一種軟骨組織工程修復(fù)支架及其制備方法

一種軟骨組織工程修復(fù)支架及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種軟骨組織工程修復(fù)支架及其制備方法，屬于軟骨組織修復(fù)領(lǐng)域。該支架包括天然高分子水凝膠和表面偶聯(lián)有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞親和肽的脫鈣骨基質(zhì)，通過將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞親和肽偶聯(lián)到脫鈣骨基質(zhì)表面，得到具有特異性骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞親和能力的軟骨組織工程修復(fù)支架。將其置于軟骨缺損區(qū)能夠募集到大量BMSC，且在該支架中天然高分子水凝膠與脫鈣骨基質(zhì)的配合作用下，BMSC能夠長期保留在軟骨缺損區(qū)，保證了軟骨修復(fù)具有更長的療效期。本發(fā)明還公開了該支架的制備方法，通過將天然高分子水凝膠溶液注射至表面偶聯(lián)有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞親和肽的脫鈣骨基質(zhì)中進(jìn)行凝膠化反應(yīng)，得到力學(xué)強(qiáng)度及誘導(dǎo)能力均較高的支架。該方法簡單，實(shí)用性高。
【專利說明】一種軟骨組織工程修復(fù)支架及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及軟骨修復(fù)領(lǐng)域，特別涉及一種軟骨組織工程修復(fù)支架及其制備方法。【背景技術(shù)】
[0002]軟骨組織工程是一種采用組織工程學(xué)方法構(gòu)建透明軟骨組織的技術(shù)。軟骨組織工程中三大基本要素是:種子細(xì)胞，可降解的軟骨組織工程修復(fù)支架以及細(xì)胞生長調(diào)節(jié)因子。對(duì)于軟骨組織工程修復(fù)支架來說，由于軟骨組織工程修復(fù)支架能夠?yàn)檐浌切迯?fù)細(xì)胞的構(gòu)建提供三維空間結(jié)構(gòu)，利于細(xì)胞的黏附、增殖，為細(xì)胞的生長提供良好的生長環(huán)境，通常將軟骨組織工程修復(fù)支架置于軟骨缺損區(qū)，用于軟骨缺損的填充修補(bǔ)，來促進(jìn)軟骨組織的再生修復(fù)。常用的軟骨組織工程修復(fù)支架主要采用天然生物支架材料制備而成，其不僅能夠促進(jìn)正常細(xì)胞外基質(zhì)的生成及重塑，且在生物相容性、生物降解及成軟骨分化(即軟骨誘導(dǎo)能力)方面具有不可比擬的優(yōu)勢。對(duì)于種子細(xì)胞來說，目前，依靠內(nèi)源性細(xì)胞進(jìn)行軟骨修復(fù)仍是臨床第一線選擇。
[0003]目前，常利用微骨折手術(shù)，通過鉆孔暴露軟骨下骨內(nèi)的骨髓，使內(nèi)源性的多潛能細(xì)胞:骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone Marrow Derived Mesenchymal Stem Cells, BMSC)進(jìn)入軟骨缺損區(qū)進(jìn)行軟骨修復(fù)。該手術(shù)簡單，花費(fèi)較低，不涉及外源細(xì)胞，能有效緩解患者傷痛癥狀，使其成為臨床的一線治療方案。
[0004]在實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的過程中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有技術(shù)至少存在以下問題:
[0005]由于軟骨缺損區(qū)內(nèi)BMSC較少、且BMSC不易保留在軟骨缺損區(qū)，致使新生軟骨組織力學(xué)強(qiáng)度較弱，不能應(yīng)對(duì)關(guān)節(jié)應(yīng)力，導(dǎo)致現(xiàn)有技術(shù)利用微骨折手術(shù)對(duì)軟骨修復(fù)的療效期短。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為了解決現(xiàn)有技術(shù)軟骨缺損區(qū)內(nèi)BMSC較少、且BMSC不易保留在軟骨缺損區(qū)的問題，本發(fā)明實(shí)施例提供了一種軟骨組織工程修復(fù)支架。所述技術(shù)方案如下:
[0007]—方面，本發(fā)明實(shí)施例提供了一種軟骨組織工程修復(fù)支架，所述軟骨組織工程修復(fù)支架的成分包括天然高分子水凝膠和脫鈣骨基質(zhì)，所述脫鈣骨基質(zhì)表面偶聯(lián)有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞親和肽。
[0008]作為優(yōu)選，所述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞親和肽的純度大于等于95%。
[0009]作為優(yōu)選，所述天然高分子水凝膠為殼聚糖水凝膠。
[0010]另一方面，本發(fā)明實(shí)施例還提供了一種軟骨組織工程修復(fù)支架的制備方法，所述方法包括:
[0011]制備脫鈣骨基質(zhì)；
[0012]將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞親和肽偶聯(lián)到所述脫鈣骨基質(zhì)表面，得到骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞親和肽修飾的脫鈣骨基質(zhì)；
[0013]配制天然高分子水凝膠溶液； [0014]將所述天然高分子水凝膠溶液注射至所述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞親和肽修飾的脫鈣骨基質(zhì)中，使所述天然高分子水凝膠溶液完全滲入所述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞親和肽修飾的脫鈣骨基質(zhì)中，并在預(yù)設(shè)溫度下進(jìn)行凝膠化反應(yīng)，得到所述軟骨組織工程修復(fù)支架。
[0015]作為優(yōu)選，所述天然高分子水凝膠溶液在20°C時(shí)的粘度為100-400cP。
[0016]作為優(yōu)選，所述預(yù)設(shè)溫度為34-38°C。
[0017]具體地，所述制備脫鈣骨基質(zhì)具體為:
