一種腫瘤治療復合納米材料及其制備方法

一種腫瘤治療復合納米材料及其制備方法
【專利摘要】本發明提供了一種腫瘤治療復合納米材料及其制備，具體地，本發明提供了一種復合納米材料，所述的復合納米材料包括核心材料A-穩定劑B復合物：其中，核心材料A為氫化處理的金屬氧化物半導體納米材料，或氫化處理的金屬氧化物半導體納米材料和其他材料進行復合形成的復合材料。本發明的復合納米材料可以用于腫瘤光熱治療，或作為腫瘤藥物的載體等。
【專利說明】一種腫瘤治療復合納米材料及其制備
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種復合納米材料。具體地，本發明提供了一種可實現惡性腫瘤的治療或診斷，特別是光熱與化學藥物協同的腫瘤治療的復合納米材料，及其制備方法。
【背景技術】
[0002]光熱治療(Photothermal Therapy, PTT)是一種新的腫瘤治療模式。其基本原理是將光熱試劑積累在腫瘤部位，通過局部近紅外激光照射，光熱試劑將光能轉換為熱能，通過高溫將腫瘤殺死。該方法具有高選擇性與微創性，且可以避免傳統腫瘤治療方法所帶來的副作用，因此是腫瘤治療的熱點研究領域。基于腫瘤光熱治療的原理，尋找生物相容性好、近紅外吸收強、光熱轉化效率高、熱穩定性好的光熱治療材料是腫瘤光熱治療的重點研究方向，而發展多功能、多模式腫瘤光熱治療材料則是該領域的發展趨勢。光熱治療是一種非侵入式腫瘤局部治療技術，借助醫學成像手段，對腫瘤進行精確的成像定位，是光熱有效治療腫瘤的重要因素之一。因此，發展一種具有增強腫瘤組織醫學成像信號功能的光熱治療材料，提高腫瘤部位的成像靈敏度，必然能夠提高光熱治療惡性腫瘤的效果。此外，以光熱治療材料為載體，搭載抗腫瘤化療藥物形成的多模式治療試劑，不僅能夠實現化療藥物的靶向遞送與光控釋放、降低藥物副作用，而且由于熱消融作用，腫瘤細胞對化療藥物愈加敏感，表現出化療與光熱治療的協同增敏效應，克服了近紅外光穿透深度有限而造成的腫瘤消融不完全，從而極大地提高惡性腫瘤的治療效果。
[0003]因此，本領域迫切需要一種在生物環境下穩定性好，不易團聚，具有生物應用價值的光熱治療材料。

【發明內容】

[0004]本發明的目的是提供一種在生物環境下穩定性好，不易團聚，具有生物應用價值的光熱治療材料。
[0005]本發明的第一方面，提供了一種復合納米材料，所述的復合納米材料包括核心材料A-穩定劑B復合物:其中，
[0006]所述的核心材料A為氫化處理的金屬氧化物半導體納米材料，或氫化處理的金屬氧化物半導體納米材料和選自下組的材料進行復合形成的復合材料:磁性納米材料、上轉換發光納米材料、貴金屬納米材料、量子點、熒光材料，或其組合；
[0007]所述的穩定劑B選自下組:有機高分子聚合物、脂質體、微泡、白蛋白納米球，或其組合，其中，所述的有機高分子聚合物的聚合單體選自下組:C2-C10的不飽和醇、酸或胺、C2-C12的多羥基化合物、乳酸、羥基乙酸，或其組合。
[0008]在另一優選例中，所述的復合為物理負載和/或化學修飾。
[0009]在另一優選例中，所述的穩定劑B基本包覆核心材料A，或所述的穩定劑B包埋核心材料A。
[0010]在另一優選例中，所述穩定劑B含有用于進行進一步修飾或反應的官能團。[0011]在另一優選例中，所述的復合納米材料粒徑為5-50nm,較佳地為10_40nm。
[0012]在另一優選例中，所述的復合納米材料的平均水合粒徑為10_500nm，較佳地為50_200nm。
[0013]在另一優選例中，所述的復合納米材料在水溶液或生理溶液(如磷酸鹽緩沖液、血清、生理鹽水)中穩定，其中，所述的穩定指所述的復合納米材料在水溶液中不發生明顯的團聚。
[0014]在另一優選例中，所述的“不發生明顯的團聚”指所述的復合納米材料在水溶液中不發生透射電鏡可檢測到的團聚。
[0015]在另一優選例中，所述的復合納米材料在水溶液或生理溶液(如磷酸鹽緩沖液、血清、生理鹽水)中的平均水合粒徑為≤I μ m，較佳地為≤500nm，更佳地為≤300nm。
[0016]在另一優選例中，所述的復合納米材料在可見光與近紅外區具有光吸收。
[0017]在另一優選例中，所述的復合納米材料能夠將吸收的光能轉換為熱能；較佳地，所述的復合納米材料的光熱轉換效率為≥ 20%，較佳地為≥30%，更佳地為≥ 35%。
[0018]在另一優選例中，所述的復合納米材料具有低的細胞毒性。
[0019]在另一優 選例中，在濃度為≥200 μ g/mL,較佳地為≥300 μ g/mL,更佳地為^ 500 μ g/mL的情況下，所述的復合納米材料對細胞活性沒有明顯抑制。
[0020]在另一優選例中，所述的“沒有明顯抑制”指抑制率為≤20%，較佳地為≤15%。[0021 ] 在另一優選例中，所述的復合納米材料具有較好的生物相容性。
[0022]在另一優選例中，所述的復合納米材料具有以下特征:對生物體進行靜脈給藥24小時后，對該生物體器官功能和/或身體指標無明顯影響。
[0023]在另一優選例中，所述的復合納米材料還包括:與核心材料A-穩定劑B復合物偶聯的腫瘤靶向分子C。
[0024]在另一優選例中，所述的復合納米材料還包括:負載于核心材料A-穩定劑B復合物的活性藥物成分D。
[0025]在另一優選例中，
[0026]所述氫化處理的金屬氧化物半導體納米材料選自下組:氫化的TiO2納米材料、氫化的ZrO2納米材料、氫化的ZnO納米材料，或其組合；和/或
[0027]所述磁性納米材料選自下組=Fe3O4納米材料、CoFe2O4納米材料、ZnFe2O4納米材料、NiFe2O4納米材料、MnFe2O4納米材料、Gd2O3納米材料，或其組合；和/或
[0028]所述上轉換發光納米材料選自下組=NaYF4: Er3+/Yb3+納米材料、NaYF4: Yb3+/Tm3+納米材料、NaYF4: Tm3VEr3+ 納米材料、NaYF4: Yb3+/Tm37Er3\ NaGdF4: Yb3+/Tm37Er3+ 納米材料，或其組合；和/或
[0029]所述貴金屬納米材料選自下組:Au納米材料、Ag納米材料、Pt納米材料、Pd納米材料，或其組合；和/或
[0030]所述量子點選自下組:量子點CdSe、CdS、CdTe、ZnS、ZnSe,或其組合；和/或
[0031]所述熒光材料選自下組:有機熒光染料分子(如茜素紅、羅丹明、吲哚菁綠、花青素Cy5.5、Cy7)、無機熒光介孔材料、貴金屬熒光納米材料(如小粒徑金、小粒徑銀)，或其組
八
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[0032]在另一優選例中，所述的穩定劑B選自下組:聚乙二醇、聚丙烯酸、葡聚糖、聚乙烯亞胺、聚乙烯胺、聚馬來酸、羧甲基殼聚糖、羧甲基淀粉、羧甲基葡聚糖、聚乳酸、聚乳酸-羥基乙酸、脂質體、白蛋白納米球，或其組合。
[0033]在另一優選例中，所述的腫瘤靶向分子C選自下組:葉酸、氨甲蝶呤、氨基蝶呤、RGD肽(精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸)、血管內皮生長因子(VEGF)、神經多肽(NPY)、腫瘤特異性抗體，或其組合。
[0034]在另一優選例中，所述活性藥物成分D選自下組:阿霉素、紫杉醇中的一種或多種。
[0035]本發明的第二方面，提供了一種如本發明第一方面所述的復合納米材料的制備方法，所述方法包括步驟:
[0036](I)提供一氫化處理的金屬氧化物半導體納米材料A ;
[0037](2)用所述的氫化處理的金屬氧化物半導體納米材料A與穩定劑B反應，得到核心材料A-穩定劑B復合物。
[0038]在另一優選例中，所述的制備方法還包括步驟:用所述的核心材料A-穩定劑B復合物與腫瘤靶向分子C進行偶聯反應，得到核心材料A-穩定劑B-腫瘤靶向分子C復合物。
