青蒿素在制備防治神經性疾病藥物中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了青蒿素及其衍生物在制備防治神經性疾病藥物中的應用。本發明以大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤PC12神經細胞株、視網膜神經細胞株RGC-5和原代皮質神經元為代表作為實驗對象，以硝普鈉、雙氧水摸擬誘導神經細胞的氧化應激和細胞凋亡等細胞損傷，研究發現青蒿素在硝普鈉、雙氧水誘導的細胞損傷中具有保護作用，并初步探討了青蒿素及其衍生物的保護作用機制，結果說明青蒿素及其衍生物可作為神經保護藥用于預防和治療各種神經性疾病，如各種神經退行性疾病、急慢性神經變性疾病、神經性眼病等，這些主要與氧化應激損傷、細胞凋亡有關的神經性疾病。本發明為神經性疾病的治療和預防帶來了新方向。
【專利說明】青蒿素在制備防治神經性疾病藥物中的應用
【技術領域】
[0001]本 發明涉及青蒿素在制備防治神經性疾病藥物中的應用。
【背景技術】
[0002]青蒿素(artemisinin)是從菊科植物艾屬黃花蒿中提取的一種化合物，已被廣泛用于各型瘧疾的治療，青蒿素對瘧原蟲的殺滅作用主要作用于紅細胞內期，對于紅細胞外期以及紅細胞前期則效果很弱。除了具有突出的抗瘧作用外，青蒿素還有顯著的抗菌、抗病毒作用，其抗菌譜包括表皮葡萄球菌、卡他球菌、炭疽桿菌、白喉桿菌，同時對金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、痢疾桿菌、結核桿菌等也有一定的抑制作用。青蒿中提取得到的谷留醇和豆甾醇亦有抗病毒作用。另，青蒿素還具有免疫調節作用，對體液免疫有明顯的抑制作用，對細胞免疫則有一定的促進作用。青蒿素類物資在臨床應用時，毒性較低，使用安全，一般無明顯不良反應。關于青蒿素在中樞神經系統疾病的作用，目前的研究還很少，有研究顯示二氫青蒿素對體外培養的小鼠神經母細胞瘤N2a的細胞增殖有一定的抑制作用，提示青蒿素對中樞神經系統的腫瘤可能有一定的抑制作用。有關青蒿素對神經細胞的保護作用及其作為神經保護劑治療神經退行性疾病及視神經病變還未見有報道。
[0003]NO是一種較小的生物活性分子，在較低濃度下，能參與腦內許多生理功能的調節，盡管其化學結構簡單，卻能以相對特異的方式控制神經元的功能或生理功能；而在較高濃度下，NO對人皮層神經元和神經細胞具有毒性作用。作為外源性NO供體，硝普鈉(SNP)制備的神經元損傷模型是相關實驗研究的理想體外實驗模型。
[0004]當代醫學的進步延長了人類的生命，而由此導致老年急慢性神經性疾病的上升，例如阿耳茨海默氏癥、中風、帕金森癥等。這些神經性疾病以疾病進程中特定神經元變性的不斷發展為特征。由于成熟神經元細胞在其死亡后不能再生，在上述神經性疾病中神經元的死亡可能導致大腦基本功能(包括識別、感覺和行動功能)的不能治愈的損傷以及由此產生的經濟和社會的過重負擔。
[0005]氧化應激(oxidativestress)和細胞凋亡(apoptosis)被認為是神經元死亡的主要途徑，氧化應激(oxidativestress)和多種神經性疾病(如各種神經退行性疾病及神經性眼病)有關。
[0006]目前，對青蒿素類藥物對神經細胞的作用了解不多，同時，青蒿素在神經細胞的氧化應激和細胞凋亡中是否具有保護作用仍不清楚。
【發明內容】
[0007]為了解決上述問題，本發明以大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤PC12神經細胞株、視網膜神經細胞株RGC-5和原代皮質神經元為代表，作為實驗對象，以硝普鈉(SNP)、雙氧水(H2O2)來摸擬誘導神經細胞的氧化應激和細胞凋亡，發現青蒿素及其衍生物在硝普鈉、雙氧水誘導的相應細胞損傷中具有保護作用，并初步探討了青蒿素及其衍生物保護作用的機制，說明青蒿素及其衍生物可作為神經保護藥用于預防和治療各種神經性疾病，如各種神經退行性疾病、急慢性神經變性疾病、神經性眼病等，這些主要與氧化應激損傷、細胞凋亡有關的神經性疾病。
