一種靶向治療和檢測雙功能的抗腫瘤雙特異性小型化抗體的制作方法
【專利摘要】本發明屬于生物工程制藥、蛋白質多肽類藥物及生物醫學工程領域，涉及對人類表皮生長因子受體EGFR1和HER2均具有高親和力的小型化融合抗體的設計、構建及其在腫瘤靶向診斷和治療中的應用。該雙特異性抗體由HER2特異性結構域和EGFR1特異性結構域通過(G4S)3連接肽串聯后經基因重組表達獲得，融合蛋白編碼基因全長為804bp，編碼268個氨基酸，融合蛋白分子量為29kD，其氨基酸序列為SEQ?ID?No:1所示序列。本發明的雙特異性小型化抗體相較于EGFR1和HER2抗體聯合使用有顯著的體內外活性優勢，且具有低毒性、非腫瘤部位體內清除快速等優點，在靶向診斷和治療中均具有高效率，可用于腫瘤診斷和治療中。
【專利說明】一種靶向治療和檢測雙功能的抗腫瘤雙特異性小型化抗體
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物工程領域，具體涉及一種對人類表皮生長因子受體EGFRl和HER2均具有高親和力的小型化融合抗體及其應用，其可用于癌癥診斷和治療。
【背景技術】
[0002]受體酪氨酸激酶ErbB家族在細胞的生長、增殖和分化等生理過程中起到重要的作用。該受體家族包括四個成員:表皮生長因子受體(EGFRUErbBl或HER1)、HER2(ErbB2)、HER3 (ErbB3)和HER4 (ErbB4)。該家族成員均由胞外配體結合結構域、胞內激酶結構域以及跨膜結構域組成，與腫瘤細胞的生物學過程具有密切的聯系。
[0003]表皮生長因子(EGF)是EGFRl的天然配體。其與EGFRl結合后，激活了 EGFRl的受體酪氨酸激酶活性，進而激活下游一系列信號通路(如PI3K/Akt)，最終對腫瘤細胞的生長、增殖、分化、遷移起到促進作用。HER2無天然配體，但其能與家族其它受體成員發生異二聚化。當 EGFR 與 HER2 發生二聚化時，HER2 下游通路(RAS/RAF/MAPK、PI3K/Akt、STAT,PLC)也被激活，促進一系列細胞行為。而目前研究表明，HER2高表達的腫瘤通常更具侵襲性，病人也往往預后不良。EGFRl和HER2在多種如乳腺癌、肺腺癌等腫瘤中呈陽性表達，這使它們成為很有前景的腫瘤細胞靶點。并且研究顯示，EGFRl和HER2通常在腫瘤細胞行為中協同發生作用，兩者共同導致細胞的癌變。當ErbB家族其它成員過表達時，單獨靶向于其中單一家族成員的抗腫瘤藥物起不到很好的療效。
[0004]鑒于EGFRl和HER2在腫瘤發生中所扮演的重要角色，大量針對EGFRl和HER2的藥物陸續上市，其主要分為大分子單克隆抗體(如西妥昔、赫賽汀)和小分子酪氨酸激酶抑制劑類藥物(如伊馬替尼、達沙替尼、尼羅替尼和拉帕替尼等)。單克隆抗體類藥物分子量通常在150kD左右，其過大的分子量使其進入腫瘤組織細胞的效率較低，體內代謝時間過長，從而導致了其治療效率較低、體內積蓄毒性較高等缺點；另一方面，目前上市的單克隆抗體都是單一靶向于EGFRl和HER2，由于EGFRl和HER2的協同作用，這些抗體對于EGFR1/HER2雙陽性腫瘤顯示不出很好的療效。而小分子酪氨酸激酶抑制劑類藥物雖然易于進入腫瘤細胞組織，但缺乏腫瘤主動靶向性是其重要缺陷，而且酪氨酸激酶在人體正常的細胞生理活動中也起著重要的作用，該類藥物對非腫瘤部位酪氨酸激酶的無差別抑制也導致了較大的體內毒性；盡管拉帕替尼對于EGFRl和HER2酪氨酸激酶均有較好的抑制效果，但由于靶向特異性缺失所導致的體內毒性也使得該類藥物的研發和使用進入了一個瓶頸階段。
【發明內容】