[0039]在另一優選例中，所述的制備方法還包括步驟:用所述的核心材料A-穩定劑B復合物與活性藥物成分D進行負載，得到核心材料A-穩定劑B-活性藥物成分D復合物。
[0040]在另一優選例中，所述的制備方法還包括步驟:用所述的核心材料A-穩定劑B腫瘤靶向分子C復合物與活性藥物成分D進行偶聯反應，得到核心材料A-穩定劑B-腫瘤靶向分子C-活性藥物成分D復合物。
[0041]本發明的第三方面，提供了一種如本發明第一方面所述的復合納米材料的用途，所述材料用于:
[0042](a)制備腫瘤光熱治療藥物組合物；
[0043](b)用于制備腫瘤成像造影劑；
[0044](C)用于體外非治療性地抑制腫瘤細胞活性；
[0045](d)用于體外非治療性地誘導腫瘤細胞凋亡。
[0046]在另一優選例中，當用于體外非治療性地抑制腫瘤細胞活性時，將所述的復合納米材料施用于待抑制的腫瘤細胞后，對所述待抑制的腫瘤細胞進行紅外光照射。
[0047]在另一優選例中，當用于體外非治療性地抑制腫瘤細胞活性時，所述復合納米材料的作用時間為2~96h，較佳地為5-48h。
[0048]在另一優選例中，當用于體外非治療性地抑制腫瘤細胞活性時，所述復合納米材料的作用濃度為20-500 μ g/mL，較佳地為50-300 μ g/mL。
[0049]本發明的第四方面，提供了一種藥物組合物，所述的藥物組合物包括治療有效量的如本發明第一方面所述的復合納米材料；和藥學上可接受的載體。
[0050]在另一優選例中，所述的藥物組合物用于治療腫瘤；較佳地，所述的治療是光熱治療或光熱/藥物協同治療。
[0051]在另一優選例中，所述的藥物組合物為注射劑；較佳地，所述的藥物注射劑為靜脈注射劑。
[0052]在另一優選例中， 所述的藥學上可接受的載體是生理鹽水。
[0053]在另一優選例中，所述的腫瘤為肝臟腫瘤或脾臟腫瘤。[0054]在另一優選例中，所述的腫瘤為乳腺腫瘤。
[0055]在另一優選例中,所述藥物組合物還包括其他腫瘤治療藥物；較佳地，所述的其他腫瘤治療藥物選自下組:阿霉素、紫杉醇。
[0056]在另一優選例中，當所述的藥物組合物包括其他腫瘤治療藥物時，所述的其他腫瘤治療藥物在酸性環境下釋放；較佳地，在pH = 1-6的酸性環境下釋放。
[0057]在另一優選例中，在pH = 1-6的酸性環境下，所述的其他腫瘤治療藥物的48小時釋放量為> 60，較佳地為> 70%，更佳地為> 80%。
[0058]本發明的第五方面，提供了一種腫瘤治療方法，所述方法包括:對治療對象施用治療有效量的如本發明第一方面所述的復合納米材料。
[0059]在另一優選例中，所述方法還包括:對治療對象的腫瘤部位進行紅外光照射。
[0060]在另一優選例中，所述方法還包括:對治療對象施用其他腫瘤治療藥物；較佳地，所述的其他腫瘤治療藥物選自下組:阿霉素、紫杉醇。
[0061]應理解，在本發明范圍內中，本發明的上述各技術特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特征之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0062]圖1是實施例1、2所制備的黑TiO2、黑Ti02-PEG、黑TiO2-PEG-FA復合納米材料的透射電鏡結果(實施例19)。
[0063]圖2是實施例1、2所制備的黑TiO2、黑Ti02-PEG、黑TiO2-PEG-FA在水中的動態光散射水合粒徑分布。
[0064]圖3是實施例1、2所制備的黑Ti02-PEG、黑TiO2-PEG-FA復合納米材料以及白TiO2的紫外-可見吸收光譜(實施例19)。
[0065]圖4是實施例1、2所制備的黑Ti02-PEG、黑TiO2-PEG-FA復合納米材料及其中間體黑TiO2-PEG-NH2的Zeta電勢(實施例19)。
[0066]圖5是實施例1、2所制備的黑Ti02-PEG、黑TiO2-PEG-FA復合納米材料在808nm、2ff/cm2的近紅外光照射下的升溫曲線(實施例19)。
[0067]圖6是實施例1、2所制備的黑Ti02-PEG、黑TiO2-PEG-FA復合納米材料對人乳腺癌細胞MCF-7的細胞毒性(實施例20)。
[0068]圖7是實施例1、2所制備的黑Ti02-PEG、黑TiO2-PEG-FA復合納米材料在808nm、2ff/cm2的近紅外光照射下，對人乳腺癌細胞MCF-7的光熱治療效果(實施例21，MTT結果)。
[0069]圖8是實施例1制備的黑TiO2-PEG復合納米材料在808nm、2W/cm2的近紅外光照射下，對人乳腺癌細胞MCF-7的光熱治療效果(實施例21，鈣黃綠素/碘化丙啶染色)。
[0070]圖9是實施例1、2所制備的黑Ti02-PEG、黑TiO2-PEG-FA復合納米材料對健康小鼠肝、腎相關的血清生化指標的影響(實施例22)。
[0071]圖10是實施例1、2所制備的黑Ti02-PEG、黑TiO2-PEG-FA復合納米材料經尾靜脈注射人乳腺癌細胞荷瘤小鼠后，在其心、肝、脾、腎、肺以及腫瘤內的分布情況(實施例23)。
[0072]圖11是實施例1、2所制備的黑Ti02-PEG、黑TiO2-PEG-FA復合納米材料在808nm、2ff/cm2的近紅外光照射下，對人乳腺癌細胞荷瘤小鼠的光熱治療效果(實施例23)。【具體實施方式】
[0073]本發明人經過長期而深入的研究，意外地發現，在現有的產能材料(光催化降解水產氫領域)經過氫化處理的金屬氧化物半導體納米材料表面，用穩定劑進行修飾，居然能夠得到一種新穎的腫瘤光熱治療藥物(或材料)。所述藥物(或材料)的生物利用度高，且在水中的穩定性與分散性非常好，適合應用于腫瘤光熱治療領域，制成腫瘤治療藥物或輔助治療藥物。基于上述發現，發明人完成了本發明。
[0074]術語
[0075]如本文所用，術語“復合”指兩種材料以任意本領域已知的方法進行結合，例如物理負載(或搭載)，或者化學偶聯等形式。
[0076]術語“核心材料A-穩定劑B復合材料”、“核心材料-穩定劑復合材料”或“Α-B復合材料”可以互換使用，均指具有穩定劑⑶修飾的核心材料(A)。其中，核心材料如本文所定義。在優選的情況下，上述術語指不帶有其他復合材料(例如本發明的腫瘤靶向分子及活性藥物成分)的核心材料-穩定劑復合材料。[0077]術語“C2-C10的不飽和醇、酸或胺”指具有2-10個碳原子，且結構中存在C-C雙鍵的醇、酸或胺類，如丙烯酸、乙烯亞胺、乙烯胺、馬來酸，或類似化合物。
[0078]術語“C2-C12的多羥基化合物”指具有2-12個碳原子，且結構中存在一個以上羥
基的化合物，如乙二醇、丙三醇、糖類等。
[0079]經過廣泛的文獻調研，本發明提出以氫化處理的金屬氧化物半導體納米材料為核心材料、或復合具有增強醫學成像信號功能的納米材料、搭載腫瘤化療藥物，形成復合納米材料，用于惡性腫瘤的光熱治療或光熱與化學藥物協同治療。此外，本發明所制備的復合納米材料還可用于惡性腫瘤的診斷與可視化治療。
[0080]核心材料
[0081]氫化處理的金屬氧化物半導體納米材料(ScientificReports2014, do1: 10.1038/srep03986.),如經過高溫、高壓氫化處理的黑色TiO2納米粒子(Angew.Chem.1nt.Ed.2012，51，12410-12412.；Science2011, 331，746-750.)，與傳統的白色TiO2納米材料相比，其材料表面無序、內部具有大量氧缺陷、在近紅外區域具有強烈的吸收、光熱轉化效率優異，具有待進一步開發成腫瘤光熱治療材料的潛力。然而，氫化處理的金屬氧化物半導體納米材料在生理鹽水等仿生環境中極易發生團聚，這阻礙了其在腫瘤治療中的應用。
