一種防治動脈粥樣硬化斑塊搜風祛痰解毒法藥物及制備方法

一種防治動脈粥樣硬化斑塊搜風祛痰解毒法藥物及制備方法
【專利摘要】一種應用于醫藥【技術領域】中的防治動脈粥樣硬化斑塊搜風祛痰解毒法藥物及制備方法，它的產品配方的重量比是，全蝎3g-5g、蜈蚣2-4g、地龍10-15g、水蛭10-15g、陳皮10-15g、半夏10-15g、白術10-15g、金銀花10-15g；其制備方法是，將全蝎、蜈蚣、地龍、水蛭、陳皮、半夏、白術、金銀花用15倍的水量浸泡40分鐘后，第一次用文火煎煮70分鐘，第二次加10倍量得水用文火煎煮50分鐘，第三次加6倍量得水用文火煎煮30分鐘，將3次所煎藥液合并，將所得藥液用紗布過濾，過濾后用100℃水浴濃縮至200ml的藥液，即得成品。該發明藥物組成簡單，配伍關系明確,藥味少，價格低廉，療效確切顯著,通過動物實驗證明具有調節血脂，有顯著的防治動脈硬化的作用,易于被患者接受。
【專利說明】一種防治動脈粥樣硬化斑塊搜風祛痰解毒法藥物及制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及醫藥【技術領域】中的一種中草藥，尤其是涉及一種防治動脈粥樣硬化斑塊搜風祛痰解毒法藥物及制備方法。
【背景技術】
[0002]一、關于HO-1和HSP70與動脈粥樣硬化的關系
Ross于1999年在他的損傷反應學說的基礎上明確提出“動脈粥樣硬化是一種炎癥性疾病”，指出動脈粥樣硬化具有慢性炎癥反應特征的病理過程，在其發生發展過程中，從脂質條紋到纖維斑塊和粥樣斑塊，乃至不穩定斑塊的生成、破裂和血栓形成中始終都有大量炎癥介質和各種炎癥細胞參與，如血紅素氧化酶1、熱休克蛋白、黏附因子、巨噬細胞都參與構成動脈粥樣斑塊或血管壁的成分。血紅素氧合酶(heine oxygenase,HO)是血紅素降解的起始酶和限速酶，降解血紅素(heme)產生鐵離子(iron)、膽綠素(bihverdin)和一氧化碳(carbon monoxide, CO)。
[0003]HO有H0-1、H0-2、H0-3三種存在形式，其中H0-1為誘導型，其分子量為32kD，熱休克增加其表達，屬熱休克蛋白(heat shock protein,HSP)家族,故又稱HSP-32。主要分布于單核巨噬細胞系統的微粒體中，在心、腎、肺、脾臟、肝臟、網狀內皮細胞和骨髓中表達較多。炎癥細胞因子、缺氧、激素、金屬離子、氧化劑等均能誘導H0-1的表達。Kazunobu等用低密度脂蛋白受體缺陷大鼠飼6周高脂飲食的實驗研究發現H0-1在動脈粥樣硬化過程中有保護血管的作用。Loke麗等[117]認為H0-1通過改善內皮功能以抗動脈粥樣硬化。王薇等實驗表明，H0-1通過抑制動脈壁的炎癥反應、減少巨噬細胞數量對AS進行干預，進而預防AS的發展。
[0004]熱休克蛋白(heat shock protein , HSP)是生物體對外界刺激發生反應而產生的應激蛋白，進化上高度保守，具有抗原性，可被免疫系統視為外源分子，從而觸發自身免疫反應。依據相對分子量的大小可分多個亞家族，包括HSP70、HSP60、HSPl 10、HSP90、HSP40、小分子HSP和泛素。內皮損傷是AS發病的起因。動脈壁長期受到高脂血癥、氧化型低密度脂蛋白(OxLDL)、毒素、高血壓和活性氧等因素的刺激，平滑肌細胞和血管內皮細胞不能對這些刺激產生相應防御反應，血管壁就會受損。血管壁受到這些應激因素刺激，就會產生HSP。近來發現，HSP過度表達時，可作為抗原及炎癥因子，誘發免疫反應與炎性反應，參與動脈粥樣硬化，尤以HSP70、HSP60家族明顯。HSP所致的Thl和Th2反應在AS發生中起著重要的作用，AS斑塊中檢測到補體復合物、補體受體和免疫球蛋白，表明了斑塊局部內補體激活可誘導炎性細胞表達炎性因子，促進炎癥的發生；HSP還可誘導巨噬細胞表達MMP-9、TNF_a，進而激活單核細胞來源的巨噬細胞、平滑肌細胞、血管內皮細胞。王曉兵等研究表明，血紅素組HSP70表達高于膽固醇組、生理鹽水組，HSP70高表達可以抑制動脈粥樣硬化病變的發展。
