一種應用帶pcl內核材料構建組織工程軟骨的方法
【專利摘要】本發明涉及一種應用帶PCL內核材料構建組織工程軟骨的方法，步驟a，制作PLC內核；步驟b，制作帶PCL內核PGA/PLA復合耳支架；步驟c，制作PGA/PLA復合耳支架；步驟d，軟骨細胞培養；步驟e，耳廓支架構建軟骨；步驟f，體外構建耳廓的裸鼠皮下回植，將軟骨細胞-耳支架復合物體外培養1周后分別進行裸鼠皮下植入。本發明應用帶PCL內核材料可以構建組織工程軟骨，具有足夠的強度對抗植入皮下所帶來的張力從而維持原先復雜精確的形狀。
【專利說明】—種應用帶PCL內核材料構建組織工程軟骨的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉生物組織領域，尤其涉及一種應用帶PCL內核材料構建組織工程軟骨的方法。
【背景技術】
[0002]小耳癥(microtia)是繼唇腭裂之后發病率最高的體表先天畸形，傳統治療主要以自體肋軟骨移植為主，對供區造成極大損傷。理論上講，組織工程技術至少在以下三個方面明顯優于傳統治療模式:(I)對病人損傷小，可取少量細胞擴增后構建大塊軟骨；(2)構建的軟骨有功能，是真正意義上的結構與功能重建；(3)可精確塑形，更符合臨床應用需求。
[0003]然而，現有技術中的體外構建的軟骨因力學性能不足，植入動物體內后難以克服皮下張力而維持原有形態。雖然鈦網支撐物輔助移植可解決裸鼠體內形態維持問題，但在大動物體內會引發異物反應干擾軟骨再生。
[0004]鑒于上述缺陷，本發明創作者經過長時間的研究和實踐終于獲得了本創作。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在于提供一種應用帶PCL內核材料構建組織工程軟骨的方法，用以克服上述技術缺陷。
[0006]為實現上述目的，本發明提供一種應用帶PCL內核材料構建組織工程軟骨的方法，具體過程為:步驟a，制作PLC內核；PCL內核是PCL顆粒材料以熱熔融沉積快速成型技術制成的網格狀多孔支架，將網格狀的PCL裁剪成適合大小，置于耳廓模具中加壓固定，加熱加壓，待加壓過程中冷卻至室溫后，取出成耳廓型的PCL內核，修剪多余材料；
[0007]步驟b，制作帶PCL內核PGA/PLA復合耳支架；
[0008]步驟bl，將長纖維撕開制成單股PGA無紡棉，將PGA無紡棉均勻的鋪在專用的長方形盒中，制作成長方形的小片，每片約150mg，共需2片；
[0009]步驟b2，將上述小片置于耳廓模具中并用無水乙醇浸飽，加壓固定，待無水乙醇揮發后，耳廓形態初步穩定；
[0010]步驟b3，滴加0.3% -3%的PLA 二氯甲烷溶液，并于模具內繼續加壓塑形，每次滴加PLA溶液前先稱重，待材料約為158-165mg時即不再滴加PLA溶液，最后得到兩片耳廓形態PGA/PLA復合支架；
[0011 ] 步驟b4，將上述耳廓形態網格狀PCL疊加于上述兩片耳廓形態PGA支架間，置于耳廓模具中加壓固定，加熱加壓冷卻，使微融的PCL與上下兩層PGA/PLA復合支架緊密粘合；
[0012]步驟b5，取出制備好的帶內核支架，修剪多余的材料，再滴加一次0.3% -3%的PLA 二氯甲烷溶液后于模具中加壓塑形，最終形成具有逼真耳廓形態的帶內核支架；
[0013]步驟c，制作PGA/PLA復合耳支架；