[0018]將股骨上附著的軟組織剔去，得到修整的股骨；
[0019]取所述修整的股骨的骨骺并清洗；
[0020]將所述骨骺切割成預(yù)定大小的骨塊，對(duì)所述骨塊進(jìn)行脫脂處理；
[0021]利用EDTA脫鈣技術(shù)對(duì)脫脂后的骨塊進(jìn)行脫鈣，待所述骨塊完全脫鈣后，對(duì)所述骨塊進(jìn)行修剪、消毒，得到所述脫鈣骨基質(zhì)，并于4°C保存。
[0022]具體地，所述將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞親和肽偶聯(lián)到所述脫鈣骨基質(zhì)表面具體為:
[0023]配制濃度為10%的己二胺的異丙醇溶液，將所述脫鈣骨基質(zhì)浸泡在所述己二胺的異丙醇溶液內(nèi)I小時(shí)，進(jìn)行胺化處理后沖洗，得到胺化處理的脫鈣骨基質(zhì)；
[0024]將所述胺化處理的脫鈣骨基質(zhì)浸泡在含雙異官能團(tuán)交聯(lián)劑的有機(jī)溶液中，并用磷酸鹽緩沖液進(jìn)行沖洗，得到雙異官能團(tuán)交聯(lián)劑功能化的脫鈣骨基質(zhì)；
[0025]將含有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞親和肽的磷酸鹽緩沖液注入所述雙異官能團(tuán)交聯(lián)劑功能化的脫鈣骨基質(zhì)中，室溫孵育，將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞親和肽偶聯(lián)到所述脫鈣骨基質(zhì)表面。
[0026]具體地，所述配制天然高分子水凝膠溶液具體為:
[0027]配制濃度為2.5%g/ml的殼聚糖的乙酸溶液，高壓滅菌后于4°C保存；
[0028]配制濃度為60%的甘油磷酸鈉溶液，除菌后于4°C保存；
[0029]在冰浴環(huán)境中，將所述甘油磷酸鈉溶液滴加到所述殼聚糖的乙酸溶液中，攪拌至澄清，得到所述天然高分子水凝膠溶液，室溫保存；
[0030]所述甘油磷酸鈉溶液與所述殼聚糖的乙酸溶液的質(zhì)量比為1:9。
[0031]具體地，作為優(yōu)選，所述殼聚糖的脫乙酰度大于等于95%。
[0032]本發(fā)明實(shí)施例提供的技術(shù)方案帶來的有益效果是:
[0033]本發(fā)明實(shí)施例提供了一種包括天然高分子水凝膠和表面偶聯(lián)有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞親和肽的脫鈣骨基質(zhì)的軟骨組織工程修復(fù)支架，通過將天然高分子水凝膠與脫鈣骨基質(zhì)相結(jié)合，一方面，該軟骨組織工程修復(fù)支架具備了水凝膠的可塑性、粘附性和可注射性，使其具備了天然生物支架材料本身所帶來的各種優(yōu)勢；另一方面，脫鈣骨基質(zhì)能夠提供膠原纖維網(wǎng)架，賦予所制備的軟骨組織工程修復(fù)支架更高的力學(xué)強(qiáng)度和誘導(dǎo)能力，進(jìn)一步促進(jìn)了細(xì)胞的粘附、增殖和分化。在上述軟骨組織工程修復(fù)支架提供平臺(tái)的基礎(chǔ)上，本發(fā)明實(shí)施例通過將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞親和肽偶聯(lián)到脫鈣骨基質(zhì)表面，得到具有特異性骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞親和能力的軟骨組織工程修復(fù)支架。將該具有特異性骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞親和能力的軟骨組織工程修復(fù)支架置于軟骨缺損區(qū)，能夠在軟骨缺損區(qū)募集到大量BMSC，且在該軟骨組織工程修復(fù)支架中天然高分子水凝膠與脫鈣骨基質(zhì)的配合作用下，該BMSC能夠長期保留在軟骨缺損區(qū)，保證了軟骨修復(fù)具有更長的療效期。
[0034]本發(fā)明實(shí)施例還提供了一種軟骨組織工程修復(fù)支架的制備方法，通過將配制的天然高分子水凝膠溶液注射至表面偶聯(lián)有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞親和肽的脫鈣骨基質(zhì)中，使該天然高分子水凝膠溶液完全滲入脫鈣骨基質(zhì)中的空隙中，并在預(yù)設(shè)溫度下進(jìn)行凝膠化反應(yīng)，得到力學(xué)強(qiáng)度及誘導(dǎo)能力均較高，且具有在軟骨缺損區(qū)募集并長期保留大量BMSC的能力的軟骨組織工程修復(fù)支架。該方法簡單，易操作，實(shí)用性高。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0035]為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。
[0036]圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的軟骨組織工程修復(fù)支架的制備方法流程圖；
[0037]圖2是本發(fā)明又一實(shí)施例提供的軟骨組織工程修復(fù)支架的制備方法流程圖；
[0038]圖3是本發(fā)明又一實(shí)施例提供的軟骨組織工程修復(fù)支架的掃描電鏡圖；
[0039]圖4為本發(fā)明又一實(shí)施例提供的軟骨組織工程修復(fù)支架的體外募集BMSC的能力示意圖；
[0040]圖5為本發(fā)明又一實(shí)施例提供的軟骨組織工程修復(fù)支架的體內(nèi)募集BMSC的能力示意圖；
[0041]圖6a為利用本發(fā)明又一實(shí)施例提供的軟骨組織工程修復(fù)支架體外培養(yǎng)BMSC四周后，該軟骨組織工程修復(fù)支架內(nèi)BMSC的DNA增殖表達(dá)示意圖；
[0042]圖6b為利用本發(fā)明又一實(shí)施例提供的軟骨組織工程修復(fù)支架體外培養(yǎng)BMSC四周后，該軟骨組織工程修復(fù)支架內(nèi)BMSC的軟骨糖胺多糖表達(dá)示意圖；
[0043]圖6c為利用本發(fā)明又一實(shí)施例提供的軟骨`組織工程修復(fù)支架體外培養(yǎng)BMSC四周后，該軟骨組織工程修復(fù)支架內(nèi)BMSC的羥脯氨酸表達(dá)示意圖；
[0044]圖6d為利用本發(fā)明又一實(shí)施例提供的軟骨組織工程修復(fù)支架體外培養(yǎng)BMSC四周后，該軟骨組織工程修復(fù)支架內(nèi)聚集蛋白聚糖的實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)表達(dá)示意圖；
