糖基化抗體的制作方法
【專利摘要】本發明提供了人IgG1或IgG3型抗體及其用途，所述抗體在Asn297處被糖鏈糖基化，其特征在于所述糖鏈內巖藻糖的量至少為99％，此外，NGNA的量為1％或以下，和/或N-末端α-1，3-半乳糖的量為1％或以下。
【專利說明】糖基化抗體
[0001]本申請為2007年4月10日提交的、發明名稱為“糖基化抗體”的PCT申請PCT/EP2007/003164的分案申請，所述PCT申請進入中國國家階段的日期為2008年10月8日，申請號為 200780012678.X。
發明領域
[0002]本發明涉及其Fe區得以表達且被糖基化的重組抗體，由此與抗體Fe區相連的主要核心糖結構被充分巖藻糖基化(fucosylated)。本發明還涉及CHO(中國倉鼠卵巢)宿主細胞，選擇此類CHO宿主細胞的方法，以及此類重組抗體的用途。
[0003]發明背景[0004]天然形式的免疫球蛋白或抗體通常是由兩條輕鏈和兩條重鏈組成的四聚體糖蛋白。抗體含有恒定結構域，據此將抗體歸屬為不同的類，如IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，以及若干亞類，如IgGl、IgG2、IgG3和IgG4。IgGl和IgG3類的人抗體通常介導ADCC (抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用)。
[0005]也存在已知的其他抗體樣分子，含有例如異源蛋白質如受體、配體或酶的結合結構域，和抗體的Fe區。例如，這樣的Fe融合蛋白由Stabila, P.等，NatureBiotechl6 (1998) 1357-1360 和 US5, 610，297 描述。
[0006]單克隆抗體引發四種效應功能:ADCC，吞噬作用，補體依賴性細胞毒作用(⑶C)，影響半衰期/清除率。ADCC和吞噬作用通過細胞結合的抗體與Fe yR(Fcy受體)之間的相互作用介導；CDC則通過細胞結合的抗體與構成補體系統的系列蛋白之間的相互作用。⑶C與Clq結合C3激活和/或Fe受體與Fe部分的結合相關。如果需要降低Clq結合C3激活和/或Fe受體與抗體恒定部分的結合，通常使用IgG4抗體，它不激活補體系統，不結合Clq，不激活C3。可選地，使用含有Y I重鏈恒定區的Fe部分，其中所述恒定區具有某些突變，如 L234A 和 L235A 或 D265A 和 N297A (W099/51642)。
[0007]本領域眾所周知如何修飾抗體的恒定結構域以改善效應功能。例如，這樣的方法描述在W099/54342中。
[0008]Routier, F.H.等，Glycoconjugate J.14(1997)201-207 報道了在 CH0-DUKX 細胞中表達的人源化IgGl抗體的糖基化模式。此抗體顯示出Fuc: Man為0.8: 3.0的摩爾比，述及 80% 的巖藻糖基化比率。Niwa, R.等,J.1mmunol.Methods306 (2005) 151-160 報道了在CHO DG44中重組生產的巖藻糖基化約為90%的抗⑶20IgGl和IgG3抗體。Mimura，Y 等，J.1mmunol.Methods247 (2001) 205-216 報道了丁酸鹽增加 CHO-Kl 細胞中人嵌合IgG的產量，同時維持其功能和糖型分布。寡糖分布顯示相當可觀量的無巖藻糖基化的(afucosylated)聚糖結構。Raju, T.S., BioProcess Internationall (2003)44-53 報道了表達系統糖基化差異對治療性免疫球蛋白生物活性的影響以及命名法。Ma，S.，Anal.Chem.71 (1999) 5185-5192報道了利妥昔單抗(rituximab)的糖分析。利妥昔單抗顯示出 9-10% 的巖藻糖基化(Niwa, R.等，J.1mmunol.Methods306 (2005) 151-160)。Fujii,
