一種nk細胞因子混合物的制備方法及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明屬于腫瘤生物治療領域，涉及一種NK細胞的活化方法獲得的NK細胞和細胞因子混合物及其應用。本發明獲得的NK細胞是在體外培養、激活和擴增的具有細胞毒作用的腫瘤殺傷細胞，將其回輸到患者體內可直接殺傷腫瘤細胞、提高免疫力；本發明的NK細胞培養上清液及予以冷凍干燥濃縮制成的凍干粉制劑含有一系列具有生物活性的天然細胞因子混合物，這種天然細胞因子的混合物在抗腫瘤治療中具有良好的抗腫瘤活性。
【專利說明】—種NK細胞因子混合物的制備方法及其應用
[0001]
【技術領域】
[0002]本發明屬于腫瘤生物治療領域，涉及一種NK細胞因子混合物的制備方法及其應用。
【背景技術】
[0003]自然殺傷細胞(Natural killer cells, NK)是人體內第一道與生俱來的免疫防線成員之一，也是對抗癌細胞或病毒最強、最有效的免疫淋巴細胞，與其他抗癌免疫細胞如毒性 T 細胞(Cytotoxic T cells, CTL)或樹突狀細胞(Dendritic cells, DC)相比，NK 細胞具廣譜性、不受組織兼容性抗原限制且不需要致敏作用的啟動即可直接發動對癌細胞的攻擊，因此稱為自然殺傷細胞。NK細胞對多種感染性微生物和腫瘤細胞起著免疫監視的作用，具有抗腫瘤、抗感染和免疫調節的作用，其靶細胞主要有腫瘤細胞、病毒感染細胞、某些自身組織細胞(如血細胞)、寄生蟲等。
[0004]臨床實驗表明:獲得腫瘤患者的免疫細胞后，進行體外刺激、擴增培養后回輸到患者體內，可以直接殺傷腫瘤細胞、恢復或增強患者的免疫機能達到抑制腫瘤生長的作用。
[0005]自然殺傷活性的NK細胞其殺傷介質主要有穿孔素、NK細胞毒因子和TNF等。活化的NK細胞可合成并分泌多種細胞因子，發揮免疫調節和造血作用以及直接殺傷靶細胞的作用，這些細胞因子包括白介素(Interleukins, ILs )、集落刺激因子(ColonyStimulating Factors, CSFs)、腫瘤壞死因子(Tumor Necrosis Factors, TNFs)、干擾素(Interferons, IFNs)以及穿孔素(Perforin)等。IL_2是參入免疫應答的重要細胞因子,參與炎癥反應、抗腫瘤反應和移植排斥反應，在調控T細胞免疫應答中起重要作用；CSFs具有增強細胞介導的抗體依賴的細胞毒作用(ADCC)，對粒細胞和巨噬細胞有直接的趨化作用，在抗腫瘤免疫中有重要作用，CFSs與IL-2 —起還能誘導前體T細胞的生長等；TNFs可誘導T細胞表達MHC-1I類分子和高親和力的IL-2受體，協同IL-2促進T細胞產生IFN-Y和增強細胞毒活性，還可增強巨噬細胞的活性和殺傷能力、免疫應答能力，對炎癥局部的中性粒細胞的活性和聚集也有促進作用；IFNs是最先發現的具有廣譜抗病毒、抗腫瘤和免疫調節等活性的細胞因子。能通過多種機制影響腫瘤細胞功能，促進免疫細胞的活性；穿孔素的作用是在靶細胞膜上形成多聚穿孔素管狀通道，使顆粒酶進入靶細胞，引起靶細胞凋亡。
[0006]目前，利用基因工程技術生產的重組細胞因子作為生物應答調節劑(BRM)治療腫瘤、造血障礙、感染等已收到良好的療效。美國食品藥品監督管理局(FDA)已批準重組白介素12 (rIL-12)作為多毛細胞白血病、卡波濟氏肉瘤以及慢性肝炎的臨床治療藥物，批準重組IFN-Y用于治療慢性肉芽腫病以及批準rIL-2在胃細胞癌上的臨床應用。