[0045]圖6e為利用本發(fā)明又一實(shí)施例提供的軟骨組織工程修復(fù)支架體外培養(yǎng)BMSC四周后，該軟骨組織工程修復(fù)支架內(nèi)二型膠原蛋白的實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)表達(dá)示意圖；
[0046]圖6f為利用本發(fā)明又一實(shí)施例提供的軟骨組織工程修復(fù)支架體外培養(yǎng)BMSC四周后，該軟骨組織工程修復(fù)支架內(nèi)一型膠原蛋白的實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)表達(dá)示意圖；
[0047]圖7是本發(fā)明又一實(shí)施例提供的體內(nèi)修復(fù)軟骨缺損24周時(shí)，軟骨組織的形態(tài)、軟骨組織的核磁共振成像、軟骨細(xì)胞的蘇木素-伊紅染色及軟骨組織中蛋白聚糖的甲苯胺藍(lán)染色示意圖。
[0048]其中，I未用E7多肽修飾的軟骨組織工程修復(fù)支架，
[0049]2 E7多肽修飾的軟骨組織工程修復(fù)支架，
[0050]3正常軟骨，
[0051]4微骨折手術(shù)，
[0052]5 體外培養(yǎng)BMSC3天，
[0053]6 體外培養(yǎng)BMSC14天，
[0054]7 體外培養(yǎng)BMSC28天，
[0055]8天然高分子水凝膠，
[0056]9脫鈣骨基質(zhì)，[0057]10含天然高分子水凝膠和脫鈣骨基質(zhì)的軟骨組織工程修復(fù)支架。
【具體實(shí)施方式】
[0058]為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明實(shí)施方式作進(jìn)一步地詳細(xì)描述。
[0059]實(shí)施例1
[0060]本發(fā)明實(shí)施例提供了一種軟骨組織工程修復(fù)支架，該軟骨組織工程修復(fù)支架的成分包括天然高分子水凝膠和脫鈣骨基質(zhì)，該脫鈣骨基質(zhì)表面偶聯(lián)有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞親和肽。
[0061]本發(fā)明實(shí)施例提供的軟骨組織工程修復(fù)支架，包括天然高分子水凝膠和表面偶聯(lián)有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞親和肽的脫鈣骨基質(zhì)。通過將天然高分子水凝膠與脫鈣骨基質(zhì)相結(jié)合，一方面，該軟骨組織工程修復(fù)支架具備了水凝膠的可塑性、粘附性和可注射性，使其具備了天然生物支架材料本身所帶來的各種優(yōu)勢；另一方面，脫鈣骨基質(zhì)能夠提供膠原纖維網(wǎng)架，賦予所制備的軟骨組織工程修復(fù)支架更高的力學(xué)強(qiáng)度和誘導(dǎo)能力，進(jìn)一步促進(jìn)了細(xì)胞的粘附、增殖和分化。重要的是，本發(fā)明實(shí)施例通過將偶聯(lián)有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞親和肽的軟骨組織工程修復(fù)支架置于軟骨缺損區(qū)，能夠在軟骨缺損區(qū)募集到大量BMSC，且在該軟骨組織工程修復(fù)支架中天然高分子水凝膠與脫鈣骨基質(zhì)的配合作用下，該BMSC能夠長期保留在軟骨缺損區(qū)，保證了軟骨修復(fù)具有更長的療效期。
[0062]實(shí)施例2
[0063]本發(fā)明實(shí)施例提供了一種軟骨組織工程修復(fù)支架，該軟骨組織工程修復(fù)支架的成分包括天然高分子水凝膠和脫鈣骨基質(zhì)，該脫鈣骨基質(zhì)表面偶聯(lián)有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞親和肽。
[0064]天然高分子水凝膠具有高含水性、可塑性及可注射性，是組織工程研究的常用材料。天然高分子水凝膠最大的優(yōu)勢是能使包裹的細(xì)胞維持圓球形的軟骨細(xì)胞表型及不發(fā)生去分化。其能設(shè)計(jì)成液體形態(tài)使其具備可注射性，能與軟骨修復(fù)細(xì)胞較好的混合，避免細(xì)胞丟失?？梢姡烊桓叻肿铀z具備的可注射性、高粘附性，使其能夠廣泛應(yīng)用在微創(chuàng)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。此外，由于天然高分子水凝膠可在水中溶脹并保持大量水分而又不溶解，使得其與充盈有大量水性液體的機(jī)體組織及其相似，而且天然高分子水凝膠柔軟，潤濕的表面能夠與組織親和，極大減少了其對(duì)周圍機(jī)體組織的刺激性，從而使其具有了良好的生物相容性。
[0065]脫鈣骨基質(zhì)是一種天然固態(tài)生物材料，不僅具備一定的力學(xué)強(qiáng)度，而且生物相容性高。發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)脫鈣骨內(nèi)含有的生物因子，能在不同的環(huán)境下誘導(dǎo)出相應(yīng)的再生組織，這些特性使其在骨骼運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)修復(fù)上有一定優(yōu)勢。通過嚴(yán)格的脫鈣及脫細(xì)胞制備過程，脫鈣骨基質(zhì)的主要成分僅由一種膠原纖維網(wǎng)架構(gòu)成，不具有生物毒性及免疫源性，同時(shí)能夠促使各種組織細(xì)胞的粘附、增殖、分化等。雖然脫鈣骨基質(zhì)擁有較大的孔隙，約300~600um之間，容易造成細(xì)胞的逸漏，不利于與體內(nèi)組織的粘附整合，但本發(fā)明實(shí)施例通過將一定粘度的天然高分子水凝膠溶液注入該脫鈣骨基質(zhì)中的孔隙內(nèi)，使脫鈣骨基質(zhì)的孔隙內(nèi)完全充滿天然高分子水凝膠成分，有效避免細(xì)胞的遺漏，而且通過兩者結(jié)合所制備的軟骨組織工程修復(fù)支架能夠與周邊組織緊密粘附，從而促使軟骨組織與周邊組織形成整體化修復(fù)。[0066]骨髓包括基質(zhì)系統(tǒng)和造血系統(tǒng)，基質(zhì)系統(tǒng)中含有的對(duì)造血系統(tǒng)起支持誘導(dǎo)作用、能分化成多種成熟間質(zhì)細(xì)胞的非造血組織干細(xì)胞，稱為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞Bone marrowstromal cell (BMSC)0 BMSC由骨前體細(xì)胞、軟骨前體細(xì)胞、脂肪前體細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和肌細(xì)胞前體細(xì)胞組成，因此BMSCs是由骨髓組織干細(xì)胞或前體細(xì)胞和軀體組織干細(xì)胞組成的成份及功能復(fù)雜的細(xì)胞群體。