取上述五種對照品溶液各10 μ L注入液相色譜儀中，以濃度和對應的峰面積計算回歸方程。
[0067](3)供試品溶液的制備:用內容量移液管精密量取本品lmL，置250mL容量瓶中，用上述混合溶液稀釋至刻度，搖勻。
[0068](4)測定法:精密量取供試品溶液10 μ L，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，由回歸方程計算供試品含量。
[0069](5)結果:亞微乳注射劑中桂皮醛含量范圍為0.3% -1.2%。
[0070]3、細菌內毒素和無菌檢驗
[0071](I)細菌內毒素:取本品，用0.1moL/L鹽酸溶液調節pH值至6.5-7.5，依法檢查(中國藥典2010年版二部附錄XIE)，每ImL中含內毒素量不得超過0.5EU。
[0072](2)無菌:取本品不少于2瓶，用薄膜過濾法處理后，依法檢查(中國藥典2010年版二部附錄XIH)，應符合規定。
[0073]4、桂皮醛亞微乳注射劑與桂皮醛納米乳藥理活性評價
[0074]已證實桂皮醛具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒、降血糖、解熱、鎮痛等多種藥理作用，這里僅采用實施例2-3制備的桂皮醛亞微乳注射劑、桂皮醛納米乳劑等和常規共識抗腫瘤藥理實驗技術與方法，評價其藥理活性作用。
[0075](I)桂皮醛亞微乳注射劑與桂皮醛納米乳對A549腫瘤細胞抑制活性:取對數期生長的A549腫瘤細胞，用胰酶消化細胞，以含100mL/L小牛血清的RPML1640培養液配成
IX 15個/mL的細胞懸液，接種在96孔板中，每孔接種15(^匕于371: -5% CO2恒溫培養箱中培養24小時，隨即每孔中加入200 μ L含不同濃度桂皮醛的培養液，陽性藥對照組加多柔比星，陰性對照組加入與實驗組相同量的不含桂皮醛的亞微乳注射劑制劑，每組設6個平行孔，于37°C -5% CO2恒溫培養箱中培養48小時。棄去上清液，于終止前4小時每孔加入MTT (5mg/mL) 20 μ L，37°C -5% CO2恒溫培養箱中繼續培養4小時。小心棄去上清液，加入150 μ L/孔二甲基亞砜，在振蕩器上振蕩數分鐘，待結晶溶解后在波長為570nm的酶標儀上測A值，計算細胞生存率(表1)。
[0076]表1桂皮醛亞微乳注射劑等制劑對A549腫瘤細胞生存率的影響
[0077]

【權利要求】
1.一種水包油型桂皮醛亞微乳注射劑藥物，其特征在于該亞微乳注射劑的粒徑在150-200nm,由下列組分的原料組成:包含桂皮醛、油、乳化劑、穩定劑和抗氧化劑。油的重容百分比為5.1% -30.6%，乳化劑的重容百分比為0.5% _3.0%，滲透壓調節劑的重容百分比為1% -4%，穩定劑的重容百分比為0.1% -0.3%，抗氧化劑的重容百分比為0.05%-0.2%。其余成分為蒸餾水。
2.根據權利要求1所述的桂皮醛亞微乳注射劑，其特征在于所述的油為精制大豆油、花生油、魚油中的I種或I種以上。
3.根據權利要求1所述的桂皮醛亞微乳注射劑，其特征在于所述的乳化劑為大豆磷脂或蛋黃卵磷脂，其中磷脂酰膽堿的含量為80%以上。
4.根據權利要求1所述的桂皮醛亞微乳注射劑，其特征在于所述的穩定劑為油酸或其鹽、膽酸或其鹽、脫氧膽酸或其鹽的I種或I種以上。
5.根據權利要求1所述的桂皮醛亞微乳注射劑，其特征在于所述的滲透壓調節劑為丙二酉字。
6.根據權利要求1所述的桂皮醛亞微乳注射劑，其特征在于所述的抗氧化劑為維生素E0
7.一種制備桂皮醛亞微乳注射劑的方法，所述的方法包括以下步驟: (1)油相的制備:油中分別加入乳化劑和桂皮醛，攪拌使其溶解，作為油相； (2)水相的制備:將穩定劑和滲透壓調節劑加入到水中，攪拌使其溶解，作為水相； (3)初乳的制備:將步驟(1)油相加入步驟(2)水相中，高速剪切分散，形成初乳； (4)高壓勻化:將步驟(3)初乳調pH至6.0-7.5，高壓勻化，得精乳； (5)灌裝:將精乳灌封至100毫升西林瓶中； (6)步驟(1)-(5)均在氮氣保護下操作； (7)將灌裝好的精乳在高壓滅菌鍋中進行滅菌。
8.根據權利要求7的方法，其特征在于驟(3)所述的高速剪切分散時間為10-30分鐘，剪切速度為8000-20000rpm，溫度為55-65°C ;步驟⑷所述的高壓勻化壓力為600-2000bar，勻化次數為5_8次，溫度為15_30°C;步驟(7)所述的滅菌條件為121 °C，15分鐘。
9.桂皮醛亞微乳注射劑可作為人類或生物的腫瘤、炎癥(包括由細菌、病毒和真菌誘發的感染性疾病)、心腦血管和代謝等疾病治療藥物具有廣泛的應用前景。
【文檔編號】A61P9/00GK104069065SQ201410188916
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2014年4月30日 優先權日:2014年4月30日
【發明者】楊倩, 王四旺, 周暄宣, 周四元, 曹蔚, 謝艷華, 孫紀元, 湯海峰, 張云龍, 趙航, 袁佳妮 申請人:中國人民解放軍第四軍醫大學