S.，J.Biol.Chem.265 (1990) 6009-6018 報道牛 IgG 包括大約 11% 無巖藻糖基化的 IgG0Mizouchi，T.，J.1mmunol.129(1982)2016-2020 報道人 IgG 大約 14%是無巖藻糖基化的。Bergwerff,A.A.,Glycoconjugate J.12 (1995) 318-330 報道了在小鼠 SP2/0 中生產的抗體含有大量N-輕乙酰神經氨酸(N-glycolylneuraminic acid,NGNA)寡糖。Nahrgang, S.等在Animal Cell Technology:Products from Cells,Cells as Products,Bernard,A.等(編輯)，Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, NL, 1999,第 259-261 頁中報道了 IgGl 的CHO表達，在瞬時轉染之后發現總體糖基化弱。Lund，J.等，Mol.1mmunol.30 (1993) 741-748報道了在小鼠轉染瘤細胞中重組生產小鼠-人嵌合抗體。13%量的IgGl抗體是無巖藻糖基化的。Patel, T.P.等，Biochem.J.285 (1992) 839-845報道了來自雜交瘤細胞和小鼠腹水的抗體的糖基化。Niwa, R.等，J.1mmunol.Methods306 (2005) 151-160 報道了在CHO DG44中重組生產CD20IgGl抗體之后91%的巖藻糖基化，而Mori，K.等，Biotech.Bioeng.88 (2004) 901-908 報道了 94 % 的巖藻糖基化。Davies, J.等，Biotechnol.Bioeng.74(2001)288-294報道表達具有改變的糖型的抗體導致ADCC增加。Sheeley，D.M.等，Anal.Biochem.247(1997) 102-110比較了不同表達系統中的抗體糖基化。Shields, R.L.等，J.Biol.Chem.277 (2002) 26733-26740 報道人 IgGlFc 上缺乏巖藻糖提高Fe YRIII 結合和 ADCC。Zhu, L.等，Nature Biotechnol.23 (2005) 1159-1169 報道了在雞蛋中生產人抗體。W02004/087756和W02005/005635公開了抗IGF-1R的改良的抗體。
[0009]發明概沭
[0010]本發明包括人IgGl或IgG3型抗體,所述抗體在Asn297處被糖鏈糖基化,其特征在于在所述糖鏈內巖藻糖的量至少為99%，此外，NGNA的量為1%或以下，和/或N-末端α-1，3_半乳糖的量為1%或以下。
[0011]根據本發明，“量”是指在Asn297處糖鏈內所述糖的量，以G0、G1、G2 (不含甘露糖(4和5))之和作為100%，如實施例3所述進行計算。
[0012]根據本發明，有可能提供巖藻糖基化甚至為99.4%或以上、99.5%或以上、或99.9%或以上的抗體和/或CHO宿主細胞。`
[0013]優選NGNA的量為0.5%或以下，更優選0.1 %或以下，甚至LCMS (液相色譜/質譜)不可檢測。
[0014]優選N-末端α-1，3-半乳糖的量為0.5%或以下，更優選0.1 %或以下，甚至LCMS不可檢測。
[0015]糖鏈優選表現出與CHO細胞中重組表達抗體的Asn297處相連的N-連接聚糖的特征。
[0016]優選抗體是單克隆抗體。優選抗體是嵌合、人源化或人抗體。
[0017]本發明還包括能夠重組表達人IgGl或IgG3型抗體的CHO細胞，所述抗體在Asn297處被糖鏈糖基化，其特征在于在所述糖鏈內巖藻糖的量至少為99%，此外，NGNA的量為1%或以下，和/或N-末端α-1，3-半乳糖的量為1%或以下。
[0018]這樣的細胞系為細胞系hu MAb〈IGF-lR>Bl-4E10_9-16)，根據國際承認用于專利程序的微生物保存布達佩斯條約，于2006年6月21日保藏在德國的德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, DSMZ),保藏號 DSMACC2795。