[0008]本發明的目的在于提供青蒿素及其衍生物在制備防治神經性疾病藥物中的應用。
[0009]本發明所采取的技術方案是:
青蒿素及其衍生物在制備防治神經性疾病藥物中的應用。
[0010]進一步的，上述的神經性疾病包括急慢性神經變性疾病、神經性眼科疾病。
[0011]進一步的，上述的神經性疾病為與氧化應激損傷相關的神經性疾病。
[0012]進一步的，上述的青蒿素衍生物為以青蒿素為母核的化合物或其藥物可接受的鹽。
[0013]進一步的，上述的以青蒿素為母核的化合物選自青蒿素甲醚、青蒿琥酯、二氫青蒿素、去氧青蒿素。
[0014]本發明的有益效果是:
O本發明證明了青蒿素及其衍生物在SNP、H2O2引發的神經細胞損傷中具有一定的保護作用，且初步探索了青蒿素及其衍生物的作用機制，其可能是通過激活或者部分激活MAPK/Erk信號通路來實現在SNP損傷神經細胞中的保護作用，由于青蒿素類藥物已經用于臨床，研究這些藥物的神經保護作用，對于尋找其可能靶點、新的藥理作用，對該類藥物的安全使用具有重要的意 義。
[0015]2)本發明說明了青蒿素及其衍生物可作為神經保護藥用于預防和治療各種神經性疾病，如各種神經退行性疾病、急慢性神經變性疾病、神經性眼病等，為神經性疾病的治療和預防帶來了新方向。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0016]圖1為PC12細胞在不同濃度的SNP處理的細胞活力情況，#表示Ρ〈0.05，##Ρ〈0.01 ；
圖2為不同濃度的青蒿素在SNP損傷PC12細胞中的保護作用，#表示尸<0.05,##表示 7X0.01 ；
圖3為Hochest染色檢測青蒿素在SNP誘發PC12細胞凋亡中的保護作用；
圖4是對圖3中細胞凋亡數目的統計分析，#/Χ0.01，##表示/X0.01 ；
圖5為在抑制劑PD98059存在下青蒿素在SNP損傷PC12細胞中的保護情況，A為青蒿素，LY 為 LY294002, PD 為 PD98059, 林/X0.01, ## 表示/X0.01 ；
圖6為青蒿素可能通過MAPK/Erk信號通路在SNP損傷PC12細胞中的起保護作用；
圖7為SNP對RGC-5細胞的損傷作用，*/X0.01 ；
圖8為不同濃度的青蒿素在SNP損傷RGC-5細胞中的保護作用(**表示P〈0.01)；
圖9為青蒿素對SNP誘導的RGC-5細胞凋亡的保護作用，A為Hoechst染色實驗，B是對A中各組細胞中凋亡比例的統計分析，ART:青蒿素(Artemisnin), mP<0.01, **7X0.01 ；圖10為SNP對皮質神經元細胞的損傷作用，*/X0.01 ；
圖11為不同濃度的青蒿素在SNP損傷皮質神經元細胞中的保護作用(#^0.05，
林/X0.01)；
圖12為H2O2對RGC-5細胞的損傷作用，*/X0.01 ；圖13為不同濃度的青蒿素在H2O2損傷RGC-5細胞中的保護作用(#表示P〈0.01)。【具體實施方式】
[0017]下面結合具體實施例對本發明作進一步的說明，但并不局限于此。
[0018]實施例1青蒿素在SNP損傷PC12神經細胞中的保護作用 一、材料與方法
(I)材料與主要試劑