[0005]H0-1為誘導型，H0-1基因內含有HSE軟件，與HSP70結構類似，現已證實H0-1是一種應激蛋白，應激條件下二者同步表達增加。HO-1正常情況下低表達或不表達，應激狀態下HO-1適量表達可以減輕蛋白質氧化、脂質過氧化及細胞損傷，減輕血管緊張素II引起的內皮細胞損傷，對血管損傷的修復有潛在保護作用。HSP70表達增多，可以保護心肌細胞微管微絲的穩定，改善心肌的收縮，舒張血管，在分子水平激活一系列相關的保護酶，抑制有害分子的表達。
[0006]二、關于TLRs和PPAR Y與動脈粥樣硬化的關系
過氧化物酶增殖體激活型受體Y (PPARy)屬于2型核受體超家族成員，是一類配體依賴的序列特異的核轉錄因子。它能對控制脂質和葡萄糖代謝的基因進行轉錄、調控。PPARs有α、β、y 3種異構體。研究表明PPARy活化能抑制炎癥反應而對動脈粥樣硬化產生影響[11]。Nagy等[12]發現在動脈粥樣硬化病變的泡沫細胞中PPAR Y表達增加；將單核細胞暴露于OX-LDL中能誘導PPAR Y表達，OX-LDL及脂質氧化成分(9-H0DE和13-H0DE)是PPAR Y內源性的激動劑和配體，而PPAR Y的轉錄激活則增強清道夫受體⑶36的表達，使巨噬細胞攝取OX-LDL增加，從而轉化為泡沫細胞，促進動脈粥樣硬化的形成。現有研究表明，PPAR- Y激活劑可抑制單核/巨噬細胞激活。活化的PPAR- Y通過活化蛋白、信號轉導和轉錄活化因子(VXQX)信號通路能抑制多種與斑塊進展相關促炎癥因子、黏附分子的基因表達，抑制IL-6、環氧化酶、內皮素-1、一氧化氮合酶的表達，抑制炎癥反應。
[0007]Toll樣受體(toll-like receptors, TLRs)是近年來新發現的模式識別受體，能調節先天與獲得性免疫，在抗微生物感染和識別內源性配體中起重要作用。TLRs識別內外源性配體后，啟動炎性應答通路，誘導炎性因子大量產生，從而對機體組織產生保護和損傷作用。大量證據表明，TLRs在As中起著重要作用。其中TLR4是該家族中有代表性的一員，它能特征性地識別革蘭陰性菌壁中的內毒素。最近的研究結果顯示，TLR4 mRNA在AS斑塊中大量表達，顯示該受體也可能與AS的發生有密切關系[14]。由于TLR4僅僅在識別細菌壁中的脂多糖并與之結合后，才能激活胞內信號傳導途徑，產生多種能擴大炎癥反應、增強殺菌作用的細胞因子。因此也提示AS的發病機制與微生物的感染有關。當然，細菌感染和TLR信號途徑不足以成為AS發病的始動因素，但它們可能導致穩定斑塊的炎癥變化，使斑塊向不穩定方向轉變。TLR4為細菌感染和AS炎癥形成之間建立了一個橋梁，并且在研究中TLR4與TNF α的表達呈正相關，進一步支持TLR4在AS炎癥活化中的作用。
[0008]AS不穩定斑塊的破裂是導致心血管事件發生的主要原因，(包括心機梗死、猝死)，穩定AS斑塊十分重要，目前西醫中穩定斑塊的藥物有他汀類，其毒副作用極大，中醫中采用的活血類藥物穩定斑塊也不易控制斑塊，易導致斑塊破裂，因此，研制開發一種防治動脈粥樣硬化斑塊搜風祛痰解毒法藥物及制備方法一直是亟待解決的新課題。

【發明內容】

[0009]本發明目的在于針對上述問題，提供一種療效確切、實際針對性強、毒副作用小、質量穩定可靠、成本低、方便服用的防治動脈粥樣硬化斑塊搜風祛痰解毒法藥物及制備方法。