[0019]優選的糖的量如上文所述。[0020]優選CHO細胞是這樣的CHO細胞:包括兩個DHFR等位基因缺失(如DG44)或功能性失活，或者一個DHFR等位基因缺失，第二個DHFR等位基因功能性失活(如DXBlI)。
[0021 ] 本發明還包括根據本發明用于人類醫療的組合物。
[0022]根據本發明組合物的抗體優選是嵌合抗體、人抗體、人源化抗體、非人抗體、包含IgGl或IgG3重鏈恒定部分的單鏈抗體、或者IgGl或IgG3重鏈恒定部分。
[0023]本發明還包括根據本發明的抗體用于制備藥物的用途。優選藥物用于免疫抑制、用以治療T細胞介導的紊亂、自身免疫紊亂、傳染病、癌病。
[0024]本發明還包括藥物組合物，其包含根據本發明的抗體。
[0025]本發明的另一目的是選擇用于重組生產人IgGl或IgG3型單克隆抗體的CHO細胞的方法，所述抗體在Asn297處被糖鏈糖基化，其特征在于在所述糖鏈內巖藻糖的量至少為99%，此外，NGNA的量為1%或以下，和/或N-末端α _1，3_半乳糖的量為1%或以下，所述方法包括在DHFR和MTX選擇壓力下培養用IgGl或IgG3抗體和DHFR基因轉染的CHO細胞，挑取單個的克隆，擴增所述克隆，選擇產生本發明糖基化模式抗體的克隆。優選培養進行至少兩周、優選至少三周。
[0026]本發明的另一目的是根據本發明的CHO細胞用于重組生產單克隆抗體的用途。
[0027]本發明的另一目的是在根據本發明的CHO細胞中重組生產單克隆抗體的方法。
[0028]CHO細胞是用于重組表達異源多肽的宿主細胞。
`[0029]附圖的簡短i兌明
[0030]圖1的柱形圖顯示了本發明抗體以及對照和參比抗體的ADCC活性或該活性的不足。
[0031]發明詳沭
[0032]抗體在重鏈恒定區的保守位置上含有糖結構，其中每個同種型擁有獨特排列的N-連接糖結構，它們可變地影響著蛋白質的裝配、分泌或功能活性(Wright, A.和Morrison, S.L., Trends Biotechnol.15(1997)26-32)。視加工程度不同，所連的 N-連接糖的結構相當地變化多樣，可以包括高甘露糖、多分支以及二天線復雜型寡糖(Wright，A.和Morrison, S.L.，Trends Biotechnol.15 (1997) 26-32)。
[0033]IgGl和IgG3型抗體是在各CH2結構域的Asn297處具有保守N-連接糖基化位點的糖蛋白。與Asn297相連的兩個復雜型二天線寡糖被遮蔽在CH2結構域之間，與多肽主鏈形成廣泛接觸，且其存在對于抗體介導效應功能如抗體依賴性細胞細胞毒作用(ADCC)是必不可少的(Lifely, M.R.等，Glycobiology5 (1995) 813-822 ；Jefferis, R.等，Tmmunol Rev.163 (1998) 59-76 ；Wright, A.和 Morrison, S.L.，TrendsBiotechnol.15(1997)26-32)。
[0034]如本文所用，術語“人IgG型Fe區”優選還包括天然存在的免疫球蛋白(抗體)Fc區的等位基因變體，以及具有取代、添加或缺失改變但不影響Ans297糖基化作用的變體。例如，免疫球蛋白Fe區的N-末端或C-末端可以缺失一個或多個氨基酸，而不會導致生物功能的實質損失。這樣的變體可以根據本領域公知的一般規則進行選擇，從而對活性具有最小的影響(參見例如 Bowie，J.U.等，Science247 (1990) 1306-1310)。
[0035]術語“抗體”涵蓋多種形式的抗體，包括但不限于全抗體、抗體片段、人抗體、人源化抗體和遺傳改造的抗體，只要保留根據本發明的特征性特性即可。因此，根據本發明的抗體至少含有IgGl或IgG3型功能活性(結合FcR的)Fc部分，包含糖基化的Asn297。
[0036]如本文所用的術語“單克隆抗體”或“單克隆抗體組合物”是指具有完全相同氨基酸組成的抗體分子制品。相應地，術語“人單克隆抗體”是指具有來源于人生殖系免疫球蛋白序列的可變和恒定區、呈現出單一結合特異性的抗體。