[0014] 與上述步驟b相同，將長纖維撕開制成單股PGA無紡棉，制作成長方形的小片，每片約300mg，滴加1% PLA，待材料約為330mg時即制備完成，修剪為耳廓形狀備用；
[0015]步驟d，軟骨細胞培養；
[0016]步驟dl，無菌條件下切取新西蘭大白兔單側耳廓軟骨，加入3倍體積的0.25%胰蛋白酶，置于37°C恒溫水浴振蕩器消化30min，然后用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3遍，沉淀細胞，除去胰蛋白酶；
[0017]步驟d2，加入0.15% II型膠原酶，以軟骨細胞培養液配成相應濃度，0.22微米針式濾器過濾，立即使用，置于37°C恒溫水浴振蕩器內消化6~8h:
[0018]步驟d3，直至大部分軟骨塊被消化后，獲得的消化液用100微米細胞濾網過濾，1500r/min，離心5min，沉淀的細胞用含10%胎牛血清和I %三抗的高糖達爾伯克改良伊格爾培養基重懸， 所得細胞以臺盼藍染色計數，并檢查軟骨細胞活力，在倒置顯微鏡下血細胞計數器計數后調整細胞密度至IxlOVcm2的濃度接種在IOOmm培養皿上，在37°C，5% CO2,飽和濕度條件下，用軟骨細胞培養液培養擴增，待軟骨細胞生長至70% -80%融合時進行傳代；
[0019]步驟e，耳廓支架構建軟骨；
[0020]將耳廓支架用75 %乙醇消毒后，PBS沖洗3次，軟骨細胞培養液沖洗3次后將支架置于培養液中預培養；將第一代(PD兔耳軟骨細胞用0.25%胰蛋白酶消化收集，用含10%FBS和1%三抗的DMEM培養液重懸至濃度100X 106/ml，等量均勻的接種在兩組支架材料上；
[0021]步驟f，體外構建耳廓的裸鼠皮下回植，將軟骨細胞-耳支架復合物體外培養I周后分別進行裸鼠皮下植入。
[0022]進一步，在上述步驟f中，植入時采用水合氯醛腹腔注射麻醉裸鼠，在臀部橫向切開皮膚約2cm，用眼科彎剪在皮下向頭側分離出腔隙；將細胞材料復合物用PBS漂洗3遍以去除血清成分，小拉鉤暴露分離開的腔隙，眼科鑷輕輕夾持組織邊緣，將組織送入到皮下間隙內，耳支架凹陷面貼靠皮膚，固定好位置，以5-0尼龍線縫合切口 ；以Imm注射器由皮膚刺入，抽吸空氣，使皮膚和肉膜緊貼細胞材料復合物，8周后取材。
[0023]進一步，在上述步驟e中，將軟骨細胞等量均勻的接種在兩組支架材料上，在37°C,5% CO2，飽和濕度條件下培養4小時后，加入軟骨細胞培養液，即10%胎牛血清，1%三抗的DMEM培養基，繼續培養，隔天換液。
[0024]進一步，在上述步驟dl中，無菌條件下切取新西蘭大白兔單側耳廓軟骨，仔細剝離表面的軟骨膜，剪成ImmX ImmX Imm大小的組織塊，氯霉素沖洗液沖洗3遍。
[0025]進一步，在上述步驟b3中，滴加PLA溶液時，PLA含量占總PGA/PLA支架的5% -10%。
[0026]進一步，在上述步驟b4中，在55_70°C高溫下加熱，I小時后置于壓力器下200N-500N加壓至模具徹底冷卻。
[0027]進一步,在上述步驟a中，網格間距層高0.1mm。
[0028]進一步，在上述步驟a中，在55_70°C下，加熱約5_10分鐘后，迅速加壓，壓力為200N-500N。
[0029]與現有技術相比較本發明的有益效果在于:本發明應用帶PCL內核材料可以構建組織工程軟骨，具有足夠的強度對抗植入皮下所帶來的張力從而維持原先復雜精確的形狀。
[0030]本發明擬采用的網狀PCL內核在構建耳廓等特殊形態軟骨方面具有顯著優勢:
