連翹中抗腫瘤活性物質的提取方法及其產品和應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種從連翹中提取抗腫瘤活性物質的方法及其產品和應用。本發明的一種從連翹中提取抗腫瘤活性物質的方法，按如下步驟進行：一、連翹水提液（FS-1）的制備；二、乙醇沉淀法初步分離抗腫瘤有效部位（FS-2）；三、大孔吸附樹脂柱層析法分離連翹抗腫瘤有效部位（FS-3）；四、薄層層析法分離連翹中的抗腫瘤活性物質（FS-4）。此外，本發明通過實驗證實了連翹抗腫瘤活性物質（FS-4）能夠誘導人胃癌SGC-7901細胞的凋亡，同時更進一步的，本發明對連翹抗腫瘤活性物質（FS-4）中的具體成分進行了初步驗證。由本發明的方法提取得到的連翹抗腫瘤活性物質（FS-4），具有明顯的抗腫瘤活性作用，對于腫瘤疾病的治療提供了一種新的技術手段。
【專利說明】連翹中抗腫瘤活性物質的提取方法及其產品和應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種活性物質的提取方法及其產品和應用，特別涉及一種從連翹中提取抗腫瘤活性物質的方法及由該方法提取得到的產品和該產品在抗腫瘤方面的應用，本發明屬于生物醫藥【技術領域】。
【背景技術】
[0002]連翹是中國臨床常用傳統中藥之一，又名黃花條、連殼、青翹、落翹、黃奇丹等。《中華人民共和國藥典》2005年版一部收載的連翅為木犀科(Oleaceae)連翅屬(Forsythia)植物連翅(Forsythia suspensa (Thunb.)Vahl)的干燥果實,連翅有抗菌、強心、利尿、鎮吐等藥理作用，常用連翹治療急性風熱感冒、癰腫瘡毒、淋巴結結核、尿路感染等癥。
[0003]目前，胃癌是世界范圍內最常見的惡性腫瘤之一。盡管其發病率在發達國家已顯著減少，但在全球癌癥相關死亡率中排名第二。本次研究是在研究連翹提取物抗病毒作用的實驗中意外的發現了連翹的抗腫瘤作用，由此，本發明對連翹抗腫瘤活性物質的提取方法進行了進一步的改進，提高了提取率，并且對該提取物進行了系統的抗腫瘤活性的測定，證明該提取物具有體外誘導人胃癌SGC-7901細胞凋亡的作用。
【發明內容】
[0004]為了解決現有癌癥尤其是胃癌臨床治療中存在的化療藥物副作用大，易耐藥等問題，本發明以我國資源豐富，價格便宜，毒副作用低且易于普及的中草藥連翹(即連翹的干燥果實)為研究對象，對其進行分離、提取，得到連翹抗腫瘤活性物質(FS-4)，并對其進行抗腫瘤活性的測定，進而提供了一種從連翹中分離提取具有抗腫瘤作用的連翹抗腫瘤活性物質的方法。
[0005]為了達到上述目的，本發明采用了以下技術手段:
[0006]一、連翹水提液(FS-1)的制備；
[0007]二、乙醇沉淀法初步分離抗腫瘤有效部位(FS-2)；
[0008]三、大孔吸附樹脂柱層析法分離連翹抗腫瘤有效部位(FS-3)；
[0009]四、薄層層析法分離連翹中的抗腫瘤活性物質(FS-4)；
[0010]五、連翹抗腫瘤活性物質(FS-4)體外誘導人胃癌SGC-7901細胞凋亡作用的研究；
[0011]六、連翹抗腫瘤活性物質(FS-4)的初步驗證。
[0012]具體的，本發明的一種提取連翹中抗腫瘤活性物質(FS-4)的方法按照如下步驟進行:
[0013](I)連翹水提液的制備
[0014]連翹經過篩除塵后，水洗浸泡過夜，次日文火煮沸，過濾，收集濾液，蒸發濃縮，制成水提液，滅菌，標記為FS-1，置4°C冰箱保存備用；
[0015](2)乙醇沉淀法初步分離抗腫瘤有效部位
[0016] 取連翹水提液FS-1置于塑料離心管中，然后向其中分次緩慢加入質量百分比濃度為90%-100%的乙醇溶液，并不斷震蕩，直至乙醇溶液的體積達到溶液總體積的90%-95%為止，將離心管置于4°C冰箱8-14h，低溫離心，收集上清液，上清液經濾紙過濾，減壓濃縮后，置于4°C冰箱備用，標記為FS-2 ；