[0037]術語“嵌合抗體”是指包含來自一種來源或物種的可變區即結合區，以及至少一部分來源于不同來源或物種的恒定區的單克隆抗體，通常通過重組DNA技術制備。特別優選包含鼠可變區和人恒定區的嵌合抗體。此類鼠/人嵌合抗體為免疫球蛋白基因的表達產物，所述免疫球蛋白基因包含編碼鼠免疫球蛋白可變區的DNA區段以及編碼人免疫球蛋白恒定區的DNA區段。生產嵌合抗體的方法包括目前本領域眾所周知的常規重組DNA技術和基因轉染技術(參見例如Morrison, S.L.等，Proc.Natl.Acad Sc1.USA81 (1984) 6851-6855 ;美國專利 N0.5，202，238 和 5，204，244)。
[0038]術語“人源化抗體”是指這樣的抗體，其中框架或“互補決定區”(OTR)已經被修飾，以包含與親本免疫球蛋白相比具有不同特異性的免疫球蛋白CDR。在優選的實施方案中，將鼠CDR移植至人抗體的框架區，以制備“人源化抗體”(參見例如Riechmann，L.等，Nature332 (1988) 323-327 ;以及 Neuberger，M.S.等，Nature314 (1985) 268-270)。特別優選的CDR對應于提供這樣序列的CDR，所述序列識別上述嵌合及雙功能抗體的抗原。
[0039]如本文所用，術語“人抗體”旨在包括具有來源于人生殖系免疫球蛋白序列的可變和恒定區的抗體。這樣的區域由例如Jobnson, G.和Wu, T.T., Nucleic AcidsRes.28(2000)214-218和文中引述的數據庫描述，只要保留根據本發明的特性就是可用的。人抗體在本領域是眾所周知的(van Dijk, Μ.Α.和van de Winkel, J.G., Curr.0pin.Chem.Biol.5 (2001) 368-374)。人抗體也可以在轉基因動物(如小鼠)中生產，所述轉基因動物經免疫后能 夠生產全部或選擇的人抗體，而無內源免疫球蛋白生產。將人生殖系免疫球蛋白基因排列轉移到這樣的生殖系突變小鼠中導致在抗原刺激時生產人抗體(參見例如 Jakobovits, A.等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90 (1993) 2551-2555 ； Jakobovits,A.等，Nature362(1993)255-258 ;Bruggemann, M.等，Year Immunol.7(1993)33-40)。人抗體也可以在卩遼菌體展示文庫中生產(Hoogenboom, H.R.和Winter, G., J.Mol.Biol.227 (1992) 381-388 ；Marks, J.D.等，J.Mol.Biol.222 (1991) 581-597)。 還可以利用Cole等及Boerner等的技術制備人單克隆抗體(Cole等，MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy, Alan R.Liss,第 77 頁(1985)；和 Boerner, P.等，J.1mmunol.147 (1991)86-95)。人抗體涵蓋多種形式的抗體結構,優選單克隆抗體,包括但不限于全抗體、抗體片段和遺傳改造的抗體(變體或突變抗體)，只要保留根據本發明的特征性特性即可。尤其優選重組人抗體。
[0040]如本文所用，術語“重組人抗體”旨在包括通過重組手段生產制備、表達、創建或分離的所有人抗體，例如，利用轉染到根據本發明的宿主細胞中的重組表達載體，從這樣的宿主細胞中分離的抗體。
[0041]“恒定結構域”不直接參與抗體與抗原的結合，但表現出其他功能如效應功能。對應于IgGl的重鏈恒定區稱為Y I鏈。對應于IgG3的重鏈恒定區稱為Y3鏈。人恒定 Y 重鏈由 Kabat, Ε.Α.等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第
