人類免疫缺陷病毒抑制劑或藥物增敏劑的篩選方法

人類免疫缺陷病毒抑制劑或藥物增敏劑的篩選方法
【專利摘要】本發明涉及以ERK和HDAC1為聯合靶標，篩選抑制人類免疫缺陷病毒（HIV）的抑制劑的方法，以及該方法篩選獲得的小分子化合物、蛋白或功能性多肽片段、聚合物、功能性核酸片段、抗體或抗體的功能片段抑制劑，還涉及由通過所述聯合靶標篩選獲得的抑制劑在制備抑制HIV病毒的藥物中的應用，以及所述聯合靶標篩選獲得的抑制劑在制備HIV治療藥物的增敏劑中的應用。
【專利說明】人類免疫缺陷病毒抑制劑或藥物增敏劑的篩選方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及染料木素抑制人類免疫缺陷病毒的復制及潛伏，以及作為聯合使用藥物增加臨床使用的逆轉錄酶抑制劑藥效的應用。
【背景技術】
[0002]人類免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus, HIV)是單鏈RNA病毒,其基因組全長9.7kb，屬于逆轉錄病毒科慢病毒屬。人類免疫缺陷病毒感染可引起獲得性免疫綜合癥(acquired immunodeficiency syndrome, AIDS),目前,被人類免疫缺陷病毒感染的人群已達3千4百萬人，并以每年2百50萬人新發感染的速度增加，在這些被感染的人群中，每年有2百萬人患獲得性免疫綜合癥。在人類免疫缺陷病毒感染嚴重的國家和地區，被感染人數已占總人數的67%，并且超過70%的死亡是由人類免疫缺陷病毒感染引起的，嚴重威脅人類健康。
[0003]目前，已有超過25種抗逆轉錄病毒藥物被批準用于臨床治療人類免疫缺陷病毒感染，雖然這些藥物對人類免疫缺陷病毒感染引發的獲得性免疫綜合癥具有一定的緩解作用，但是其效果相當有限，原因之一是因為大多數藥物僅針對特定的病毒蛋白靶點，而RNA病毒基因組的高突變率導致耐藥毒株的產生和宿主免疫系統的逃逸效果，更進一步的，抗人類免疫缺陷病毒的靶標蛋白主要集中在逆轉錄酶、蛋白酶、gp41跨膜蛋白和整合酶中，限制了抗病毒藥物的靶標數量。
[0004]另一方面，雖然同時使用多種抗病毒藥物的療法(highly activeantiretroviral therapy,HAART)會比單一使用一種抗病毒藥物的療法療效明顯,但是,也會促進病毒感染進入潛伏期，這時病毒復制速度較慢，新生病毒粒子少，抗病毒藥物無明顯療效，而一旦停藥或產生耐藥突變株，病毒就會大量復制使病情加重，這也是獲得性免疫綜合癥病人終身服藥和導致死亡的主要原因。
[0005]目前，不同于傳統的抗人類免疫缺陷病毒藥物的開發策略，一些較為新穎的抗人類免疫缺陷病毒藥物開始著眼于不同的角度來優化現有藥物和療法中存在的弊端，例如通過抑制特定的病毒生命周期所需要的細胞因子或信號轉導途徑，或是降低現有藥物的用量以減緩藥物壓力產生突變株的數量和時間。
[0006]病毒的復制和傳播是一個與宿主細胞相互作用的過程，大量的宿主細胞蛋白參與到病毒的生活周期中。在人類免疫缺陷病毒的復制過程中，胞外信號調節激酶(ERK)是病毒逆轉錄及基因組整合過程中所需的宿主細胞因子，目前文獻報道減少的胞外信號調節激酶導致病毒逆轉錄及基因組整合效率顯著降低，并且胞外信號調節激酶也整合進入成熟病毒粒子中，宿主細胞中降低表達的胞外信號調節激酶導致其整合進入病毒粒子中的效率降低，使得新生病毒粒子毒力減弱。另外，組蛋白去乙酰化酶I (HDACl)是已整合病毒進入潛伏期所必需的，組蛋白 去乙酰化酶I調節染色質構象，對病毒LTR表達十分重要。已有文獻表明，組蛋白去乙酰化酶I的抑制劑可以有效地增加病毒基因的表達從而防止病毒進入潛伏期。[0007]雖然胞外信號調節激酶通過調控病毒逆轉錄和整合過程而影響人類免疫缺陷病毒的復制和擴散及組蛋白去乙酰化酶I通過調控人類免疫缺陷病毒LTR表達而防止病毒進入潛伏期的基礎功能都已被闡明。但是，并未有任何報道表明，存在某一化合物，能夠同時調控ERK和HDACl的分子效應。而同時，并未出現某一化合物通過調控ERK能顯著提高已有藥物抗病毒療效的報道。