[0017](3)大孔吸附樹脂柱層析法分離連翹抗腫瘤有效部位
[0018]取FS-2，緩慢加入到預處理好的大孔吸附樹脂柱頂端，加入量為2%柱體積，待FS-2滲入樹脂層，依次用蒸餾水、質量百分比濃度為30%、60%、90%的乙醇溶液，以5.0Oml/min流速進行洗脫，收集洗脫部分，質量百分比濃度為90%的乙醇洗脫液經100°C條件下減壓濃縮后，標記為FS-3 ；
[0019](4)薄層層析法分離連翹抗腫瘤活性物質
[0020]按照苯:正己烷:甲醇:冰乙酸的體積比=14-16:14-16:0.5-1.5:0.5-1.5配制展開劑，將FS-3于室溫25°C下在薄層制備板上展開，展開時間50-60min，晾干；然后，通過碘熏法熏染薄層制備板，并在紫外燈照射下觀察，即發現FS-3分為13個條帶，收集從薄層制備板上數的第4個條帶，標記為FS-4，即為抗腫瘤活性物質。[0021]在本發明中，優選的，步驟(1)按照以下步驟進行:連翹經過篩除塵后，用自來水清洗3-6遍，再用蒸餾水洗2-4遍，然后加蒸餾水使液面高出連翹8-15cm，浸泡過夜；次日文火于100°C煮沸，l_3h后趁熱用脫脂棉過濾，藥渣重復提取，再用脫脂棉過濾，將兩次濾液混合，于10(TC蒸發濃縮至1.00mg/ml，制成水提液，經三日間歇平壓滅菌法滅菌，每次40min,置4°C冰箱保存備用。
[0022]在本發明中，優選的，步驟(2)中所述的低溫離心是指于4°C，4000r/min離心15min。
[0023]在本發明中，優選的，步驟(3)中所述的大孔吸附樹脂柱為X-5型大孔吸附樹脂柱。
[0024]在本發明中，優選的，步驟(4)中所述的展開劑按照苯:正己烷:甲醇:冰乙酸的體積比=15:15:1:1配制，展開時間為55min。
[0025]在本發明中，優選的，步驟(4)中所述第4個條帶的收集方法包括以下步驟:
[0026](I)從薄層制備板上將上數第4個條帶切割下來放入小燒杯中；
[0027](2)向燒杯中加入無水乙醇，攪拌，沉淀20_24h后收集上清液，用脂溶性的0.22 μ m濾膜過濾，得到過濾后的上清液，備用，重復步驟(2) 2-3次；
[0028](3)將收集的過濾后的上清液混合后，再離心，取上清液，減壓濃縮后以脂溶性0.22 μ m的濾膜過濾，濾液經冷凍干燥制成粉末，標記為FS-4，即為抗腫瘤活性物質。
[0029]進一步的本發明還提出了按照以上任一所述的方法制備得到的抗腫瘤活性物質及其在制備抗腫瘤藥物中的應用。
[0030]在本發明中，優選的，所述的腫瘤為胃癌。
[0031]本發明提取出的連翹抗腫瘤活性物質(FS-4)，經一系列的抗腫瘤活性測定，證實其具有體外誘導人胃癌SGC-7901細胞凋亡的作用。FS-4作用于SGC-7901細胞36h半數抑制濃度(IC5tl)僅為3.23 μ g/ml，優于臨床常用藥物順鉬的作用(IC5tl為4.21 μ g/ml)。根據《國家新藥(西藥)臨床前研究指導原則匯編》規定，植物粗提物IC5tl ( 20μ g/ml，并且有細胞毒性的劑量依賴性關系，可判定樣品在體外對細胞具有殺傷作用，由此可見連翹抗腫瘤活性物質(FS-4)是一種強的抗腫瘤活性物質。【專利附圖】
【附圖說明】
[0032]圖1為Α0/ΕΒ雙熒光染色法檢測藥物作用12h后SGC-7901細胞凋亡的形態學變化(X40)；
[0033]附注:A.對照組；B.50 μ g/ml FS-4 ；C.100 μ g/ml FS-4 ；
[0034]圖2為正常細胞對照組和FS-4作用12h后透射電鏡下SGC-7901細胞形態；
[0035]附注:透射電鏡1:正常細胞X8000 ;2:實驗組細胞X8000 ;3:正常細胞X 20000 ；4:實驗組細胞X 20000 ；
