利用亞硫酸鈉建立的低氧和缺氧模型及其應用的制作方法

利用亞硫酸鈉建立的低氧和缺氧模型及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種利用亞硫酸鈉建立的低氧和缺氧模型及其應用。該低氧和缺氧模型是由緩沖液體系和亞硫酸鈉組成的不同濃度的亞硫酸鈉溶液，所述緩沖液體系為磷酸鹽緩沖液、生理鹽水或M9緩沖液。本發明的模型簡便易行、重復性好、穩定性高、可靠性強，能替代現用常規的物理性低氧缺氧模型和化學性低氧缺氧模型，應用于對生物和細胞的低氧效應研究和防治缺氧損傷相關疾病的藥物評價中。
【專利說明】利用亞硫酸鈉建立的低氧和缺氧模型及其應用
[0001]本申請是申請號201010119570.4，申請日2010年3月8日，發明名稱“利用亞硫
酸鈉建立低氧和缺氧模型的方法以及一種低氧和缺氧模型”專利申請的分案申請。
【技術領域】
[0002]本發明屬于化學技術和生物技術應用領域，特別是涉及一種利用亞硫酸鈉在溶液中建立低氧和缺氧模型的方法及其用途，該模型可應用在低氧應答相關研究和評價治療缺氧損傷相關疾病藥物等方面。
【背景技術】
[0003]氧氣是生物體生命活動的基礎，高氧和低氧均不利于機體生理功能的發揮，尤其是低氧和缺氧環境對于機體正常生理功能影響巨大。低氧不僅能夠使生命體生理功能發生改變，而且嚴重時可引起一系列損傷及病變，如腦部缺氧會引發腦卒中和神經系統退行性疾病，心臟、肝臟和腎臟長時間低氧會造成器官永久性損害，高原低氧還易引發高原低氧血癥等。
[0004]為了深入研究和模擬低氧對機體造成的損害及其作用機制，目前常用多種低氧缺氧模型，一般可分為兩類:物理性誘導的低氧缺氧模型和化學性誘導的低氧缺氧模型。物理性低氧缺氧模型雖能很好地模擬造成損傷的低氧環境，但是需要購置專業的低氧設備，不僅價格昂貴，而且操作復雜、穩定性較差，尤其是其中的氧探頭極易出現故障而導致工作體系不穩定，實施起來存在很大的局限性。化學性低氧缺氧模型包括利用氯化鈷、去鐵胺、連二亞硫酸鈉等化學試劑來建立的模型。但氯化鈷中的Co2+屬于重金屬，容易造成細胞等生命體中毒并誘發遺傳性病變等，使其應用受到了極大限制。去鐵胺可能是作為一種鐵螯合劑來使血紅素蛋白不能 和氧結合而保持還原狀態，從而模擬缺氧，但具體的機制尚不清楚。另外，雖然連二亞硫酸鈉也可以與溶液中的溶解氧反應，形成一個物理性的低氧缺氧環境，但由于其與溶液的化學反應復雜，易產生二氧化硫有毒氣體，操作不當甚至會發生自燃，使其難以推廣應用。

【發明內容】

[0005]本發明目的在于提供一種簡便易行、重復性好、穩定性高、可靠性強的利用亞硫酸鈉構建的低氧和缺氧模型。
[0006]利用亞硫酸鈉構建的低氧和缺氧模型，是由緩沖液體系和亞硫酸鈉組成的不同濃度的亞硫酸鈉溶液，所述緩沖液體系為磷酸鹽緩沖液、生理鹽水或M9緩沖液。
[0007]所述的低氧和缺氧模型，亞硫酸鈉溶液的濃度范圍為0.2 — 5g/L。
[0008]所述的低氧和缺氧模型，為低氧模型，亞硫酸鈉濃度范圍為0.2 — 1.0g/L ;所述低氧模型中溶解氧濃度在24小時內穩定在不大于0.lmg/L范圍內。
[0009]優選的，所述低氧模型中緩沖液體系為磷酸鹽緩沖液，亞硫酸鈉濃度為1.0g/L。
[0010]所述的低氧和缺氧模型為缺氧模型，亞硫酸鈉濃度范圍為2.0 — 5.0g/L ;所述缺氧模型中溶解氧濃度在64小時內穩定在Omg/L。
[0011]優選的，所述缺氧模型中緩沖液體系為磷酸鹽緩沖液，亞硫酸鈉濃度為2.0g/L或
5.0g/L。
[0012]本發明還進一步提供低氧和缺氧模型在生物或細胞培養體系在缺氧或低氧應答研究中的應用，或利用生物或細胞培養體系在缺氧或低氧應答反應在評價預防和治療缺氧或低氧損傷相關疾病藥物中的應用。
[0013]所述生物包括大腸桿菌、酵母、秀麗線蟲、果蠅、斑馬魚、小鼠、大鼠、豚鼠、兔、豬、犬等。
[0014]所述應用在秀麗線蟲在低氧缺氧環境中的應答研究中，包括以下過程:
[0015](I)低氧缺氧模型的建立:利用M9緩沖液配制亞硫酸鈉濃度為0.5g/L-4.0g/L范圍內的亞硫酸鈉溶液；