[0008]基于宿主細胞因子在人類免疫缺陷病毒復制和擴散中的重要作用，本發明人通過篩選，發現黃酮類小分子化合物的典型化合物染料木素在抑制人免疫缺陷病毒中的獨特效果，通過對其分子靶標的鑒定，結合相關的功能驗證，證實了這一小分子通過降低ERK和HDACl蛋白表達，抑制人類免疫缺陷病毒復制和擴散，并可在聯合使用時，顯著提高已有抗病毒藥物的藥效。為針對HIV病毒的藥物開發工作，提供了一種全新的思路。
[0009]下列參考文獻作為【背景技術】的參考，以其公開的內容引入本申請:
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【發明內容】

[0023]本發明涉及胞外信號調節激酶(ERK)、組蛋白去乙酰化酶I (HDACl)作為聯合靶標在篩選抑制人類免疫缺陷病毒(HIV)的抑制劑中的應用。
[0024] 本發明還涉及以ERK和HDACl為聯合靶標，篩選抑制人類免疫缺陷病毒(HIV)的抑制劑的方法，其特征在于，篩選得到的抑制劑同時降低:(I)胞外信號調節激酶(ERK)的轉錄/翻譯水平或磷酸化激活水平；(2)組蛋白去乙酰化酶I (HDACl)的轉錄/翻譯水平。
[0025]所述的抑制劑包括但不限于，小分子化合物、蛋白或功能性多肽片段、聚合物、功能性核酸片段、抗體或抗體的功能片段。
[0026]本發明還涉及通過所述篩選方法獲得的抑制劑，所述抑制劑優選為染料木素。
[0027]本發明還涉及通過所述聯合靶標篩選獲得的抑制劑在制備抑制HIV病毒的藥物中的應用。所述的抑制劑優選為染料木素。
[0028]本發明還涉及胞外信號調節激酶(ERK)、組蛋白去乙酰化酶I (HDACl)作為聯合靶標在篩選HIV治療藥物的增敏劑中的應用。
[0029]本發明還涉及以ERK和HDACl為聯合靶標，篩選抑制人類免疫缺陷病毒(HIV)治療藥物增敏劑的方法，其特征在于，篩選得到的增敏劑同時降低:(1)胞外信號調節激酶(ERK)的轉錄/翻譯水平或磷酸化激活水平；(2)組蛋白去乙酰化酶I (HDACl)的轉錄/翻譯水平。
[0030]所述的藥物增敏劑包括但不限于，小分子化合物、蛋白或功能性多肽片段、聚合物、功能性核酸片段、抗體或抗體的功能片段。
[0031]所述的HIV治療藥物為針對HIV的蛋白酶抑制劑、針對HIV的核苷類/非核苷類逆轉錄酶抑制劑，優選為齊夫多定(Zidovudine)、奈韋拉平(Nevirapine)。
[0032]本發明還涉及通過所述的聯合靶標篩選獲得的HIV治療藥物增敏劑，所述增敏劑優選為染料木素。
[0033]本發明還涉及通過所述聯合靶標篩選獲得的化合物在制備HIV治療藥物的增敏劑中的應用。所述的增敏劑優選為染料木素。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0034]圖1.染料木素對人類免疫缺陷病毒的抑制效果(圖1A.染料木素對人類免疫缺陷病毒侵染影響的柱狀圖、圖1B.染料木素對人類免疫缺陷病毒蛋白p24表達影響的柱狀圖、圖1C.染料木素對人類免疫缺陷病毒蛋白p24表達影響的定量效果圖)。
[0035]圖2.染料木素對人類免疫缺陷病毒復制影響的柱狀圖(圖2A.染料木素對人類免疫缺陷病毒逆轉錄和整合影響的柱狀圖、圖2B.染料木素對人類免疫缺陷病毒感染毒力影響的柱狀圖)。
[0036]圖3.染料木素對調節人類免疫缺陷病毒基因表達影響的柱狀圖。
[0037]圖4.染料木素對ERK和HDACl蛋白表達影響的效果圖。
[0038]圖5.染料木素對增加已有抗人類免疫缺陷病毒藥物藥效的效果圖。
【具體實施方式】
[0039]細胞及培養方法、病毒株、化合物
[0040]1、人胚腎上皮細胞(293T，ATCC N0.CRL-3216? ;永生化人胚腎上皮細胞，由上海細胞庫提供)培養于含10%胎牛血清(美國PAA公司)、青霉素和鏈霉素各100U/ml的DMEM培養基中(Gibico公司)，5%0)2、371: (FIL-TER型培養箱，德國Thermo公司)。