[0007]NK細胞在培養過程中，產生一系列的天然細胞因子并分泌于培養上清液中形成天然細胞因子混合物(nonrecombinant cytokine mixture, NCM)。 [0008]NCM療法已被國外證實是一種安全有效的治療方法，不但能夠直接發揮抗腫瘤作用，而且還可通過多種途徑激活和增強人體免疫系統，清除已發生轉移的瘤細胞。美國Cel-Sci公司自主研發的細胞因子混合物白介素注射液(Multikine?)用于抗腫瘤應用，通過改變腫瘤細胞的細胞周期，從而提高腫瘤細胞對放化療的敏感性。Hemispherx生物制藥公司研發的天然的IFN-α s注射劑(Alferon N)是由二十幾種甚至更多的淋巴因子組成的混合物，在治療尖銳濕疣癥中顯示了良好的治療效果。
[0009]傳統NK細胞培養方法中需要用PHA和/或腫瘤細胞株(如K562、HFffT以及K562-MB15-41BBL)作刺激因子和滋養層來培養NK細胞，具有繁瑣的細胞培養步驟，使用PHA和腫瘤細胞株也帶來安全問題。
【發明內容】
[0010]本發明首先所要解決的技術問題提供更加高效安全的NK細胞培養方法，以及提供一種NK細胞因子混合物的制備方法及其應用。
[0011]為達到上述目的，本發明采用如下技術方案:
一種NK細胞的培養方法，包括如下步驟:將分離好的單個核細胞置于含有0KT-3抗體和IL-2細胞因子的培養液中，培養五天后，每2天更換一次新鮮NK細胞培養基，并添加IL-12和IL-15，使其在培養液中濃度分別達到10ng/ml和50ng/ml，培養至21天。
[0012]傳統NK細胞培養方 法中，PHA作為一種有絲分裂原，主要用于激活免疫淋巴細胞，由于其較難提純，且成本極高，一直以來僅在實驗室中作為刺激淋巴細胞增殖的試劑，難以大規模普及應用，且對免疫細胞具有過度刺激的作用。本發明僅僅采用IL-2、0KT-3、IL-12以及IL-15的有效組合，本發明中所添加的IL-12和IL-15基本可以取代細胞株分泌的因子對NK的刺激增殖作用，這些因子的共同刺激有利于NK細胞的生長擴增，第5天添加IL-12和IL-15后即可發現NK細胞迅速處于擴增狀態，而其它類型的細胞開始逐漸處于抑制生長狀態，第20天后可以獲得較高純度的NK細胞，高達64%，以及獲得大量的NK細胞，細胞擴增效率高達510倍。
[0013]本發明還提供細胞毒NK細胞制劑的制備方法，具體如下:
從細胞培養第9天開始每隔兩天將部分細胞收獲，離心后棄上清，細胞沉淀用復方電解質注射液懸浮后再離心，重復一次，棄上清，將細胞沉淀用復方電解質注射液懸浮均勻，加入人血白蛋白，毒性NK細胞制劑的制備完成。
[0014]本發明進一步提供一種細胞因子混合物的制備方法，具體如下:
從細胞培養第6~12天離心收集細胞上清液，將細胞返還細胞培養瓶或細胞培養袋中；低溫下將上清液超速離心，棄沉淀，取上清超濾、微濾，將獲得的濾液4°C短期保存備用，或-20°C長期保存備用。
[0015]于無菌條件下，將上述濾液等體積分裝于安瓿瓶中，并置于凍干盤內，-20°C預凍上清液至凝固狀態，同時抽真空，升華干燥，去除冰晶，塞入鹵化丁基膠塞，加蓋鋁塑蓋封口，于4°C保存凍干粉或運輸。