[0082]本發明的復合材料包括核心材料A和穩定劑B，其中，所述的核心材料A是經過氫化處理的金屬氧化物半導體納米材料，或含有經過氫化處理的金屬氧化物半導體納米材料的復合材料。
[0083]與傳統的白色TiO2納米材料相比,經過氫化處理的金屬氧化物半導體納米材料表面無序、內部具有大量氧缺陷、在近紅外區域具有強烈的吸收、光熱轉化效率優異，具有待進一步開發的潛力。然而，氫化處理的金屬氧化物半導體納米材料的生物應用性能較差，這阻礙了其在腫瘤治療中的應用。
[0084]在另一優選例中，所述氫化處理的金屬氧化物半導體納米材料選自下組:氫化的TiO2納米材料(即黑TiO2)、氫化的ZrO2納米材料(即黑ZrO2)、氫化的ZnO納米材料(即黑ZnO)，或其組合。
[0085]在本發明中，所述的經過氫化處理的金屬氧化物半導體納米材料可與其他的納米材料進行復合，組成含有經過氫化處理的金屬氧化物半導體納米材料的復合材料。其中，優選的進行復合的納米材料選自下組:磁性納米材料、上轉換發光納米材料、貴金屬納米材料、量子點、熒光材料，或其組合。
[0086]在本發明的優選例中，所述磁性納米材料選自下組=Fe3O4納米材料、CoFe2O4納米材料、ZnFe2O4納米材料、NiFe2O4納米材料、MnFe2O4納米材料、Gd2O3納米材料，或其組合。
[0087]在本發明的優選例中，所述上轉換發光納米材料選自下組=NaYF4: Er3+/Yb3+納米材料、NaYF4: Yb3VTm3+ 納米材料、NaYF4: Tm3+/Er3+ 納米材料、NaYF4: Yb3+/Tm37Er3\ NaGdF4: Yb3+/Tm3VEr3+納米材料,或其組合。
[0088]在本發明的優選例中,所述貴金屬納米材料選自下組:Au納米材料、Ag納米材料、Pt納米材料、Pd納米材料,或其組合。
[0089]在本發明的優選例中，所述量子點選自下組:量子點CdSe、CdS、CdTe、ZnS、ZnSe,或其組合。
[0090]在本發明的優選例中，所述熒光材料選自下組:有機熒光染料分子(如茜素紅、羅丹明、吲哚菁綠(ICG)、花青素Cy5.5、Cy7)、無機熒光介孔材料、貴金屬熒光納米材料(如小粒徑金、小粒徑銀)，或其組合。
[0091]穩定劑
[0092]本發明中，用穩定劑B對核心材料A進行修飾，以改善其生物應用性能。
[0093]所述的穩定劑B可以是選自下組的穩定劑:有機高分子聚合物、脂質體、微泡、白蛋白納米球，或其組合，優選為上述四種中的一種。
[0094]其中，所述的有機高分子聚合物的聚合單體選自下組:C2_C10的不飽和醇、酸或胺、C2-C12的多羥基化合物、乳酸、羥基乙酸，或其組合，優選的所述有機高分子聚合物可以是聚乙二醇、聚丙烯酸、葡聚糖、聚乙烯亞胺、聚乙烯胺、聚馬來酸、羧甲基殼聚糖、羧甲基淀粉、羧甲基葡聚糖中的一種或多種。
[0095]其中，所述的微泡指微米級球狀空心結構。在本發明的優選例中,所述微泡的殼體材料可以是聚乳酸、聚乳酸-羥基乙酸中的一種或多種。
[0096]腫瘤靶向分子及活性藥物成分
[0097]本發明中，核心材料A-穩定劑B復合材料可以任選地和其他腫瘤治療相關的材料，例如腫瘤靶向分子，或者活性藥物成分進行復合，以改善其靶向性或療效。其中，所述的復合形式沒有特別限制，可以是物理負載(或搭載)，或者化學偶聯等形式。
[0098]在本發明中，所述的腫瘤靶向分子沒有特別的限制，可以為任意本領域已知的具有腫瘤靶向性，且可以偶聯于A-B的分子。在一個優選例中，所述的腫瘤靶向分子C選自下組:葉酸、氨甲蝶呤、氨基蝶呤、RGD肽(精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸)、血管內皮生長因子(VEGF)、神經多肽(NPY)、腫瘤特異性抗體，或其組合。
[0099]所述的活性藥物成分沒有特別限制，可以為任意本領域已知的能夠用于腫瘤治療，或者輔助腫瘤治療的藥物。在本發明的一個優選例中，所述的活性藥物成分D選自下組:阿霉素、紫杉醇中的一種或多種。
[0100] 腫瘤光熱治療藥物組合物[0101]光熱治療(Photothermal Therapy, PTT)是一種新的腫瘤治療模式。其基本原理是將光熱試劑積累在腫瘤部位，通過局部近紅外激光照射，光熱試劑將光能轉換為熱能，通過高溫將腫瘤殺死。借助醫學成像手段，對腫瘤進行精確的成像定位，是光熱有效治療腫瘤的重要因素之一。因此，發展一種具有增強腫瘤組織醫學成像信號功能的光熱治療材料，提高腫瘤部位的成像靈敏度，必然能夠提高光熱治療惡性腫瘤的效果。
[0102]基于此，本發明提供了一種腫瘤光熱治療藥物組合物。所述的組合物包括治療有效量的本發明復合材料，即核心材料A-穩定劑B復合材料，或核心材料A-穩定劑B與腫瘤靶向分子C和/或活性藥物成分D復合形成的復合材料。
[0103]所述的用穩定劑B修飾的復合材料具有一系列適合進行生物應用的特性，例如，具有穩定劑B修飾的核心材料A-穩定劑B復合材料在水中具有較好的穩定性；在可見光與近紅外區有光吸收，且具有很高的光熱轉換效率，因而適用于腫瘤光熱治療；細胞毒性低，生物相容性好，等等。
[0104]較佳地，所述的復合材料還包括藥學上可接受的載體。所述的藥學上可接受的載體包括:注射劑載體,如蒸餾水,生理鹽水,丙三醇等。
[0105]本發明的主要有益效果包括:
[0106](1)本發明提供了一種治療惡性腫瘤的復合納米材的制備方法，該方法簡單易行，成本低廉，利于工業化生產和市場推廣。
[0107](2)將本發明提供的復合納米材料給予腫瘤部位，可實現近紅外光激發的腫瘤光熱治療，還可以實現近紅外光激發的光熱與化療藥物協同治療腫瘤。
[0108](3)本發明提供的復合納米材料，能夠增強磁共振成像、超聲成像、光聲成像、熒光成像等醫學造影信號，可以用于惡性腫瘤的診斷與可視化治療。
[0109]下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。
[0110]實施例1:黑TiO2-PEG復合納米材料的制備
[0111]取0.2mol/L四氯化鈦(TiCl4)的鹽酸溶液10mL，緩慢滴加于90mL超純水中，冰浴條件下攪拌、水解5小時。水解結束后，將反應液置于透析袋中，于超純水中透析，每兩小時換一次新水，共換水5次,獲得TiO2前驅體溶液。取TiO2前驅體溶液IOOmL置于反應爸中，240°C加熱10小時，得到TiO2納米粒子。TiO2納米粒子經80°C高溫烘干后，獲得TiO2納米粒子粉末。取上述制備的TiO2納米粒子粉末50mg，置于高壓氫氣系統，設定如下反應條件:壓力20.(^&1*、溫度2001:、氫化時間5天。反應結束后，獲得氫化的黑TiO2納米粒子。取黑TiO2納米粒子IOOmg分散于200mL乙醇中，200W超聲波分散30分鐘。取聚乙二醇(PEG，分子量為2000)7500mg，溶于300mL乙醇中。將含有黑TiO2納米材料的乙醇逐滴加入到PEG乙醇溶液中，攪拌反應24小時，使PEG充分包裹于黑TiO2納米材料表面。反應結束后，12000轉/分鐘離心30分鐘，去除上清液中多余的PEG，獲得黑TiO2-PEG復合納米材料。
[0112]實施例2:黑TiO2-PEG-FA復合納米材料的制備
[0113]取實施例1制備的黑TiO2-PEG復合納米材料50mg，分散于IOOmL乙醇中。取3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES) 600 μ L，溶于200mL乙醇中。將APTES的乙醇溶液逐滴加入到含黑TiO2-PEG復合納米材料的乙醇中，攪拌反應24小時，使黑TiO2-PEG復合納米材料表面的PEG末端修飾上氨基。反應結束后，12000轉/分鐘離心30分鐘，去除上清液中多余的反應副產物，獲得黑TiO2-PEG-NH2復合納米材料中間體，并將其分散于IOOmL純水中。取20mgl-(3- 二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺(EDC),加入到IOOmL的0.lmg/mL葉酸(FA)溶液中活化葉酸的羧基，迅速將EDC與FA的混合溶液加入到含黑TiO2-PEG-NH2復合納米材料的純水中，攪拌反應24小時。反應結束后，12000轉/分鐘離心30分鐘，去除上清液中多余的副產物，獲得黑TiO2-PEG-FA復合納米材料。
