細辛總木脂素提取物及其提取方法和在制備減輕或抑制咳嗽藥物中的用途
【專利摘要】本發明屬于藥物【技術領域】，公開了一種細辛總木脂素提取物及其制備方法和用途。從細辛的根與/或根莖中用極性溶劑提取，濃縮干燥得到細辛總提物；將細辛總提物用水溶解后，上大孔吸附樹脂，用乙醇水溶液進行梯度洗脫，收集洗脫液，回收溶劑，干燥，即得含量為60wt%-80wt%的細辛總木脂素提取物，得率為8.4wt%。發明人通過大量的藥效學試驗首次證明細辛總木脂素提取物具有抑制咳嗽和降低咳嗽敏感性的作用，接近可待因的效果，而且發現具有抑制氣道炎癥、降低咳嗽次數及延長咳嗽潛伏期的作用，對各型咳嗽具有良好的預防和治療作用，可以用于制備治療咳嗽相關疾病的藥物。本發明活性明確、實驗材料來自原植物，成本低。
【專利說明】細辛總木脂素提取物及其提取方法和在制備減輕或抑制咳嗽藥物中的用途
【技術領域】
[0001]本發明屬于藥物【技術領域】，更具體而言，涉及一種細辛總木脂素提取物及其提取方法和在制備減輕或抑制咳嗽藥物中的用途。
【背景技術】
[0002]由于工作壓力、空氣環境污染等諸多因素影響，人類呼吸系統疾病的發病率居高不下，而咳嗽是呼吸系統常見病、多發病，是呼吸科門診的常見主訴。咳嗽本身是呼系統受到刺激時產生的一種防御性反射活動，是一種有益的動作，有時亦見于健康人群。一般情況下，對于輕度而不頻繁的咳嗽無須應用止咳藥便可自然緩解。此外，咳嗽對人體健康的影響亦是辯證的，也是一種病理性的反應，長期頻繁或過于激烈的咳嗽不僅會增加患者的痛苦，影響休息和睡眠，增加體力消耗，嚴重時還會促進疾病的發展，產生其他并發癥。
[0003]根據病程的不同，咳嗽可分為急性、亞急性與慢性咳嗽。急性咳嗽〈3周，亞急性咳嗽3-8周，慢性咳嗽>8周。I)急性咳嗽:目前一般認為急性上呼吸道病毒感染是最常見的病因，其他包括鼻炎、鼻竇炎、急性支氣管炎、慢性支氣管炎急性發作、支氣管哮喘等。上呼吸道感染最常見的病原體是鼻病毒、冠狀病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒、腺病毒和腸病毒等，其中以鼻病毒最常見。急性咳嗽也可能與哮喘、支氣管炎以及其他呼吸系統疾病的急性發作有關。臨床上，常可見到不少以急性咳嗽為前驅表現的傳染病或其他一些疾患；2)亞急性咳嗽:最常見原因是感染后咳嗽(又稱感冒后咳嗽)、細菌性鼻竇炎和哮喘等。作為病原體的病毒以鼻病毒多見，約占30%~50% ;其次為冠狀病毒和流感病毒，分別為10%~15%和5%~15%。除了呼吸道病毒外，肺炎支原體和肺炎衣原體等亦可導致感染后咳嗽；3)慢性咳嗽:臨床上通常將慢性咳嗽定義以咳嗽為唯一癥狀或主要癥狀、時間大于8周、胸部X線檢查無明顯異常者，稱為不明原因慢性咳嗽，簡稱慢性咳嗽。在專科門診中，慢性咳嗽的比例高達10%-38%。歐美各國的問卷調查顯示慢性咳嗽發生率也高達9%-33%。常見病因為嗜酸粒細胞性支氣管炎(EB)、上氣道咳嗽綜合征(UACS，原稱鼻后滴流綜合征(PNDS))、胃食管反流性咳嗽(GERC )、咳嗽變異性哮喘(CVA )等。
[0004]廣州呼吸疾病研究所2006年一項針對1087名大學生咳嗽的現場調查顯示，該群體咳嗽總發生率為10.9%，其中慢性咳嗽總發生率為3.3%，可以推測社區人群的咳嗽發生率將更高，這類患者的平均病程較長，有的甚至長達數十年。有資料顯示，全世界每年約有15%的成年人和10%的未成年人受到不同程度咳嗽的影響。因此，開發安全有效的止咳藥物將在滿足巨大市場需求的同時，創造出較好的社會效益和經濟效益。