青蒿素購于大連美侖生物科技有限公司；硝普鈉(SNP)購于碧云天生物技術研究所；DMEM培養基、胎牛血清和馬血清購于美國Gibco公司；噻唑藍(MTT )、二甲亞砜(DMS0)、購于美國 Sigma 公司;LY294002、PD98059 購自美國 Sigma-Aldrich 公司!Western blot相關試劑購自廣州碧云天生物技術研究所；Western所用抗體Ant1-phospho_Akt (Ser473)antibody和Ant1-phospho_p44/42 MAPK (Erkl/2) (Thr202/Tyr204) antibody 購自 CellSignaling Technology (Woburn, USA);辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗(IgG)購自美國Santa Cruz公司；化學發光底物試劑盒購自美國Thermo公司。
[0019](2)主要儀器雙人單面凈化超凈臺(蘇州凈化設備有限公司)；Model 2323 二氧化碳培養箱(美國SHELLA公司)；LX71熒光倒置相差顯微鏡，S8F-3顯微照相系統(日本Olympus公司)！western blot垂直電泳及轉印系統(Bio-Rad公司)。
[0020](3)方法 I)細胞培養
高分化PC12細胞株由加拿大Mcgill university道格拉斯研究中心Remi Quirion饋贈，依據鄭文華等建立的方法進行培養:使用體積分數分別為5%胎牛血清和5%馬血清、青霉素100U/ml、鏈霉素100U/ml的DMEM培養基，置于37 °C，體積分數為5%的CO2氣體的培養箱中培養。隔兩天用0.25%胰酶-0.02%EDTA消化傳代備用。
[0021]2)原代神經元培養
a.實驗前準備:將實驗所用的手術器械浸泡在75 %的酒精中，需浸泡30 min以上，預先準備好分離皮質所需的小培養皿、離心管等器材，配好I XHBSS，消化終止液及培養基。
[0022]b.Poly-D-Lysine包被:6孔板每孔加1.5 mL Poly-D-Lysine,其他孔板按此類推，10-30 min后用IXPBS洗兩次。
[0023]c.原代神經元培養所用的孕鼠來自中山大學實驗動物中心，選取孕18天的昆明孕小鼠，鼠腹部噴75%的酒精，脫臼處死，沿腹中線切開腹部，找到子宮，快速取出，置于預先準備的培養皿內，迅速轉移至超凈臺。
[0024]d.剪開子宮，取出孕鼠，斷頭，分離頭骨，取出全腦，置于盛有IXHBSS的培養皿內。
[0025]e.超凈工作臺內，用眼科手術鑷、手術剪，小心分離海馬及皮質，置于IXHBSS中漂洗。
[0026]f.用眼科手術鑷仔細去除皮質及海馬組織表面的腦膜及血絲，在培養皿內用鑷子盡量撕碎腦組織，將撕碎的組織轉移至10 mL EP管中。
[0027]g.加IXHBSS沖洗數次，發現有懸浮的血絲，立即去除，加胰酶，置37°C CO2培養箱消化8 min。[0028]h.加含10 % FBS的培養基終止消化，輕彈離心管，持續1.5-2 min。
[0029]1.吸去FBS，加IXHBSS I mL，巴斯德吸管反復吹打直至呈單細胞并分散均勻，如見有組織塊或結締組織，則吸起棄去。
[0030]j.吹打均勻后，取10 μ L細胞懸液進行計數，800 rpm XlO min離心。
[0031]k.吸去上清，加預先準備好的細胞培養基，制成單細胞懸液，根據細胞計數量種板，置于CO2培養箱培養。種板時所用培養基為:DMEM+10% FBS+0.2 % PSA, 6 h后貼壁后換液，換為Neurobasal + 2 % B27 +0.2 % PSA，定期觀察細胞。
[0032]3) MTT法檢測細胞活力 將PC12細胞以IXlO4個/孔密度接種于96孔板，細胞貼壁后，加入青蒿素(3~100 μ M)、SNP ( 500 μ Μ)，于給藥后在37 V、體積分數為5%的CO2氣體的培養箱中培養24h，加入MTT液(0.5mg/ml)，在37°C孵育4h后棄去上清，每孔加入100 μ L DMSO振蕩，待結晶完全溶解后在酶標儀上檢測490 nm波長處吸光度(A49tl )，檢測細胞活力。
[0033]4)免疫印跡法檢測下游信號通路蛋白磷酸化水平