[0010]本發明的目的是這樣實現的:一種防治動脈粥樣硬化斑塊搜風祛痰解毒法藥物，它的產品配方的重量比是，全蝎3g-5g、蜈蚣2-4g、地龍10-15g、水蛭10-15g、陳皮10_15g、半夏10_15g、白術10-15g、金銀花10-15g ;—種防治動脈粥樣硬化斑塊搜風祛痰解毒法藥物的制備方法，其制備方法是，將全蝎、蜈蚣、地龍、水蛭、陳皮、半夏、白術、金銀花用15倍的水量浸泡40分鐘后，第一次用文火煎煮70分鐘，第二次加10倍量得水用文火煎煮50分鐘，第三次加6倍量得水用文火煎煮30分鐘，將3次所煎藥液合并，將所得藥液用紗布過濾，過濾后用100°C水浴濃縮至200ml的藥液，即得成品。
[0011]本發明的要點在于它的產品配方及制備方法。祖國醫學中并沒有動脈粥樣硬化這一病名，根據其臨床表現涉及到中醫學真心痛、胸痹、厥心痛、中風、癡呆、痰飲等疾病。中醫對動脈粥樣硬化病機認識有本虛標實之分，本虛多為氣虛；標實則以血瘀、痰濁、氣滯多見。中醫對急性冠脈綜合癥不穩定斑塊思路上有四種:
一是從瘀論治，文川等[125]通過復制ApoE基因缺陷小鼠動脈粥樣硬化模型，從細胞成分、膠原、炎癥介質、病理形態學等方面，觀察桃仁、川芎、三七、赤芍、丹參穩定斑塊的效果及作用機理。該實驗結果顯示，破血藥(桃仁、酒大黃)、活血藥(三七、川芎)、和血藥(赤芍)能降低ApoE基因缺陷小鼠LDL、TG、TC水平。活血中藥具有一定穩定斑塊的作用。
[0012]二是從痰瘀論治，有學者認為，不穩定斑塊從中醫角度上說屬于痰瘀交阻，痰濁多因嗜食肥甘厚味，飲食不潔而內有臟腑虛損，可致痰濁內生，瘀血阻滯，痰瘀互結，脈絡閉阻而發病；或表現為臟腑氣血虛損，氣機運行不暢，血行受阻，瘀血內停，發為血瘀、痰濁及瘀血內滯，脈絡阻滯。以活血化瘀方劑進行治療，對ACS常用的活血化瘀方劑有失笑散、血府逐瘀湯、丹參飲等，可不同程度地改善血液動力學，調節血脂載脂蛋白的代謝，減輕局部炎癥反應，抑制動脈粥樣硬化斑塊的形成，抗動脈硬化，祛瘀消斑，抑菌、抗炎、防止血栓形成，以穩定斑塊。
[0013]三是從毒瘀論治，也有學者考慮到毒的致病因素，提出“毒、瘀致易損斑塊”，因毒邪侵襲致病后，臟腑氣機功能失調，津液凝聚為痰，血滯聚集而為瘀，痰、瘀、毒三者相互為用，而致動脈粥樣硬化斑塊破裂而發生ACS ;因而治療當以清熱解毒之法治療邪毒，以消除斑塊及穩定斑塊從而治療ACS。
[0014]四是從風痰論治，認為冠心病、動脈粥樣硬化的過程與痰瘀致胸痹有物質學的相似性，甚至把某種代謝產物如動脈粥樣硬化斑塊認為就是痰瘀的有形之物，因其竄流經脈，且黏澀，既可滯著于動脈壁上形成斑塊，又可導致血液流變學異常，產生瘀血，現代人運動減少，飲食膏粱厚味致使脾虛生痰，痰凝血瘀，痰瘀蘊結不解而生內癰毒熱，熱極生內風，風邪為百病之長，善行而數變，痰為百病之祟，痰風內動，與動脈粥樣硬化斑塊破裂的不穩定性有相似之處。正如《醫方考》謂“風痰者，濕土生痰，痰生熱，熱生風也。”內風即指風氣內動，是機體陽氣過于亢盛，所致的氣病。唐代孫思邈所著之《備急千金要方》首次提出內風起于心氣不定，胸上蓄積痰濁實邪，發病時患者多面熱紅赤，究其病因，內生之風邪為痰濁熱化所致。痰濁、瘀血多為氣血運行失常所致的病理產物，二者常常相伴出現。所以我們在繼承前人理論基礎上我們創新性提出中醫心血管事件鏈:虛-痰-瘀-毒(熱)_風。故治療宜搜風祛痰，解毒活血，從痰從風論治動脈粥樣硬化不穩定斑塊。達到預防心血管事件的發生。
[0015]而且風藥善于宣暢氣機，疏通血絡，消除瘀滯，化解脈中瘀血而達化瘀之效，尤其蟲類風藥更以行走攻竄見長，擅疏通經絡壅滯，開啟孔竅閉塞，故能通利心絡，開通心竅，善止痹痛。黃淑芬首倡“治血先治風，風去血自通”，用風藥治療血瘀證已取得初步成效，在體外細胞培養的條件下，從內皮細胞功能角度探討搜風祛痰法中藥對動脈粥樣硬化的研究證明從痰從風論治動脈粥樣硬化的可行性。穩斑湯方中全蝎、蜈蚣息風止痙，攻毒散結，通絡止痛；地龍清熱息風，通絡，利尿，共為君藥；陳皮、半夏、白術合用，既能燥濕健脾，又能化痰散結，為臣藥；水蛭為蟲類化瘀藥，破血逐瘀而不傷新血，為佐藥。諸藥合用共奏搜風祛痰，祛瘀通絡之功效。