[0005] 根據藥物作用機理的不同可將止咳藥物分為兩大類:第一類為中樞性鎮咳藥，這類藥物能直接選擇性的抑制延髓呼吸中樞而產生鎮咳作用，如嗎啡、可待因等，這類藥物鎮咳效果較好，但副作用明顯，可導致成癮性及呼吸抑制，甚至誘發幻覺、妄想或其它精神病癥狀等；第二類為外周性鎮咳藥，這類藥物通過抑制肺-迷走神經反射而阻斷咳嗽反射的傳入沖動，起到鎮咳作用，如苯丙哌林、磷酸苯丙哌林、莫吉斯坦等，多數為生物堿類藥物，可能會產生惡心、心悸、頭暈等不良反應。雖然臨床上用于鎮咳的藥物繁多，但很多慢性咳嗽患者用這些藥物治療并不能獲得有效的緩解。
[0006]中醫藥學是中華民族幾千來防病治病豐富實踐經驗的結晶，中醫能辨西醫不明之癥，中藥能治西藥難治和不治之癥，中醫中藥對咳嗽的治療有著悠久的歷史與豐富的經驗，可以與西醫西藥互為補充。雖然目前國內有很多治療咳嗽的中藥和中成藥，但這些藥物的有效組分、適應癥并不清楚。另外，對于不明原因且伴有氣道炎癥的慢性咳嗽患者，還沒有很好的治療藥物，因而研發副作用更小且能有效治療咳嗽的純天然中藥是從事呼吸系統疾病領域藥學工作者的首要任務。
[0007]中藥細辛，始載于《神農本草經》，列為上品。2010版《中國藥典》規定細辛來源為馬3?鈴科植物北細辛 Asarum Heterotropoids Fr.Schmidt var.mandshuricum (Maxim.)Kitag.、漢城細辛Asarum sieboldii Miq.var.seoulense Nakai 或華細辛Asarum sieboldiiMiq.的干燥根與根莖。性溫，味辛，歸心、肺、腎經。具有解表散寒、祛風止痛、通竅、溫肺化飲的功效，用于痰飲咳喘、風寒感冒、頭痛、牙痛、鼻塞流涕、鼻鼽、鼻淵、風濕痹痛的治療。古籍有細辛治咳的記載，《本經》謂:“細辛，主咳逆，頭痛腦動……利九竅”；《本草綱目》:“辛能泄肺，故風寒咳嗽上氣者宜用之”；《日華子本草》:“治咳……胸中結聚”；《長沙藥解》:“善降沖逆，專止咳嗽”；《藥性論》:“治咳逆上氣……”等。目前有關細辛止咳文獻報道大多數集中在揮發油中的甲基丁香酚成分(周慧秋.甲基丁香酚藥理作用研究.中醫藥學報.2000，(2):79-80)。我們前期研究發現:細辛揮發油對檸檬酸激發的急性咳嗽豚鼠模型具有明顯的鎮咳作用， 但對于香煙暴露下咳嗽高敏豚鼠模型鎮咳效果則明顯沒有細辛非揮發性成分細辛總木脂素好，且大劑量具有一定的副作用。此外，對于細辛非揮發性成分研究報道也較少，僅有報道從細辛根及根莖中分離得到非揮發性成分卡枯醇、1-細辛脂素、1-芝麻脂素、馬兜鈴酰胺1、山奈酚-3-0-葡萄糖苷等(蔡少青.北細辛非揮發性化學成分的研究.北京醫科大學學報.1996，28(3):228-230 ;呂帥.遼細辛地下部分的化學成分
(II).沈陽藥科大學學報.2010，27 (9):707-710 ;魏青春.漢城細辛化學成分的分離與鑒定.時珍國醫國藥.2010，21 (3):676-677)。目前尚未見有關細辛總木脂素的制備方法及含量測定的報道，更未見有關細辛總木脂素止咳活性的研究報道。
【發明內容】
[0008]針對以上現有技術的不足，本發明的首要目的在于提供一種具有鎮咳活性的細辛總木脂素提取物的提取方法。