將上述培養的PC12細胞消化后進行細胞計數，以含1%FBS的DMEM培養基接種到用多聚賴氨酸包被的12孔板中。細胞貼壁后，用LY294002、PD98059處理后，洗去細胞培養液，用冰冷的PSB輕輕沖洗，收獲細胞后獲取細胞總蛋白，BCA法蛋白定量后將蛋白濃度調至等濃度。以30yg/Well的蛋白樣品經8%的聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離，再轉印至PVDF膜上。用含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉轉印膜1.5h，加入各種抗體(Ant1-phospho-Akt(Ser473)antibody, Ant1-phospho_p44/42 MAPK (Erkl/2) (Thr202/Tyr204) antibody)室溫孵育過夜。洗膜后,再用辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育lh。ECL化學發光系統檢測蛋白信號。
[0034]5)統計學方法
采用SPSS 16.0進行統計學分析，劑量資料多組間比較采用單因素方差分析(One-wayAN0VN)，各組均數的多重比較采用最小顯著插值法(LSD)，P < 0.05為差異有統計學意義。
[0035]二、結果 (1)3咿能誘導？(:12細胞損傷
PC12細胞剝奪血清后，使用不同濃度的SNP (200~1000 μ M)處理PCl2細胞，另設置含1% FBS (v/v)以及不含血清(CTL)的DMEM培養基處理PC12細胞作為對照，培養24h后通過MTT法檢測細胞活力的變化，檢測結果如圖1所示，從中可以看出隨著SNP濃度的增加，PC12細胞的活力逐漸降低，當SNP濃度達到800 μ M及以上時，對PC12細胞活力的損傷具有極顯著差異(Ρ〈0.01)。
[0036]上述結果說明SNP對PC12細胞的損傷具有劑量依賴性，800 μ M的SNP即可用于誘導PC12細胞損傷的實驗。
[0037](2 )青蒿素在SNP損傷PC12細胞活力中的保護作用
PC12細胞剝奪血清后，加入不同濃度的青蒿素(0、3.125,6.25,12.5、25、50、100 μ Μ，用DMEM培養基配制)預處理lh，隨即再加入800 μ M SNP(用DMEM培養基配)，處理24h后，通過MTT法檢測細胞活力，另外設立對照組CTL (加入相同體積的DMEM培養基)，檢測結果如圖2所示，從中可以看出在800 μ M SNP的處理下，隨著青蒿素(Artemisnin)濃度的增加，PC12細胞活力被損傷的程度逐漸降低，當青蒿素濃度達到25 μ M及以上時，降低SNP對PC12細胞活力的損傷作用具有顯著差異Ρ〈0.01。
[0038]上述結果說明，青蒿素在SNP誘導的PC12細胞氧化應激損傷中具有保護作用，且這種保護作用具有劑量依賴性，當青蒿素濃度達到25 μ M及以上時幾乎可阻斷SNP對PC12的毒性損傷作用。
[0039] (3)青蒿素在SNP誘發PC12細胞凋亡中的保護作用
上述MTT結果表明青蒿素可以保護SNP所誘導的細胞損傷,接下來進一步采用Hoechst染色法來觀察青蒿素抑制SNP誘導細胞凋亡的作用。
[0040]PC12細胞剝奪血清后，加入25 μ M的青蒿素預處理lh，隨即再加入800 μ M SNP處理24h后，相關對照組的設置如圖3和圖4所示，處理后進行Hochest33258染色，檢測各組細胞凋亡情況。
[0041]Hoechst染色結果如圖3所示，對照組細胞胞核圓潤飽滿，著色均勻；給予SNP處理后，在正常的PC12細胞核之間散在分布一些出現凋亡特征的細胞核，如細胞核體積變小皺縮，可見到核碎裂成小葉狀或呈現濃染致密的顆粒塊狀，呈現高強度的藍色熒光(如圖中箭頭所示);然而在給予25 μ mol/L青蒿素(Artemisinin)干預下,細胞核皺縮數減少且核碎裂的現象有所緩解。這表明青蒿素在SNP誘導PC12細胞凋亡中有一定的保護作用。