[0016]全蝎:藥性:辛，平，有毒，歸肝經；具有息風止痙，攻毒散結，通絡止痛之功效；用于痙攣抽搐，瘡瘍腫毒、瘰疬結核，風濕頑痹，頑固性偏正頭痛。本品入肝經，性善走竄，既平息肝風，又搜風通絡，有良好的息風止痙之效，為治痙攣抽搐之要藥。《本草求真》云:“全蝎，專入肝祛風，凡小兒胎風發搐，大人半身不遂，口眼歪斜，語言謇澀，手足抽搐，瘧疾寒熱，耳聾，帶下，皆因外風內客，無不用之。”《本草從新》云:“治諸風掉眩，驚癇抽掣，口眼歪斜……厥陰風木之病。”《開寶本草》:“療諸風癮疹及中風半身不遂，口眼斜，語澀，手足抽掣。”
現代藥理研究表明，全蝎含蝎毒，一種類似蛇毒神經毒的蛋白質。全蝎提取液能抑制血栓形成和抗凝。彭延古等報道新西蘭白兔耳緣靜脈注射全蝎純化液后，新西蘭白兔血漿中6酮-前列腺素Flj6-Keto-PGFla)含量升高，血漿中TXB2含量降低，提示全蝎純化液可抑制動脈內膜受損后血栓形成[132]。蝎毒對血小板聚集功能的影響有助于減少斑塊形成，延緩動脈粥樣硬化進程[133]。另外全蝎提取液可通過促進纖溶、抑制血小板聚集而抑制血栓形成
[134]
[0017]蜈蚣:最早記載于《神農本草經》，為下品藥，藥性:辛，溫，有毒，歸肝經；具有息風止痙，攻毒散結，通絡止痛之功效。本品性溫，性善走竄，通達內外，搜風定搐力強，與全蝎均為息風要藥。《神農本草經》瞰諸蛇、蟲、魚毒……去三蟲。”《本草綱目》曰:“小兒驚癇風搐，臍風口噤、丹毒、禿瘡、瘰疬、便毒、痔漏、蛇瘕、蛇瘴、蛇傷。”
現代藥理研究表明，蜈蚣具有增強心肌抗氧化能力、降低血脂、改善血液流變學、調節脂代謝及保護心肌免受脂質過氧化損傷的作用，可保護血管內皮細胞免受損傷，有效防治動脈粥樣硬化的形成。蜈蚣煎劑能改善小鼠的微循環，延長凝血時間，降低血粘度。張艷慧等[135]采用高脂飼料喂法造成動脈粥樣硬化家兔模型，以觀察蜈蚣水提物抗動脈粥樣硬化作用。結果表明蜈蚣可降低內皮素水平，抑制平滑肌細胞分裂、增殖，升高血清NO水平，從而起到抑制動脈粥樣硬化的作用。
[0018]地龍:又名蚯蚓，最早記載大約是《詩經》。《禮記?月令》有孟夏之月“蚯蚓出”，仲冬之月“蚯蚓結”之觀察記錄。《神農本草經》將其列為下品藥。藥性:咸、寒，歸肝、脾、膀胱經；具有清熱息風，平喘，通絡，利尿之功效；用于高熱驚癇、癲狂，肺熱哮喘，氣虛血滯、半身不遂，痹證，小便不利、尿閉不通。《本草綱目》曰:“性寒而下行，性寒故能解諸熱疾，下行故能利小便，治足疾而通經絡也。”“主傷寒瘧疾，大熱狂煩，及大人小兒小便不通，急慢驚風，歷節風痛。”《本草拾遺》:“療溫病大熱，狂言，主天行諸熱，小兒熱病癲癇。”
現代藥理研究表明，地龍具有(I)降血脂；(2)抗菌；(3)抗氧化；(4)降壓和抗心律失常；(5)抗凝血溶血栓的雙重作用；(6)解熱、抗炎、鎮痛、鎮靜、抗1驚厥；(7)止咳平喘；
(8)抗腫瘤；(9)免疫調節；(10)促進傷口愈合。
[0019]水蛭:俗稱螞蝗，最早記載于《神農本草經》，為下品藥，藥性:咸、苦、平，有小毒，歸肝經；具有破血通經，逐瘀消癥之功效；用于血瘀經閉、癥瘕積聚，跌打損傷、心腹疼痛。《本草綱目》載:“咸走血，苦勝血。水蛭之咸苦，以除蓄血，乃肝經血分藥，故能通肝經聚血。”《神農本草經》云:“主逐惡血，瘀血，月閉，破血逐瘀，無子，利水道。”《本草衍義》治折傷。”現代藥理研究表明，水蛭主要含有蛋白質。唾液中含有水蛭素，還含有肝素、抗血栓素及組織胺樣物質。水蛭素、水蛭提取物能抑制血小板聚集；水蛭水煎劑有較強抗凝血作用，能顯著延長纖維蛋白的凝聚時間。水蛭具有(I)抗凝、抗血栓作用；(2)抗炎作用；(3)抗腫瘤作用；(4)抗癌；(5)抗纖維化作用。