`[0016](2)線蟲處理:向裝有不同濃度的亞硫酸鈉溶液的玻璃離心管中加入一定數量的秀麗線蟲(例如100只)，并置于26°C生化培養箱中處理；
[0017](3)處理結束后對秀麗線蟲相關指標進行檢測，相關指標包括死亡率、咽部的形態學變化、神經細胞突起損傷和HIF-1蛋白表達水平。
[0018]進一步，所述應用通過研究秀麗線蟲在低氧缺氧環境中的應答反應評價預防和治療缺氧損傷相關疾病藥物的藥效，在上述步驟基礎上繼續包括以下過程:
[0019](4)在步驟(1)建立的低氧缺氧模型中加入所述藥物，重復步驟(2)和(3)，得到再次處理的秀麗線蟲相關指標；
[0020](5)將步驟(3)和步驟(4)兩次獲得的指標進行比較，獲得該藥物的藥效數據。
[0021]本發明提供的利用亞硫酸鈉建立的低氧和缺氧模型及其應用，其核心是利用緩沖液體系(如磷酸鹽緩沖液、生理鹽水和M9緩沖液等)，配制不同濃度的亞硫酸鈉溶液，并通過便攜式溶解氧測定儀實時監測一定時間內緩沖體系中溶解氧變化，確認亞硫酸鈉能夠消耗緩沖液體系中的溶解氧，并能夠在一定時間內維持緩沖液的低氧缺氧狀態，具有一定的穩定性。本發明將普通化學試劑亞硫酸鈉用于低氧缺氧模型的建立中，不僅提供了亞硫酸鈉的一種新用途，且由此建立的低氧缺氧模型穩定性高，不僅能夠克服常用化學低氧缺氧模型的毒性及安全性問題，而且操作簡便，能夠提高效率并節約成本，為進一步深入研究低氧缺氧效應及其機制奠定了基礎。該模型可以用于多種生命體的低氧研究，如大腸桿菌、酵母、斑馬魚、秀麗線蟲、小鼠和細胞等，并且可以通過亞硫酸鈉濃度和緩沖液(或水)的調整，針對不同生命體的不同研究需求進行調整。本發明利用亞硫酸鈉建立的低氧和缺氧模型可望替代現用常規的物理性低氧缺氧模型和化學性低氧缺氧模型，應用于低氧效應研究之中。
[0022]下面結合具體實施例對本發明做進一步詳細說明。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1:利用亞硫酸鈉構建的低氧和缺氧模型的構建方法流程圖
[0024]圖2:折線圖顯示不同濃度亞硫酸鈉溶液中溶解氧的變化趨勢
[0025]圖3:秀麗線蟲不同株系經不同濃度溶液體系及不同時間處理后死亡率統計分析
[0026]圖4:微分干涉相差(DIC)顯微鏡觀察不同溶液體系處理N2株系線蟲12小時后咽部變化(放大倍數X 100)
[0027]圖5:熒光顯微鏡觀察不同溶液體系中IS_2(增強型綠色熒光蛋白轉基因)株系線蟲神經細胞突起的變化情況(放大倍數X200)
[0028]圖6:免疫印跡檢測不同亞硫酸鈉溶液處理N2株系線蟲后HIF-1的表達情況【具體實施方式】
[0029]下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法。
[0030]實施例1、亞硫酸鈉低氧和缺氧模型的建立方法
[0031]如圖1所示，本發明亞硫酸鈉低氧和缺氧模型的構建方法包括以下步驟:
[0032]1、不同緩沖液體系(以磷酸緩沖液為例)
[0033]按以下配方配制I X磷酸緩沖液(pH7.4):
[0034]用量筒量取800mL 蒸餾水，加入 NaC18g, KC10.2g，Na2HPO4L 44g，KH2PO40.24g，調節pH值至7.4,加蒸懼水至1L。
[0035]2、配制不同濃度的亞硫酸鈉溶液
[0036]利用IX磷酸緩沖液(pH7.4)配制不同濃度亞硫酸鈉溶液:在準備好的IX磷酸緩沖液中按表1所示濃度加入計算量的亞硫酸鈉。
[0037]實施例中根據便攜式溶解氧測定儀(JPB-607型)的測試需要，每種濃度溶液配制200mL，盛于250mL血清瓶中。
[0038]3、亞硫酸鈉對于溶解氧剝奪的測定
[0039]根據便攜式溶解氧測定儀的測試需要，同時也為了獲得穩定而正確的溶氧值，利用磁力攪拌器(IKA RH basic-?)驅動轉子使待測溶液恒定流速。經測定，當磁力攪拌器轉速選擇2檔時其轉速為540r/min。使用上述測定方法，利用便攜式溶解氧測定儀在37°C下對蒸餾水、PBS溶液、以及溶解在磷酸緩沖液(PBS)中的梯度亞硫酸鈉溶液(0.1g/L、0.2g/L、0.5g/L、l.0g/L,2.0g/L 和 5.0g/L)進行了 72 小時(hours, hrs)的連續性測定。