(1)該支架可通過三維打印制備，網孔大小，網格厚度等關鍵參數均可精確調控；(2)該支架在常規加熱(約60°C)加壓的條件下可通過模具精確塑形，冷卻到室溫或體溫后形態維持不變，顯然有利于耳廓形態精確控制及維持；(3)在包裹PGA纖維的前提下加熱加壓塑形，則PCL內核可與PGA纖維緊密粘連，且網孔部分也能被PGA填充，不會發生內核與外圍材料脫離的現象。
[0031]此外，接種的細胞經PGA引導能長入PCL網孔內部，經體外培養，PGA降解后，所形成的軟骨樣組織不僅充分覆蓋PCL表面，并且也充分長入其網孔內部，形成錨定結構，進一步防止了外圍組織與內核材料脫離。
[0032]本發明構建出具有精確形態并且不隨時間而變形的組織工程耳廓軟骨，為組織工程入耳向臨床應用轉化探索新的思路與方法。 【具體實施方式】
[0033]以下，對本發明上述的和另外的技術特征和優點作更詳細的說明。
[0034]本發明應用帶PCL內核材料構建組織工程軟骨的方法的具體過程為，
[0035]步驟a，制作PLC內核；PCL內核是PCL顆粒材料以熱熔融沉積快速成型技術制成的網格狀多孔支架，本實施例中，網格間距2mm，層高0.1mm。將網格狀的PCL裁剪成適合大小，置于耳廓模具中加壓固定。在55-70°C下,加熱約5-10分鐘后,迅速加壓,壓力為200N-500N ;待加壓過程中冷卻至室溫后，取出成耳廓型的PCL內核，修剪多余材料。
[0036]步驟b，制作帶PCL內核PGA/PLA復合耳支架；
[0037]步驟b I，將長纖維撕開制成單股PGA無紡棉，將PGA無紡棉均勻的鋪在專用的長方形盒中，制作成長方形的小片，每片約150mg，共需2片；
[0038]步驟b2，將上述小片置于耳廓模具中并用無水乙醇浸飽，加壓固定，待無水乙醇揮發后，耳廓形態初步穩定；
[0039]步驟b3，滴加0.3% -3%的PLA 二氯甲烷溶液，并于模具內繼續加壓塑形，每次滴加PLA溶液前先稱重，待材料約為158-165mg時即不再滴加PLA溶液，最后得到兩片耳廓形態PGA/PLA復合支架；滴加PLA溶液時，PLA含量占總PGA/PLA支架的5% -10% ;一般來說，不使用PLA或者PLA過少容易使PGA纖維過于蓬松而不利于塑形；但PLA含量過多又容易造成材料過于致密，導致PGA纖維難以充分填充PGL網孔，此外還會影響PGA/PLA材料的孔隙率、親水性等；一般PLA含量小于20%時不會對材料的生物相容性造成明顯影響。
[0040]步驟b4，將上述耳廓形態網格狀PCL疊加于上述兩片耳廓形態PGA支架間，置于耳廓模具中加壓固定，在55-70°C高溫下加熱，I小時后置于壓力器下200N-500N加壓至模具徹底冷卻，使微融的PCL與上下兩層PGA/PLA復合支架緊密粘合；
[0041]步驟b5，取出制備好的帶內核支架，修剪多余的材料，再滴加一次0.3% -3%的PLA 二氯甲烷溶液后于模具中加壓塑形，最終形成具有逼真耳廓形態的帶內核支架；同理還可以制作出其他形態的支架，如圓形、三角形、方形、氣管狀等。
[0042]步驟c，制作PGA/PLA復合耳支架；
[0043]與上述步驟b相同，將長纖維撕開制成單股PGA無紡棉，制作成長方形的小片，每片約300mg，滴加1% PLA，待材料約為330mg時即制備完成，修剪為耳廓形狀備用。
[0044]步驟d，軟骨細胞培養；