[0114]實施例3:黑TiO2-PEG-DOX復合納米材料的制備
[0115]取實施例1制備的黑TiO2-PEG復合納米材料50mg，分散于250mL純水，高溫滅菌后待用。取4mg抗腫瘤藥物阿霉素(DOX)，溶于250mL純水中，0.22 μ m濾膜過濾除菌。在無菌條件下，將DOX溶液逐滴加入到經高溫滅菌后的黑TiO2-PEG復合納米材料分散液中，攪拌反應24小時。反應結束后，10000轉/分鐘離心30分鐘，去除上清液中多余的D0X，獲得黑TiO2-PEG-DOX復合納米材料。
[0116]實施例4:黑TiO2-PEG-FA-DOX復合納米材料的制備
[0117]取實施例2制備的黑TiO2-PEG-FA復合納米材料lOOmg，分散于200mL純水。取5mg DOX,溶于200mL純水中。將DOX溶液逐滴加入到黑TiO2-PEG-FA復合納米材料分散液中，攪拌反應18小時。反應結束后，10000轉/分鐘離心30分鐘，去除上清液中多余的D0X，獲得黑TiO2-PEG-FA-DOX復合納米材料。
[0118]實施例5:氫化ZrO2-PAA復合納米材料的制備
[0119]取6mL鋯酸四丁酯溶于40mL異丙醇中，得到溶于A。取2mL超純水、2mL濃硝酸溶于40mL異丙醇中，得到溶液B。將A溶液逐滴加入到B溶液中，攪拌I小時后將反應液置于反應釜中，180°C反應24小時。反應結束后，60°C將反應物加熱烘干，獲得ZrO2前驅體。將ZrO2前驅體研磨成粉末后，在600°C下煅燒5小時，獲得ZrO2納米粒子。取上述ZrO2納米粒子粉末，置于高壓氫氣系統，壓力20.0bar、溫度220°C下氫化5天，獲得氫化ZrO2納米粒子。取上述制備的氫化ZrO2納米粒子50mg,分散于200mL乙醇中，超聲波分散0.5小時。取聚丙烯酸(PAA，分子量為2000)2000mg，溶于300mL乙醇中。將含有氫化ZrO2納米材料的乙醇逐滴加入到PAA乙醇溶液中，攪拌反應24小時，使PAA充分包裹于氫化ZrO2納米材料表面。反應結束后，12000轉/分鐘離心30分鐘，去除上清液中多余的PAA，獲得氫化ZrO2-PAA復合納米材料。
[0120]實施例6:氫化ZnO-PEI復合納米材料的制備
[0121]取2mol/L的碳酸鈉溶液(Na2CO3) 20mL，攪拌加熱至80°C。取lmol/L的硫酸鋅(ZnSO4)溶液10mL，逐滴加入到Na2CO3溶液中，攪拌反應I小時后，冷卻抽濾。將反應物在80°C下烘干后，置于反應釜中400°C反應3小時后，獲得ZnO納米粒子粉末。取上述ZnO納米粒子，置于高壓氫氣系統，壓力20.0bar、溫度200°C下氫化4天，獲得氫化ZnO納米粒子。取上述氫化ZnO納米粒子20mg，分散于200mL乙醇中，超聲波分散0.5小時。取聚乙烯亞胺(PEI,分子量為5000)400mg，溶于IOOmL乙醇中。將含有氫化ZnO納米材料的乙醇逐滴加入到PEI乙醇溶液中，攪拌反應24小時，使PEI充分包裹于氫化ZnO納米材料表面。反應結束后，12000轉/分鐘離心30分鐘，去除上清液中多余的PEI，獲得氫化ZnO-PEI復合納米材料。
[0122]實施例7:黑TiO2-Fe3O4-PEG復合納米材料的制備[0123]取0.lmol/L四氯化鈦(TiCl4)的鹽酸溶液10mL，緩慢滴加于90mL超純水中，冰浴條件下攪拌、水解4小時。水解結束后，將反應液置于透析袋中，于超純水中透析，每3小時換一次新水，共換水5次,獲得TiO2前驅體溶液。取TiO2前驅體溶液IOOmL置于反應爸中，180°C加熱12小時，得到TiO2納米粒子。TiO2納米粒子經60°C高溫烘干后，獲得TiO2納米粒子粉末。取TiO2納米粒子粉末lOOmg，置于高壓氫氣系統，壓力22.0bar、溫度220°C、氫化3天。反應結束后，獲得氫化的黑TiO2納米材料。取黑TiO2納米材料lOOmg，分散于200mL乙醇中，超聲分撒0.5小時后，逐滴加入到IOOmL正己烷中，攪拌均勻。將200mg乙酰丙酮鐵[Fe (acac) 3]溶于40mL油胺和120mL正辛醇的混合溶液中。將黑TiO2分散液加入到上述混合溶液中、攪拌，加熱到80°C，使乙醇與正己烷蒸發。之后將上述溶液置于反應釜中，240°C反應2小時。反應結束后離心去除油胺和正辛醇，并用乙醇清洗多次，獲得黑TiO2-Fe3O4復合納米材料。將上述黑TiO2-Fe3O4復合納米材料分散于200mL乙醇中，超聲波分散30分鐘。取PEG (分子量為1500)5000mg，溶于300mL乙醇中。將含有黑TiO2-Fe3O4復合納米材料的乙醇分散液逐滴加入到PEG乙醇溶液中，攪拌反應18小時，使PEG充分包裹于黑TiO2-Fe3O4復合納米材料表面。反應結束后，12000轉/分鐘離心30分鐘，除去上清液中多余的PEG，獲得黑TiO2-Fe3O4-PEG復合納米材料。
[0124]實施例8:黑TiO2-Gd2O3-PEG復合納米材料的制備
[0125]取六水硝酸釓[Gd(NO3)3.6H20]100mg、氫氧化鈉Img溶于200mL—縮二乙二醇中，180°C下磁力攪拌反應5小時，將反應液進行透析后獲得透析液。取0.lmol/L四氯化鈦(TiCl4)的鹽酸溶液7mL，緩慢滴加于93mL超純水中，冰浴條件下攪拌、水解3小時。水解結束后，將反應液置于透析袋中，于超純水中透析，每3小時換一次新水，共換水4次，獲得TiO2前驅體溶液。將TiO2前驅體置于反應釜中，180°C加熱10小時，得到TiO2納米粒子。TiO2納米粒子經6(TC高溫烘干后,獲得TiO2納米粒子粉末。取TiO2納米粒子粉末IOOmg,置于高壓氫氣系統，壓力20.0bar、溫度220°C、氫化5天。反應結束后，獲得氫化的黑TiO2納米材料。取黑TiO2納米材料lOOmg，分散于200mL乙醇中，超聲分撒30分鐘后，逐滴加入上述六水硝酸釓透析液，攪拌；反應8小時后，室溫陳化24小時；12000轉/分鐘離心30分鐘，去除多余反應物，得到黑TiO2-Gd2O3復合納米材料。將黑TiO2-Gd2O3復合納米材料分散于200mL乙醇中，超聲處理30分鐘，取PEG (分子量為1500) 4000mg，溶于300mL乙醇中。將含有黑TiO2-Gd2O3復合納米材料的乙醇分散液逐滴加入到PEG乙醇溶液中，攪拌反應24小時，使PEG充分包裹于黑TiO2-Gd2O3復合納米材料表面。反應結束后，12000轉/分鐘離心30分鐘，除去上清液中多余的PEG，獲得黑TiO2-Gd2O3-PEG復合納米材料。
[0126]實施例9:黑TiO2-NaYF4IYb3VTm3+-PEG復合納米材料的制備