[0036]圖3為FCM檢測FS-4作用12h SGC-7901細胞凋亡率結果；
[0037]附注:1:對照組；2:12.5 μ g/ml FS-4 作用組；3:25 μ g/ml FS-4 作用組；4:50 μ g/mlFS-4 作用組；5:100 μ g/ml FS-4 作用組；
[0038]圖4為空白對照及FS-4質譜總離子流圖。
[0039]圖5為碘熏法熏染后的薄層制備板(左)及各條帶的相應切割位置(右)。
[0040]箭頭所示為上數的第4個條帶(FS-4)，其中第2、3個條帶用肉眼看不到，只有在紫外燈下才能看到。
【具體實施方式】
[0041]下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨具體實施例的描述更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明精神和范圍下可以對本發明的技術方案和細節形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明保護的范圍內。
[0042]實施例1:連翹水提液(FS-1)的制備
[0043]取連翹(購買自世一堂藥店，黃翹，產地山西)500g經過篩除塵后，用自來水清洗5遍，用蒸餾水洗3遍，加蒸餾水使液面高出連翹IOcm左右，浸泡過夜。次日文火于100°C煮沸，2h后趁熱用脫脂棉過濾，藥渣重復提取，再用脫脂棉過濾，將兩次濾液混合，于100°C蒸發濃縮至1.00mg/ml,經三 日間歇平壓滅菌法滅菌,每次40min,制成水提液,標記為FS-1,置4°C冰箱保存備用。
[0044]實施例2:乙醇沉淀法初步分離抗腫瘤有效部位(FS-2)
[0045]取3.5ml連翹水提液FS_1置于塑料離心管中，然后向其中分段緩慢加入質量百分比濃度為100%的乙醇溶液，并不斷震蕩，直至乙醇溶液體積達到溶液總體積的90%為止。將離心管置4°C冰箱12h，于低溫離心機4°C，4000r/min離心15min，收集上清液，上清液經濾紙過濾，減壓濃縮，置于4°C冰箱，備用，標記為FS-2。
[0046]實施例3:大孔吸附樹脂柱層析法分離連翹抗腫瘤有效部位(FS-3)
[0047]取FS-2，緩慢加入到預處理好的大孔吸附樹脂(X-5型)柱頂端，加入量為2%柱體積，8mg/次，共6次。待FS-2滲入樹脂層，依次用蒸餾水、質量百分比濃度為30%、60%、90%的乙醇溶液，以5.0Oml/min流速進行洗脫，收集洗脫部分，質量百分比濃度為90%的乙醇溶液洗脫液經100°C條件下減壓濃縮后，即得FS-3。
[0048]實施例4:薄層層析法分離連翹抗腫瘤活性物質(FS-4)
[0049](I)薄層板的活化:將薄層板在烘箱中漸漸升溫，維持105°C~110°C活化30min。活化后的制備薄層板放在干燥器內保存待用；
[0050](2)點樣:先用鉛筆在距薄層板一端Icm處輕輕劃一橫線作為起始線，然后用100微升的點樣管吸取FS-3，在起始線上小心點樣，使上樣量達到2mg/板，點好樣的制備薄層板用電吹風的熱風吹干，備用；
[0051](3)展開:首先按苯:正己烷:甲醇:冰乙酸的體積比=15:15:1:1配置展開劑。在展開缸中加入配好的展開溶劑，使其高度不超過lcm，將點好樣的薄層板小心放入展開缸中，點樣一端朝下，浸入展開劑中，蓋好蓋。室溫25°C，展開時間55min，晾干；
[0052](4)顯色
[0053]碘蒸氣進行顯色:將展開后的薄層板揮發掉溶劑后置于一放置有少量固體顆粒碘的密閉玻璃容器中I~2min，然后從碘蒸氣容器中取出薄層板，用針尖畫出組分顯現的條帶;
[0054](5)收集:
[0055]將多塊經上數步驟(1)- (4)得到的薄層板先在紫外燈下進行劃線，顏色褪去后進4丁切割:
[0056]將薄層板上數第4個條帶切割下來收集到小燒杯中，加入其體積5倍的無水乙醇溶液，攪拌，沉淀24h后收集上清，用脂溶性的0.22 μ m濾膜過濾上清液，以上步驟重復3次(具體操作:①用注射器從燒杯A中吸出上清液，然后用脂溶性的0.22濾膜過濾到燒杯B中；②再向燒杯A中加入5倍體積的無水乙醇溶劑重復上述步驟；③燒杯B中隨時可以用鼓風干燥器蒸干。)；將上清液混合后，再離心，取上清液，最后減壓濃縮至IOml左右，再以0.22μπι的濾膜過濾，濾液經冷凍干燥的方法將提取得到的藥物制成粉末，標記為FS-4，-20°C保存備用。
[0057]實施例5:連翹抗腫瘤活性物質(FS-4)體外誘導人胃癌SGC-7901細胞凋亡作用
[0058]采用MTT比色法檢測連翹抗腫瘤活性物質體外對人胃癌SGC-7901細胞生長、增殖的抑制作用。FS-4作用于人胃癌SGC-7901細胞6、12、24、36h的半數抑制濃度(IC5tl)分別為 87.38 μ g/ml、56.10 μ g/ml、34.45 μ g/ml、3.23 μ g/ml。
[0059]通過AO-EB雙熒光染色法觀察到不同濃度的FS-4作用人胃癌SGC-7901細胞后，出現大量的凋亡細胞(圖1所示)。
[0060]透射電子顯微鏡(金標準)觀察到FS-4作用人胃癌SGC-7901細胞后，凋亡細胞的超微結構。顯示核漿比減少，核仁消失，胞漿內空泡明顯，染色質密集邊緣化，細胞表面絨毛脫失，形成質膜葉片樣突起，并有凋亡小體形成(圖2所示)。
[0061]FS-4作用于SGC-7901細胞后，可使細胞DNA發生斷裂，形成“梯狀” DNA。
[0062]流式細胞儀Annexin V -PI雙染檢測細胞凋亡的情況(圖3所示)。正常細胞對照組及 12.5 μ g/ml、25 μ g/ml、50 μ g/ml、100 μ g/ml FS-4 處理 SGC-7901 細胞 12h 后，細胞凋亡率分別為4.15%、8.04%,29.46%,44.66%,58.53%，FS-4各作用組與對照組差異均有顯著性(P < 0.01)。
[0063]Western Blot測定不同時間作用于SGC-7901細胞，以及不同濃度FS-4作用于SGC-7901細胞后，均可激活凋亡相關蛋白(Caspase-3、Caspase-9、Bcl_2、Bax)的表達。
[0064] 本發明提取出的連翹抗腫瘤活性物質(FS-4)，經一系列的抗腫瘤活性測定，證實其具有體外誘導人胃癌SGC-7901細胞凋亡的作用。FS-4作用于SGC-7901細胞36h半數抑制濃度(IC5tl)僅為3.23 μ g/ml，優于臨床常用藥物順鉬的作用(IC5tl為4.21 μ g/ml)。根據《國家新藥(西藥)臨床前研究指導原則匯編》規定，植物粗提物IC5tl ( 20μ g/ml，并且有細胞毒性的劑量依賴性關系，可判定樣品在體外對細胞具有殺傷作用，由此可見連翹抗腫瘤活性物質(FS-4)是一種強的抗腫瘤活性物質。
[0065]實施例6:FS-4成分的初步驗證
[0066]WATERS公司Acquity超高效液相色譜儀串聯四級桿飛行時間質譜儀(UPLC/Q-T0FMS), ACQUITY UPLC BEH C18 (2.1 X 50mm, 1.7 μ m)色譜柱，配有 PDA 檢測器和 MassLynx4.1
工作站。
[0067]1、樣品溶液制備
[0068]溶劑為80%甲醇水溶液。稱取FS-410mg溶于10ml80%甲醇水溶液，制作lmg/ml的貯備液，4 °C存儲，待測。
[0069]2、色譜分離條件
[0070]流動相A為0.1%甲酸高純水溶液，流動相B為乙腈；流速為0.35ml/min。梯度洗脫進行分離，初始梯度保持2%流動相B (乙腈)0.5min,在IOmin內乙腈線性上升至100%,維持1.5min，之后3.5min內乙腈含量降回2%，詳見下表1。平衡色譜柱lmin。每次進樣量為5 μ L ;柱溫35°C ；自動進樣器內環境溫度維持在4°C。