BMSC對(duì)骨髓中的造血干細(xì)胞(HSC)不僅有機(jī)械支持作用，還能分泌多種生長因子(如IL-6，IL-11，LIF, M-CSF及SCF等)來支持造血。基于BMSC上述優(yōu)點(diǎn)，本發(fā)明實(shí)施例在脫鈣骨基質(zhì)表面偶聯(lián)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞親和肽，來大量募集微骨折手術(shù)動(dòng)員的BMSC，避免了外源性細(xì)胞的使用，同時(shí)利用該軟骨組織修復(fù)支架的特性使BMSC保留在軟骨缺損區(qū)，為軟骨缺損區(qū)提供更多的修復(fù)細(xì)胞，有效促進(jìn)軟骨的修復(fù)。
[0067]作為優(yōu)選，該骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞親和肽的純度大于等于95%。
[0068]為了提高該軟骨組織修復(fù)支架在軟骨缺損區(qū)募集BMSC的能力，本發(fā)明實(shí)施例優(yōu)選骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞親和肽的純度大于等于95%。
[0069]更具體地，該骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞親和肽為E7多肽。
[0070]作為優(yōu)選，該天然高分子水凝膠為殼聚糖水凝膠。
[0071]殼聚糖是一種來源廣泛，廉價(jià)易得，且具有良好的生物相容性、安全性和生物降解性的用于制備水凝膠的理想材料。殼聚糖具有溫敏性，其在室溫或低于室溫時(shí)可保持液態(tài)較長時(shí)間，而溫度升高到生理體溫(37°C )后則發(fā)生凝膠化，生成水凝膠?；诖耍景l(fā)明實(shí)施例優(yōu)選殼聚糖水凝膠。本發(fā)明實(shí)施例通過將天然的殼聚糖水凝膠與天然固態(tài)支架結(jié)合，利用殼聚糖的溫敏性，使殼聚糖溶液發(fā)生凝膠化生成殼聚糖水凝膠，制備成一種軟骨組織工程固膠雙相支架。這種固膠雙相支架不僅能保留天然高分子水凝膠的可注射性、高含水性、粘附性、可塑性，還能利用脫鈣骨基質(zhì)提供的膠原纖維網(wǎng)架，賦予支架更高的力學(xué)強(qiáng)度，避免了單純?cè)黾犹烊桓叻肿铀z交聯(lián)密度而出現(xiàn)的骨分化或軟骨肥大，最終能夠誘導(dǎo)出適宜的成軟骨分化。
`[0072]可以理解的是，該天然高分子水凝膠還可選自明膠、膠原、纖維蛋白、透明質(zhì)酸鹽、海藻酸鹽和瓊脂糖中的任意一種。
[0073]實(shí)施例3
[0074]如附圖1所示，本發(fā)明實(shí)施例提供了一種軟骨組織工程修復(fù)支架的制備方法，包括:
[0075]步驟101:制備脫鈣骨基質(zhì)。
[0076]步驟102:將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞親和肽偶聯(lián)到脫鈣骨基質(zhì)表面，得到骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞親和肽修飾的脫鈣骨基質(zhì)。
[0077]步驟103:配制天然高分子水凝膠溶液。
[0078]步驟104:將該天然高分子水凝膠溶液注射至骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞親和肽修飾的脫鈣骨基質(zhì)中，使天然高分子水凝膠溶液完全滲入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞親和肽修飾的脫鈣骨基質(zhì)中，并在預(yù)設(shè)溫度下進(jìn)行凝膠化反應(yīng)，得到軟骨組織工程修復(fù)支架。
[0079]本發(fā)明實(shí)施例提供的軟骨組織工程修復(fù)支架的制備方法，通過將配制的天然高分子水凝膠溶液注射至表面偶聯(lián)有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞親和肽的脫鈣骨基質(zhì)中，使水凝膠溶液完全滲入脫鈣骨基質(zhì)中的空隙中，并在預(yù)設(shè)溫度下進(jìn)行凝膠化反應(yīng)，得到力學(xué)強(qiáng)度及誘導(dǎo)能力均較高，且具有在軟骨缺損區(qū)募集并長期保留大量BMSC的能力的軟骨組織工程修復(fù)支架。該方法簡單，易操作，實(shí)用性高。
[0080]實(shí)施例4
[0081]本發(fā)明實(shí)施例提供了一種軟骨組織工程修復(fù)支架的制備方法，包括:
[0082]步驟201:制備脫鈣骨基質(zhì):
[0083]將股骨上附著的軟組織剔去，得到修整的股骨；
[0084]取該修整的股骨的骨骺并清洗；
[0085]將骨骺切割成預(yù)定大小的骨塊，并對(duì)骨塊進(jìn)行脫脂處理；
[0086]利用EDTA脫鈣技術(shù)對(duì)脫脂后的骨塊進(jìn)行脫鈣，待骨塊完全脫鈣后，對(duì)骨塊進(jìn)行修剪、消毒，得到脫鈣骨基質(zhì)，并于4°C保存。
[0087]步驟202:將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞親和肽偶聯(lián)到脫鈣骨基質(zhì)表面，得到骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞親和肽修飾的脫鈣骨基質(zhì):
[0088]配制濃度為10%的己二胺的異丙醇溶液，將所述脫鈣骨基質(zhì)浸泡在所述己二胺的異丙醇溶液內(nèi)I小時(shí)，進(jìn)行胺化處理后沖洗，得到胺化處理的脫鈣骨基質(zhì)；
[0089]將所述胺化處理的脫鈣骨基質(zhì)浸泡在含雙異官能團(tuán)交聯(lián)劑的有機(jī)溶液中，并用磷酸鹽緩沖液進(jìn)行沖洗，得到雙異官能團(tuán)交聯(lián)劑功能化的脫鈣骨基質(zhì)；
[0090]將含有骨 髓間充質(zhì)干細(xì)胞親和肽的磷酸鹽緩沖液注入所述雙異官能團(tuán)交聯(lián)劑功能化的脫鈣骨基質(zhì)中，室溫孵育，將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞親和肽偶聯(lián)到所述脫鈣骨基質(zhì)表面。