[0005]本發明公開了一種雙重靶向EGFRl和HER2的小型化雙特異性抗體，其具有分子量小(只有29kD)且易于進入腫瘤組織、雙靶點特異靶向等優點，對于EGFR/HER2過表達腫瘤的治療具有至關重要的作用。
[0006]體內體外實驗均表明本發明的雙特異性小型化抗體具有低毒性、非腫瘤部位體內清除快速等優點。其在體內體外均能與表達表皮生長因子受體EGFRl和HER2的腫瘤細胞特異性結合，且對EGF和EGFRl的結合具有強烈的拮抗作用，能夠對EGFRl和HER2下游腫瘤增殖、遷移、侵襲相關信號通路進行調控。在艾氏腹水癌小鼠移植瘤治療試驗中，該抗體療效顯著，可用于癌癥診斷和治療。此外，該抗體能夠偶聯抗腫瘤藥物和近紅外熒光染料進行活體腫瘤治療和檢測，具有很高的腫瘤治療和檢測效率。
[0007] 最重要的是，無論在體內還是體外，該雙特異性抗體均展現了強于相同摩爾濃度的EGFRl特異性抗體和HER2特異性抗體聯合使用的靶向活性，起到了協同的效果。
[0008]本發明的EGFR1/HER2雙特異性小型化抗體命名為MaAbNA，其能夠對EGFR和HER2高表達腫瘤進行體內體外診斷，并單獨或偶聯傳統化療藥成為一種腫瘤治療藥物。該雙特異性抗體由HER2(編碼氨基酸1-124)和EGFRl (編碼氨基酸140-268)特異性結構域依次串聯而成，由于其不含抗體恒定區，不僅大大降低了該抗體的分子量(僅為29kD)，使其更易進入腫瘤細胞組織中，在體內代謝更快不會在腎臟中長期積蓄導致腎毒性。為避免各分子之間空間結構的相互干擾，在依次相連的分子中間設計了由(G4S)3組成的柔性連接肽，見圖1。
[0009]本發明構建的融合蛋白編碼基因全長為804bp，編碼268個氨基酸，融合蛋白分子量為29kD，其氨基酸序列為SEQ ID No:1所示序列，其基因編碼序列為SEQ ID No: 2所示序列。
[0010]本發明的抗體MaAbNA能與熒光染料羅丹明B通過共價鍵偶聯，用作腫瘤靶向探針。
[0011]本發明的抗體MaAbNA還能與近紅外染料通過共價鍵偶聯，用作腫瘤靶向探針。其中近紅外染料優選吲哚菁綠(簡稱ICG)。
[0012]上述腫瘤靶向探針可以按常規方法添加輔料后制備成腫瘤診斷試劑盒。
[0013]本發明的抗體MaAbNA還能夠和抗腫瘤藥物通過雙羧基聚乙二醇共價連接進行腫瘤治療。優選的抗腫瘤藥物是:阿霉素、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶以及阿糖胞苷。
[0014]下面是本發明的抗體MaAbNA體內外活性的試驗:
[0015]1.細胞激光共聚焦細胞攝取分析
[0016]人肺腺癌A549細胞、人乳腺癌MDA-MB-231細胞、人乳腺癌MCF-7細胞在共聚焦皿中培養12小時后，加入標記了染料羅丹明B的MaAbNA體外靶向探針(結構為MaAbNA-NH-CO-羅丹明B)共孵育2小時后，吸棄培養液，并用PBS緩沖液洗滌2次后在共聚焦顯微鏡下觀察其熒光強度。結果表明:與標記了羅丹明B的MaAbNA共同孵育的EGFR1/HER2雙陽性細胞A549和EGFRl陽性細胞MDA-MB-231均具有較高的熒光強度值，而對EGFRl和HER2低表達細胞MCF-7熒光強度較低，三種細胞的平均熒光強度按如A549>MDA-MB-231>MCF-7的順序排列，見圖2，這說明了本發明雙特異性小型抗體MaAbNA對EGFR1/HER2陽性細胞的親合力。