[0127]取0.2mol/L四氯化鈦(TiCl4)的鹽酸溶液10mL，緩慢滴加于90mL超純水中，冰浴條件下攪拌、水 解5小時。水解結束后，將反應液置于透析袋中，于超純水中透析，每3小時換一次新水，共換水4次,獲得TiO2前驅體溶液。取TiO2前驅體溶液IOOmL置于反應爸中，180°C加熱10小時，得到TiO2納米粒子。TiO2納米粒子經60°C高溫烘干后，獲得TiO2納米粒子粉末。取TiO2納米粒子粉末lOOmg，置于高壓氫氣系統，壓力20.0bar、溫度220°C、氫化3天。反應結束后，獲得氫化的黑TiO2納米材料。取黑1102納米材料50mg分散到IOOmL的水中，超聲波分散30分鐘。然后依次加入20mg/mL的氯化釔(YCl3)8.9mL、氯化鐿(YbCl3) lmL、氯化錢(TmCl3)0.lmL。再加入20mg/mL的檸檬酸鈉水溶液IOmL和10mg/mL的氟化鈉(NaF)水溶液40mL，并攪拌I小時。之后將混合溶液放入反應釜，在120°C下，水熱反應2小時。反應結束后，將產物離心水洗數次，獲得黑TiO2-NaYF4: Yb3+/Tm3+復合納米材料。將制備的黑TiO2-NaYF4:Yb3+/Tm3+復合納米材料50mg，分散于IOOmL乙醇中。取PEG (分子量為1500) 2000mg,溶于300mL乙醇中。將含有黑TiO2-NaYF4: Yb3+/Tm3+復合納米材料的乙醇分散液逐滴加入到PEG乙醇溶液中，攪拌反應24小時，使PEG充分包裹于黑TiO2-NaYF4 = Yb3+/Tm3+復合納米材料表面。反應結束后，12000轉/分鐘離心30分鐘，除去多余的PEG，獲得黑 TiO2-NaYF4:Yb3+/Tm3+-PEG 復合納米材料。
[0128]實施例10:黑TiO2-NaYF4: Yb3+/Tm3+-PEG-VEGF復合納米材料的制備
[0129]取實施例9制備的黑TiO2-NaYF4: Yb3+/Tm3+-PEG復合納米材料10mg，分散于IOOmL乙醇中。取3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES) 50 μ L，溶于IOOmL乙醇中。將APTES的乙醇溶液逐滴加入到含黑TiO2-NaYF4: Yb3VTm3+-PEG復合納米材料的乙醇中，攪拌反應24小時，使黑TiO2-NaYF4:Yb3+/Tm3+-PEG復合納米材料表面的PEG末端修飾上氨基。反應結束后，13000轉/分鐘離心30分鐘，去除多余的3-氨丙基三乙氧基硅烷，收集制備的黑TiO2-NaYF4: Yb3VTm3+-PEG-NH2復合納米材料，并將其分散于IOOmL純水中。取經1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)活化的0.lmg/mL血管內皮生長因子(VEGF)溶液ImL加入到含黑TiO2-NaYF4:Yb3+/Tm3+-PEG-NH2復合納米材料的純水中，攪拌反應18小時。反應結束后，12000轉/分鐘離心30分鐘，去除多余的VEGF，獲得黑TiO2-NaYF4: Yb3+/Tm3+-PEG-VEGF復合納米材料。
[0130]實施例11:黑TiO2-Au-PEG復合納米材料的制備
[0131]取0.lmol/L四氯化鈦(TiCl4)的鹽酸溶液5mL，緩慢滴加于95mL超純水中，冰浴條件下攪拌、水解3小時。水解結束后，將反應液置于透析袋中，于超純水中透析，每2小時換一次新水，共換水5次,獲得TiO2前驅體溶液。取TiO2前驅體溶液IOOmL置于反應爸中，180°C加熱10小時，得到TiO2納米粒子。TiO2納米粒子經60°C高溫烘干后，獲得TiO2納米粒子粉末。取TiO2納米粒子粉末lOOmg，置于高壓氫氣系統，壓力20.0bar、溫度220°C、氫化3天。反應結束后，獲得氫化的黑TiO2納米材料。取黑TiO2納米材料50mg，分散于IOOmL乙醇中，超聲波分散30分鐘。將上述溶液加入到IOOmL葡萄糖(lOmmol/mL)水溶液中攪拌，使葡萄糖吸附在黑TiO2粒子表面。然后再加入ImL濃度為1mmol/mL氯金酸(AuCl4)溶液、IOmg檸檬酸鈉并加熱攪拌16小時，獲得黑TiO2-Au復合納米材料。將上述獲得的黑TiO2-Au復合納米材料分散于IOOmL純水中，超聲波分散30分鐘。取PEG(分子量為1500) 1000mg,溶于300mL純水中。將含有黑TiO2-Au納米材料的分散液逐滴加入到PEG水溶液中，攪拌反應24小時，使PEG充分包裹于黑TiO2-Au復合納米材料表面。反應結束后，12000轉/分鐘離心30分鐘，去除多余的PEG，獲得黑TiO2-Au-PEG復合納米材料。
[0132]實施例12:黑TiO2-CdSe-PEG復合納米材料的制備
[0133]取0.lmol/L四氯化鈦(TiCl4)的鹽酸溶液10mL，緩慢滴加于90mL超純水中，冰浴條件下攪拌、水解3小時。水解結束后，將反應液置于透析袋中，于超純水中透析，每2小時換一次新水，共換水4次,獲得TiO2前驅體溶液。取TiO2前驅體溶液IOOmL置于反應爸中，180°C加熱12小時，得到TiO2納米粒子。TiO2納米粒子經60°C高溫烘干后，獲得TiO2納米粒子粉末。取TiO2納米粒子粉末50mg，置于高壓氫氣系統，壓力20.0bar、溫度220°C、氫化5天。反應結束后，獲得氫化的黑TiO2納米材料。取黑TiO2納米材料50mg，分散于IOOmL純水中，超聲波分散30分鐘。然后用0.lmol/L的鹽酸水溶液調節溶液的pH值到3.0，加入100 μ L濃度為10mmol/L硒代硫酸鈉(Na2SeSO3)水溶液,再加入ImL濃度為5mmol/L的氯化鎘(CdCl2)水溶液，攪拌反應24小時，通過高速離心獲得黑TiO2-CdSe復合納米材料。將獲得的黑TiO2-CdSe復合納米材料分散于300mL純水中，超聲波分散30分鐘。取PEG (分子量為2000) 2000mg,溶于200mL純水中。將含有黑TiO2-CdSe納米材料的純水逐滴加入到PEG水溶液中，攪拌反應24小時，使PEG充分包裹于黑TiO2-CdSe復合納米材料表面。反應結束后，12000轉/分鐘離心30分鐘，去除多余的PEG，獲得黑TiO2-CdSe-PEG復合納米材料。
[0134]實施例13:黑TiO2-1CG-PEG復合納米材料的制備
[0135]取0.lmol/L四氯化鈦(TiCl4)的鹽酸溶液10mL，緩慢滴加于90mL超純水中，冰浴條件下攪拌、水解5小時。水解結束后，將反應液置于透析袋中，于超純水中透析，每2小時換一次新水，共換水5次,獲得TiO2前驅體溶液。取TiO2前驅體溶液IOOmL置于反應爸中，220°C加熱12小時，得到TiO2納米粒子。TiO2納米粒子經60°C高溫烘干后，獲得TiO2納米粒子粉末。取TiO2納米粒子粉末50mg，置于高壓氫氣系統，壓力20.0bar、溫度220°C、氫化5天。反應結束后，獲得氫化的黑TiO2納米材料。取制備的黑TiO2納米材料50mg，分散于90mL純水中，超聲波分散30分鐘。然后加入0.lmg/mL的吲哚菁綠(ICG)溶液IOml避光攪拌反應16小時。反應結束后，通過離心去除多余的ICG，獲得黑TiO2-1CG復合納米材料。將上述復合納米材料分散于IOOmL超純水中。取PEG (分子量為1500) lOOOmg，溶于200mL純水中。將含有黑TiO2-1CG納米材料的分散液逐滴加入到PEG水溶液中，避光攪拌反應24小時，使PEG充分包裹于黑TiO2-1CG復合納米材料表面。反應結束后，12000轉/分鐘離心30分鐘，去除多余的PEG，獲得黑TiO2-1CG-PEG復合納米材料。
[0136]實施例14:黑TiO2-熒光介孔硅-PEG復合納米材料的制備