[0091]步驟203:配制在20°C時(shí)的粘度為100~400cP的天然高分子水凝膠溶液:
[0092]配制濃度為2.5%g/ml的殼聚糖的乙酸溶液，高壓滅菌后于4°C保存；
[0093]配制濃度為60%的甘油磷酸鈉溶液，除菌后于4°C保存；
[0094]在冰浴環(huán)境中，將上述甘油磷酸鈉溶液滴加到上述殼聚糖的乙酸溶液中，攪拌至澄清，得到天然高分子水凝膠溶液，室溫保存；
[0095]其中，甘油磷酸鈉溶液與殼聚糖的乙酸溶液的質(zhì)量比為1:9。
[0096]為了保證天然高分子水凝膠溶液兼具較好的可注射性和粘附性，本發(fā)明實(shí)施例將該天然高分子水凝膠溶液在20°C時(shí)的粘度控制為100~400cP。此外，在配制殼聚糖的乙酸溶液時(shí)，還可選用其他弱酸溶液來溶解殼聚糖，例如，草酸、碳酸等。
[0097]作為優(yōu)選，殼聚糖的脫乙酰度大于等于95%。
[0098]為了保證殼聚糖能夠容易地在乙酸溶液中溶解，且保持其高分子量、高粘度的特性，從而保證所制備的軟骨組織工程修復(fù)支架具有結(jié)構(gòu)形態(tài)完好均一，本發(fā)明實(shí)施例將殼聚糖的脫乙酰度控制在大于等于95%，例如96%、98%等。
[0099]步驟204:將該天然高分子水凝膠溶液注射至骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞親和肽修飾的脫鈣骨基質(zhì)中，使天然高分子水凝膠溶液完全滲入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞親和肽修飾的脫鈣骨基質(zhì)中，并在34-38°C下進(jìn)行凝膠化反應(yīng)，得到軟骨組織工程修復(fù)支架。
[0100]其中，上述使天然高分子水凝膠溶液完全滲入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞親和肽修飾的脫鈣骨基質(zhì)中指的是天然高分子水凝膠溶液完全充滿脫鈣骨基質(zhì)中任何空隙的一種理想狀態(tài)。
[0101]實(shí)施例5
[0102]脫鈣骨基質(zhì)制備:
[0103]I)將股骨上附著的肌肉、筋膜、脂肪等軟組織剔去，僅保留骨性成分。[0104]2)將修整的股骨進(jìn)行切割，選取骨骺端，利用生理鹽水沖洗殘留的骨髓3次。
[0105]3)將沖洗后的骨骺切割成4X4X2cm3大小的骨塊，懸浸于脫脂液(甲醇:氯仿=1:1)內(nèi)，進(jìn)行脫脂處理48小時(shí)。
[0106]4)脫鈣液配制:用去離子水配制0.5M乙二胺四乙酸脫鈣液，控制其PH=8.3，脫鈣液保存及脫鈣過程均在4°C下用塑料容器盛載(避免玻璃容器)。
[0107]5)生理鹽水沖洗脫脂后骨塊，浸泡于乙二胺四乙酸脫鈣液中，脫鈣液每日更換。
[0108]6)脫鈣完全度檢測:每日換下的脫鈣液用原子吸收分光光度計(jì)檢測鈣離子濃度以監(jiān)測脫鈣進(jìn)程，當(dāng)脫鈣液中的鈣(Ca)螯合物濃度〈0.5g/L，即為完全脫鈣，脫鈣后的標(biāo)本進(jìn)行X線和CT檢測，證明完全脫鈣。
[0109]向脫鈣骨基質(zhì)表面偶聯(lián)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞親和肽:
[0110]I)采用固相法在聚乙二醇-聚苯乙烯樹脂上合成E7多肽分子，利用高效液相色譜法測定E7多肽純度，保證其純度> 95%。
[0111]2)將脫鈣骨基質(zhì)修整成1X1X0.5cm3大小。
[0112]3)配制濃度為10%的己二胺的異丙醇溶液，37°C的溫度下將修整后的脫鈣骨基質(zhì)浸泡在該溶液內(nèi)I小時(shí)，進(jìn)行胺化處理。
[0113]4)利用雙蒸水沖洗胺化處理后的脫鈣骨基質(zhì)3次。
[0114]5)雙異官能團(tuán)交聯(lián):將IOmg的雙異官能團(tuán)交聯(lián)劑:4_(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亞胺酯鈉于IOOul 二甲基亞砜溶液內(nèi)溶解，得到雙異官能團(tuán)交聯(lián)劑溶液(該溶液需現(xiàn)配現(xiàn)用)。然后在在避光環(huán)境中，利用該雙異官能團(tuán)交聯(lián)劑溶液浸泡上述雙蒸水沖洗過的胺化后的脫鈣骨基質(zhì)I小時(shí)。
[0115]6)用磷酸鹽緩沖(PBS)溶液配制濃度為0.1M的乙二胺四乙酸緩沖液，利用該緩沖液沖洗上述脫鈣骨基質(zhì)3次。
[0116]7)將E7多肽分子溶解在PBS溶液中，配制成濃度為0.lmg/ml的E7多肽的PBS溶液，并將該E7多肽的PBS溶液注入到緩沖液沖洗過的脫鈣骨基質(zhì)中，室溫孵育2小時(shí)，使E7多肽充分偶聯(lián)到脫鈣骨基質(zhì)的固態(tài)支架上，實(shí)現(xiàn)E7多肽對(duì)脫鈣骨基質(zhì)的表面修飾。
[0117]8)利用雙蒸水沖洗修飾有E7多肽的脫鈣骨基質(zhì)3次，洗去脫鈣骨基質(zhì)表面未偶聯(lián)上的E7多肽。
[0118]9)將修飾有E7多肽的脫鈣骨基質(zhì)冷凍干燥24小時(shí)，密封，使用前進(jìn)行鈷60照射消毒。
[0119]天然高分子水凝膠溶液的制備:
[0120]I)殼聚糖的乙酸溶液配制:用去離子水配制0.1M乙酸溶液，將2.5g殼聚糖顆粒加到100mL乙酸溶液內(nèi)，磁力攪拌48小時(shí)至完全溶解，高壓滅菌后分裝4°C保存。
[0121]2)甘油磷酸鈉溶液配制:去離子水配制60%甘油磷酸鈉溶液，0.22um過濾除菌，4°C保存。
[0122]3)冰浴攪拌下，將質(zhì)量份分別為I等份的甘油磷酸鈉溶液緩慢滴加進(jìn)9等份的殼聚糖的乙酸溶液內(nèi)，攪拌至澄清，得到天然高分子水凝膠溶液，室溫保存。
