苦杏仁甙保護缺血心臟的應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了苦杏仁甙保護缺血心臟的應用，這些用途是基于其新功能的發現和證實：苦杏仁甙可減輕心肌缺血/再灌損傷，尤其是增強胰島素激活“生存信號”通路中心分子Akt當中的作用。胰島素抵抗是糖尿病、高血壓、冠心病等心腦血管疾病的共同土壤，且胰島素抵抗主要表現為以Akt為中心環節的“生存信號”通路信號轉導的缺陷。因此可增強胰島素激活Akt作用的苦杏仁甙用于基于胰島素抵抗的疾病的輔助治療，可能具有潛在的較為廣闊的應用前景。如開發富含苦杏仁甙的保健品或藥品，則可為維護民眾健康、特別是預防以胰島素抵抗為基礎的心血管疾病有所裨益。
【專利說明】苦杏仁甙保護缺血心臟的應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于苦杏仁甙的應用【技術領域】，涉及苦杏仁甙保護缺血心臟的應用。
【背景技術】
[0002]近年來，心血管疾病已成為威脅人類健康和生存的主要原因之一，而心肌梗死的發病率亦呈上升趨勢。早期溶栓治療是急性心肌梗死最理想的治療措施，能夠縮小梗死面積，提高心臟功能，改善預后，但卻引起細胞的缺血/再灌注損傷。
[0003]胰島素是糖與脂肪能量代謝過程中主要的調控激素。胰島素可激活已知至少兩條信號途徑:一是磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)途徑；另一條是絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)途徑。PI3K信號通路是胰島素的主要信號通路，已有研究表明，在缺血期給予胰島素治療，可通過磷脂酰肌醇3激 酶-蛋白激酶B-內皮型一氧化氮合酶(PI3K-Akt-eN0S)途徑激活細胞“生存信號”通路，發揮抗炎、抗心肌細胞凋亡的心臟保護作用(Yu QJ1Si R, Zhou N, etal.1nsulin inhibits b-adrenergic action in ischemic/reperfused heart:A novelmechanism of insulin in cardioprotection.Apoptosis.2008 ； 13:305-17 ；Li J，ZhangHF, Wu F，et al.Suppression of TNF- a induction by insulin in the ischemic/reperfused rat hearts:Roles of Akt and eNOS phosphorylation.Crit Care Med2008 ；36:1551-58.)。且有研究表明，在胰島素抵抗狀態，胰島素剌激引起的PI3K_Akt信號傳導途徑的作用下降，而MAPK介導的信號通路正常。
[0004]苦杏仁為歷版中國藥典一直收載的中藥，對苦杏仁及其制劑的研究已有將近200年的歷史。苦杏仁一貫為降氣平喘止咳、潤腸通便之中藥配方選用，單獨以苦杏仁命名的制劑為數極少，如苦杏仁止咳糖漿。
[0005]苦杏仁的主要成分苦杏仁式(Semen Armeniacae amarum, SAA),又稱維生素B17，也可從杏、蘋果、櫻桃等果核中提取。國外研究表明，苦杏仁甙對T淋巴細胞有調節作用，因而具有一定抗腫瘤功效(Matthew M.Ames, Thomas P.Moyer, John S.Kovach, etal.Pharmacology of amygdalin(Iaetrile) in cancer patients.Cancer ChemotherPharmacol.1981, 6:51-57.);苦杏仁式可減少腫瘤壞死因子mRNA含量及誘導型一氧化氮合酶的表達，從而降低脂多糖引起的炎癥反應(Hwang, H.J.，Lee, H.J.，Kim, C.J.，etal.1nhibitory effect of amygdalin on lipopolysaccharide-1nducible TNF-alpha andIL-1beta mRNA expression and carrageenan—induced rat arthritis.J Microbiol Biotechnol.2008, 18 (10): 1641-1647.)。還有研究發現，苦杏仁甙可增加正常以及腦缺血狀態下的能量代謝中細胞色素氧化酶的活性(《中藥新藥與臨床藥理》，1996，7 (2):50-51)。然而，苦杏仁甙抗炎、增加缺血后能量代謝的細胞色素氧化酶的活性的具體機制是什么并未見報道。