5版，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.(1991)以及 Brueggemann, Μ.等，J.Exp.Med.166 (1987) 1351-1361 ；Love, T.ff.等，MethodsEnzymo1.178 (1989) 515-527詳細描述。IgGl或IgG3型的恒定結構域在Asn297處糖基化。根據本發明的“Asn297”表示大致位于Fe區第297位上的氨基酸天冬酰胺；根據抗體微小的序列變異，Asn297也可以位于上游或下游的某些氨基酸位置上(通常不超過±3個氨基酸)。例如，在根據本發明的一個抗體中，“Asn297”位于氨基酸位置298處。
[0042]人IgGl或IgG3的糖基化發生在Ash297處，為核心巖藻糖基化的二天線復雜型寡糖糖基化，由至多2個Gal殘基封端。根據末端Gal殘基量的不同，這些結構命名為 GO、Gl (α 1，6 或 α 1，3)或 G2 聚糖殘基(Raju，T.S.，BioProcessInternationall (2003) 44-53)。抗體 Fe 部分的 CHO 型糖基化由例如 Routier, F.H.，Glycoconjugate J.14 (1997) 201-207 描述。
[0043]如本文所用的“可變區”(輕鏈可變區(VL)、重鏈可變區(VH))表示直接參與抗體與抗原結合的每一對輕鏈和重鏈。
[0044]根據本發明，可以選擇生產抗體的CHO宿主細胞，其能夠經由重組表達提供表現出根據本發明糖基化模式的單克隆抗體的組合物。這樣的CHO宿主細胞含有用于重組表達這類抗體的一個或多個表達載體。優選宿主細胞用所述載體穩定轉染，抗體編碼核酸穩定整合到CHO宿主細胞基因組中。
[0045]術語“CH0細胞”涵蓋以兩個缺失的dhfr等位基因(二氫葉酸還原酶缺陷型(dhfr_))為基礎的多種形式的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。這樣的&打_細胞及其產生方法描述在例如 Urlaub，G..等，Cell33 (1983)405-412 ；Urlaub, G.等，Som.Cell Molec.Genet.12 (1986) 555-566 ；KoIkekar 等，Biochemistry36 (1997) 10901-10909 中。優選細胞是DG44細胞系。可以利用Y射線消除整個的dhfr基因座生產這樣的CHO dhfr—細胞。在非突變的野生型細胞中，dhfr是從甘氨酸、嘌呤和胸苷酸從頭合成必不可少的酶。這使得質粒上編碼的dhfr基因能夠在dhfr_缺陷型細胞系中用作蛋白質表達的顯性選擇標記和基因放大器(amplifier)。細胞中的dhfr_突變穩定且不可逆轉。成功地共轉染了人IgGl或IgG3型抗體和DHFR基因的表達載體的CHO細胞將擁有dhfr+表型，并且通過在缺乏胸苷和次黃嘌呤、任選含有擴增用甲氨蝶呤(MTX)的培養基中培養細胞集落能容易地進行選擇。
[0046]DG44細胞在本領域眾所周知，例如，可以作為細胞系從例如美國英駿公司(Invitrogen Corp.,USA)商購獲得。DG44細胞可以貼壁、在懸液中和/或在無血清培養基中培養。如本文所用，表述“細胞”、“細胞系”和“細胞培養物”互換使用，且所有這樣命名的CHO dhfr—細胞系(兩個缺失的dhfr等位基因)包括子代。從而，措辭“轉化株”和“轉化細胞”包括最早的受試細胞和由之獲得的培養物，而不考慮轉移次數。也應當理解，由于故意或無意的突變，所有的子代在DNA內容方面可能并不精確相同。具有在原始轉化的細胞中進行篩選的根據本發明的糖基化特性的變體子代包括在本發明的范圍內。
[0047] 優選CHO dhfr—細胞系至少與DHFR —起進行共擴增，后者作為一種選擇標記基因。例如，將含有選擇標記的哺乳動物表達載體和抗體基因共轉染到受體CHO細胞中。可以對產生的集落進行選擇，呈現出預期表型的集落能夠表達抗體。額外的選擇標記是或者可能不是顯性的。用于共轉染的額外選擇標記的實例包括:腺苷脫氨酶(Kaufman，R.J.等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA83 (1986) 3136-3140)、天冬酰胺合成酶(Cartier,Μ.