[0123]將本發(fā)明實(shí)施例制備的軟骨組織工程修復(fù)支架用于軟骨損傷修復(fù)中，根據(jù)經(jīng)微骨折處理后的軟骨缺損的大小，對(duì)E7多肽修飾的脫鈣骨基質(zhì)進(jìn)行修剪至合適的大小，并將其填塞進(jìn)軟骨缺損中；隨后將上述配制的天然高分子水凝膠溶液注射進(jìn)該軟骨缺損區(qū)內(nèi)，使天然高分子水凝膠溶液滲透進(jìn)脫鈣骨基質(zhì)中孔隙內(nèi)，并完全填充整個(gè)軟骨缺損區(qū)。利用體溫使天然高分子水凝膠溶液發(fā)生凝膠化，最終在軟骨缺損區(qū)內(nèi)形成軟骨組織工程修復(fù)支架。該軟骨組織工程修復(fù)支架利用脫鈣骨基質(zhì)偶聯(lián)的E7多肽特異地募集微骨折釋放的內(nèi)源性BMSC，并在該軟骨組織工程修復(fù)支架提供的微環(huán)境中，進(jìn)行新生軟骨的再生，最終促進(jìn)軟骨修復(fù)。通過掃描電鏡分別對(duì)比觀察天然高分子水凝膠8、脫鈣骨基質(zhì)9和所制備的含天然高分子水凝膠9、脫鈣骨基質(zhì)9的軟骨組織工程修復(fù)支架10的結(jié)構(gòu)，如附圖3所示，含天然高分子水凝膠8、脫鈣骨基質(zhì)9的軟骨組織工程修復(fù)支架10有效并充分地將上述兩者進(jìn)行了結(jié)合，形成一體結(jié)構(gòu)。該含天然高分子水凝膠8、脫鈣骨基質(zhì)9的軟骨組織工程修復(fù)支架10不僅保留了天然高分子水凝膠的有利的微觀結(jié)構(gòu)，即30~70um的微孔，且利用了脫鈣骨基質(zhì)的300~600um的膠原蛋白網(wǎng)架，使該軟骨組織工程修復(fù)支架有效保留大量細(xì)胞。
[0124]本發(fā)明實(shí)施例通過利用微骨折技術(shù)，在軟骨損傷區(qū)內(nèi)清除壞死的組織、暴露新鮮創(chuàng)面、動(dòng)員軟骨修復(fù)細(xì)胞，為該軟骨組織工程修復(fù)支架提供修復(fù)空間及修復(fù)細(xì)胞。利用脫鈣骨基質(zhì)填塞軟骨缺損，可以發(fā)揮其力學(xué)優(yōu)勢，使新生的修復(fù)組織具有一定的力學(xué)強(qiáng)度，以應(yīng)對(duì)關(guān)節(jié)腔內(nèi)的應(yīng)力要求。另外，脫鈣骨基質(zhì)內(nèi)含有的生物因子，能進(jìn)一步誘導(dǎo)成軟骨分化。通過脫鈣骨基質(zhì)表面修飾的親和多肽，能特異性地募集骨髓來源干細(xì)胞，為軟骨修復(fù)提供更多的修復(fù)細(xì)胞。利用殼聚糖溶液的溫敏化，使缺損區(qū)及脫鈣骨基質(zhì)的孔隙內(nèi)充滿水凝膠成分，可以有效避免修復(fù)細(xì)胞的丟失，并且與周邊組織粘附緊密，從而促使再生軟骨與周圍組織形成整體化修復(fù)。
[0125]實(shí)施例6
[0126]本發(fā)明實(shí)施例分別對(duì)軟骨組織工程修復(fù)支架體外和體內(nèi)募集BMSC的能力進(jìn)行了測定，具體過程如下:
[0127]體外募集B MSC的能力:
[0128]I)在同樣條件下分別制備E7多肽修飾的軟骨組織工程修復(fù)支架I和未用E7多肽修飾的軟骨組織工程修復(fù)支架2，并將兩者均放入6孔板內(nèi)，用磷酸鹽緩沖溶液浸泡4小時(shí)，除去凝膠后殘留的甘油磷酸鈉。
[0129]2)吸走磷酸鹽緩沖溶液，向6孔板里加入含濃度為10%的胎牛血清的MEM- α培養(yǎng)基(Minimum essential medium alpha medium),每孔 2ml, 37°C孵育支架 I 小時(shí)。
[0130]3)向6孔板里添加含SD大鼠(Sprague Dawley)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的α培養(yǎng)基Iml (3 X 106/ml)，細(xì)胞密度最終為I X 106/ml，37°C孵箱培養(yǎng)。
[0131]4)培養(yǎng)3天后，取出上述支架，并用磷酸鹽緩沖溶液沖洗2次。利用濃度為4%多聚甲醛對(duì)其進(jìn)行固定，羅丹明-鬼筆環(huán)肽(160nM，2ml)避光染細(xì)胞骨架4小時(shí)。
[0132]5)磷酸鹽緩沖溶液沖洗2次，利用DNA染料Hoechst33258(l:800，2ml)復(fù)染細(xì)胞核I小時(shí)。
[0133]6)磷酸鹽緩沖溶液沖洗2次，激光共聚焦顯微鏡觀測細(xì)胞分布情況。
[0134]體內(nèi)募集BMSC的能力:
[0135]I) SD大鼠(400g，雄性)，動(dòng)物后肢膝關(guān)節(jié)備皮，消毒，取正中切口，向外側(cè)翻轉(zhuǎn)髕骨，暴露膝關(guān)節(jié)腔。在膝關(guān)節(jié)滑車部位用3mm角膜環(huán)鉆鉆至鈣化層，取出軟骨部分。用IOml注射器針頭在暴露的鈣化層上穿刺，進(jìn)針密度為間隔0.5_，深度到達(dá)軟骨下骨內(nèi)，釋放骨髓。[0136]2)根據(jù)鉆取的軟骨缺損大小分別修剪E7多肽修飾的脫鈣骨基質(zhì)和未用E7多肽修飾的脫鈣骨基質(zhì)，填充軟骨缺損區(qū)。
[0137]3)向脫鈣骨基質(zhì)及軟骨缺損區(qū)內(nèi)注射預(yù)制的殼聚糖溶液，關(guān)閉關(guān)節(jié)腔，體溫作用15分鐘。暴露關(guān)節(jié)腔，檢查凝膠化程度，確定軟骨組織工程修復(fù)支架成功。
[0138]4)生理鹽水沖洗關(guān)節(jié)腔，關(guān)閉關(guān)節(jié)腔，縫合切口。
[0139]5) 2周后處死動(dòng)物，解剖取出手術(shù)膝關(guān)節(jié)。
[0140]6)按照上述體外方法進(jìn)行細(xì)胞骨架及細(xì)胞核染色，利用激光聚焦顯微鏡對(duì)軟骨缺損部位進(jìn)行直接觀測。[0141]如附圖4所示，E7多肽修飾的軟骨組織工程修復(fù)支架2比未用E7多肽修飾的軟骨組織工程修復(fù)支架I體外募集到更多的BMSC。其中電鏡圖中的灰白色區(qū)域分別代表Hoechest33258標(biāo)記的細(xì)胞核、羅丹明-鬼筆環(huán)肽標(biāo)記的細(xì)胞骨架和異硫氰酸熒光素標(biāo)記的E7多肽。
[0142]在微骨折手術(shù)的基礎(chǔ)上，檢測軟骨組織工程修復(fù)支架體內(nèi)募集BMSC的能力。如附圖5所示，正常軟骨3的BMSC及其細(xì)胞核(Nuclei)、細(xì)胞骨架(cytoskeleton)、的分布均勻，且存在異硫氰酸熒光素標(biāo)記的E7多肽(Petide-FITC);單純的微骨折手術(shù)4能釋放一定量細(xì)胞，細(xì)胞分布不均勻；未用E7多肽修飾的軟骨組織工程修復(fù)支架I募集的BMSC較少，且不利于細(xì)胞動(dòng)員；E7多肽修飾的軟骨組織工程修復(fù)支架2能在軟骨缺損區(qū)募集到大量的BMSC，且細(xì)胞分布均勻，與正常軟骨內(nèi)的細(xì)胞分布相似?？梢?，E7多肽修飾后的軟骨組織工程修復(fù)支架2能有效募集到大量的BMSC，同時(shí)利用該生物支架的特性使BMSC保留在缺損區(qū)，為軟骨缺損區(qū)提供更多的修復(fù)細(xì)胞，從而促進(jìn)軟骨修復(fù)效果。
[0143]實(shí)施例7
[0144]本發(fā)明實(shí)施例分別對(duì)上述E7多肽修飾的軟骨組織工程修復(fù)支架和未用E7多肽修飾的軟骨組織工程修復(fù)支架的軟骨分化誘導(dǎo)能力進(jìn)行了測試，具體過程如下:
[0145]DBMSC原代培養(yǎng)及傳代:商品化SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞Pl代(RASMX-01001，廣州賽業(yè))，復(fù)蘇后加入含濃度為10%的胎牛血清的MEM-α培養(yǎng)基(minimum essentialmedium), 2-3天換一次液，并傳一代，傳至P4代進(jìn)行軟骨分化能力檢測
[0146]2)P4代大鼠BMSC，胰酶消化，計(jì)算細(xì)胞數(shù)量，離心，用預(yù)先配制的殼聚糖溶液重懸細(xì)胞，細(xì)胞密度控制在I X 107/ml。
[0147]3)將含有BMSC的殼聚糖溶液注射在E7多肽修飾的脫鈣骨基質(zhì)上，轉(zhuǎn)移至6孔板內(nèi)，37°C孵育15分鐘，使殼聚糖溶液凝膠化，制成含BMSC的軟骨組織工程修復(fù)支架。
[0148]4)將商品化軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基(RASMX-90041，廣州賽業(yè))添加到6孔板內(nèi)，37°C孵箱培養(yǎng)，2~3天更換誘導(dǎo)培養(yǎng)液。培養(yǎng)4周后，收集軟骨組織工程修復(fù)支架，進(jìn)行軟骨分化檢測，包括 RT-PCR(Real Time-Polymerase Chain Reaction,實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng))，GAG(Glycosaminoycan,軟骨糖胺多糖)的測定，HYP (Hydroxyproline,輕脯氨酸)的測定。
[0149]如附圖6a所示，利用本發(fā)明實(shí)施例提供的軟骨組織工程修復(fù)支架分別體外培養(yǎng)BMSC3天5、體外培養(yǎng)BMSC14天6及體外培養(yǎng)BMSC28天7后，相比未用E7多肽修飾的軟骨組織工程修復(fù)支架1，E7多肽修飾的軟骨組織工程修復(fù)支架2內(nèi)修復(fù)細(xì)胞的增殖更明顯；如附圖6b所示，利用本發(fā)明實(shí)施例提供的軟骨組織工程修復(fù)支架體外培養(yǎng)BMSC3天、14天及28天后，相比未用E7多肽修飾的軟骨組織工程修復(fù)支架1，E7多肽修飾的軟骨組織工程修復(fù)支架2產(chǎn)生了更多的軟骨特異性細(xì)胞外基質(zhì):軟骨糖胺多糖；如附圖6c所示，利用本發(fā)明實(shí)施例提供的軟骨組織工程修復(fù)支架體外培養(yǎng)BMSC的時(shí)間分別為3天、14天及28天后，相比未用E7多肽修飾的軟骨組織工程修復(fù)支架1，E7多肽修飾的軟骨組織工程修復(fù)支架2產(chǎn)生了更多的羥脯氨酸；如附圖6d所示，利用本發(fā)明實(shí)施例提供的軟骨組織工程修復(fù)支架體外培養(yǎng)BMSC的時(shí)間分別為14天及28天后，相比未用E7多肽修飾的軟骨組織工程修復(fù)支架1，E7多肽修飾的軟骨組織工程修復(fù)支架2產(chǎn)生更多的聚集蛋白聚糖；如附圖6e所示，利用本發(fā)明實(shí)施例提供的軟骨組織工程修復(fù)支架體外培養(yǎng)BMSC的時(shí)間分別為14天及28天后，相比未用E7多肽修飾的軟骨組織工程修復(fù)支架1，E7多肽修飾的軟骨組織工程修復(fù)支架2產(chǎn)生更多的二型膠原蛋白；如附圖6f所示，利用本發(fā)明實(shí)施例提供的軟骨組織工程修復(fù)支架體外培養(yǎng)BMSC的時(shí)間分別為14天及28天后，相比未用E7多肽修飾的軟骨組織工程修復(fù)支架1，E7多肽修飾的軟骨組織工程修復(fù)支架2有效抑制了一型膠原蛋白的表達(dá)，有利于軟骨特異基因(例如，聚集蛋白聚糖，二型膠原蛋白)的上調(diào)?？梢姡诨蛩缴?，E7多肽修飾的軟骨組織工程修復(fù)支架2表現(xiàn)出更明顯的軟骨分化，說明BMSC親和肽:E7多肽修飾后的軟骨組織工程修復(fù)支架2能夠更有效地誘導(dǎo)軟骨分化的發(fā)生，有利于軟骨基質(zhì)的生成，最終促進(jìn)體內(nèi)軟骨修復(fù)效果。
[0150]實(shí)施例8
[0151]本發(fā)明實(shí)施例對(duì)所制備的軟骨組織工程修復(fù)支架體內(nèi)修復(fù)軟骨缺損的能力進(jìn)行測試，具體過程如下:
[0152]I)膝關(guān)節(jié)軟骨缺損常規(guī)微骨折手術(shù)處理，測量軟骨缺損區(qū)。
[0153]2)根據(jù)軟骨缺損區(qū)的大小，對(duì)E7多肽修飾的脫鈣骨基質(zhì)進(jìn)行修剪。
[0154]3)將修整后的脫鈣骨基質(zhì)填塞進(jìn)軟骨缺損區(qū)中，利用脫鈣骨基質(zhì)的強(qiáng)度給予軟骨缺損區(qū)一定的力學(xué)支持。
[0155]4)將預(yù)先配制的殼聚糖水凝膠溶液注射進(jìn)軟骨缺損區(qū)內(nèi)，使殼聚糖水凝膠溶液滲透進(jìn)脫鈣骨基質(zhì)中孔隙內(nèi)，并完全填充整個(gè)軟骨缺損區(qū)。
[0156]5)利用體溫使殼聚糖水凝膠溶液發(fā)生凝膠化，在軟骨缺損區(qū)內(nèi)形成固膠雙相的軟骨組織工程修復(fù)支架。殼聚糖水凝膠溶液能有效避免修復(fù)細(xì)胞的丟失，并且與周邊組織粘附緊密，從而促使再生軟骨與周圍組織的整合。
[0157]6)利用脫鈣骨偶聯(lián)的E7多肽特異性募集微骨折釋放的內(nèi)源性骨髓來源干細(xì)胞，在支架提供的微環(huán)境中，進(jìn)行新生軟骨的再生，最終促進(jìn)軟骨修復(fù)。
[0158]7)體內(nèi)修復(fù)6月后，通過組織學(xué)及核磁共振成像檢測，來判斷本發(fā)明實(shí)施例制備的E7修飾的軟骨組織工程修復(fù)支架的軟骨修復(fù)效果。
[0159]在同樣操作條件下，還對(duì)微骨折手術(shù)及未修飾E7多肽的軟骨組織工程修復(fù)支架的軟骨修復(fù)效果進(jìn)行了測定。