[0137]取0.lmol/L四氯化鈦(TiCl4)的鹽酸溶液10mL，緩慢滴加于90mL超純水中，冰浴條件下攪拌、水解3小時。水解結束后，將反應液置于透析袋中，于超純水中透析，每I小時換一次新水，共換水5次,獲得TiO2前驅體溶液。取TiO2前驅體溶液IOOmL置于反應爸中，200°C加熱10小時，得到TiO2納米粒子。TiO2納米粒子經80°C高溫烘干后，獲得TiO2納米粒子粉末。取TiO2納米粒子粉末50mg，置于高壓氫氣系統，壓力20.0bar、溫度200°C、氫化6天。反應結束后，獲得氫化的黑TiO2納米材料。取制備的黑1102納米材料50mg，溶于IOOmL乙醇中，超聲分散30分鐘后，加入IOOmL純水并攪拌均勻，獲得溶液A。向溶液A中加入300mg十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、lmL氨水(NH3.H2O)，40°C攪拌加熱30分鐘溶解CTAB。待CTAB溶解后，向反應液中加入400 μ L正硅酸乙酯(TEOS)，攪拌反應8小時，多次離心水洗后，得到黑TiO2-介孔硅復合材料。取黑TiO2-介孔硅復合材料50mg分散到IOOmL的水中，然后依次加入20mg/mL的氯化釔(YC13)8.9mL、氯化鐿(YbCl3) lmL、氯化銩(TmCl3)0.lmL。 再加入20mg/mL的檸檬酸鈉水溶液IOmL和20mg/mL的氟化鈉水溶液20mL,并攪拌I小時。之后將混合溶液放入反應釜，在130°C下，進行水熱反應2小時。反應結束后，將產物離心水洗數次，獲得黑TiO2-熒光介孔硅復合材料。將制備的黑TiO2/熒光介孔硅復合材料50mg，分散于200mL水中。取PEG (分子量為2000) 3000mg，溶于300mL水中。將含有黑TiO2/熒光介孔硅復合材料的分散液逐滴加入到PEG水溶液中，攪拌反應24小時，使PEG充分包裹于黑TiO2-熒光介孔硅復合材料表面。反應結束后，通過離心除去多余的PEG,獲得黑TiO2-熒光介孔硅-PEG復合納米材料。
[0138]實施例15:黑TiO2-熒光Au-PEG復合納米材料的制備
[0139]取0.2mol/L四氯化鈦(TiCl4)的鹽酸溶液10mL，緩慢滴加于90mL超純水中，冰浴條件下攪拌、水解6小時。水解結束后，將反應液置于透析袋中，于超純水中透析，每I小時換一次新水，共換水5次,獲得TiO2前驅體溶液。取TiO2前驅體溶液IOOmL置于反應爸中，240°C加熱12小時，得到TiO2納米粒子。TiO2納米粒子經80°C高溫烘干后，獲得TiO2納米粒子粉末。取TiO2納米粒子粉末50mg，置于高壓氫氣系統，壓力20.0bar、溫度220°C、氫化3天。反應結束后，獲得氫化的黑TiO2納米材料。取制備的黑TiO2納米粒子5mg，分散于5mL超純水中，超聲分散30分鐘。將5mL的4mg/mL氯金酸(HAuCl4)、5mL的20mg/mL牛血清白蛋白(BSA)溶液分別加入到攪拌狀態下的黑TiO2納米粒子分散液中。37°C下，加入50 μ L的0.3mg/mL抗壞血酸溶液，使用氫氧化鈉溶液調節溶液pH至11，攪拌反應5小時，獲得黑TiO2-熒光Au復合納米簇。將獲得的黑TiO2-熒光Au復合納米簇分散于50mL水中。取PEG (分子量為2000) 500mg,溶于200mL水中。將含有黑TiO2-熒光Au復合納米簇的水溶液逐滴加入到PEG水溶液中，攪拌反應24小時，使PEG充分包裹于黑TiO2-熒光Au復合納米簇表面。反應結束后，通過離心除去多余的PEG，獲得黑TiO2-熒光Au-PEG復合納米材料。
[0140]實施例16:黑TiO2-脂質體-PEG復合納米材料的制備
[0141]取0.lmol/L四氯化鈦(TiCl4)的鹽酸溶液5mL，緩慢滴加于95mL超純水中，冰浴條件下攪拌、水解2小時。水解結束后，將反應液置于透析袋中，于超純水中透析，每I小時換一次新水，共換水6次,獲得TiO2前驅體溶液。取TiO2前驅體溶液IOOmL置于反應爸中，200°C加熱16小時，得到TiO2納米粒子。TiO2納米粒子經80°C高溫烘干后，獲得TiO2納米粒子粉末。取TiO2納米粒子粉末50mg，置于高壓氫氣系統，壓力20.0bar、溫度200°C、氫化4天。反應結束后，獲得氫化的黑TiO2納米材料。取制備的黑TiO2納米材料10mg、氫化大豆磷脂40mg、膽固醇20mg、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000單甲氧醚50mg，將上述材料分散于或溶于IOmL氯仿-正己烷(1:1，體積比)中，超聲分散成乳后，經減壓旋轉蒸發至約2mL濃乳，獲得A乳液。取氫化大豆磷脂40mg、膽固醇20mg、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000單甲氧醚50mg，溶于5mL氯仿-正己烷(1:1，體積比)，獲得B乳液。將B乳液加入到A濃乳中，混勻后，加入IOmL賴氨酸緩沖液(0.02mol/L)，充分振蕩后，乳液經減壓蒸發至不再產生氣泡，吹氮氣蒸發有機溶劑，室溫超聲5分鐘，獲得黑TiO2-脂質體-PEG復合納米材料。
[0142]實施例17:黑TiO2-BSA復合納米材料的制備
[0143]取0.lmol/L四氯化鈦(TiCl4)的鹽酸溶液10mL，緩慢滴加于90mL超純水中，冰浴條件下攪拌、水解3小時。水解結束后，將反應液置于透析袋中，于超純水中透析，每2小時換一次新水，共換水5次,獲得TiO2前驅體溶液。取TiO2前驅體溶液IOOmL置于反應爸中，220°C加熱10小時，得到TiO2納米粒子。TiO2納米粒子經80°C高溫烘干后，獲得TiO2納米粒子粉末。取TiO2納米粒子粉末50mg，置于高壓氫氣系統，壓力20.0bar、溫度200°C、氫化4天。反應結束后，獲得氫化的黑TiO2納米材料。取制備的黑1102納米材料50mg，溶于IOOmL超純水中，超聲分散30分鐘。取50mg牛血清白蛋白(BSA)，溶于50mL pH為10的氯化鈉溶液(0.8mg/mL)中。將黑TiO2分散液逐滴加入到BSA溶液中，邊加邊攪拌，并逐滴加Λ 5mL乙醇，再逐滴加入10%的戊二醛溶液50 μ L，攪拌反應24小時，再加入50mg/mL的賴氨酸溶液lmL，攪拌2小時。將反應溶液于超純水中透析5次后，獲得黑TiO2-BSA復合納米材料。
[0144]實施例18:黑TiO2-PLA復合材料的制備
[0145]取0.lmol/L四氯化鈦(TiCl4)的鹽酸溶液5mL，緩慢滴加于95mL超純水中，冰浴條件下攪拌、水解4小時。水解結束后，將反應液置于透析袋中，于超純水中透析，每2小時換一次新水，共換水4次,獲得TiO2前驅體溶液。取TiO2前驅體溶液IOOmL置于反應爸中，240°C加熱12小時，得到TiO2納米粒子。TiO2納米粒子經80°C高溫烘干后，獲得TiO2納米粒子粉末。取TiO2納米粒子粉末50mg，置于高壓氫氣系統，壓力20.0bar、溫度200°C、氫化5天。反應結束后，獲得氫化的黑TiO2納米材料。取制備的黑Ti025mg，加入到含有0.1g聚乳酸(PLA)、0.05g司盤80(Span80)的2mL三氯甲烷中，超聲處理I分鐘得到均勻的初乳。將上述初乳加入到20mL的聚乙烯醇溶液(30mg/mL)中，劇烈攪拌6小時，獲得微泡，待二氯甲烷揮發完全。將微泡離心水洗3次，重新分散在純水中，冷凍干燥后獲得黑TiO2-PLA復合材料。[0146]實施例19:復合納米材料的表征
[0147]綜合物理性能:取實施例1-18制備的復合納米材料，通過透射電子顯微鏡(TEM)、X射線衍射儀(XRD)、動態光散射納米粒度分析儀(DLS)、傅立葉變換紅外光譜儀(FT-1R)、紫外-可見分光光譜儀(UV-VIS)等儀器對復合納米材料的微觀形貌、晶型、水合粒徑、化學鍵、近紅外吸收等進行表征。
[0148]以實施例1、2所制備的復合納米材料的表征結果為例，實施例1、2所制備的黑TiO2、黑Ti02-PEG、黑TiO2-PEG-FA復合納米材料的透射電鏡結果如圖1所示，表征結果顯示，制備的黑T i O2基復合納米材料粒徑在20nm左右，但是，黑Ti O2發生了明顯的團聚，而黑Ti02-PEG、黑TiO2-PEG-FA復合納米材料的分散性良好。