[0042]細胞凋亡計數結果如圖4所示:與正常培養的PC12細胞相比，SNP處理后，PC12細胞凋亡數量顯著高于正常組(/X0.01)，而給予藥物青蒿素干預后，可以一定程度上逆轉SNP的毒性作用，其凋亡壞死的細胞數顯著減少，且其保護效應具有統計學差異(/X0.01)。
[0043]上述結果說明青蒿素在SNP誘導的神經細PC12的氧化應激和細胞凋亡等細胞損傷(PC12細胞的SNP損傷模型)中具有保護作用。
[0044](5)青蒿素可能通過MAPK/Erk信號通路在SNP損傷PC12細胞中的起保護作用 已有研究報道青蒿素類藥物可能通過MAPK信號通路在細胞內發揮藥效作用，為了進
一步探索青蒿素是通過怎樣的信號途經起到保護PC12細胞的作用，本發明選取PI3K/Ak和MAPK/Erk信號通路進行探索。
[0045]PC12細胞剝奪血清后，分別使用PI3K/Akt信號通路的特異性抑制劑LY294002(25 μ Μ),MAPK/Erk信號通路的特異性抑制劑PD98059 (50 μ Μ)預處理PC12細胞30min后，加入25 μ M青蒿素處理lh，隨即加入SNP處理24h后，通過MTT法檢測處理組和相應的對照組的細胞活力，如圖5所示。從圖5中可以看出，抑制劑LY294002和TO98059本身并不會明顯降低PC12細胞活力，且在青蒿素和SNP同時存在時PC12細胞活力幾乎也不受影響，但當在青蒿素、SNP和抑制劑TO98059同時存在時，PC12細胞活力明顯降低，這說明當有抑制劑PD98059存在時青蒿素在SNP損傷PC12細胞中的保護作用喪失，推測青蒿素可能通過MAPK/Erk信號通路在SNP損傷PC12細胞中的起保護作用。
[0046]為了進一步探索上述推測是否正確,接下來通過western blot進一步檢測MAPK/Erk信號通路中相關蛋白激酶在青蒿素作用下的磷酸化情況，細胞處理方法同上，實驗設計和檢測結果如圖6所示。
[0047]從圖6中可以看出當SNP與青蒿素同時處理PC12細胞后，ρ-Erk水平顯著增高；加入PI3K/Akt的特異性抑制劑LY294002不能降低Erk的磷酸化水平，而加入MAPK/Erk的特異性抑制劑PD98059后，Erk磷酸化水平降到對照組水平。說明青蒿素對SNP損傷PC12的保護作用可能是通過MAPK/Erk信號通路發揮作用。[0048]絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activatedprotein kinases, MAPK)信號轉導通路是近年來的研究熱點之一，它能將細胞表面信號轉導至細胞核內。該家族通過影響動物細胞內基因的轉錄和調控，從而影響細胞的增殖、分化、轉化、凋亡等。目前在哺乳動物細胞中一共發現了 4條并行的MAPK信號通路:MAPK家族的信號通路主要包括細胞外信號調控的蛋白激酶(ERK)、c-Jun N端激酶(JNK) /應激激活的蛋白激酶(SAPK)、P38MAPK以及ERK5/BMK1四條途徑。其中，Ras-Raf-ERK途徑迄今研究得比較清楚的一條通路，該通路參與了細胞生長、發育、增殖、分化等多種生理、病理過程。生長因子與受體結合激活酪氨酸激酶，通過銜接蛋白將信號傳遞給Ras蛋白，Ras-GTP直接與Raf相結合，形成一個短暫的膜錨定信號。活化的Raf通過磷酸化促分裂原激活的蛋白激酶的激酶(MEK)環上的絲氨酸殘基而將其激活。MEK再將促分裂原激活的蛋白激酶(ERK)激活，進而磷酸化許多與胞質和胞膜相連的底物而促進細胞增殖。在我們的研究中發現，PD98059能抑制青蒿素對SNP損傷的PC12細胞的保護作用，即可說明青蒿素保護SNP損傷的PC12細胞，可能是通過激活或者部分激活MAPK/Erk信號通路而促進細胞的增殖，從而達到神經保護作用。而激活該通路的具體機制，則有待進一步的研究。