【發明內容】
[0006]本發明解決的問題在于提供苦杏仁甙在保護缺血心臟方面的新用途，尤其是其在增強胰島素“生存信號”系統、提高缺血心臟功能方面的作用。
[0007]本發明是通過以下技術方案來實現:
[0008]1、苦杏仁甙保護缺血心臟的應用。
[0009]2、苦杏仁甙用于抗心肌缺血藥物的制備的應用。
[0010]3、苦杏仁甙用于抗心臟缺血/再灌注損傷藥物的制備的應用。
[0011]4、苦杏仁甙促進或增強胰島素激活Akt的應用。
[0012]5、苦杏仁甙與胰島素的混合物用于激活Akt藥物的制備的應用。
[0013]6、如權利要求5所述的應用，其特征在于，所述的苦杏仁甙與胰島素的混合物中胰島素與苦杏仁甙的配比為藥學上可接受的配比。
[0014]7、苦杏仁甙用于治療基于胰島素抵抗的疾病的輔助藥物的應用。
[0015]8、苦杏仁甙用于 預防心血管疾病的藥物、保健品或食品的制備的應用。
[0016]與現有技術相比，本發明具有以下有益的技術效果:
[0017]本發明提出了苦杏仁甙的新用途，這些用途是基于其新的功能的發現和證實:苦杏仁甙能夠增強胰島素激活“生存信號”通路蛋白，尤其是PI3K-Akt信號途徑當中的作用。苦杏仁甙并不能直接激活Akt，但胰島素在苦杏仁甙存在情況下，激活Akt的作用大于單獨使用等量的胰島素，并且在胰島素存在情況下，苦杏仁甙組的Akt磷酸化水平較對照組也顯著增加。
[0018]因此，苦杏仁甙通過增強胰島素激活“生存信號”通路下，能夠對心肌缺血/再灌注損傷心臟具有保護作用:其保護作用體現在增加缺血/再灌損傷大鼠的心臟功能、減小心肌梗死范圍。所以，苦杏仁甙對于缺血心臟的保護就可應用于抗心肌缺血藥物的制備或預防心血管疾病的藥物的制備。
[0019]進一步，鑒于苦杏仁甙對胰島素激活“生存信號”通路蛋白的顯著增加的作用，苦杏仁甙可用于基于胰島素抵抗的疾病的輔助治療，可能具有潛在的較為廣闊的應用前景。如開發富含苦杏仁甙的保健品或藥品，則可為維護民眾健康、特別是預防以胰島素抵抗為基礎的心血管疾病有所裨益。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0020]圖1為苦杏仁甙(SAA)及胰島素(Insulin)均可減少大鼠缺血/再灌注后心肌梗死范圍的檢測結果及柱狀圖。
[0021]圖2為在基礎胰島素環境，苦杏仁甙(SAA)及胰島素(Insulin)均可增加大鼠缺血/再灌注后心肌Akt磷酸化水平的檢測結果及柱狀圖。
[0022]圖3為I型糖尿病模型中單獨使用苦杏仁甙(SAA)不能增加大鼠缺血/再灌注后心肌Akt磷酸化水平的檢測結果及柱狀圖。
[0023]圖4為苦杏仁甙(SAA)不能降低大鼠心肌缺血/再灌注后的血糖水平的柱狀圖。【具體實施方式】
[0024]下面結合具體的實施例對本發明做進一步的詳細說明，所述是對本發明的解釋而不是限定。
[0025]1、為說明苦杏仁甙對胰島素激活信號的增強作用和對缺血/再灌注的保護，采用以下模型及檢測手段:
[0026]1.1、大鼠心肌缺血/再灌注(MIR)模型的制備:
[0027]將SD大鼠以30g/L戊巴比妥鈉(40mg/kg)經腹腔注射麻醉后，按常規方法制備大鼠MIR(30min/3h)模型:頸正中切口氣管插管，連接呼吸機行正壓人工呼吸。經右頸總動脈插管至左心室記錄左室壓及其微分。開胸暴露心臟，5-0絲線結扎左冠狀動脈前降支中上1/3處，心電圖ST段抬高為結扎成功指標。缺血30分鐘后松開絲線，再灌注3小時。
[0028]1.2、心臟功能監測:通過多導生理記錄儀(RM-4200)持續監測大鼠心電及血流動力學各指標。心電圖、左室收縮壓(LVSP)、左室等容收縮/舒張期壓力上升或下降最大速率(土 LVdP/dtmax)等均通過數據分析系統由計算機自動采集、記錄并計算。