[0149]實施例1、2所制備的黑TiO2、黑Ti02-PEG、黑TiO2-PEG-FA復合納米材料的動態光散射水合粒徑分布如圖2所示，實驗結果顯示，黑TiO2在水中極易團聚，團聚的平均水合粒徑為3 μ m左右，而黑TiO2經過穩定劑PEG包裹后(黑Ti02_PEG、黑TiO2-PEG-FA)，在水中的穩定性得到顯著的提高，其平均水合粒徑為200nm左右。
[0150]實施例1、2所制備的黑Ti02-PEG、黑TiO2-PEG-FA復合納米材料以及白TiO2的紫外-可見吸收光譜結果如圖3所示，表征結果顯示，制備的黑TiO2基復合納米材料在可見光與近紅外區具有明顯的光吸收，具備了腫瘤光熱治療試劑的基本特征。而同等濃度的白TiO2在近紅外區的光吸收非常弱。
[0151]實施例1、2所制備的黑Ti02-PEG、黑TiO2-PEG-FA復合納米材料及其中間體黑Ti02-PEG-NH2的Zeta電勢結果如圖4所示，表征結果顯示，在pH = 7的中性水溶液中，黑TiO2-PEG表面帶負電荷(-33.9)，經過APTES對其表面進行氨基修飾后，黑TiO2-PEG-NH2表面帶正電荷0.16)，將葉酸偶聯于黑TiO2-PEG-NH2表面后，形成的黑TiO2-PEG-FA帶負電荷(-20.77)，說明葉酸被成功地偶聯于復合納米材料表面。
[0152]光熱轉換性能:取實施例1-18制備的復合納米材料lmg、另取Img白TiO2作為對照，分別分散于IOmL純水中。使用808nm激光器系統輻照含有復合納米材料的分散液10分鐘，激光功率密度為2W/cm2。測量每分鐘時間點的液體溫度，繪制升溫曲線，計算材料的光熱轉換效率。以實施例1、2所制備的黑Ti02-PEG、黑TiO2-PEG-FA復合納米材料為例。實驗結果如圖5顯示，復合納米材料具有優異的光熱轉換效率，能夠將吸收的光能迅速轉化為熱能，其中黑TiO2-PEG的光熱轉換效率達到了 38%。該結果表明，制備的復合納米材料具備了腫瘤光熱治療納米材料的基本特征。
[0153]生理條件下穩定性:取實施例1-18制備的復合納米材料lmg，分別分散于IOmL的0.lmol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)、10%胎牛血清(FBS)、0.9%生理鹽水(NaCl)中，在37°C恒溫箱中放置30天，每天通過動態光散射納米粒度分析儀(DLS)對復合納米材料的粒徑進行測量。實驗結果顯示，制備的復合納米材料在PBS、10% FBS,0.9% NaCl等溶液中粒徑穩定保持在10-300nm之間。該結果表明，制備的復合納米材料在生理溶液中具有良好地穩定性與分散性，具備了體內注射的基本條件。
[0154]pH控制的藥物釋放性能:取實施例3、4制備的黑Ti02-PEG-D0X、黑TiO2-PEG-FA-DOX復合納米材料10mg，分散于pH為3、5、7的緩沖液IOmL中，將上述緩沖液裝入透析袋中，置于PH相同的90mL同種緩沖液中透析2天，每隔2小時取ImL透析液(同時補足ImL新的緩沖液)，使用高效液相色譜(HPLC)對透析液中的DOX進行定量分析，繪制藥物釋放曲線。實驗結果顯示，在PH = 3的酸性環境下，DOX更容易釋放，48小時的釋放量為80%，而pH = 7的中性環境下，DOX釋放量為20%。該結果說明，制備的復合納米材料具備了腫瘤給藥體系的基本特征，可用于抗腫瘤化療藥物的遞送。
[0155]磁共振成像(MRI)性能:取實施例7、8制備的黑TiO2-Fe3O4-PEGmO2-Gd2O3-PEG復合納米材料，分散于超純水中，配制成濃度為0.01mg/mL、0.02mg/mL、0.04mg/mL、0.08mg/mL、0.16mg/mL、0.32mg/mL的溶液各2mL。通過核磁共振儀(NMR)表征復合納米材料的T2或Tl加權的MRI信號。實驗結果顯示，制備的復合納米材料具有良好的Τ2 (黑TiO2-Fe3O4-PEG)或Tl (黑TiO2-Gd2O3-PEG)加權的MRI信號，可用于腫瘤的MRI診斷以及治療效果評價。
[0156]電子計算機X射線斷層掃描(CT)成像:性能取實施例11制備的黑TiO2-Au-PEG復合納米材料，分散于超純水中，配制成濃度為0.01mg/mL、0.02mg/mL、0.04mg/mL、0.08mg/mL、0.16mg/mL的溶液各2mL。通過電子計算機X射線斷層掃描儀表征復合納米材料的X_射線成像性能。實驗結果顯示，制備的復合納米材料具有良好的CT信號，可用于腫瘤的CT診斷以及治療效果評價。
[0157]熒光發光性能:取實施例9、10、12、13、14 制備的黑 TiO2-NaYF4: Yb3+/Tm3+-PEG、黑 TiO2-NaYF4:Yb3+/Tm3+-PEG-VEGF、黑 Ti02-CdSe_PEG、黑 TiO2-1CG-PEG、黑 TiO2-熒光介孔硅-PEG復合納米材料各lmg，分散于IOmL純水中，配制成0.lmg/mL。通過熒光光譜儀測試上述復合納米材料的熒光發光性能。實驗結果顯示，上述復合納米材料具有良好的熒光發光性能，可用于腫瘤的診斷以及可視化治療。
[0158]雙光子發光性能:取實施例15制備的黑TiO2-熒光Au-PEG復合納米材料Img分散于IOmL超純水中。通過雙光子顯微鏡觀察復合納米材料的發光性能。結果顯示，制備的黑TiO2-熒光Au-PEG復合納米材料具有良好的雙光子激發熒光性能，可用于腫瘤的診斷以及可視化治療。
[0159]超聲成像性能:取實施例18制備的黑TiO2-PLA復合材料2mg，分散于20mL超純水中。將復合材料注入瓊脂糖模擬超聲成像軟管中，通過超聲波成像儀，檢測復合材料的超聲信號。實驗結果顯示，該復合材料具有良好的超聲信號，可用于腫瘤的診斷以及可視化治療。
[0160]實施例20:復合納米材料的細胞毒性
[0161]取實施例1-18制得的復合納米材料，高溫滅菌后，分散于培養液中，分別配制成50、100、200、300、400、500μ g/mL待用。取對數生長期的人乳腺癌細胞MCF-7，調整細胞濃度為I X IO5個/mL，分別接種于96孔細胞培養板中，每孔100 μ L，在5% C02、37°C、飽和濕度的細胞培養箱中培養24小時。24小時后，棄掉培養板中的培養基，在培養板中分別加入新鮮培養液、含有復合納米材料的培養液，在5% C02、37°C、飽和濕度的細胞培養箱中孵育24小時。24小時后，在培養孔中加入10 μ L噻唑藍(MTT, 5mg/mL)，孵育細胞4小時。4小時后將培養液吸棄，每孔加入100 μ L 二甲基亞砜(DMSO)，溶解10分鐘后，于酶標儀上550nm測量每孔OD值，計算復合納米材料的細胞毒性。以實施例1、2所制備的復合納米材料的表征結果為例，實施例1、2所制備的黑Ti02-PEG、黑TiO2-PEG-FA復合納米材料對人乳腺癌細胞MCF-7的細胞毒性如圖6所示，結果顯示，濃度高達500 μ g/mL的復合納米材料作用細胞24小時后，細胞活性沒有發生明顯地降低，說明制備的黑Ti02-PEG、黑TiO2-PEG-FA復合納米材料細胞毒性低、生物相容性良好。
[0162]實施例21:復合納米材料對腫瘤細胞的光熱治療
[0163]取實施例1-18制得的復合納米材料，高溫滅菌后，分散于培養液中，配制成100 μ g/mL待用。取對數生長期的人乳腺癌細胞MCF-7，調整細胞濃度為I X IO5個/mL，分別接種于96孔細胞培養板中，每孔100 μ L，在5% CO2、37°C、飽和濕度的細胞培養箱中培養24小時。24小時過后，棄掉培養孔板中的培養基，在培養板中分別加入新鮮培養液、含有復合納米材料的培養液，在5% C02、37°C、飽和濕度的細胞培養箱中孵育4小時。棄去原液，加入培養液。使用808nm激光器系統對細胞進行照射、激光功率密度為2W/cm2。照射結束后，取其中一部分細胞，用鈣黃綠素/溴化丙啶染色后，于熒光顯微鏡下觀察；另一部分細胞在5% C02、37°C、飽和濕度的細胞培養箱中繼續孵育24小時。24小時后，在培養孔中加AlOyL噻唑藍(MTT, 5mg/mL)，孵育細胞4小時。4小時后將培養液吸棄，每孔加入100 μ L二甲基亞砜(DMS0)，溶解10分鐘后，于酶標儀上550nm測量每孔OD值，計算復合納米材料對乳腺癌細胞的光熱治療效果。