[0020]陳皮:藥性:辛、苦、溫，歸肺、脾經；具有理氣健脾，燥濕化痰之功效；用于脾胃氣滯證，嘔吐、呃逆，濕痰、寒痰咳嗽，胸痹。《本草綱目》曰:“療嘔噦反胃嘈雜，時吐清水，痰痞咳瘧，大便閉塞，婦人乳癰。入食料，解魚腥毒。”“其治百病，總取其理氣燥濕之功。同補藥貝IJ補，同瀉藥則瀉，同升藥則勝，同降藥則降。”《神農本草經》云:“主胸中瘕熱，逆氣。利水谷，久服，去臭。”《名醫別錄》下氣，止嘔咳。”“主脾不能消谷，氣沖胸中，吐逆霍亂，止泄。” 現代藥理研究表明，陳皮主要含黃酮類、生物堿、揮發油、肌醇等成分。陳皮中黃酮類化合物具有(I)抗動脈粥樣硬化，降低血清膽固醇；(2)抑制血小板聚集；(3)抗癌作用；(4)抗氧化作用。
[0021]半夏:最早記載于《神農本草經》，為下品藥，藥性:辛、溫，有毒，歸肺、脾、胃經；具有燥濕化痰，降逆止嘔，消痞散結，外用消腫止痛之功效；用于濕痰、寒痰證，嘔吐，心下痞、結胸、梅核氣，癭瘤、痰核、癰疽瘡毒、毒蛇咬傷。《名醫別錄》:“消心腹胸膈痰熱滿結，咳嗽上氣，心下急痛，堅痞，時氣嘔逆，消癰腫，墮胎。”《醫學啟源》:“治寒痰及形寒肢冷，大和胃氣，除胃寒，進飲食。治太陰痰厥頭痛，非此不能除。《主治秘要》云:燥胃濕，化痰，益脾胃氣，消腫散結，除胸中痰涎。”
現代藥理研究表明，半夏可阻止或延緩食傅性聞脂血癥的形成，對聞脂血癥有一定的治療作用，其中對降低TC和LDL—的作用較顯著。灌服清半夏75%乙醇提取物能顯著延長大鼠實驗性體內血栓形成時間，并且有延長凝血時間的傾向。
[0022]白術:最早記載于《神農本草經》，為上品藥，藥性:甘、苦、溫，歸脾、胃經；具有健脾益氣，燥濕利尿，止汗，安胎；用于脾氣虛證，氣虛自汗，脾虛胎動不安。本品甘苦性溫，主歸脾胃經，以健脾、燥濕為主要作用，被前人譽之為“脾臟補氣健脾第一要藥。”《本草通玄》:“補脾胃之藥，更無出其左右者。土旺則能健運，故不能食者，食停滯者，有痞積者，皆用之也。土旺則能勝濕，故患痰飲者，腫滿者，濕痹者，皆賴之也。土旺則清氣善升，而精微上奉，濁氣善除，而糟柏下輸，故吐瀉者，不可闕也。”
現代藥理研究表明，白術具有(I)抑制脂肪形成；(2)抑瘤作用；(3)抗炎作用；(4)芳香化酶抑制作用。
[0023]金銀花:性能，甘、寒。歸肺、心、胃經。功效，清熱解毒，疏散風熱。
[0024]應用，(I)癰腫疔瘡，(2)外感風熱，溫病初起，(3)熱毒血痢。
[0025]藥理作用:本品具有廣譜抗菌作用，對金黃色葡萄球菌、痢疾桿菌等致病菌有較強的抑制作用，對鉤端螺旋體、流感病毒及致病霉菌等多種病原微生物亦有抑制作用；金銀花煎劑能促進白細胞的吞噬作用；有明顯的抗炎及解熱作用。本品有一定降低膽固醇作用。
[0026]一種防治動脈粥樣硬化斑塊搜風祛痰解毒法藥物及制備方法與現有技術相比，具有存在量效關系，藥物組成簡單，配伍關系明確，藥味少，價格低廉，療效確切顯著，通過動物實驗證明具有調節血脂，保護血管內皮細胞，抑制炎癥因子的表達的作用，有顯著的防治動脈硬化的作用，易于被患者接受等優點，將廣泛的應用于醫藥【技術領域】中。【專利附圖】

【附圖說明】
[0027]下面結合附圖及實施例對本發明進行詳細說明。
[0028]圖1是各組小鼠腹主動脈組織(H-E染色，X 100倍)圖。
[0029]圖2是各組小鼠腹主動脈組織中HSP-70的蛋白表達(DAB顯色，X 400倍)圖。
[0030]圖3是各組小鼠腹主動脈組織中HSP-70的蛋白表達(DAB顯色，X 400倍)圖。[0031]圖4是各組小鼠腹主動脈組織中HO-1 mRNA表達電泳圖。
[0032]圖5是各組小鼠腹主動脈組織中HSP70 mRNA表達電泳圖一。
[0033]圖6是各組小鼠腹主動脈組織中PPAR- Y mRNA表達電泳圖二。
[0034]圖7各組小鼠腹主動脈組織中TLR_4mRNA表達電泳圖三。
【具體實施方式】
[0035]實施例一
將全蝎3g、蜈蟻3g、地龍13g、水蛭14g、陳皮15g、半夏14g、白術13g、金銀花14g用15倍的水量浸泡40分鐘后，第一次用文火煎煮70分鐘，第二次加10倍量得水用文火煎煮50分鐘，第三次加6倍量得水用文火煎煮30分鐘，將3次所煎藥液合并，將所得藥液用紗布過濾，過濾后用100°C水浴濃縮至200ml的藥液，即得成品。