[0009]本發明的又一目的在于提供上述提取方法得到的細辛總木脂素提取物。
[0010]本發明的再一目的在于提供上述細辛總木脂素提取物在制備減輕或抑制咳嗽藥物中的用途。
[0011]本發明目的通過以下技術方案實現:
[0012]一種細辛總木脂素提取物的提取方法，包括以下操作步驟:將細辛的根與/或根莖用極性溶劑提取，濃縮干燥得到細辛總提物；將細辛總提物用水溶解混懸后，上大孔吸附樹脂，用乙醇水溶液進行梯度洗脫，收集洗脫液，回收溶劑，干燥，即得細辛總木脂素提取物；所述梯度洗脫是采用乙醇體積百分比濃度為10%-50%的乙醇水溶液進行洗脫。
[0013]所述極性溶劑為水或體積百分比濃度為10%_100%的乙醇溶液，更加優選體積百分比濃度為50%-90%的乙醇溶液。
[0014]所述極性溶劑的重量是細辛的根與/或根莖重量的5-20倍。
[0015]所述細辛為北細辛、漢城細辛或華細辛，更加優選為北細辛。
[0016]所述大孔樹脂為LS-300、LS-300B、AB-8、D101、NKA-9、X-5、HPD-100 或 HPD-400。
[0017]一種由上述方法制備得到的細辛總木脂素提取物，所述細辛總木脂素提取物中木脂素含量為60wt%-80wt%，其中細辛脂素(asarinin)的含量為40wt%_50wt%。
[0018]上述細辛總木脂素提取物在制備減輕或抑制咳嗽藥物中的用途，所述細辛總木脂素提取物單獨或與其他藥物組合制備治療咳嗽藥物。
[0019]所述細辛總木脂素提取物與可用藥物載體制成各種劑型。
[0020]所述劑型為顆粒劑、片劑、膠囊劑、丸劑、滴丸劑、泡騰片、軟膏劑、糖漿劑、注射劑、口服液、合劑、酊劑、緩釋劑、控釋劑或靶向制劑。
[0021]藥學上可接受的載體如:填充劑、粘合劑、潤滑劑、崩解劑或潤濕劑。填充劑包括乳糖、蔗糖、玉米淀粉、山梨醇；粘合劑包括糖漿、阿拉伯膠、明膠、山梨醇、羥丙基甲基纖維素或聚乙烯吡咯烷酮；潤滑劑包括硬脂酸鎂；崩解劑包括淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、交聚維酮、微晶纖維素；潤濕劑如十二烷基硫酸鈉。
[0022]所述的細辛脂素(asarinin),即結構式為C2tlH18O6,化學式為2，6_bis(3, 4-methylened1xyphenyl) -3, 7-d1xabicyclo [3.3.0] octane 的化合物。
[0023]本發明可采用紫外分光光度法，以細辛脂素為對照品，在280nm波長處測定細辛總木脂素提取物中細辛有效總木脂素含量。
[0024]當色譜條件為:色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18 柱(4.6mmX 250mm, 5 μ m);流動相A相為水，B相為乙臆，梯度洗脫，洗脫程序為:0_30min, 45%-60%B, 30_40min, 60%-100%B ；運行時間:40min,平衡時間:1min ;體積流量:1.0mL/min ;檢測波長:285nm ;柱溫:30°C ；
進樣量:10 μ L，可測定細辛脂素的含量。
[0025]本發明具有鎮咳活性的細辛總木脂素提取物的有效劑量按照人的體重60kg來計算,為 2.5g-ll.0g/ 人.天。
[0026]本發明的原理是:
[0027]藥理實驗證明，本發明的細辛總木脂素提取物具有良好的減輕和/或抑制咳嗽的活性，可用于預防或治療各型咳嗽。
[0028]藥效學試驗結果表明，對于豚鼠急性咳嗽模型，檸檬酸激發后細辛總木脂素提取物低、中、高劑量組與空白對照組相比可延長動物的咳嗽潛伏期，降低豚鼠的咳嗽次數；與細辛總揮發油相比細辛總木脂素對豚鼠的急性鎮咳活性相對較弱；而對于慢性咳嗽敏感性增高并伴有氣道炎癥的豚鼠模型(香煙暴露14天)，檸檬酸激發后細辛總木脂素提取物低、中、高劑量組與模型組相比可明顯延長動物的咳嗽潛伏期，降低豚鼠的咳嗽次數，同時可以降低豚鼠BALF中的炎癥細胞總數及中性粒細胞的比例，抑制氣道炎癥，達到或接近可待因的效果；與細辛總提取物及細辛總揮發油相比，細辛總木脂素提取物中、高劑量組鎮咳率均具有顯著性差異(P〈0.05)，顯示細辛總木脂素提取物對長期香煙暴露下的咳嗽高敏豚鼠模型具有更好的鎮咳活性。
[0029]本發明的有益效果是:
[0030](I)本發明為目前鎮咳藥物提供了一種全新的選擇和思路，拓展了鎮咳藥物的選擇領域，也為該【技術領域】的發展做出了貢獻。
[0031](2)本發明首次證明細辛總木脂素提取物具有顯著的鎮咳效果，可以降低咳嗽敏感性和抑制氣道炎癥的作用，且無成癮性。
[0032](3)本發明首次提供的細辛總木脂素提取物的制備工藝能有效的富集并去除雜質，其細辛總木脂素得率及含量高，質量控制可以通過紫外分光光度法和高效液相色譜法進行含量測定分析，該方法簡單易行可控。
[0033](4)本發明提供的提取物制備方法簡單、快捷、重現性好；所選用的溶劑低廉、無毒。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0034]圖1細辛總木脂素提取物對急性咳嗽豚鼠模型咳嗽次數的影響η=8)，其中A:空白組；Β:溶劑組(質量分數0.5%CMC-Na) ；C:硫酸可待因30mg/kg組；D細辛總木脂素200mg/kg組；E:細辛總木脂素400mg/kg組；F:細辛總木脂素800mg/kg組；G:細辛總提取物1600mg/kg組；H:細辛總揮發油200mg/kg組；與空白組相比:*ρ〈0.05，**ρ〈0.01，***ρ〈0.001。
[0035]圖2細辛總木脂素提取物對慢性咳嗽高敏豚鼠模型咳嗽次數的影響CF士S，η=8),其中A:空白組；Β:模型組；C:溶劑組(質量分數0.5%CMC-Na)；D:硫酸可待因30mg/kg組；E細辛總木脂素200mg/kg組；F:細辛總木脂素400mg/kg組；G:細辛總木脂素800mg/kg組；H:細辛總提取物1600mg/kg組；1:細辛總揮發油200mg/kg組；與模型組相比廣*p〈0.001 ；與細辛總提取物組相比:AP〈0.05 ;與細辛總揮發油組相比#p〈0.05。
[0036]圖3細辛總木脂素提取物對慢性咳嗽高敏豚鼠模型肺組織病理代表圖(HE染色，X200)，其中A:空白組；B:模型組；C:溶劑組(質量分數0.5%CMC-Na) ；D:硫酸可待因30mg/kg組；E細辛總木脂素200mg/kg組；F:細辛總木脂素400mg/kg組；G:細辛總木脂素800mg/kg組；H:細辛總提取物1600mg/kg組；1:細辛總揮發油200mg/kg組。