[0041]2、人宮頸上皮細胞(HeLa，ATCC N0.CCL-2? ;人宮頸腺癌上皮細胞，由上海細胞庫提供)培養于含10%胎牛血清(美國PAA公司)、青霉素和鏈霉素各100U/ml的DMEM培養基中(Gibico 公司)，5%0)2、37。。(FIL-TER 型培養箱，德國 Thermo 公司)。
[0042]3、人外周血T細胞(Jurkat，ATCC N0.TIB-152? ;人外周血白血病T細胞，由上海細胞庫提供)培養于含10%胎牛血清(美國PAA公司)、青霉素和鏈霉素各100U/ml的RPMI1640培養基中(Gibico公司)，5%0)2、371: (FIL-TER型培養箱，德國Thermo公司)。
[0043]4、人原代外周血單核細胞(PBMC，由血液中心捐贈者血液中提取)培養于含10%胎牛血清(Gibico公司)不含抗生素的RPM1-1640培養基中，5%C02、37°C (FIL-TER型培養箱，德國Thermo公司)。
[0044]5、人類免疫缺陷病毒假病毒NL4-3及VSV-G包裝質粒，用于包裝HIV-VSVG假病毒，由中國科學院生物物理研究所提供。
[0045]6、人類免疫缺陷病毒HIV-VSVG假病毒包裝方法:由轉染293T細胞人類免疫缺陷病毒NL4-3及VSV-G假病毒包裝質粒獲得。制備方法為:將293T細胞以70%豐度接種于IOcm細胞培養皿中，培養24小時。使用lipofectmin2000轉染試劑，將總量為24yg的NL4-3質粒與VSV-G質粒以4:1比例共同轉染培養于OPT1-MEM培養基中的293T細胞，6小時后將培養基換為DMEM培養基補充10%FBS，繼續培養至48小時，收集細胞上清，除去細胞碎片后存于_80°C備用。人類免疫缺陷病毒NL4-3假病毒普遍用于人類免疫缺陷病毒的科學研究。
[0046]7、染料木素由山西惠科公司購買。
[0047]8、ERK及HDACl抑制劑均購于sigma公司。
[0048]9、其他試劑或原材料如無特別說明，為本領域常規試劑或原材料，純度為分析純。
[0049]其他說明
[0050]以下實施例中使用NL4-3及VSV-G假病毒包裝質粒制備的HIV-VSVG假病毒評價染料木素對逆轉錄病毒基因表達，病毒感染毒力及病毒逆轉錄和基因組整合過程的抑制作用。NL4-3假病毒包裝質粒中插入熒光素酶基因作為報告基因，該基因經過假病毒制備過程被包裝入HIV-VSVG假病毒粒子中，只有在假病毒成功感染宿主細胞并將其基因組整合于宿主基因組中時，該基因 才會表達，所以被廣泛用于檢測逆轉錄病毒的基因表達水平和病毒感染毒力。另外，逆轉錄病毒如HIV，在將其基因組整合進入宿主細胞基因組過程前需要進行逆轉錄過程，將其RNA基因逆轉錄為DNA。如果此過程不能完成，則在宿主細胞基因組中無法檢測到報告基因的表達，因此，熒光素酶基因也用于表征病毒逆轉錄和基因整合水平。GAPDH作為宿主細胞的組成型表達基因，不存在于病毒粒子中，熒光素酶/GAPDH的比值將宿主細胞數目和基因表達水平差異均一化，更準確地反應出病毒基因表達水平的差異。
[0051]實施例一、染料木素對人類免疫缺陷病毒的抑制效果
[0052]1.1luciferase檢測法,使用Iuciferase檢測法檢測染料木素抗人類免疫缺陷病毒效果，將293T細胞接種于96孔板中(10000細胞/孔)，將100 μ M染料木素加入培養基中，并加入100 μ I的HIV-VSVG假病毒(lxl07IFU/ml)，孵育24小時后，檢測Iuciferase表達量。結果見圖1A。可見，染料木素具有顯著地抗人類免疫缺陷病毒感染作用。
[0053]1.2Elisa法檢測人類免疫缺陷病毒蛋白p24表達，將豐度90%的A549細胞用
