一種有效抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒的中藥復方及其提取方法
【專利摘要】本發明公開了一種有效豬繁殖與呼吸綜合征病毒的中藥復方及其提取方法，其技術方案有下列藥物組成：夏枯草3/8重量份、魚腥草2/8重量份、柴胡2/8重量份和蘆根1/8重量份，采用水煎煮方法進行粗提，本發明的復方中藥制劑在體外能有效抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒。
【專利說明】一種有效抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒的中藥復方及其提取方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于獸用中藥領域，涉及一種體外抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒的中藥復方。
【背景技術】
[0002]豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)，是由豬繁殖與呼吸系統綜合征病毒(PRRSV)引起豬的以繁殖障礙和呼吸道癥狀為主要特征的一種高度傳染性疾病。該病既能垂直傳染又能水平傳播，能夠引起妊娠母豬發熱、厭食、流產、早產、木乃伊胎、弱仔及誘發仔豬和育成豬的多種呼吸系統疾病。1996年郭寶清等人確定了其在我國的存在，PRRS具有傳播迅速、流行廣泛和毒株變異能力強的特點，該病對養豬業造成嚴重威脅和巨大經濟損失，防治主要靠疫苗預防，目前尚無有效藥物，其綜合防制有很大難度。近年來，中草藥的扶正培本、調整機體陰陽失衡、增強免疫力方面越來越得到醫學界的關注和重視，研究表明，中草藥能夠直接或通過調節機體免疫力影響病毒的復制，對病毒性疾病的預防和治療有較好的作用，而且具有毒副作用少、殘留低、資源豐富等優勢。本發明主要針對豬繁殖與呼吸系統綜合征防治問題，選取具有清熱解毒、活血化瘀或固本解表等功效的16種中藥，如:魚腥草、菊花、山銀花、知母、桂枝、麻黃、赤芍、柴胡、貫眾、大青葉、桅子、薄荷葉、牡丹皮、水牛角、千里光、地膽草等，研究它們在體外抗PRRSV的作用。在此基礎上篩選、確定本發明所述的抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒的中藥復方。
【發明內容】
[0003]本發明的目的是提供一種有效抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒的中藥復方及其提取方法。
[0004]一種用于抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒的中藥復方，其特征在于，包含如下藥物及其重量份:夏枯草3重量份、魚腥草2重量份、柴胡2重量份、蘆根I重量份。
[0005]具體實施中，一種用于抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒的中藥復方，按照配制8克中藥復方為標準，包含如下藥物及其重量份:夏枯草3/8重量份、魚腥草2/8重量份、柴胡2/8重量份和蘆根1/8重量份。
[0006]所述的復方是指所含的中藥種類及其中藥在復方中藥中的比重。
[0007]所述的重量份是指復方中各種藥物占整個復方的重量比例。
[0008]作為本發明的另一目的，還包括一種用于抗抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒的中藥復方的提取方法，采用水煎煮方法進行粗提，具體步驟是:
(1)按夏枯草3/8重量份、魚腥草2/8重量份、柴胡2/8重量份和蘆根1/8重量份稱取各中藥，組成8g中藥復方；
(2)按照步驟(1)的配方稱量配方藥，水浸泡lh，浸泡加水量為中藥復方重量的4倍，然后再加入中藥復方重量的 4倍的水量，煎煮20-30min，過濾得第一次煮液；再加入中藥復方重量的5倍的水量，煎煮20min，過濾得第二次煮液。
[0009](3)合并2次煎液，于燒杯中加熱蒸煮，定容至20ml，每毫升相當于0.2g生藥；
(4)置涼，用離心機以轉速為3000r/min離心10min，取上層清液存200ml容量瓶中，用
NaHC03溶液調pH值至7.0，經高壓滅菌分裝于4°C保存備用。
[0010]本發明采用的中藥復方成分及其中藥特性和在本發明中起到的作用如下:
本發明采用的夏枯草:性寒，味甘、辛、微苦，具有清泄肝火、清火明目、散結消腫、清熱
解毒、祛痰止咳、涼血止血的功效。
[0011]本發明采用的魚腥草:性微寒，味苦，歸肺經、膀胱、大腸經。具有清熱解毒、利尿通淋的功效。我們前期 研究證實:魚腥草具有明顯的抗豬繁殖與呼吸病毒的阻斷作用。
[0012]本發明采用的柴胡:味苦，性微寒，歸肝、膽經。具有透表泄熱、疏肝解郁和升舉陽氣的功效。我們前期實驗證明:柴胡對豬繁殖與呼吸病毒具有明顯的阻斷、殺滅和抑制作用。
[0013]本發明采用的蘆根:性甘、寒。歸肺經、胃經。具有清熱生津、除煩、止嘔和利尿等功效。
【具體實施方式】
[0014]下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。
[0015]一種用于抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒的中藥復方，包含如下藥物及其重量份:夏枯草3重量份、魚腥草2重量份、柴胡2重量份、蘆根I重量份。
[0016]所述的復方是指所含的中藥種類及其中藥在復方中的比重。
[0017]本申請書所述的重量份是指復方中各種藥物占整個復方的重量比例。
[0018]下述實施例中所用實驗材料如下:
(一)細胞與病毒
細胞:Marc-145細胞，由華南農業大學獸醫微生物學與免疫學實驗室惠贈，按常規方法傳代、培養；豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)由華南農業大學獸醫學院惠贈。