[0037]圖4細辛總木脂素提取物對慢性咳嗽高敏豚鼠模型氣管組織病理代表圖(HE染色，X200)，其中A:空白組；B:模型組；C:溶劑組(質量分數0.5%CMC-Na) ；D:硫酸可待因30mg/kg組；E細辛總木脂素200mg/kg組；F:細辛總木脂素400mg/kg組；G:細辛總木脂素800mg/kg組；H:細辛總提取物1600mg/kg組；1:細辛總揮發油200mg/kg組。
【具體實施方式】
[0038]下面結合附圖和具體實施例對本發明作進一步詳細描述，但不作為對本發明的限定。
[0039]實施例1
[0040]細辛總木脂素提取物制備
[0041] 干燥的細辛根與/或根莖5kg,用藥材重量10倍量的體積百分比濃度70%的乙醇溶液，加熱回流提取三次，每次2h，提取液減壓干燥，得細辛總提物，得率為12.3wt% ;用水混懸細辛總提物后，上LS-300B大孔吸附樹脂柱，3BV的水洗脫除去雜質，再用1BV的體積百分比濃度50%乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮、干燥，即得細辛總木脂素提取物421g，得率為8.4wt%,細辛總木脂素含量為65wt%。[0042]實施例2
[0043]細辛總木脂素提取物對檸檬酸所致豚鼠咳嗽的急性鎮咳作用
[0044]I實驗材料
[0045]實驗動物:普通級Hartley豚鼠，雌雄各半，體重250_350g，由廣東省醫學實驗動物中心提供，動物合格證號=SCXK (粵)2008-0002。
[0046]試劑與儀器:一水合檸檬酸(廣州化學試劑廠，批號:20121001-2),用時配制成
0.8M的生理鹽水溶液；動物無創Buxco肺功能檢測系統(美國Buxco公司);Aeroneb Pro霧化器(Aerogen (愛爾蘭)有限公司)；灌胃針(廣東省醫學實驗動物中心)。
[0047]2實驗方法
[0048]采用檸檬酸誘導豚鼠急性咳嗽模型進行藥效評價。取128只Hartley豚鼠，將其逐一置于動物無創Buxco肺功能檢測系統6L體描儀內，偏流儀空氣流速2.5L/min,使用Aeroneb Pro霧化器通入霧化的0.8M的檸檬酸超純水溶液氣溶膠lmin，霧化的粒子平均直徑2.5 μ m，觀察5min，監測6min內的咳嗽次數，咳嗽的聲音由室內放置的麥克風記錄和放大，聲波經B1system XA軟件進行分析,再經電腦軟件處理聲音數據記錄咳嗽次數，同時由經過訓練的觀察者補充觀察。挑選咳嗽次數大于10次的豚鼠為合格動物進行試驗。
[0049]取篩選合格的64只Hartley豚鼠,雌雄各半，隨機分成8組,空白組給予lmL/kg的生理鹽水，溶劑組給予等體積的相應溶劑(質量百分比濃度0.5%的CMC-Na水溶液)，陽性藥組給予等體積的30mg/kg磷酸可待因，給藥組給予等體積的細辛木脂素提取物(實施例1樣品 200mg/kg、400mg/kg、800mg/kg)、細辛總提取物(1600mg/kg)、細辛總揮發油(200mg/kg,常規水蒸汽蒸懼制備所得)，每天I次，連續給藥3天。末次給藥后2h在動物無創Buxco肺功能檢測系統進行檸檬酸霧化激發試驗(霧化條件同前)，霧化激發lmin，誘導豚鼠產生急性咳嗽，觀察5min，計算6min內的咳嗽次數(N)、咳嗽潛伏期，并用公式“鎮咳率=(Nsot照_N給藥組)/N空白對照X 100%計算各給藥組的鎮咳率。
[0050]數據用f ±S表示，采用IBM SPSS Statisticsl9.0統計軟件對各組參數進行單因素方差分析。進行組間比較，P〈0.05為有顯著性差異。