0.25%的胰蛋白酶消化后將細胞于70%豐度接種于96孔培養板，細胞貼壁24小時后，除去培養基，PBS (pH=7.0)沖洗細胞一次，加入100 μ I的HIV-VSVG假病毒(lxl07IFU/ml)及100 μ M染料木素培養24小時。使用ρ24檢測試劑盒檢測ρ24表達量，結果如圖1Β。該結果進一步證明了染料木素具有抑制人類免疫缺陷病毒感染作用。
[0054]1.3使用免疫蛋白印跡法檢測人類免疫缺陷病毒I型核心蛋白蛋白ρ24 (通常用來表征病毒感染)表達量與染料木素濃度的量效關系，將豐度90%的Α549細胞用0.25%的胰蛋白酶消化后將細胞于70%豐度接種于24孔培養板，細胞貼壁24小時后，除去培養基，PBS (ρΗ=7.0)沖洗細胞一次，每孔加入500 μ I的HIV-VSVG假病毒(lxl07IFU/ml )，并加入不同濃度梯度的染料木素(O μ Μ，10 μ Μ, 25 μ Μ, 50 μ M和100 μ Μ)培養24小時。收集蛋白，使用免疫蛋白印跡法檢測Ρ24蛋白表達量，結果如圖1C所示。該結果進一步證明了 ρ24蛋白表達水平與染料木素濃度具有劑量依賴性。
[0055]實施例二、染料木素對人類免疫缺陷病毒逆轉錄和整合過程的影響
[0056]2.1293Τ，HeLa, Jurkat和PBMC細胞于70%豐度接種于24孔培養板，細胞貼壁24小時后，除去培養基，PBS (ρΗ=7.0)沖洗細胞一次，加入HIV-VSVG假病毒粒子500 μ I(lxl07IFU/ml)及50 μ M或100 μ M染料木素(10 μ M ERK抑制劑-U0126作為對照)，37°C孵育細胞24小時。提取細胞基因組，對其基因組做RT-PCR分析。結果顯示，對ERK的抑制明顯降低人類免疫缺陷病毒的逆轉錄和基因組整合過程，100 μ M和50 μ M的染料木素對人類免疫缺陷病毒的逆轉錄和基因組整合過程有不同程度的抑制作用，具體結果見圖2Α，上述實驗表明，染料木素對人類免疫缺陷病毒的逆轉錄和基因組整合過程具有抑制作用。
[0057]2.2染料木素對人類免疫缺陷病毒感染毒力影響
[0058]將豐度為70%的293Τ細胞接種于24孔板中，培養24小時。使用lipofectmin2000轉染試劑將總量為2 μ g的NL4-3與VSV-G質粒以4:1比例轉染培養于OPT1-MEM培養基中的293T細，用于包裝HIV-VSVG假病毒，6小時后將培養基換為DMEM補充10%FBS，并分別加入0μΜ，50μΜ或100μΜ染料木素，使用10 μ M U0126作為對照。細胞培養48小時后，收集細胞上清并分別接種于293Τ，HeLa, Jurkat及PBMC細胞中，細胞繼續培養24小時，提取細胞基因組，使用RT-PCR法檢測其拷貝數。結果顯示對比U0126抑制劑，50 μ M和100μΜ染料木素都不同程度降低HIV-VSVG假病毒拷貝數，結果如圖2Β所示，上述實驗表明，染料木素對人類免疫缺陷病毒感染毒力具有抑制作用。
[0059]實施例三、染料木素對調節人類免疫缺陷病毒基因表達的影響[0060]將293T，HeLa, Jurkat和PBMC細胞于70%豐度接種于24孔培養板，細胞貼壁24小時后，除去培養基，PBS (pH=7.0)沖洗細胞一次，加入HIV-VSVG假病毒粒子500 μ I(lxl07IFU/ml)培養24小時后，去除培養上清，加入DMEM培養基補充2%FBS并加入O μ M，
50μ M或100 μ M染料木素(I μ M和500nMHDACl抑制劑-SAHA作為對照)，37°C孵育細胞24小時。提取細胞RNA，使用RT-PCR法檢測HIV-VSVG假病毒基因的表達。結果顯示50 μ M或100 μ M染料木素，1 μ M或500nM SAHA都對HIV-VSVG假病毒基因表達起到促進作用，結果如圖3所示，說明染料木素具有提高HIV-VSVG假病毒基因表達作用。
[0061]實施例四、染料木素對ERK和HDACl蛋白表達的影響