等，Mol.Cell Biol.7 (1987) 1623-1628)、大腸桿菌(E.coli) trpB 基因和沙門氏菌屬(Salmonella)hisD 基因(Hartman, S.C.和 Mulligan, R.C.，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA85 (1988) 8047-8051)、M2 小鼠核糖核苷酸還原酶(Thelander，M.和 Thelander，L.,EMBOJ.8(1989)2475-2479)、人多藥耐藥基因(Kane, S.E.等，Gene84(1989)439-446)、谷氨酰胺合成酶(Bebbington, C.R.等，DNA Cloning, Vol.1ll, D.M.Glover (編輯),IRL Press,第163-188頁，1987)、黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(gpt) (Mulligan, R.C.和Berg，P.，Science209 (1980) 1422-1427)、潮霉素 B (Santerre, R.F.等，Gene30 (1984) 147-156)、新霉素基因(Southern, P.J.和 Berg, P.，J.Mol.Appl.Genet.1 (1982) 327-341)。
[0048]選擇標記還可以提供抗體編碼基因得以擴增的基礎。在CHO細胞系的共轉染過程中，各載體DNA通常整合到細胞染色體相同的基因座上。從而，一般僅僅使用一種選擇標記作為擴增基礎就引起兩種基因拷貝數的平行增加。以這種方式使用的一種特別的選擇標記是dhfr，通過使用濃度漸增的MTX，能夠獲得期望的擴增。又一優選的選擇標記是GS，通過添加甲硫氨酸亞砜胺(methionine sulphoximine, MSX)能夠進行擴增。
[0049]選擇標記當然要處于DNA調控元件的控制之下以確保其表達。在使用dhfr作為選擇標記的情況下，調控元件優選為病毒來源的，例如來自DNA腫瘤病毒。特別優選使用SV40或腺病毒主要晚期啟動子。就此而言，從所述啟動子中除去增強子元件從而有效使之“削弱”尤為有利。與否則如果使用強啟動子會發生的情況相比，這種修飾能夠在各種濃度的甲氨蝶呤選擇下增加基因擴增水平。在使用新霉素作為選擇標記的情況下，適宜啟動子的實例為小鼠金屬硫蛋白啟動子。
[0050]如本文所用，術語“核酸”或“核酸分子”旨在包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是單鏈或雙鏈的，但優選為雙鏈DNA。
[0051]當核酸與另一核酸序列處于功能關聯狀態時，其“有效連接”。例如，如果前序列或分泌前導序列的DNA與多肽的DNA的連接表達為參與所述多肽分泌的前蛋白，則他們有效連接；如果啟動子或增強子的連接影響編碼序列的轉錄，則他們有效連接；或者如果核糖體結合位點與編碼序列的排置有利`于翻譯，則他們有效連接。通常，“有效連接”表示連接的DNA序列是順式的，而且在分泌前導序列的情況下是相鄰且同讀框連接的。不過，增強子不必相鄰。連接通過便利的限制性位點處的連接實現。如果不存在這樣的位點，則按照常規操作使用合成的寡核苷酸接納體(adaptor)或接頭。
[0052]根據本發明的抗體優選通過重組手段生產。此類方法在本領域廣為人知，并且包括在原核和真核細胞中表達蛋白質，隨后分離抗體多肽，并通常純化至可藥用的純度。為進行蛋白質表達，通過標準方法將編碼輕鏈和重鏈或其片段的核酸插入表達載體中。在CHO宿主細胞中進行表達，并從細胞或上清液(優選在裂解后)中回收抗體。
[0053]抗體的重組生產在本領域眾所周知，并描述在例如Makrides, S.C., ProteinExpr.Purif.17 (1999) 183-202 ；Geisse, S.等，Protein Expr.Purif.8 (1996) 271-282 ；Kaufman , R.J., Mol.Biotechnol.16 (2000) 151-161 ； Werner , R.G., DrugRes.48(1998)870-880 的綜述文章中。