[0164]以實施例1、2所制備的復合納米材料的表征結果為例，實施例1、2所制備的黑Ti02-PEG、黑TiO2-PEG-FA復合納米材料在808nm、2W/cm2的近紅外光照射下，對人乳腺癌細胞MCF-7的光熱治療效果的MTT結果如圖7所示，結果顯示，100 μ g/mL復合納米材料作用細胞4小時后、使用2W/cm2的808nm近紅外光照射細胞5分鐘后，細胞繼續培養24小時，被照射的腫瘤細胞全部死亡。
[0165]圖8是實施例1制備的黑TiO2-PEG復合納米材料在808nm、2W/cm2的近紅外光照射下，對人乳腺癌細胞MCF-7的光熱治療效果的鈣黃綠素/溴化丙啶染色結果。結果顯示，100 μ g/mL黑TiO2-PEG作用細胞4小時后，使用2W/cm2的808nm近紅外光照射細胞5分鐘，腫瘤細胞即發生大量死亡，死亡率可高達95%或更高。
[0166]實施例22:復合納米材料的動物急性毒性
[0167] 取實施例1-18制得的復合納米材料分散于生理鹽水中，配制成200 μ g/mL,高溫滅菌待用。取健康的小鼠，通過尾靜脈給藥IOOyL復合納米材料以及生理鹽水。觀察并記錄動物在給藥后24小時內的毒性癥狀及程度。24小時后，將小鼠處死，測定肝、腎功能相關的血清生化指標、并對心、肝、脾、腎、肺等主要臟器進行組織切片分析。
[0168]圖9是實施例1、2所制備的黑Ti02-PEG、黑TiO2-PEG-FA復合納米材料對健康小鼠肝、腎相關的血清生化指標的影響的實驗結果。結果顯示，制備的黑Ti02-PEG、黑TiO2-PEG-FA復合納米材料生物相容性良好，作用小鼠24小時后，沒有顯著地影響小鼠肝、腎器官的功能。
[0169]實施例23:復合納米材料對荷瘤小鼠實體瘤的光熱治療
[0170]取實施例1-18制得的復合納米材料分散于生理鹽水中，配制成200 μ g/mL,高溫滅菌待用。取MCF-7細胞荷瘤小鼠，給藥200 μ L的復合納米材料以及生理鹽水，用2W/cm2的808nm激光照射腫瘤部位。照射結束后，將一半小鼠處死，對其腫瘤進行蘇木精/伊紅染色的組織切片分析，評價小鼠腫瘤損傷情況，通過ICP-MS分析被處死小鼠的心、肝、脾、腎、肺以及腫瘤中鈦元素的含量。其余小鼠在兩周內，每天測量腫瘤大小及體重，分析治療效果。兩周之后將所有小鼠處死，解剖實體瘤，記錄其體積、重量，評價復合納米材料治療小鼠實體瘤的效果。
[0171]圖10是實施例1、2所制備的黑Ti02-PEG、黑TiO2-PEG-FA復合納米材料經尾靜脈注射人乳腺癌細胞荷瘤小鼠后，在其心、肝、脾、腎、肺以及腫瘤內的分布情況。結果顯示，黑Ti02-PEG、黑TiO2-PEG-FA復合納米材料主要分布于肝、脾等器官，在腫瘤部位也有一定量的分布。
[0172]圖11是實施例1、2所制備的黑Ti02-PEG、黑TiO2-PEG-FA復合納米材料在808nm、2ff/cm2的近紅外光照射下，對人乳腺癌細胞荷瘤小鼠的光熱治療效果。結果顯示，與對照組(生理鹽水、激光、黑TiO2-PEG、黑TiO2-PEG-FA等)相比，黑TiO2-PEG、黑TiO2-PEG-FA復合納米材料在808nm近紅外光作用下的，能夠顯著地引起腫瘤的消融，說明制備的復合納米材料是一種優異的腫瘤光熱治療試劑。
[0173]在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
【權利要求】
1.一種復合納米材料，其特征在于，所述的復合納米材料包括核心材料A-穩定劑B復合物:其中， 所述的核心材料A為氫化處理的金屬氧化物半導體納米材料，或氫化處理的金屬氧化物半導體納米材料和選自下組的材料進行復合形成的復合材料:磁性納米材料、上轉換發光納米材料、貴金屬納米材料、量子點、熒光材料，或其組合； 所述的穩定劑B選自下組:有機高分子聚合物、脂質體、微泡、白蛋白納米球，或其組合，其中，所述的有機高分子聚合物的聚合單體選自下組:C2-C10的不飽和醇、酸或胺、C2-C12的多羥基化合物、乳酸、羥基乙酸，或其組合。
2.如權利要求1所述的復合納米材料，其特征在于，所述的復合納米材料還包括:與核心材料A-穩定劑B復合物偶聯的腫瘤祀向分子C。
3.如權利要求1所述的復合納米材料，其特征在于，所述的復合納米材料還包括:負載于核心材料A-穩定劑B復合物的活性藥物成分D。
4.如權利要求1所述的復合納米材料，其特征在于， 所述氫化處理的金屬氧化物半導體納米材料選自下組:氫化的TiO2納米材料、氫化的ZrO2納米材料、氫化的ZnO納米材料,或其組合；和/或 所述磁性納米材料選自下組=Fe3O4納米材料、CoFe2O4納米材料、ZnFe2O4納米材料、NiFe2O4納米材料、MnFe2O4納米材料、Gd2O3納米材料，或其組合；和/或 所述上轉換發光納米材料 選自下組=NaYF4: Er3+/Yb3+納米材料、NaYF4: Yb3+/Tm3+納米材料、NaYF4: Tm3VEr3+ 納米材料、NaYF4: Yb3+/Tm37Er3\ NaGdF4: Yb3+/Tm37Er3+ 納米材料，或其組合；和/或 所述貴金屬納米材料選自下組:Au納米材料、Ag納米材料、Pt納米材料、Pd納米材料，或其組合；和/或 所述量子點選自下組:量子點0(156、0(15、0(?^、21^、21^6，或其組合；和/或 所述熒光材料選自下組:有機熒光染料分子(如茜素紅、羅丹明、吲哚菁綠、花青素Cy5.5、Cy7)、無機熒光介孔材料、貴金屬熒光納米材料(如小粒徑金、小粒徑銀)，或其組口 ο
5.如權利要求1所述的復合納米材料，其特征在于，所述的穩定劑B選自下組:聚乙二醇、聚丙烯酸、葡聚糖、聚乙烯亞胺、聚乙烯胺、聚馬來酸、羧甲基殼聚糖、羧甲基淀粉、羧甲基葡聚糖、聚乳酸、聚乳酸-羥基乙酸、脂質體、白蛋白納米球，或其組合。
6.如權利要求2所述的復合納米材料，其特征在于，所述的腫瘤靶向分子C選自下組:葉酸、氨甲蝶呤、氨基蝶呤、RGD肽(精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸)、血管內皮生長因子(VEGF)、神經多肽(NPY)、腫瘤特異性抗體，或其組合。
7.如權利要求3所述的復合納米材料，其特征在于，所述活性藥物成分D選自下組:阿霉素、紫杉醇中的一種或多種。
8.如權利要求1所述的復合納米材料的制備方法，其特征在于，包括步驟: (1)提供一氫化處理的金屬氧化物半導體納米材料A; (2)用所述的氫化處理的金屬氧化物半導體納米材料A與穩定劑B反應，得到核心材料A-穩定劑B復合物。
9.如權利要求1-7任一所述的復合納米材料的用途，其特征在于，用于:(a)制備腫瘤光熱治療藥物組合物； (b)用于制備腫瘤成像造影劑； (C)用于體外非治療性地抑制腫瘤細胞活性； (d)用于體外非治療性地誘導腫瘤細胞凋亡。
10.一種藥物組合物，其特征在于，所述的藥物組合物包括治療有效量的如權利要求.1-7任一所述的復合納米材料；和藥學上可接受的載體。
【文檔編號】A61K9/14GK103893128SQ201410175018
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年4月28日 優先權日:2014年4月28日
【發明者】任文智, 吳愛國 申請人:中國科學院寧波材料技術與工程研究所