[0029]1.3、心肌梗死范圍:再灌注3h結束后，再次結扎冠脈，向左心室腔注入2%伊文藍(I~2ml)。速取出心臟，凍存于_20°C。用心臟切片器垂直于心臟長軸將其切成Imm厚的薄片，分片置于含2mll% TTC (pH7.4)的12孔培養皿中，37°C孵育15min。用數碼相機拍照并輸入計算機。采用單盲法分別將伊文藍染色區(非缺血區)、TTC染色區(紅染，缺血但仍存活組織)以及非TTC染色區(梗死心肌)，用SigmaScan面積測算軟件進行計算處理。心肌梗死范圍以每一心臟總梗死面積(INF)占總缺血區面積(AAR)的百分比表示。
[0030]I.4、蛋白表達水平檢測:
[0031]為研究SAA減輕心肌缺血/再灌注損傷的分子機制,采用Western blot方法檢測心肌細胞中磷酸化Akt (p-Akt)及Akt表達水平。心肌組織在預冷至0°C的PBS (pH7.4)中剪碎、清洗數次后移入預冷至O °C的裂解液中并進一步剪碎。
[0032]裂解液成分如下(mmol/L):20Tris.HCl、50NaCl、50NaF、50Na4P207、250Sucrose、2Na3V04、1DTT、I %復合型蛋白酶抑制劑。
[0033]用Heidolph DIA900 組織勻漿器勻漿 lmin，勻漿液 12000 X g (4°C )離心 lOmin，取
上清即得組織蛋白提取液。BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量。
[0034]蛋白定量后，組織蛋白提取液加入5倍上樣緩沖液(溶液成分(mmol/L):50Tris.HC1、100DTT、2% SDS、0.1 % 溴酚藍、10 % 甘油)，100°C 煮沸 5min，恢復至室溫，12000Xg離心10min,取上清分裝，_80°C保存。
[0035]按Laemmli (1970)方法，以每孔50~100 μ g蛋白上樣量加到8~12%十二烷基硫酸鈉一聚丙烯酰胺凝膠電泳分離膠(SDS/PGEA)上進行電泳，電泳完成后，小心取下分離膠，用半干電轉法將蛋白轉移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上，5%脫脂奶粉室溫下封閉lh。將PVDF膜與一抗共孵育，4°C過夜；用PBST緩沖液(溶液成分:10mmol/L PBS加0.1 %的Tween20)洗去所有未結合的一抗，將膜與偶聯二抗37°C —起孵育Ih(二抗為辣根過氧化物酶標的山羊抗兔抗體)，洗去所有未結合的二抗，使用ECL-plus免疫檢測試劑盒進行熒光檢測。完成P-Akt或β-Actin免疫檢測后，50°C解析液(溶液成分(mmol/L，PH6.7):1002-巰基乙醇、2% (W/V)SDS、62.5Tris.HCl)對原一抗進行30min解離，用PBST漂洗，5 %脫脂奶粉室溫下重新封閉，印跡膜進行Akt蛋白表達的免疫檢測。
[0036] 1.5,1型糖尿病動物模型:SD大鼠禁食8h，迅速腹腔注射新鮮配制的鏈脲霉素(STZ)溶液(35mg/kg),每天一次,連續注射兩天。選用7天空腹血糖大于16.7mmol/L的大鼠用于實驗。制作心肌缺血/再灌注模型，于再灌注結束后，取危險區心室肌組織，同上方法提取蛋白，用Western blot方法檢測心肌細胞中ρ-Akt及Akt表達水平。[0037]2、苦杏仁甙的新的藥用功能:
[0038]2.1、確定苦杏仁甙的實驗劑量
[0039]為確定SAA在缺血/再灌注中的用藥量，將大鼠隨機分為以下幾組:(1)心肌缺血/ 再灌注組(MIR) ;(2)MIR+SAA10 組(10mg/kg，劑量體重比)；(3)MIR+SAA100 組(IOOmg/kg) ;(4)MIR+SAA1000組(1000mg/kg)。SAA治療組再灌注前15min給藥(iv)。然后檢測如表1所示的各指標，從而選擇合適的劑量。
[0040]表1不同劑量苦杏仁甙對心肌缺血/再灌注大鼠心臟功能的影響
[0041]
【權利要求】
1.苦杏仁甙用于預防心血管疾病的藥物、保健品或食品的制備的應用。
2.如權利要求1所述的應用，其特征在于，所述的藥物或保健品是預防以胰島素抵抗為基礎的心血管疾病的藥物或保健品。
3.苦杏仁甙 用于治療基于胰島素抵抗的疾病的輔助藥物的制備的應用。
【文檔編號】A61P9/10GK103948612SQ201410174903
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2012年5月14日 優先權日:2012年5月14日
【發明者】董玲, 劉文沖, 高峰, 張海鋒 申請人:中國人民解放軍第四軍醫大學