[0054]抗體可以存在于完整細胞、上清液、細胞裂解物中，或為部分純化或基本上純的形式。通過標準技術，包括本領域眾所周知的堿/SDS處理、氯化銫分帶(CsCl banding)、柱層析、瓊脂糖凝膠電泳等等進行純化，以除去其他細胞組分或其他雜質，如其他細胞核酸或蛋白質(參見 Ausubel, F.等編輯 Current Protocols in Molecular Biology, GreenePublishing and Wiley Interscience, New York(1987))。
[0055]例如，適用于原核生物的控制序列包括啟動子，任選的操縱子序列，和核糖體結合位點。真核細胞已知利用啟動子、增強子和多聚腺苷酸化信號。
[0056]可以通過常規的免疫球蛋白純化方法如蛋白質A-瓊脂糖、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析從雜交瘤培養基中適當地分離單克隆抗體。編碼單克隆抗體的DNA和RNA很容易從雜交瘤中分離，并利用常規方法進行測序。雜交瘤細胞可用作為此類DNA和RNA的來源。DNA —經鑒定和分離，即可插入到表達載體中，隨之轉染到否則將不生產免疫球蛋白的CHO細胞中，以實現宿主細胞中重組單克隆抗體的合成。
[0057]本發明在另一方面提供了藥物組合物，包括與可藥用載體配制在一起的本發明組合物。優選使用根據W098/22136的藥物組合物。例如，Iml這樣的組合物含有
2.0mg抗體，15mM磷酸緩沖液pH6.5, 30mM氯化鈉，25mg甘露醇(mannite), IOmg精氨酸，
0.lrngTwctMi? 20。
[0058]如本文所用，“可藥用載體”包括生理上相容的任何及所有溶劑、分散介質、包衣、抗細菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等等。優選載體適于靜脈內、肌內、皮下、腸胃外、脊髓(spinal)或表皮給藥(例如通過注射或輸注)。
[0059]“可藥用鹽”是指保留抗體期望的生物活性而不帶來任何不期望的毒物學效應的鹽(參見例如Berge, S.M.等，J.Pharm.Sc1.66 (1977) 1-19)。這樣的鹽包括在本發明范圍內。這樣的鹽的實例包括酸加成鹽和堿加成鹽。酸加成鹽包括從無毒的無機酸衍生的鹽，如鹽酸鹽。
[0060]本發明的組合物可通過本領域公知的多種方法給藥。正如技術人員將會理解的那樣，給藥路徑和/或方式將隨期望的`結果而變動。
[0061]為通過某些給藥路徑給藥本發明的化合物，可能需要用防止化合物失活的材料對其進行包衣，或化合物與之共給藥。例如，可以向受試者給藥處于適宜載體例如脂質體或稀釋劑中的化合物。可藥用稀釋劑包括鹽溶液和水性緩沖溶液。
[0062]可藥用載體包括無菌水性溶液或分散液，以及用于臨時制備無菌注射液或分散液的無菌粉劑。此類介質和藥劑用于藥物活性物質的用途是本領域公知的。
[0063]如本文所用的短語“腸胃外給藥”和“經腸胃外給藥”，表示不同于腸和局部給藥的給藥方式，通常是通過注射，包括但不限于:靜脈內、肌內、動脈內、鞘內、囊內、眶內、心臟內、皮內、腹膜內、經氣管、皮下、表皮下、關節內、囊下、蛛網膜下、脊柱內、硬膜外和胸骨內注射和輸注。
[0064]這些組合物還可以含有佐劑，如防腐劑、潤濕劑、乳化劑和分散劑。通過前述滅菌操作，以及通過納入多種抗細菌劑和抗真菌劑例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等，均可以確保防止微生物的存在。還可能期望在組合物中納入等滲劑，如糖、氯化鈉等。另外，可注射藥物形式的延遲吸收可以通過納入延遲吸收的藥劑如單硬脂酸鋁和明膠來實現。
[0065]無論所選的施用路徑如何，可以以適宜水合物形式使用的本發明的化合物和/或本發明的藥物組合物通過本領域公知的常規方法配制為可藥用劑型。