[0017]MaAbNA的EGFRl特異性結構域和HER2特異性結構域分別來源于EGFRl納米抗體和HER2親和抗體。為比較MaAbNA相對于EGFRl納米抗體、HER2親和抗體以及兩種抗體聯合使用的體外親和力。在激光共聚焦試驗中，與MaAbNA探針相同摩爾濃度的EGFRl納米抗體探針和HER2親和抗體探針以及兩種抗體探針的混合溶液分別作為對照用于A549細胞攝取。結果表明=MaAbNA組平均熒光強度為436±31，EGFRl納米抗體組為252±19，HER2親和抗體組為274± 17，兩種抗體聯合使用組為351 ±21，見圖3。這說明了 MaAbNA擁有相較于EGFRl納米抗體、HER2親和抗體以及兩種抗體聯合使用的體外親和力優勢。
[0018]2.EGF體外競爭性試驗:
[0019]將A549、MDA-MB-231細胞從12孔板上消化后重懸于PBS溶液，每種細胞分別與羅丹明B標記的表皮生長因子(EGF-羅丹明B) (50nmol/L)共孵育2小時，并通過流式細胞術檢測其平均熒光強度。不同濃度的未標記染料的EGF或MaAbNA抗體被加入到孵育后細胞，與染料標記EGF競爭結合細胞膜受體。隨著EGF或MaAbNA濃度的升高，細胞平均熒光強度在一定EGF或MaAbNA濃度范圍內呈線性下降。無論在A549還是MDA-MB-231細胞中，MaAbNA競爭組的斜率均大于EGF組，這表明MaAbNA對EGF具有顯著的競爭性拮抗作用作用，見圖4。這進一步證明了 MaAbNA對EGF結合EGFRl的競爭抑制作用。
[0020]3.融合蛋白的活體腫瘤靶向:
[0021]MaAbNA在標記了近紅外染料ICG后，作為一種近紅外探針被用于體內腫瘤親合力檢測，其結構為MaAbNA-NH-CO-1CG。A549、MDA-MB-231、MCF-7荷瘤裸鼠均被尾靜脈給藥以MaAbNA-1CG探針。該探針對A549和MDA-MB-231裸鼠移植瘤展示了優秀的靶向能力，而對陰性腫瘤MCF-7靶向效果甚微。在A549和MDA-MB-231移植瘤中，該探針在2小時左右即可靶向到腫瘤部位，在此后72小時內其他臟器的熒光信號逐漸消失，而腫瘤部位熒光信號一直保持較高的信噪比，而MCF-7信噪比較低，三種細胞移植瘤的近紅外熒光信噪比按以下順序排列:A549>MDA-MB-231>MCF-7，見圖5。靶向試驗結果表明=MaAbNA能夠在活體內部環境下靶向至EGFR1/HER2陽性腫瘤，從而使其能夠用于活體腫瘤靶向和診斷。
[0022]為比較MaAbNA相對于EGFRl納米抗體、HER2親和抗體以及兩種抗體聯合使用的體內親和力。在活體腫瘤靶向試驗中，與MaAbNA探針相同摩爾濃度的EGFRl納米抗體探針和HER2親和抗體探針以及兩種抗體探針的混合溶液分別作為對照用于A549細胞移植瘤靶向。結果表明=MaAbNA組腫瘤部位近紅外熒光信噪比為436±31，EGFRl納米抗體組為252±19，HER2親和抗體組為274± 17，兩種抗體聯合使用組為351 ±21，見圖6。這說明了MaAbNA擁有相較于EGFRl納米抗體、HER2親和抗體以及兩種抗體聯合使用的體內親和力優勢。
[0023]4.體內代謝試驗:
[0024]將MaAbNA-1CG探針通過尾靜脈給藥的方式注入正常裸鼠體內，在24小時內實時檢測裸鼠體內近紅外熒光信號。結果顯示=MaAbNA在進入體內30分鐘后就迅速分布到全身，并在4小時后開始從腎臟代謝，24小時后體內就檢測不到任何熒光信號，見圖7，。這表明MaAbNA的低分子量使其在體內代謝迅速，不會再腎臟內蓄積，不會導致藥物的腎臟毒性。
[0025]5.MTT增殖抑制試驗:
[0026]A549、MDA_MB_2 31、MCF-7細胞以及正常人肺上皮L2細胞分別于37°C、5% CO2培養箱中培養，待長滿90%以上時，用0.25%胰蛋白酶液消化后，制備成單細胞懸液(完全生長培養基)，以3000個細胞/孔鋪96孔板，于37°C，5% CO2培養箱中培養，24小時后換用1% FBS的低血清培養液，然后加入MaAbNA抗體至梯度終濃度(2、4、8、16、32、64mg/mL)。以相同濃度梯度的阿霉素和5-氟尿嘧啶為陽性對照，不加藥組為陰性對照，同時設置空白對照(不加細胞，其余操作均相同)。72小時后每孔加10 μ L ΜΤΤ，繼續于37°C，5% CO2培養箱中培養，4小時后吸棄培養基，每孔加150 μ L DMSO顯色，酶標儀檢測A570nm-A630nm。細胞增殖抑制率=(A樣品-A空)/ (A對-A空)*100%。試驗結果(見圖8)表明MaAbNA抗體對A549細胞增殖具有顯著的抑制能力，該效果強于對照抗腫瘤藥物5-氟尿嘧啶。其對于MDA-MB-231細胞也有一定的抑制效果，而對于陰性細胞MCF-7增殖抑制能力較低。此外，MaAbNA對正常細胞L2幾乎沒有毒性，與此相對的是傳統抗腫瘤藥物阿霉素對L2細胞的毒性相當大。
[0027]為檢驗MaAbNA共價偶聯阿霉素后作為抗腫瘤復合藥物的細胞增殖抑制效果，以雙羧基聚乙二醇(PEG)為Iinker(HOOC-PEG-COOH)兩端分別連接MaAbNA和阿霉素上的氨基，形成以MaAbNA為靶向性“彈頭”，阿霉素為腫瘤殺傷藥物的復合腫瘤靶向治療藥物MaAbNA-阿霉素(結構為 MaAbNA-NH-CO-PEG-CO-NH-阿霉素)。A549、MDA-MB-231 細胞分別于37°C、5% CO2培養箱中培養，待長滿90%以上時，用0.25%胰蛋白酶液消化后，制備成單細胞懸液(完全生長培養基)，以3000個細胞/孔鋪96孔板，于37 °C，5% CO2培養箱中培養，24h后換用1% FBS的低血清培養液，然后加入梯度終濃度的MaAbNA-阿霉素，相同濃度梯度的阿霉素作為對照組藥物。試驗結果見圖9，顯示MaAbNA-阿霉素對A549和MDA-MB-231細胞的增殖抑制能力相較于阿霉素有了顯著的增強。該結果表明MaAbNA對于EGFRl或HER2陽性細胞的靶向能力能夠更好地使阿霉素進入腫瘤細胞，發揮出更強的腫瘤細胞殺傷能力。這證明了連接傳統化療藥物后的MaAbNA是一種高選擇性高效的抗腫瘤復合藥物。
[0028]6.體內治療實驗:
[0029]將24只腫瘤大小、體重相近的艾氏腹水(EAC)移植瘤分為4組，每組6只，分別給藥MaAbNA抗體、阿霉素、5-氟尿嘧啶、生理鹽水，給藥劑量均為6mg/kg，給藥方式為尾靜脈注射。試驗期間每2天給一次藥，測一次腫瘤直徑和體重，根據公式V = ab2/2計算腫瘤體積(a為腫瘤長徑，b為腫瘤短徑)，繪制腫瘤生長曲線，計算抑瘤率，觀察體重變化。同時根據小鼠的存活情況繪制存活 曲線。15天后處死小鼠，剝離腫瘤拍照并進行組織切片研究。在試驗中，MaAbNA展示了很好的治療效果，見圖10。研究結果表明:MaAbNA給藥組的腫瘤生長速率遠低于生理鹽水給藥組小鼠，其抑瘤率為45.7%，療效強于5-氟尿嘧啶，而略弱于阿霉素；相對于阿霉素給藥組小鼠明顯下降的體重和較高的死亡率，MaAbNA給藥組小鼠體重下降較不明顯，15天存活率為100%，這展現了其對正常細胞組織的低毒性。
[0030]為比較MaAbNA相對于EGFRl納米抗體和HER2親和抗體聯合使用的抑瘤率，EGFRl納米抗體和HER2親和抗體的混合溶液也被作為藥物注射到一組荷瘤小鼠中，每2天給一次藥。15天后處死小鼠，將腫瘤剝離并拍照。結果表明MaAbNA組抑瘤率為45.7%，大于聯合治療組的37.3%，圖11，這證明了 MaAbNA相對于EGFRl納米抗體和HER2親和抗體聯合使用更高的抑瘤效率。