[0045]步驟dl，無菌條件下切取新西蘭大白兔單側耳廓軟骨，仔細剝離表面的軟骨膜，剪成ImmX ImmX Imm大小的組織塊,氯霉素沖洗液沖洗3遍；加入3倍體積的0.25%胰蛋白酶，置于37°C恒溫水浴振蕩器消化30min，然后用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3遍，沉淀細胞，除去胰蛋白酶；
[0046]步驟d2，加入0.15% II型膠原酶，即NB4，以軟骨細胞培養液配成相應濃度，0.22微米針式濾器過濾，立即使用，置于37°C恒溫水浴振蕩器內消化6~8h ；
[0047]步驟d3，直至大部分軟骨塊被消化后，獲得的消化液用100微米細胞濾網過濾，1500r/min，離心5min，沉淀的細胞用含10%胎牛血清和I %三抗的高糖達爾伯克改良伊格爾培養基重懸，所得細胞以臺盼藍染色計數，并檢查軟骨細胞活力，在倒置顯微鏡下血細胞計數器計數后調整細胞密度至IxlOVcm2的濃度接種在IOOmm培養皿上，在37°C，5% CO2,飽和濕度條件下，用軟骨細胞培養液培養擴增，待軟骨細胞生長至70% -80%融合時進行傳代。
[0048]步驟e，耳廓支架構建軟骨；
[0049]將耳廓支架用75%乙醇消毒后，PBS沖洗3次，軟骨細胞培養液沖洗3次后將支架置于培養液中預培養；將第一代(PD兔耳軟骨細胞用0.25%胰蛋白酶消化收集，用含10%FBS和1%三抗的DMEM培養液重懸至濃度100X 106/ml，等量均勻的接種在兩組支架材料上。在37°C，5% C02，飽和濕度條件下培養4小時后，加入軟骨細胞培養液，即10%胎牛血清，I %三抗的DMEM培養基，繼續培養，隔天換液。
[0050]步驟f，體外構建耳廓的裸鼠皮下回植；
[0051]將軟骨細胞-耳支架復合物體外培養I周后分別進行裸鼠皮下植入；植入時采用水合氯醛腹腔注射麻醉裸鼠，在臀部橫向切開皮膚約2cm，用眼科彎剪在皮下向頭側分離出腔隙；將細胞材料復合物用PBS漂洗3遍以去除血清成分，小拉鉤暴露分離開的腔隙，眼科鑷輕輕夾持組織邊緣，將組織送入到皮下間隙內，耳支架凹陷面貼靠皮膚，固定好位置，以5-0尼龍線縫合切口 ；以Imm注射器由皮膚刺入，抽吸空氣，使皮膚和肉膜緊貼細胞材料復合物，8周后取材。
[0052]本發明在體外構建過程中，外圍PGA材料充分降解，并且被接種于其上的軟骨細胞所分泌的自體軟骨組織替代，因此可有效避免PGA支架引發的異物反應；體外構建所形成的是軟骨樣組織，而非單純的細胞材料復合物，因此性能更穩定，也更利于操作；體外構建技術平臺有利于今后利用干細胞構建軟骨，因為干細胞必須經歷體外培養來實現成熟的軟骨定向分化。
[0053]結果分析:
[0054]軟骨細胞與材料
[0055]原代軟骨細胞一般12~24小時貼壁，48小時后完全鋪展開，開始增殖。軟骨細胞剛剛貼壁時仍為圓形，逐漸伸展后呈橢圓形、三角形和多角形，細胞核為圓形或橢圓形。傳代后軟骨細胞增長加速，分裂細胞多見，大多是多角形，折光性強，一般5至7天左右即可達到90%以上的融合狀態，免疫熒光染色細胞核PI襯染為紅色，表達有II型膠原的細胞漿染為綠色。[0056]體外培養I周內用倒置像差顯微鏡連續觀察顯示，實驗組和對照組的軟骨細胞穩定地粘附在PGA材料纖維上，并分裂增殖，逐漸分泌細胞外基質。生物相容性檢測顯示實驗組和對照組DNA定量檢測無差別，結果有統計學意義，表明PCL內核不影響軟骨細胞在材料上的粘附。掃描電鏡顯示，兩組材料的細胞均已已完全鋪展開并形成豐富的細胞外基質，實驗組切面可見PCL內核上也有細胞粘附并分泌基質。