[0066]根據本發明藥物組合物中活性成分的實際劑量水平可有變動，以獲得有效量的活性成分，從而對于特定的患者、組合物和給藥方式實現期望的治療反應，而對患者沒有毒性。所選的劑量水平將取決于多種藥代動力學因素，包括所采用的本發明特定組合物或其酯、鹽或氨基化合物(amide)的活性、給藥路徑、給藥時間、所采用特定化合物的排泄速率、與所采用特定組合物組合使用的其他藥物、化合物和/或材料、所治療患者的年齡、性別、體重、病情、總體健康和既往病史、以及醫學領域眾所周知的類似因素。
[0067]組合物必需是無菌和流動的，從而組合物可以通過注射器遞送。除了水之外，載體還可以是等滲緩沖鹽溶液，乙醇，多元醇(例如甘油，丙二醇，液體聚乙二醇，等等)，以及它們適宜的混合物。
[0068]例如，可以通過使用包衣如卵磷脂，分散劑的情況下通過維持所需的顆粒大小，通過使用表面活性劑，來維持適當的流動性。在許多情況下，優選在組合物中納入等滲劑，例如糖，多元醇如甘露醇或山裂糖醇，和氯化鈉。可注射組合物的長期吸收可以通過在組合物中納入延遲吸收的藥劑如單硬脂酸鋁或明膠來實現。
[0069]提供如下實施例和附圖以幫助理解本發明，本發明的真正范圍闡釋在所附權利要求書中。應當理解，可以對所示的操作進行改動而不會偏離本發明的精神。
實施例
[0070]細胞系
[0071]用來產生重組表達IgG的細胞系的親本細胞系是中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系CH0-DG44 (Fl intoff, ff.F.等，Somat.Cell Genet.2 (1976) 245-261 ；Flintoff, ff.F.等，Mol.Cell.Biol.2 (1982) 275-285 ；Urlaub, G.等，Cell33 (1983) 405-412 ；Urlaub.G.等，Somat.Cell Mol.Genet.12 (1986) 555-566)。CH0-DG44 細胞的兩個內源二氫葉酸還原酶(DHFR)基因座均已喪失。
[0072]CH0-DG44 細胞培養在MEM alpha Minus 培養基(Gibco N0.22561)，10%透析的胎牛血清 FCS (Gibco N0.2640`0-044)和 2mmol/L L-谷氨酸，100 μ M次黃嘌呤，16 μ M 胸苷(HT增補物)中。
[0073]質粒
[0074]表達系統包括CMV啟動子，并在表1中描述。至于抗體，使用了抗IGF-1R抗體(W02005005635 ;ΑΚ18 或ΑΚ22)。
[0075]表1
[0076]
【權利要求】
1.人IgGl或IgG3型單克隆抗體,所述抗體在Asn297處被糖鏈糖基化,所述抗體的特征在于 a)在所述糖鏈內巖藻糖的量至少為99%，其中所述量以不含甘露糖4和甘露糖5的G0、G1、G2之和作為100%，并且是通過液相色譜/質譜(LCMS)肽圖譜分析所分析的；并且此外， b)在所述糖鏈內NGNA的量為I%或以下，其中所述量以不含甘露糖4和甘露糖5的G0、G1、G2之和作為100%，并且是通過液相色譜/質譜(LCMS)肽圖譜分析所分析的， 和/或在所述糖鏈內N末端α-1，3-半乳糖的量為1%或以下，其中所述量以不含甘露糖4和甘露糖5的GO、Gl、G2之和作為100%，并且是通過液相色譜/質譜(LCMS)肽圖譜分析所分析的。
2.根據權利要求1的抗體，其特征在于NGNA的量為0.5%或以下。
3.根據權利要求1或2的抗體，其特征在于N-末端a-1，3-半乳糖的量為0.5%或以下。
4.根據權利要求1至3的抗體，其特征在于所述抗體是嵌合、人源化或人抗體。
5.藥物組合物，包含根據權利要求1至4的抗體。
【文檔編號】A61P31/00GK103864923SQ201410108197
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2007年4月10日 優先權日:2006年4月11日
【發明者】S·漢森, K-P·金克勒, D·羅伊施, R·舒馬赫 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司