[0049]綜上所述,本研究在PC12細胞中證明青蒿素對SNP損傷的神經細胞具有保護作用，其作用可能是通過激活或者部分激活MAPK/Erk信號通路，但其具體的機制還有待更深入的研究。由于青蒿素類藥物已經用于臨床，研究這些藥物的神經保護作用，對于尋找其可能靶點、新的藥理作用，對該類藥物的安全使用具有重要的意義。
[0050]實施例2青蒿素在SNP損傷視網膜神經細胞RGC-5中的保護作用 一、材料與方法
同實施例1。
[0051]二、結果
(I)SNP能誘導RGC-5細胞損傷
RGC-5細胞剝奪血清后，使用不同濃度的SNP (62.5~1000 μ M)處理RGC-5細胞以及DMEM培養基培養RGC-5細胞作為對照(CTL)，培養24h后通過MTT法檢測細胞活力的變化，檢測結果如圖7所示，從中可以看出低濃度的SNP促進細胞增殖(I~250μΜ)，當達到500 μ M時SNP出現毒性，在750 μ M細胞存活率降為59%左右，此濃度作為SNP細胞毒性模型。
[0052](2)青蒿素在SNP損傷RGC-5細胞活力中的保護作用
在已建立的SNP誘導的細胞損傷模型的基礎之上，采用750 μ mol/L的SNP對RGC-5細胞進行處理，MTT法檢測青蒿素是否對SNP誘導的RGC-5細胞損傷具有保護作用，青蒿素的溶度分別選用6.25、12.5、25、50和100 μ mol/L,檢測結果如圖8所示，隨著青蒿素濃度的增加，SNP誘導RGC-5細胞損傷的作用逐漸減弱，細胞的存活率逐漸增加，當青蒿素的濃度達到50 ymol/L時，其保護作用已經具有顯著性差異(7X0.01)。這表明，低濃度的青蒿素對SNP誘導的RGC-5細胞損傷具有保護作用，且呈劑量依賴性(O~50 μ mol/L)。
[0053](3)青蒿素在SNP誘發RGC-5細胞凋亡中的保護作用
上述MTT結果表明青蒿素可以保護SNP所誘導的細胞損傷,接下來進一步采用Hoechst染色法來觀察青蒿素抑制SNP誘導細胞凋亡的作用。
[0054]Hoechst染色結果如圖9 A所示，對照組細胞胞核圓潤飽滿，著色均勻；給予SNP處理后，在正常的RGC-5細胞核之間散在分布一些出現凋亡特征的細胞核，如細胞核體積變小皺縮，可見到核碎裂成小葉狀或呈現濃染致密的顆粒塊狀，呈現高強度的藍色熒光(如圖中箭頭所示);然而在給予25 μ mol/L青蒿素干預下，細胞核皺縮數減少且核碎裂的現象有所緩解。這表明青蒿素在SNP誘導RGC-5細胞凋亡中有一定的保護作用。
[0055]細胞凋亡計數結果如圖9 B所示:與正常培養的RGC-5細胞相比，SNP處理后，RGC-5細胞凋亡數量顯著高于正常組(/X0.01)，而給予藥物青蒿素干預后，可以一定程度上逆轉SNP的毒性作用，其凋亡壞死的細胞數顯著減少，且其保護效應具有統計學差異0°〈0.01)。
[0056] 上述結果說明青蒿素在SNP誘導的RGC-5視網膜神經細胞的氧化應激損傷中具有保護作用。
[0057]實施例3青蒿素在SNP損傷皮質神經元中的保護作用 一、材料與方法
同實施例1。
[0058]二、結果
(I) SNP能誘導皮質神經元細胞損傷
皮質神經元細胞剝奪血清后，使用不同濃度的SNP (12.5~1000 μ Μ)處理皮質神經元細胞以及DMEM培養基培養皮質神經元細胞作為對照(CTL)，培養24h后通過MTT法檢測細胞活力的變化，檢測結果如圖10所示，從中可以看出從12.5 ymol/L到100 ymol/L之間SNP可明顯降低神經元的存活率，MTT的值呈現劑量依賴性下降，50 μ mol/L的SNP即可顯著抑制神經元的存活，后續神經元損傷的SNP的劑量選擇為50 μ mol/L。
[0059](2)青蒿素在SNP損傷皮質神經元細胞活力中的保護作用