[0036]實施例二
將全蝎4g、蜈蟻4g、地龍14g、水蛭15g、陳皮14g、半夏13g、白術12g、金銀花IOg用15倍的水量浸泡40分鐘后，第一次用文火煎煮70分鐘，第二次加10倍量得水用文火煎煮50分鐘，第三次加6倍量得水用文火煎煮30分鐘，將3次所煎藥液合并，將所得藥液用紗布過濾，過濾后用100°C水浴濃縮至200ml的藥液，即得成品。
[0037]實施例三
將全蝎5g、蜈蟻2g、地龍10g、水蛭llg、陳皮12g、半夏14g、白術13g、金銀花15g用15倍的水量浸泡40分鐘后，第一次用文火煎煮70分鐘，第二次加10倍量得水用文火煎煮50分鐘，第三次加6倍量得水用文火煎煮30分鐘，將3次所煎藥液合并，將所得藥液用紗布過濾，過濾后用100°C水浴濃縮至200ml的藥液，即得成品。
[0038]以上述實施例制備的防治動脈粥樣硬化斑塊搜風祛痰解毒法藥物為例作出的實驗報告。
[0039]I實驗材料
1.1實驗動物
選擇體重為18g~20g，SPF級6-8周齡ApOE~jn^70只，雌雄各半；提供單位:北京維通利華實驗動物技術有限公司。
[0040]1.2實驗藥品及制備
穩斑湯:全蝎3_5g,蜈蟲公2_4g,地龍10-15 g,水蛭10-15g,陳皮10_15g,半夏10_15g,白術10-15g，金銀花10-15g。由遼寧中醫藥大學附屬醫院中藥局提供，加工制成含生藥2g/ml中藥濃縮液備用。
[0041]對照藥阿托伐他汀鈣片:生產廠家是輝瑞制藥有限公司，IOmg/片，國藥準字號:J20030047。[0042]1.3主要試劑
兩步法RT-PCR試劑盒，購自北京全式金生物技術有限公司。
[0043]DNA marker，購自北京全式金生物技術有限公司。
[0044]Trizol,購自 invitrogen 公司。
[0045]引物，由北京三博遠志生物技術有限公司代為合成。
[0046]—抗購自北京博奧森生物科技有限公司。
[0047]Sp試劑盒購自北京博奧森生物科技有限公司。
[0048]DAB顯色試劑盒購自北京博奧森生物科技有限公司。
[0049]抗體稀釋液購自北京博奧森生物科技有限公司。
[0050]抗原修復液購自北京博奧森生物科技有限公司。[0051]一次性塑料試管，1.5mlEP管，200微升吸頭，1000微升吸頭，載玻片，蓋玻片等耗材由遼寧中醫藥大學生物技術實驗室提供。
[0052]1.4主要儀器及設備
電子天平，JY5002型，0.01g-500g，上海精密科學儀器有限公司生產。
[0053]電子天平，BS223S型，0.001g_220g，北京賽多利斯儀器系統有統公司生產。
[0054]電熱恒溫培養箱，HH.Bll.500型，上海躍進醫療器械廠生產。
[0055]微量移液器，美國熱電公司生產。
[0056]脫水機，LEICA 300型，德國徠卡公司生產。
[0057]石蠟包埋機，EG1150型，德國徠卡公司生產。
[0058]切片機，LEICA RM2235型，德國徠卡公司生產。
[0059]數碼顯微鏡，OLYMPUS BX41型。日本OLYMPUS公司生產。
[0060]熒光顯微鏡，OLYMPUS BX51型。日本OLYMPUS公司生產。
[0061 ] 生物顯微鏡，CHA型，日本OLYMPUS公司生產。
[0062]2實驗方法 2.1實驗動物
2.1.ΙΑροΕ—小鼠動物造模
6-8周齡ApoE-小鼠70只，雌雄各半，SPF級，體重18g_20g，飼以含花生油8%，砂糖6%，蛋黃粉5%，膽固醇1.5%，膽鹽0.2%，甲基硫氧嘧啶20g，谷氨酸鈉(味素)1%，其余為基礎飼料78%的高脂飼料(60Co Y滅菌照射處理)，飼養條件為2級，室溫保持在22°C -24°C，相對濕度50%，光照時間07:00-19:00。13周后，隨機處死4只，取腹主動脈根部，HE染色觀察基礎AS硬化硬度，確定造模成功。