[0031]綜上所述，激光共聚焦體內親和力試驗、體外EGF拮抗試驗、體內近紅外染料標記抗體荷瘤鼠靶向試驗、MTT細胞增殖抑制試驗、共價偶聯阿霉素后MaAbNA的MTT增值抑制試驗、艾氏腹水癌小鼠移植瘤治療試驗均證明了 MaAbNA的EGFR1/HER2靶向活性，對EGF結合EGFRl的競爭性拮抗作用，對正常組織細胞的低毒性，以及對EAC移植瘤小鼠的治療活性。
[0032]并且在以上試驗中MaAbNA體現了相較于EGFRl納米抗體、HER2親和抗體以及兩者聯合使用的活性優勢。究其原因，是因為當聯合使用EGFRl納米抗體和HER2親和抗體時，兩者之間的空間位阻會使其相互干擾，降低其分別結合EGFRl和HER2的效率。而MaAbNA設計了(G4S)3柔性肽連接雙功能結構域，有效避免了結構域之間的空間位阻，提高了其結合特異性受體的效率。
[0033] 本發明的MaAbNA抗體分子量小(僅29kD)、體內代謝快、腫瘤穿透力強，對正常組織細胞毒性低，對于EGFRl和HER2均有靶向性，具有對EGFR1/HER2陽性腫瘤生長的抑制能力，既可以作為一種高特異性腫瘤靶向探針，能夠攜帶熒光染料進行腫瘤診斷和治療，也可以單獨或與傳統化療藥物復合作為一種高效、小型化抗腫瘤藥物，具有良好的應用前景。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0034]圖1是本發明雙特異性抗體的結構設計示意圖
[0035]圖2是激光共聚焦分析A549、MDA-MB-231、MCF-7細胞對MaAbNA體外探針的攝取
[0036]圖3是MaAbNA相對于EGFRl納米抗體、HER2親和抗體以及兩種抗體聯合使用的體外親和力比較
[0037]圖4是MaAbNA競爭性拮抗EGF結合A549、MDA-MB-231細胞
[0038]圖5是MaAbNA體內探針靶向A549、MDA_MB_231、MCF-7細胞移植瘤
[0039]圖6是近紅外成像比較EGFRl納米抗體/HER2親和抗體聯合使用和MaAbNA的體內腫瘤靶向性
[0040]圖7是體內近紅外檢測MaAbNA在小鼠體內的代謝情況
[0041 ] 圖8是MTT試驗檢測MaAbNA對A549、MDA_MB_231、MCF-7、L2細胞的增殖抑制
[0042]圖9是MTT試驗檢測MaAbNA-阿霉素復合藥物對A549和MDA-MB-231細胞的增殖抑制
[0043]圖10是體內治療試驗，其中A為抑瘤率，B為剝離腫瘤照片，C為小鼠體重曲線，D為小鼠生存曲線，E為腫瘤組織切片分析
[0044]圖11是體內治療試驗中比較EGFRl納米抗體/HER2親和抗體聯合使用和MaAbNA的抑瘤率
[0045]圖12是雙特異性抗體的表達質粒構建示意圖
[0046]圖13是不同濃度咪唑HisTrap Ni2+柱洗脫液SDS-PAGE電泳分析，其中1、2、3、4、
5、6、7、8 分別為 0、5、10、20、50、100、500mmol/L 咪唑洗脫液
[0047]圖14是MaAbNA電泳分析分子量
[0048]圖15是MaAbNA紫外吸收
【具體實施方式】
[0049]實施例1
[0050]重組表達質粒pET22b_MaAbNA的構建:
[0051](I)EGFRl (基因編碼序列1_372)和HER2 (基因編碼序列420-804)特異性結構域的蛋白序列由文獻中獲得，通過(G4S) 3柔性肽將HER2特異性結構域和EGFRl特異性結構域依次串聯后，根據其整體氨基酸序列反推出DNA序列，并根據大腸桿菌偏好密碼子優化，即為SEQ ID No:2所示MaAbNA基因編碼序列。該重組基因序列在5’端和3’端分別引入限制性內切酶(BamHI和NcoI)酶切位點后由南京金斯瑞生物科技公司合成。基因合成采用化學合成法，其合成從SEQ ID No:2所示DNA序列的3’端堿基開始,具體反應步驟如下:[0052]①脫保護基