[0040]結果如圖2所示，可見蒸餾水中的溶解氧濃度由5.5mg/L在12hrs內逐漸降至
5.0mg/L,之后恒定不變；PBS中的溶解氧濃度由5.5mg/L在24hrs內逐漸降至4.5mg/L,之后恒定不變；0.lg/L的亞硫酸鈉溶液中的溶解氧濃度在2hrs內出現一個快速短暫下降(2.5mg/L降至1.2mg/L)后，持續上升，并在40hrs時升至4.5mg/L,之后恒定不變；
0.2g/L的亞硫酸鈉溶液中的溶解氧濃度在8hrs內可穩定在0.5mg/L,之后持續上升至
4.5mg/L (48hrs),并恒定不變；0.5g/L的亞硫酸鈉溶液中的溶解氧濃度在24hrs內可穩定在0.lmg/L，之后持續上升至4.5mg/L(72hrs) ；1.0g/L的亞硫酸鈉溶液中的溶解氧濃度在36hrs內可穩定在0.lmg/L以下,之后也會持續上升,在72hrs時可上升至3.2mg/L ;而
2.0g/L和5.0g/L的亞硫酸鈉溶液中的溶解氧濃度基本維持在0mg/L。從圖中可以歸納出能夠應用的亞硫酸鈉濃度及可維持溶液中溶解氧濃度的有效時間段，如表1所示。
[0041]表1不同濃度亞硫酸鈉溶液可維持溶解氧濃度的有效時間段
【權利要求】
1.一種利用亞硫酸鈉構建的低氧和缺氧模型，是由緩沖液體系和亞硫酸鈉組成的不同濃度的亞硫酸鈉溶液，所述緩沖液體系為磷酸鹽緩沖液、生理鹽水或M9緩沖液。
2.根據權利要求1所述的低氧和缺氧模型，其特征在于:所述亞硫酸鈉溶液的濃度范圍為 0.2 —5g/L。
3.根據權利要求1或2所述的低氧和缺氧模型，其特征在于:為低氧模型，亞硫酸鈉濃度范圍為0.2 — 1.0g/L ;所述低氧模型中溶解氧濃度在24小時內穩定在小于或等于0.lmg/L范圍內ο
4.根據權利要求3所述的低氧和缺氧模型，其特征在于:所述低氧模型中緩沖液體系為磷酸鹽緩沖液，亞硫酸鈉濃度為1.0g/L。
5.根據權利要求1或2所述的低氧和缺氧模型，其特征在于:為缺氧模型，亞硫酸鈉濃度范圍為2.0 — 5.0g/L ;所述缺氧模型中溶解氧濃度在64小時內穩定在Omg/L。
6.根據權利要求5所述的低氧和缺氧模型，其特征在于:所述缺氧模型中緩沖液體系為磷酸鹽緩沖液，亞硫酸鈉濃度為2.0g/L或5.0g/L。
7.權利要求1至6任一所述的低氧和缺氧模型在生物或細胞培養體系在缺氧或低氧應答研究中的應用，或利用生物或細胞培養體系在缺氧或低氧應答反應在評價預防和治療缺氧或低氧損傷相關疾病藥物中的應用。
8.根據權利要求7所述應用，其特征在于:所述生物包括大腸桿菌、酵母、秀麗線蟲、果蠅、斑馬魚、小鼠、大鼠 、豚鼠、兔、豬、犬等。
9.根據權利要求7或8所述應用，其特征在于:研究秀麗線蟲在低氧缺氧環境中的應答，包括以下過程: (1)低氧缺氧模型的建立:利用M9緩沖液配制亞硫酸鈉濃度為0.5g/L-4.0g/L范圍內的亞硫酸鈉溶液； (2)線蟲處理:向裝有不同濃度的亞硫酸鈉溶液的玻璃離心管中加入一定數量的秀麗線蟲(例如100只)，并置于26°C生化培養箱中處理； (3)處理結束后對秀麗線蟲相關指標進行檢測，相關指標包括死亡率、咽部的形態學變化、神經細胞突起損傷和HIF-1蛋白表達水平。
10.根據權利要求9所述應用，其特征在于:通過研究秀麗線蟲在低氧缺氧環境中的應答反應評價預防和治療缺氧損傷相關疾病藥物的藥效，進一步包括以下過程: (4)在步驟(1)建立的低氧缺氧模型中加入所述藥物，重復步驟(2)和(3)，得到再次處理的秀麗線蟲相關指標； (5)將步驟(3)和步驟(4)兩次獲得的指標進行比較，獲得該藥物的藥效數據。
【文檔編號】A61K33/04GK103860586SQ201410106427
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2010年3月8日 優先權日:2010年3月8日
【發明者】張成崗, 蔣斌, 任長虹, 吳永紅, 李偉光, 高艷 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所