[0071 ] 表1連翹FS-4梯度洗脫條件
[0072]
【權利要求】
1.一種從連翹中提取抗腫瘤活性物質的方法，其特征在于包括以下步驟: (1)連翹水提液的制備 連翹經過篩除塵后，水洗浸泡過夜，次日文火煮沸，過濾，收集濾液，蒸發濃縮，制成水提液，滅菌，標記為FS-1，置4°C冰箱保存備用； (2)乙醇沉淀法初步分離抗腫瘤有效部位 取連翹水提液FS-1置 于塑料離心管中，然后向其中分次緩慢加入質量百分比濃度為90%-100%的乙醇溶液，并不斷震蕩，直至乙醇溶液的體積達到溶液總體積的90%-95%為止，將離心管置于4°C冰箱8-14h，低溫離心，收集上清液，上清液經濾紙過濾，減壓濃縮后，置于4°C冰箱備用，標記為FS-2 ； (3 )大孔吸附樹脂柱層析法分離連翹抗腫瘤有效部位 取FS-2，緩慢加入到預處理好的大孔吸附樹脂柱頂端，加入量為2%柱體積，待FS-2滲入樹脂層，依次用蒸餾水、質量百分比濃度為30%、60%、90%的乙醇溶液，以5.00ml/min流速進行洗脫，收集洗脫部分，質量百分比濃度為90%的乙醇洗脫液經100°C條件下減壓濃縮后，標記為FS-3 ； (4)薄層層析法分離連翹抗腫瘤活性物質 按照苯:正己烷:甲醇:冰乙酸的體積比=14-16:14-16:0.5-1.5:0.5-1.5配制展開劑，將FS-3于室溫25°C下在薄層制備板上展開，展開時間50-60min，晾干；然后，通過碘熏法熏染薄層制備板，并在紫外燈照射下觀察，即發現FS-3分為13個條帶，收集從薄層制備板上數的第4個條帶，標記為FS-4，即為抗腫瘤活性物質。
2.按照權利要求1所述的方法，其特征在于步驟(1)按照以下步驟進行:連翹經過篩除塵后，用自來水清洗3-6遍，再用蒸餾水洗2-4遍，然后加蒸餾水使液面高出連翹8-15cm，浸泡過夜；次日文火于100°C煮沸，l_3h后趁熱用脫脂棉過濾，藥渣重復提取，再用脫脂棉過濾，將兩次濾液混合，于100°C蒸發濃縮至1.00mg/ml，制成水提液，經三日間歇平壓滅菌法滅菌，每次40min，置4°C冰箱保存備用。
3.按照權利要求1所述的方法，其特征在于步驟(2)中所述的低溫離心是指于4°C，4000r/min 離心 15min。
4.按照權利要求1所述的方法，其特征在于步驟(3)中所述的大孔吸附樹脂柱為X-5型大孔吸附樹脂柱。
5.按照權利要求1所述的方法，其特征在于步驟(4)中所述的展開劑按照苯:正己烷:甲醇:冰乙酸的體積比=15:15:1:1配制,展開時間為55min。
6.按照權利要求1所述的方法，其特征在于步驟(4)中所述第4個條帶的收集方法包括以下步驟: (1)從薄層制備板上將上數第4個條帶切割下來放入小燒杯中； (2)向燒杯中加入無水乙醇，攪拌，沉淀20-24h后收集上清液，用脂溶性的0.22 μ m濾膜過濾，得到過濾后的上清液，備用，重復步驟(2) 2-3次； (3)將收集的過濾后的上清液混合后，再離心，取上清液，減壓濃縮后以脂溶性的0.22 μ m的濾膜過濾，濾液經冷凍干燥制成粉末，標記為FS-4，即為抗腫瘤活性物質。
7.按照權利要求1-6任一項所述的方法制備得到的抗腫瘤活性物質。
8.權利要求7所述的抗腫瘤活性物質在制備抗腫瘤藥物中的應用。
9.按照權利要求8所述的應用，其特征在于所述的腫瘤為胃癌 。
【文檔編號】A61P35/00GK103933125SQ201410135783
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年4月4日 優先權日:2014年4月4日
【發明者】李鑫, 劉微, 李洪源, 李丹娜 申請人:哈爾濱醫科大學