[0053]用三氯乙酸脫去連結在可控多孔玻璃(Controlled Pore Glass,CPG)固相合成柱上的核苷酸的保護基團二甲氧基三苯甲基(DMT)，獲得游離的5’ -羥基端，以供下一步縮合反應。
[0054]②活化
[0055]將亞磷酰胺保護的核苷酸單體與四氮唑活化劑混合并進入合成柱，形成亞磷酰胺四唑活性中間體(其3’ -端已被活化，但5’ -端仍受DMT保護)，此中間體將與GPG上的已脫保護基的核苷酸發生縮合反應。
[0056]③連接
[0057]亞磷酰胺四唑活性中間體遇到CPG上已脫保護基的核苷酸時，將與其5’ -羥基發生親合反應，縮合并脫去四唑，此時合成的寡核苷酸鏈向前延長一個堿基。
[0058]④封閉
[0059]縮合反應后為了防止連在CPG上的未參與反應的5’-羥基在隨后的循環反應中被延伸，通過乙酰化來封閉此端羥基，乙酰化試劑采用乙酸酐/N-甲基咪唑溶液。
[0060]⑤氧化
[0061]縮合反應時核苷酸單體是通過亞磷酯鍵與連在CPG上的寡核苷酸連接，而亞磷酯鍵不穩定，易被酸、堿 水解，用碘的四氫呋喃溶液將亞磷酰轉化為磷酸三酯，得到穩定的寡核苷酸。
[0062]經過以上五個步驟后，一個脫氧核苷酸就被連到CPG的核苷酸上，同樣再用三氯乙酸脫去新連上的脫氧核苷酸5’-羥基上的保護基團DMT后，重復以上的活化、連接、封閉、氧化過程至SEQ ID No:2所示DNA序列的5’端堿基為止，即可得到DNA片段粗品。經脫保護基和高效液相色譜(HPLC)純化后即可得到SEQ ID No: 2所示DNA序列片段。
[0063](2)合成基因序列和pET22b表達載體在37°C下均由BamHI和NcoI限制性內切酶雙酶切3小時。雙酶切后合成基因序列和pET22b表達載體以1:3的比例通過T4連接酶作用16°C下反應12小時后，MaAbNA基因序列被插入至pET22b表達載體，得到重組表達載體pET22b-MaAbNA，見圖 12。
[0064]實施例2
[0065]融合蛋白的表達純化與復性:
[0066](I)將重組質粒pET22b-MaAbNA轉化入大腸桿菌BL21star?(DE3)，用含Amp抗性的SOB平板篩選陽性克隆。轉化菌株在37°C，200rpm條件下培養過夜后，1:100轉接至新鮮LB培養基中，繼續培養至菌液OD值約為600，加入終濃度為lmmol/L IPTG誘導蛋白表達，5小時后終止誘導，將菌液離心并收集菌體。將誘導后的重組菌體重懸并超聲裂解后，取沉淀溶解于8mol/L尿素溶液中。
[0067](2)使用HisTrap Ni2+柱對MaAbNA重組蛋白包涵體進行純化，將包涵體溶液上樣后，依次用平衡緩沖液、5mmol/L、10mmol/L、20mmol/L、50mmol/L、100mmol/L>200mmol/L>500mmol/L咪唑洗脫，收集洗脫組分，SDS-PAGE電泳檢測后發現MaAbNA在100mmol/L咪唑洗脫液中，見圖13。在4°C條件下，將HisTrap Ni2+柱純化獲得的MaAbNA重組蛋白包涵體溶液通過梯度透析復性。復性蛋白經S印hadex G-75分子篩進一步純化。最終產物即為SEQID No:1所示的氨基酸序列。SDS-PAGE蛋白電泳分析其分子量為29kD，見圖14，紫外吸收光譜也只在波長280nm處有單吸收峰，圖15。
[0068]實施例3
[0069]MaAbNA-羅丹明B體外診斷探針的合成:
[0070](I)取羅丹明B4.79mg及(3_ 二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC) 2.1lmg兩者混合溶解于Iml 二甲基甲酰胺(DMF)后于室溫避光攪拌反應2小時。反應后溶液再加入1.38mg N-羥基丁二酰亞胺(NHS)和6mg MaAbNA繼續避光攪拌反應，12小時后停止反應。
[0071](2)反應產物上樣S印hadex G-75分子篩柱，并以PBS緩沖液(ρΗ8.0)沖柱，收集紅色聚集色帶。收集產物即為MaAbNA-羅丹明B體外診斷探針。
[0072]實施例4
[0073]MaAbNA-1CG體內診斷探針的合成
[0074](I)取ICGlOmg及(3_ 二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC) 2.1 Img兩者混合溶解于Iml 二甲基甲酰胺(DMF)后于室溫避光攪拌反應2小時。反應后溶液再加入1.38mg N-羥基丁二酰亞胺(NHS)和6mg MaAbNA繼續避光攪拌反應，12小時后停止反應。
[0075](2)反應產物上樣S印hadex G-75分子篩柱，并以PBS緩沖液(ρΗ8.0)沖柱，收集藍色聚集色帶。收集產物即為MaAbNA-羅丹明B體外診斷探針。
[0076]實施例5
[0077]MaAbNA-阿霉素抗腫瘤復合藥物的合成:
[0078](I)將其中一端羧基酯化保護后的雙羧基PEG200(結構為H00C-PEG-C0-0_CH2-CH3) 6.5mg與(3- 二甲氛基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC) 4.22mg兩者混合溶解于Iml 二甲基甲酰胺(DMF)后于室溫避光攪拌反應2小時，再加入2.76mg N-羥基丁二酰亞胺(NHS)和1.5mg阿霉素，避光攪拌反應6小時后將反應產物通過葡聚糖凝膠柱純化。
[0079](2)將純化產物pH用氫氧化鈉溶液調至12.0后,在80°C水浴鍋中反應5分鐘，以水解為保護雙羧基PEG —端羧基的酯鍵(反應后結構為阿霉素-PEG-COONa)。將反應后溶液用鹽酸調pH至7.0后，透析脫鹽并凍干。
[0080](3)取4mg凍干后產物與2.llmg(3_ 二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)混合溶解于Iml 二甲基甲酰胺(DMF)后于室溫避光攪拌反應2小時，再加入1.38mgN-羥基丁二酰亞胺(NHS)和6mg MaAbNA，避光攪拌反應12小時。
[0081](4)反 應產物上樣S印hadex G-75分子篩柱，并以PBS緩沖液(ρΗ8.0)沖柱，收集紅色聚集色帶。收集產物即為MaAbNA-阿霉素抗腫瘤復合藥物。
[0082]
【權利要求】
1.一種靶向抗腫瘤抗體，其序列為SEQ ID No:1所示的氨基酸序列。
2.一種腫瘤靶向探針，由權利要求1的抗腫瘤抗體與熒光染料羅丹明B通過共價鍵偶聯。
3.一種腫瘤靶向探針，由權利要求1的抗腫瘤抗體與近紅外染料通過共價鍵偶聯。
4.權利要求3的靶向探針，其中近紅外染料是吲哚菁綠。
5.一種腫瘤診斷試劑盒，含有權利要求2或3的靶向探針及輔料。
6.一種抗腫瘤藥物，由權利要求1的抗體和抗腫瘤藥物通過雙羧基聚乙二醇共價連接。
7.權利要求 2或3的靶向探針用于制備腫瘤診斷試劑盒的用途。
【文檔編號】A61K47/42GK103951754SQ201410117420
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年3月26日 優先權日:2014年3月26日
【發明者】顧月清, 丁笠 申請人:中國藥科大學