[0057]本發明的PCL-PGA/PLA復合耳支架，基于該耳支架體外構建的耳廓形態軟骨已獲得成功，并且植入裸鼠體內后可長期維持形態。以往基于PGA/PLA耳支構建的耳廓在裸鼠體內無法維持形態；用鈦網支撐物輔助移植有助于形態維持，但在大動物體內可能會引發異物反應。因此，本發明采用PCL支架作為內核，外圍包裹PGA纖維，再經PLA包埋，形成PCL-PGA/PLA復合耳支架；目前，基于該支架應用動物軟骨細胞體外構建耳廓形態軟骨已獲成功，并且植入裸鼠體內后可長期維持形態。
[0058]通過延長體外培養時間，提高體外構建軟骨質量，解決利用細胞材料復合物在免疫動物體內再生軟骨組織。
[0059]采用10%~20%含量的PLA包埋PGA，既增加支架材料的力學性能又延緩其降解速率，在體外實現構建產物形態長久維持；采用醫用純鈦內支撐網在皮下植入時輔助維持耳廓形態；將上述體內構建的耳廓去除內支撐后再植入皮下，形態可繼續維持。
[0060]PCL內核材料在裸鼠體內構建過程中有助于維持耳廓的精確形態，并且生物相容性好，可形成緊實的PCL軟骨復合體。
[0061] 以上所述僅為本發明的較佳實施例，對發明而言僅僅是說明性的，而非限制性的。本專業技術人員理解，在發明權利要求所限定的精神和范圍內可對其進行許多改變，修改，甚至等效，但都將落入本發明的保護范圍內。
【權利要求】
1.一種應用帶PCL內核材料構建組織工程軟骨的方法，其特征在于，該具體過程為: 步驟a，制作PLC內核；PCL內核是PCL顆粒材料以熱熔融沉積快速成型技術制成的網格狀多孔支架，將網格狀的PCL裁剪成適合大小，置于耳廓模具中加壓固定，加熱加壓，待加壓過程中冷卻至室溫后，取出成耳廓型的PCL內核，修剪多余材料； 步驟b，制作帶PCL內核PGA/PLA復合耳支架； 步驟b I，將長纖維撕開制成單股PGA無紡棉，將PGA無紡棉均勻的鋪在專用的長方形盒中，制作成長方形的小片，每片約150mg，共需2片； 步驟b2，將上述小片置于耳廓模具中并用無水乙醇浸飽，加壓固定，待無水乙醇揮發后，耳廓形態初步穩定； 步驟b3，滴加0.3 % -3 %的PLA 二氯甲烷溶液，并于模具內繼續加壓塑形，每次滴加PLA溶液前先稱重，待材料約為158-165mg時即不再滴加PLA溶液，最后得到兩片耳廓形態PGA/PLA復合支架； 步驟b4，將上述耳廓形態網格狀PCL疊加于上述兩片耳廓形態PGA支架間，置于耳廓模具中加壓固定，加熱加壓冷卻，使微融的PCL與上下兩層PGA/PLA復合支架緊密粘合； 步驟b5，取出制備好的帶內核支架，修剪多余的材料，再滴加一次0.3 % -3 %的PLA 二氯甲烷溶液后于模 具中加壓塑形，最終形成具有逼真耳廓形態的帶內核支架； 步驟C，制作PGA/PLA復合耳支架； 與上述步驟b相同，將長纖維撕開制成單股PGA無紡棉，制作成長方形的小片，每片約300mg，滴加1% PLA，待材料約為330mg時即制備完成，修剪為耳廓形狀備用； 步驟d，軟骨細胞培養； 步驟dl，無菌條件下切取新西蘭大白兔單側耳廓軟骨，加入3倍體積的0.25%胰蛋白酶，置于37°C恒溫水浴振蕩器消化30min，然后用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3遍，沉淀細胞，除去胰蛋白酶； 