[0051]3實驗結果
[0052](I)細辛總木脂素提取物對急性咳嗽豚鼠模型咳嗽次數的影響
[0053]各組動物經過檸檬酸霧化激發后6min內的咳嗽次數及咳嗽抑制率見表1及圖
1。由表1及圖1可知，與空白組相比，細辛總木脂素提取物低、中、高劑量組均可以顯著降低豚鼠的咳嗽次數，其中低劑量組具有顯著性差異(P〈0.05)，中、高劑量具有極顯著性差異(p〈0.01)，鎮咳率分別達到30%、39.6%和44.4%。細辛總提取物在1600mg/kg劑量時鎮咳率為39.2%，而細辛木脂素提取物中、高劑量組在400mg/kg、800mg/kg劑量時鎮咳活性較總提取物為高，進而說明細辛總木脂素是細辛鎮咳的主要活性組分之一，細辛總木脂素提取物與細辛總提取物之間無顯著性差異。細辛總揮發油對于豚鼠的急性鎮咳活性均比細辛總提取物及細辛總木脂素好(鎮咳率53.8%)，但三者之間均無顯著性差異。
[0054]以上結果表明，細辛總木脂素提取物具有良好的急性鎮咳作用，并具量效關系，且用藥相對安全。
[0055]表1細辛總木脂素提取物對急性咳嗽豚鼠模型咳嗽次數的影響(f±S, n=8)
[0056]
【權利要求】
1.一種細辛總木脂素提取物的提取方法，其特征在于包括以下操作步驟:將細辛的根與/或根莖用極性溶劑提取，濃縮干燥得到細辛總提物；將細辛總提物用水溶解混懸后，上大孔吸附樹脂，用乙醇水溶液進行梯度洗脫，收集洗脫液，回收溶劑，干燥，即得細辛總木脂素提取物；所述梯度洗脫是采用乙醇體積百分比濃度為10%-50%的乙醇水溶液進行洗脫。
2.根據權利要求1所述的提取方法，其特征在于:所述極性溶劑為水或體積百分比濃度為10%-100%的乙醇溶液。
3.根據權利要求2所述的提取方法，其特征在于:所述乙醇溶液的體積百分比濃度為50%-90%。
4.根據權利要求1所述的提取方法，其特征在于:所述極性溶劑的重量是細辛的根與/或根莖重量的 5-20 倍；所述大孔樹脂為 LS-300、LS-300B、AB-8、D101、NKA-9、X-5、HPD-100或 ΗΗ)-400。
5.根據權利要求1所述的提取方法，其特征在于:所述細辛為北細辛、漢城細辛或華細辛。
6.根據權利要求5所述的提取方法，其特征在于:所述細辛為北細辛。
7.一種由權利要求1-6任一項所述方法制備得到的細辛總木脂素提取物，其特征在于:所述細辛總木脂素提取物中木脂素含量為60wt%-80wt%，其中細辛脂素的含量為40wt%-50wt%o
8.根據權利要求7所述的一種細辛總木脂素提取物在制備減輕或抑制咳嗽藥物中的用途，其特征在于:所述細辛總木脂素提取物單獨或與其他藥物組合制備治療咳嗽藥物。
9.根據權利要求8所述的用途，其特征在于:所述細辛總木脂素提取物與可用藥物載體制成各種劑型。
10.根據權利要求8所述的用途，其特征在于:所述劑型為顆粒劑、片劑、膠囊劑、丸劑、滴丸劑、泡騰片、軟膏劑、糖漿劑、注射劑、口服液、合劑、酊劑、緩釋劑、控釋劑或靶向制劑。
【文檔編號】A61K36/268GK104027374SQ201410114814
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年3月25日 優先權日:2014年3月25日
【發明者】賴克方, 劉曉東, 鐘伯年, 聶怡初, 鐘山 申請人:廣州醫科大學附屬第一醫院, 廣州呼吸疾病研究所