[0063]2.1.2動物分組及動物給藥
動物分組:采用隨機數字法，將造模成功的ApoE-小鼠60只隨機分為5組每組12只，即模型對照組、穩斑湯低劑量組、中劑量組、穩斑湯高劑量組及西藥組，繼續給予高脂飼料喂養；正常C57BL/6J小鼠12只設為空白對照組，給予正常飼料喂養。給藥13周后，取腹主動脈，進行病理觀察。
[0064]動物給藥劑量:空白對照組和模型對照組大鼠不給藥，模型對照組給予0.3mL/日的生理鹽水；根據成人每日用藥臨床推薦的常用劑量，按成人與小鼠的體表面積折算系數
0.0026折算成小鼠用量:穩斑湯低劑量組6.175g/kg/日、中劑12.35g/kg/日、高劑量組24.7 g/kg/日，西藥組(阿托伐他汀鈣片)27.3mg/kg/日。灌胃給藥，每日I次。給藥13周后，取腹主動脈，進行病理觀察。
[0065]2.2實驗取材
取材前夜禁食，經小鼠眼眶靜脈叢采血，離心分離血清，_80°C凍存，用作測定HSP70、HO-1濃度。處死全部小鼠，無菌條件下取出心臟及腹主動脈，心臟10%甲醛固定，腹主動脈放在凍存管內液氮驟冷保存。
[0066]2.3實驗操作步驟
2.3.ΙΑροΕ—小鼠腹主動脈組織HE染色樣品制作
將在溫箱內烘烤干的組織切片取出，再按以下步驟進行染色H-E染色的染色步驟:
(1)二甲苯I 10~15分鐘
(2)二甲苯II 10~15分鐘
(3)100%乙醇I 2~3分鐘
(4)100%乙醇II 2~3分鐘
(5)95%乙醇I I~2分鐘
(6)95%乙醇II I~2分鐘
(7)80%乙醇I~2分鐘
(8)70%乙醇I~2分鐘
(9)蒸餾水洗2~3分鐘
(10)蘇木精染液染細胞核5~10分鐘
(11)自來水洗3~5分鐘
(12)1%鹽酸乙醇20秒
(13)自來水洗15分鐘
(14)伊紅染液I~10分鐘
(15)自來水洗30秒
(16)蒸餾水洗30秒
(17)70%乙醇20秒
(18)80%乙醇20秒
(19)95%乙醇I I~2分鐘
(20)95%乙醇II I~2分鐘
(21)100%乙醇I 2~5分鐘
(22)100%乙醇II 2~5分鐘
(23)二甲苯I 5~10分鐘
(24)二甲苯II 5~10分鐘
(25)中性樹膠封片
2.3.2ApoE_小鼠腹主動脈組織免疫組化法樣品制作
(I)脫蠟
二甲苯(I)中脫蠟5分鐘，用吸水紙吸干液體；
二甲苯(II)中脫蠟10分鐘(切片透明)，用吸水紙吸干液體；
100%乙醇(I) 5分鐘，用吸水紙吸干液體；100%乙醇(II) 5分鐘，用吸水紙吸干液體；
95%乙醇3分鐘；
流水沖洗2分鐘，用吸水紙吸干水分；
(2)蒸餾水沖洗，PBS浸泡5分鐘(如需采用抗原修復，在此步驟后進行)。
[0067](3)3%H202去離子水(無色液體)孵育10-15分鐘，以消除內源性過氧化物酶活性。
[0068](4)滴加試劑A (藍色液體)室溫孵育10-15分鐘，傾去，勿洗。
[0069](5)滴加適當比例稀釋的一抗，37oC孵育2_3小時或4oC過夜。
[0070](6)PBS 沖洗，3 分鐘 X3 次。
[0071](7)滴加試劑B (黃色液體)，室溫或37°C孵育10-15分鐘。
[0072](8)PBS 沖洗，3 分鐘 X3 次。
[0073](9)滴加試劑C (橙色液體)，室溫或37oC孵育10-15分鐘。
[0074](10) PBS 沖洗，3 分鐘 X 3 次。
[0075](11)顯色劑顯色(DAB)。
[0076](12)自來水充分沖洗。
[0077](13)蘇木素復染，鹽酸酒精分化。
[0078](14)透明，封片。