[0019](二)主要試劑
胎牛血清、胰蛋白酶、DMEM培養液均為HyClone產品；二甲基亞砜(DMSO)購自GIBICO公司；噻唑藍(MTT)為SIGMA產品，以無Ca2+、Mg2+的PBS液配制成5mg/mL，過濾除菌分裝，-20°C避光保存備用。
[0020](三)中藥的提取
采用水煎煮方法進行粗提，具體步驟是:
(1)按夏枯草3/8重量份、魚腥草2/8重量份、柴胡2/8重量份和蘆根1/8重量份稱取各中藥，組成8g中藥復方；
(2)按照步驟(1)的配方稱量配方藥，水浸泡lh，浸泡加水量為中藥復方重量的4倍，然后再加入中藥復方重量的4倍的水量，煎煮20-30min，過濾得第一次煮液；再加入中藥復方重量的5倍的水量，煎煮20min，過濾得第二次煮液。
[0021](3)合并2次煎液，于燒杯中加熱蒸煮，定容至20ml，每毫升相當于0.2g生藥(SP200mg/mL)；
(4)置涼，用離心機以轉速為3000r/min離心10min，取上層清液存200ml容量瓶中，用NaHC03溶液調pH值至7.0，經高壓滅菌分裝于4°C保存備用。
[0022]實施例1中藥復方對Marc-145細胞安全濃度和豬繁殖與呼吸綜合征病毒的半數毒性濃度(TCID50)的測定
1.中藥復方對Marc-145細胞安全濃度的測定
取Marc-145細胞長成單層的96孔培養板，棄原液，PBS洗滌I次，以DMEM完全培養液對中藥原液作2倍倍比稀釋至第10孔，每孔100 μ L，第11、12孔為細胞對照，各稀釋度重復4孔，37°C、C02培養箱培養至72h，每天觀察細胞的形態變化及生長狀況。72h后棄去培養液，以PBS液洗滌I次，加入MTT液20 μ L/孔，37°C繼續培養4h后棄MTT液，加入DMS0150 μ L/孔，恒溫振蕩IOmin待結晶全部溶解,490nm波長下測定OD值。
[0023]根據公式以OD值計算不同濃度復方中藥對細胞的生長抑制率，細胞生長抑制率=(細胞對照組OD值-藥物組OD值)/細胞對照組OD值，并結合CPE觀察結果來判斷復方中藥毒性的大小，當生長抑制率為O則表明該中藥對細胞無毒性作用，結合復方中藥的起始濃度，來確定其最大安全濃度。
[0024]2.豬繁殖與呼吸綜合征病毒的半數毒性濃度(TCID50)的測定
將待測病毒按10倍比系列稀釋至10-10，按100 μ L/孔的劑量加入長至單層Marc-145細胞的96孔板，最后2列作細胞對照組，各組重復8孔，370C吸附1.5h后棄病毒液，各孔加入DMEM維持液100 μ L, C02培養箱37°C培養。
[0025]每天觀察細胞病變作用(CPE)，72-96h后，以MTT法測定各孔OD值。根據下述公式計算:病毒對細胞的生長抑制率=(細胞對照組OD值-病毒對照組OD值)/細胞對照組OD值。采用Reed-Muench兩氏法，計算病毒的半數毒性濃度(TCID50)，即距離比例=(高于50%的細胞生長抑制率-50%) / (高于50%的細胞生長抑制率-低于50%的細胞生長抑制率)。Log2TC50=距離比例X稀釋度對數之間的差+高于50%細胞生長抑制率的對數。
[0026]3.數據處理
用SPSS19.0軟件進行統計分析，先計算各中藥不同濃度下的平均OD值(以X (—)土S.E表示),根據公式計算對細胞的抑制率或保護率。
[0027](I)復方中藥對細胞的安全濃度
根據公式以OD值計算不同濃度復方中藥對細胞的生長抑制率，并結合CPE觀察結果來判斷復方中藥毒性的大小，當生長抑制率為O則表明該中藥對細胞無毒性作用，結合復方中藥的起始濃度，來確定其最大安全濃度(結果見表1)。
【權利要求】
1.一種有效抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒的中藥復方，其特征在于，包含如下藥物及其重量份:夏枯草3重量份、魚腥草2重量份、柴胡2重量份、蘆根1重量份。
2.如權利要求1所述的中藥復方，其特征在于，按照配制8克中藥復方為標準，包含如下藥物及其重量份:夏枯草3/8重量份、魚腥草2/8重量份、柴胡2/8重量份和蘆根1/8重量份。
3.如權利要求1-2所述的一種有效抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒的中藥復方，其特征在于，所述的復方是指所含的中藥種類及其中藥在復方中藥中的比重。
4.如權利要求1-2所述一種有效抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒的中藥復方，所述的重量份是指復方中各種藥物占整個復方的重量比例。
5.根據權利要求1或2所述的一種有效抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒的中藥復方的提取方法，其特征在于，采用水煎煮方法進行粗提，具體步驟是: (1)按夏枯草3/8重量份、魚腥草2/8重量份、柴胡2/8重量份和蘆根1/8重量份稱取各中藥，組成8g中藥復方； (2)按照步驟(1)的配方稱量配方藥，水浸泡lh，浸泡加水量為中藥復方重量的4倍，然后再加入中藥復方重量的4倍的水量，煎煮20-30min，過濾得第一次煮液；再加入中藥復方重量的5倍的水量，煎煮20min，過濾得第二次煮液； (3)合并2次煎液，于燒杯中加熱蒸煮，定容至20ml，每毫升相當于0.2g生藥； (4)置涼，用離心機以轉速為3000r/min離心10min，取上層清液存200ml容量瓶中，用NaHC03溶液調pH值至7.0，經高壓滅菌分裝于4°C保存備用。
【文檔編號】A61K36/899GK103933384SQ201410121724
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年3月28日 優先權日:2014年3月28日
【發明者】王丙云, 冼瓊珍, 計慧琴, 陳勝鋒, 陳志勝 申請人:佛山科學技術學院