[0016]本發明方法采用本身具有抗腫瘤免疫效應的NK細胞進行培養，一段時間后可以獲得活化的具有細胞毒作用的腫瘤殺傷NK細胞。同時，細胞培養過程中會分泌多種高含量的天然細胞因子于培養基中(如表1、2)在此特定時期收集細胞培養上清，通過超速離心、超濾微濾，可以獲得可供臨床使用的，含有多種高含量天然細胞因子混合物。所制得的細胞因子混合物中含有如穿孔素、顆粒酶和腫瘤壞死因子等，可以引起惡性腫瘤細胞破裂或凋亡，直接發揮抗腫瘤作用；還含有其它如IL-10、TGF等對機體免疫系統具有調節作用的因子，可以在體內相互協同作用，刺激體內具有腫瘤殺傷作用的免疫細胞增殖、成熟，從而間接發揮抗腫瘤作用。所制得的細胞因子混合物是天然細胞因子，與臨床使用的重組細胞因子相t匕，具有天然構象，活性更強；各種細胞因子量是免疫細胞按最佳配比分泌的，有理由推測這種配比可能與NK細胞發揮強大的抗腫瘤作用相關，也可能是在體內發揮作用最合適的。
【具體實施方式】
[0017]1、NK細胞的體外培養、擴增和激活
1)無菌條件下從患者靜脈抽取20ml的外周血于50ml離心管中，加入300IU肝素鈉抗凝劑；
2)按1:1加入生理鹽水或PBS稀釋；
3)向空的15ml離心管中加入5ml淋巴細胞分離液，取IOml稀釋血液緩慢加入15ml離心管中，1500rpm,離心20min,取白膜層細胞并用生理鹽水洗漆，1200rpm,離心10min后PBS重懸，重復I次，棄上清；
4)用NK細胞培養基重懸上述細胞，并添加抗CD3抗體(Orthoclone0KT-3; Ortho
Biotech, Raritan, NJ),抗體終濃度調至 10ng/ml ;
【權利要求】
1.一種NK細胞的培養方法，其特征在于: 將分離好的單個核細胞置于含有0KT-3抗體和IL-2細胞因子的培養液中，培養五天后，每2天更換一次新鮮NK細胞培養基，并添加IL-12和IL-15，使其在培養液中濃度分別達到10ng/ml和50ng/ml,培養至21天。
2.一種細胞毒NK細胞制劑的制備方法，其特征在于: 將分離好的單個核細胞置于含有0KT-3抗體和IL-2細胞因子的培養液中，培養五天后，每2天更換一次新鮮NK細胞培養基，并添加IL-12和IL-15，使其在培養液中濃度分別達到10ng/ml和50ng/ml,培養至21天; 從細胞培養第9天開始每隔兩天將部分細胞收獲，置于50mL離心管中，1200rpm，離心IOmin,棄上清，細胞沉淀用復方電解質注射液懸浮，1000rpm,離心10min，重復一次，棄上清，將細胞沉淀用95mL復方電解質注射液懸浮均勻，轉移到IOOmL玻璃瓶中，加入5mL 20%人血白蛋白，毒性NK細胞制劑的制備完成。
3.一種細胞因子混合物的制備方法，包括如下步驟: 將分離好的單個核細胞置于含有0KT-3抗體和IL-2細胞因子的培養液中，培養五天后，每2天更換一次新鮮NK細胞培養基，并添加IL-12和IL-15，使其在培養液中濃度分別達到10ng/ml和50ng/ml,培養至21天; 從細胞培養第6~12天離心收集細胞上清液，將細胞返還細胞培養瓶或細胞培養袋中；4°C下將上清通過50000 rpm超速離心2h,棄沉淀,取上清超濾,再用0.Ι?μπι微孔濾膜微濾，將濾液添加進細胞制劑中，或4°C短期保存備用，或_20°C長期保存備用。
4.權利要求3所制備的細胞因子混合物。
5.權利要求4所述的細胞因子混合物在制備抗腫瘤藥物中的應用。
【文檔編號】A61P35/00GK103923879SQ201410175015
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年4月29日 優先權日:2014年4月29日
【發明者】吳皖, 王雄偉, 湯威, 邢文彥, 羅琳 申請人:湖北華賽生物醫藥技術有限公司