[0079]灰度值測定:切片染色后，選擇染色良好區域，應用Leica Q550CW圖象采集和分析系統，每只大鼠觀察3張切片，每張切片在顯微鏡下(40X10)選取5個互不重疊視野，測定單位面積陽性細胞表達的平均光密度值作為其表達情況。
[0080]2.3.3實時定量RT-PCR操作
2.3.3.1.總 RNA 提取
(1)液氮充分預冷研缽(液氮揮發不十分劇烈即可)
(2)迅速將低溫凍結的IOOmg冷凍組織放入預冷的研缽中，用研杵研磨組織，期間不斷加入液氮，直至組織被研磨成粉末狀。
[0081](3)向研缽中加入2ml的Trizol，將研磨成粉末狀的樣品完全覆蓋，把鋁箔紙蓋上包好，然后室溫靜置，直至樣品完全融化，再用研杵繼續研磨至裂解液呈透明狀。
[0082](4)用移液器將勻漿液轉移至離心管中，每管1ml，室溫靜置5分鐘。
[0083](5) 12，000g，4°C離心 5 分鐘。
[0084](6)小心吸取上清液，移入新的離心管中。
[0085](7)加入1/5體積量的氯仿，蓋緊離心管蓋，用手劇烈振蕩15秒。待溶液充分乳化(無分相現象)后，再室溫靜置5分鐘。
[0086](8) 12，000g，4°C離心 15 分鐘。
[0087](9)從離心機中小心取出離心管，此時勻漿液分為三層，即:無色的上清液、中間的白色蛋白層及帶有顏色的下層有機相。吸取上清液轉移至另一新的離心管中(切忌吸出白色中間層)。
[0088](10)向上清中加入等體積(500μ I)的異丙醇，上下顛倒離心管充分混勻后，在15~30°C下靜置10分鐘。
[0089](11) 12，000g，4°C離心10分鐘。一般在離心后，試管底部會出現沉淀。
[0090](12)清洗RNA沉淀:小心棄去上清，緩慢地沿離心管壁加入75%的乙醇Iml/管(切勿觸及沉淀)，輕輕上下顛倒洗滌離心管管壁，12，000g，4°C離心5分鐘后小心棄去乙醇(為了更好地控制RNA中的鹽離子含量，應盡量除凈乙醇)。
[0091](13) RNA的溶解。室溫干燥沉淀2~5分鐘(不可以離心或加熱干燥，否則RNA將會很難溶解)，加入適量的RNase-free水(DEPC處理水)溶解沉淀，必要時可用移液槍輕輕吹打沉淀，待RNA沉淀完全溶解后于-80°C保存。
[0092](14)RNA濃度和純度測定:取I μ I RNA樣本，加79 μ I DEPC /K，紫外分光光度計測0D260與0D280，二者比值應1.8^2.0，提示樣本中RNA純度合格。
[0093]RNA ( μ g/ μ I)濃度=0D260 X 40 X 稀釋倍數/1000。
[0094]2.3.3.2.cDNA 第一鏈合成
(1)將RNA模板、RT Mix, Primer Mix和Rnase-free Water溶解并置于冰上備用。
[0095](2)根據下表配置反應體系，總體積為20ul
【權利要求】
1.一種防治動脈粥樣硬化斑塊搜風祛痰解毒法藥物，其特征在于:它的產品配方的重量比是，全蝎3g-5g、蜈蚣2-4g、地龍10-15g、水蛭10-15g、陳皮10_15g、半夏10_15g、白術10-15g、金銀花 10-15g。
2.根據權利要求1所述的一種防治動脈粥樣硬化斑塊搜風祛痰解毒法藥物的制備方法，其特征在于:其制備方法是，將全蝎、蜈蚣、地龍、水蛭、陳皮、半夏、白術、金銀花用15倍的水量浸泡40分鐘后，第一次用文火煎煮70分鐘，第二次加10倍量得水用文火煎煮50分鐘，第三次加6倍量得水用文火煎煮30分鐘，將3次所煎藥液合并，將所得藥液用紗布過濾，過 濾后用100°C水浴濃縮至200ml的藥液，即得成品。
【文檔編號】A61K35/64GK103893453SQ201410175012
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年4月29日 優先權日:2014年4月29日
【發明者】宮麗鴻 申請人:遼寧中醫藥大學附屬醫院