[0062]將293Τ，HeLa，Jurkat和PBMC細胞于70%豐度接種于6孔培養板，細胞貼壁24小時后，除去培養基，PBS (pH=7.0)沖洗細胞一次，加入O或100 μ M染料木素孵育24小時，收集各細胞蛋白檢測染料木素對ERK蛋白表達和激活及HDACl蛋白表達的影響。結果如圖4所示，在293Τ，HeLa, Jurkat和PBMC細胞中，染料木素對ERK蛋白表達和激活(激活的ERK蛋白即磷酸化的ERK蛋白，圖4中用p-ERK表示)均有不同程度的抑制作用，對HDACl蛋白表達也具有抑制作用。
[0063]實施例五、染料木素對增加已有抗人類免疫缺陷病毒藥物(Zidovudine，ZDV及Nevirapine, NVP)藥效的效果
[0064]將293T，HeLa, Jurkat和PBMC細胞于70%豐度接種于24孔培養板，細胞貼壁24小時后，除去培養基，PBS (pH=7.0)沖洗細胞一次，加入HIV-VSVG假病毒粒子500 μ I(lxl07IFU/ml)及如下組別的抑制劑:
[0065](I) 100μΜ 染料木素；
[0066](2) IyMZDV;
[0067](3) 100μΜ 染料木素和 I μ M ZDV ；
[0068](4) 10 μ M ZDV ；
[0069](5) ΙμΜ NVP ；
[0070](6) 100μΜ 染料木素和 I μ M NVP ；
[0071](7)10yMNVP。
[0072]37°C孵育細胞24小時。提取細胞基因組，對其基因組做RT-PCR分析。結果如圖5所示，染料木素與ZDV或NVP聯合使用時可顯著提高其藥效。
【權利要求】
1.以ERK和HDACl為聯合靶標，篩選抑制人類免疫缺陷病毒(HIV)的抑制劑的方法，其特征在于，篩選得到的抑制劑同時降低: (1)胞外信號調節激酶(ERK)的轉錄/翻譯水平或磷酸化激活水平； (2)組蛋白去乙酰化酶I(HDACl)的轉錄/翻譯水平。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的抑制劑為小分子化合物、蛋白或功能性多肽片段、聚合物、功能性核酸片段、抗體或抗體的功能片段。
3.根據權利要求1所述方法篩選獲得的針對HIV病毒的抑制劑，所述的抑制劑優選為染料木素。
4.權利要求3所述的抑制劑在制備抗HIV病毒的藥物中的應用。
5.以ERK和HDACl為聯合靶標，篩選抗人類免疫缺陷病毒(HIV)的藥物的增敏劑的方法，其特征在于，篩選得到的增敏劑同時降低: (1)胞外信號調節激酶(ERK)的轉錄/翻譯水平或磷酸化激活水平； (2)組蛋白去乙酰化酶1(HDACl)的轉錄/翻譯水平。
6.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述的增敏劑為小分子化合物、蛋白或功能性多肽片段、聚合物、功能性核酸片段、抗體或抗體的功能片段。
7.根據權利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述的抗HIV的藥物為針對HIV的蛋白酶抑制劑、針對HIV的核苷類/非核苷類逆轉錄酶抑制劑，優選為齊夫多定(Zidovudine)、奈韋拉平(Nevirapine)。
8.根據權利要求6或7所述的方法篩選獲得的增敏劑，優選為染料木素。
9.根據權利要求6或7所述的方法篩選獲得的增敏劑在制備抗HIV藥物增敏劑中的應用，所述的增敏劑優選為染料木素。
10.胞外信號調節激酶(ERK)、組蛋白去乙酰化酶I(HDACl)作為聯合靶標在篩選， (1)抑制人類免疫缺陷病毒(HIV)的抑制劑； (2)抗HIV藥物的增敏劑； 中的應用。
【文檔編號】A61P31/18GK103877595SQ201410108246
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年3月21日 優先權日:2014年3月21日
【發明者】梁偉, 董文娟, 張春玲, 魏秀莉, 黃峰 申請人:中國科學院生物物理研究所