在已建立的SNP誘導的細胞損傷模型的基礎之上，采用50 μ mol/L的SNP對皮質神經元細胞進行處理，MTT法檢測青蒿素是否對SNP誘導的皮質神經元細胞損傷具有保護作用，青蒿素的溶度分別選用6.25、12.5、25、50和100 μ mol/L,檢測結果如圖11所示，隨著青蒿素濃度的增加，SNP誘導皮質神經元細胞損傷的作用逐漸減弱，細胞的存活率逐漸增加，當青蒿素的濃度達到25 μ mol/L時，其保護作用已經具有顯著性差異(/X0.01 )。這表明，在25 -1OOymol內，青蒿素對SNP誘導的皮質神經元細胞凋亡有顯著的抑制作用，且呈明顯的劑量效應。
[0060]上述結果說明青蒿素在SNP誘導的皮質神經元細胞的損傷中具有保護作用。
[0061]實施例4青蒿素在H2O2損傷視網膜神經細胞RGC-5中的保護作用 一、材料與方法
同實施例1。
[0062]二、結果
(I) H2O2能誘導RGC-5細胞損傷
RGC-5細胞剝奪血清后，使用不同濃度的H202( 10~100 μ Μ)處理RGC-5細胞以及DMEM培養基培養RGC-5細胞作為對照(CTL)，培養24h后通過MTT法檢測細胞活力的變化，檢測結果如圖12所示，從中可以看出高濃度的H2O2濃度(60~100 μ M )依賴性地引起RGC-5細胞死亡，100 μ M H2O2可引起大約40~60%細胞死亡。
[0063](2)青蒿素在H2O2損傷RGC-5細胞活力中的保護作用在已建立的H2O2誘導的細胞損傷模型的基礎之上，采用100 μ mol/L的H2O2對RGC-5細胞進行處理，MTT法檢測青蒿素是否對H2O2誘導的RGC-5細胞損傷具有保護作用，青蒿素的溶度分別選用6.25、12.5、25、50和100 μ mol/L。檢測結果如圖8所示，隨著青蒿素濃度的增加，H2O2誘導RGC-5細胞損傷的作用逐漸減弱，細胞的存活率逐漸增加，當青蒿素的濃度達到25 μ mol/L時，其保護作用已經具有顯著性差異(/X0.05)。這表明，低濃度的青蒿素對H2O2誘導的RGC-5細胞損傷具有保護作用，且呈劑量依賴性(O~100 μ mol/L)。
[0064]上述結果說明青蒿素在H2O2誘導的神經細胞(PC12)的氧化應激和細胞凋亡等細胞損傷中具有保護作用。
[0065]同樣,對青蒿素衍生物(如青蒿素甲醚Artemether、青蒿琥酯Artesunate、二氫青蒿素Dihydroartemisinin及去氧青蒿素Deoxyartemisinin等)或其藥物可接受的鹽進行上述實施例中類似的實驗研究，發現其衍生物均有與青蒿素類似的保護神經細胞、增強神經細胞抵抗損傷能力的作用，從而也可以說明以青蒿素為母核的類似物也具有類似的作用。
[0066]上述相關青蒿素及其衍生物結構式如下:
青蒿素 Artemisinin
【權利要求】
1.青蒿素及其衍生物在制備防治神經性疾病藥物中的應用。
2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于:所述的神經性疾病包括急慢性神經性疾病、神經性眼科疾病。
3.根據權利要求1所述的應用，其特征在于:所述的神經性疾病為與氧化應激損傷相關的神經性疾病。
4.根據權利要求1所述的應用，其特征在于:所述的青蒿素衍生物為以青蒿素為母核的化合物或其藥物可接受的鹽。
5.根據權利要求4所述的應用，其特征在于:所述的以 青蒿素為母核的化合物選自青蒿素甲醚、青蒿琥酯、二氫青蒿素、去氧青蒿素。
【文檔編號】A61P27/02GK103948585SQ201410156407
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年4月17日 優先權日:2014年4月17日
【發明者】鄭文華, 周旋和, 孟茜, 王曰康, 汪海濤, 張浪, 閆鳳俠, 賴永長 申請人:中山大學中山眼科中心