步驟d2，加入0.15% II型膠原酶，以軟骨細胞培養液配成相應濃度，0.22微米針式濾器過濾，立即使用，置于37°C恒溫水浴振蕩器內消化6~8h ; 步驟d3，直至大部分軟骨塊被消化后，獲得的消化液用100微米細胞濾網過濾，1500r/min，離心5min，沉淀的細胞用含10%胎牛血清和I %三抗的高糖達爾伯克改良伊格爾培養基重懸，所得細胞以臺盼藍染色計數，并檢查軟骨細胞活力，在倒置顯微鏡下血細胞計數器計數后調整細胞密度至IxlOVcm2的濃度接種在IOOmm培養皿上，在37°C，5% CO2，飽和濕度條件下，用軟骨細胞培養液培養擴增，待軟骨細胞生長至70% -80%融合時進行傳代；步驟e，耳廓支架構建軟骨；將耳廓支架用75 %乙醇消毒后，PBS沖洗3次，軟骨細胞培養液沖洗3次后將支架置于培養液中預培養；將第一代(PD兔耳軟骨細胞用0.25%胰蛋白酶消化收集，用含10% FBS和1%三抗的DMEM培養液重懸至濃度100 X 106/ml，等量均勻的接種在兩組支架材料上；步驟f，體外構建耳廓的裸鼠皮下回植，將軟骨細胞-耳支架復合物體外培養I周后分別進行裸鼠皮下植入。
2.根據權利要求1所述的應用帶PCL內核材料構建組織工程軟骨的方法，其特征在于，在上述步驟f中，植入時采用水合氯醛腹腔注射麻醉裸鼠，在臀部橫向切開皮膚約2cm，用眼科彎剪在皮下向頭側分離出腔隙；將細胞材料復合物用PBS漂洗3遍以去除血清成分，小拉鉤暴露分離開的腔隙，眼科鑷輕輕夾持組織邊緣，將組織送入到皮下間隙內，耳支架凹陷面貼靠皮膚，固定好位置，以5-0尼龍線縫合切口 ；以Imm注射器由皮膚刺入，抽吸空氣，使皮膚和肉膜緊貼細胞材料復合物，8周后取材。
3.根據權利要求1或2所述的應用帶PCL內核材料構建組織工程軟骨的方法，其特征在于，在上述步驟e中，將軟骨細胞等量均勻的接種在兩組支架材料上，在37°C，5% CO2，飽和濕度條件下培養4小時后，加入軟骨細胞培養液，即10 %胎牛血清，I %三抗的DMEM培養基，繼續培養，隔天換液。
4.根據權利要求3所述的應用帶PCL內核材料構建組織工程軟骨的方法，其特征在于，在上述步驟dl中，無菌條件下切取新西蘭大白兔單側耳廓軟骨，仔細剝離表面的軟骨膜，剪成ImmX ImmX Imm大小的組織塊,氯霉素沖洗液沖洗3遍。
5.根據權利要求3所述的應用帶PCL內核材料構建組織工程軟骨的方法，其特征在于，在上述步驟b3中，滴加PLA溶液時，PLA含量占總PGA/PLA支架的5% -10%。
6.根據權利要求5所述的應用帶PCL內核材料構建組織工程軟骨的方法，其特征在于，在上述步驟b4中，在55-70°C高溫下加熱，I小時后置于壓力器下200N-500N加壓至模具徹底冷卻。
7.根據權利要求5所述的應用帶PCL內核材料構建組織工程軟骨的方法，其特征在于，在上述步驟a中，網格間距層高0.1mm。
8.根據權利要求7所述的應用帶PCL內核材料構建組織工程軟骨的方法，其特征在于，在上述步驟a中，在55-70°C下，加熱約5-10分鐘后，迅速加壓，壓力為200N-500N。
【文檔編號】A61L27/48GK103948969SQ201410163412
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年4月18日 優先權日:2014年4月18日
【發明者】周廣東, 劉豫, 曹誼林, 殷宗琦 申請人:上海國睿生命科技有限公司