[0160]如附圖7所示，正常軟骨3的組織，其軟骨連續(xù)，有光澤。單純的微骨折手術(shù)4術(shù)后6個(gè)月，新生軟骨組織仍未能填滿軟骨缺損區(qū)，缺損周邊有骨質(zhì)的增生表現(xiàn)；對(duì)軟骨組織的核磁共振成像(MRI)及對(duì)軟骨細(xì)胞(Chondrocyte)的蘇木素_伊紅染色顯示軟骨缺損未填充，對(duì)蛋白聚糖(Proteoglycan)的甲苯胺藍(lán)染色顯示軟骨缺損區(qū)修復(fù)組織內(nèi)蛋白多糖的含量較低，為纖維軟骨修復(fù)。使用未修飾E7多肽的軟骨組織工程修復(fù)支架I在體內(nèi)修復(fù)6個(gè)月后，軟骨缺損有一定填充，但不完全，且表面粗糙；對(duì)軟骨組織的核磁共振成像可見軟骨不連續(xù)，軟骨下骨有囊表；對(duì)軟骨細(xì)胞的蘇木素-伊紅染色及對(duì)蛋白聚糖的甲苯胺藍(lán)染色見缺損部分填充，表面不平，GAG含量低。使用E7多肽修飾的軟骨組織工程修復(fù)支架2于體內(nèi)修復(fù)6個(gè)月后，軟骨的大體形態(tài)與正常軟骨相似，軟骨缺損填充完全，軟骨有光澤，對(duì)軟骨組織的核磁共振成像可見軟骨連續(xù)，軟骨下骨無囊變等異常；對(duì)軟骨細(xì)胞的蘇木素-伊紅染色及對(duì)蛋白聚糖的甲苯胺藍(lán)染色顯示缺損填充良好，與周邊組織結(jié)合緊密，GAG含量接近正常軟骨。
[0161]可見，本發(fā)明實(shí)施例提供的E7多肽修飾的軟骨組織工程修復(fù)支架對(duì)軟骨缺損進(jìn)行了有效缺損，且在6個(gè)月內(nèi)使受損的軟骨組織達(dá)到正常軟骨組織的形態(tài)和功能，對(duì)于軟骨修復(fù)具有重要的意義。
[0162]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、 等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種軟骨組織工程修復(fù)支架，其特征在于，所述軟骨組織工程修復(fù)支架的成分包括天然高分子水凝膠和脫鈣骨基質(zhì)，所述脫鈣骨基質(zhì)表面偶聯(lián)有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞親和肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的軟骨組織工程修復(fù)支架，其特征在于，所述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞親和肽的純度大于等于95%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的軟骨組織工程修復(fù)支架，其特征在于，所述天然高分子水凝膠為殼聚糖水凝膠。
4.一種權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的軟骨組織工程修復(fù)支架的制備方法，其特征在于，所述方法包括: 制備脫鈣骨基質(zhì)； 將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞親和肽偶聯(lián)到所述脫鈣骨基質(zhì)表面，得到骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞親和肽修飾的脫鈣骨基質(zhì)； 配制天然高分子水凝膠溶液； 將所述天然高分子水凝膠溶液注射至所述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞親和肽修飾的脫鈣骨基質(zhì)中，使所述天然高分子水凝膠溶液完全滲入所述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞親和肽修飾的脫鈣骨基質(zhì)中，并在預(yù)設(shè)溫度下進(jìn)行凝膠化反應(yīng)，得到所述軟骨組織工程修復(fù)支架。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的軟骨組織工程修復(fù)支架的制備方法，其特征在于，所述天然高分子水凝膠溶液在20°C時(shí)的粘度為100-400cP。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述 的軟骨組織工程修復(fù)支架的制備方法，其特征在于，所述預(yù)設(shè)溫度為34-38 °C。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的軟骨組織工程修復(fù)支架的制備方法，其特征在于，所述制備脫鈣骨基質(zhì)具體為: 將股骨上附著的軟組織剔去，得到修整的股骨； 取所述修整的股骨的骨骺并清洗； 將所述骨骺切割成預(yù)定大小的骨塊，對(duì)所述骨塊進(jìn)行脫脂處理； 利用EDTA脫鈣技術(shù)對(duì)脫脂后的骨塊進(jìn)行脫鈣，待所述骨塊完全脫鈣后，對(duì)所述骨塊進(jìn)行修剪、消毒，得到所述脫鈣骨基質(zhì)，并于4°C保存。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的軟骨組織工程修復(fù)支架的制備方法，其特征在于，所述將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞親和肽偶聯(lián)到所述脫鈣骨基質(zhì)表面具體為: 配制濃度為10%的己二胺的異丙醇溶液，將所述脫鈣骨基質(zhì)浸泡在所述己二胺的異丙醇溶液內(nèi)I小時(shí)，進(jìn)行胺化處理后沖洗，得到胺化處理的脫鈣骨基質(zhì)； 將所述胺化處理的脫鈣骨基質(zhì)浸泡在含雙異官能團(tuán)交聯(lián)劑的有機(jī)溶液中，并用磷酸鹽緩沖液進(jìn)行沖洗，得到雙異官能團(tuán)交聯(lián)劑功能化的脫鈣骨基質(zhì)； 將含有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞親和肽的磷酸鹽緩沖液注入所述雙異官能團(tuán)交聯(lián)劑功能化的脫鈣骨基質(zhì)中，室溫孵育，將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞親和肽偶聯(lián)到所述脫鈣骨基質(zhì)表面。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的軟骨組織工程修復(fù)支架的制備方法，其特征在于，所述配制天然高分子水凝膠溶液具體為: 配制濃度為2.5%g/ml的殼聚糖的乙酸溶液，高壓滅菌后于4°C保存； 配制濃度為60%的甘油磷酸鈉溶液，除菌后于4°C保存； 在冰浴環(huán)境中，將所述甘油磷酸鈉溶液滴加到所述殼聚糖的乙酸溶液中，攪拌至澄清，得到所述天然高分子水凝膠溶液，室溫保存； 所述甘油磷酸鈉溶液與所述殼聚糖的乙酸溶液的質(zhì)量比為1:9。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的軟骨組織工程修復(fù)支架的制備方法，其特征在于，所述殼聚糖的脫乙酰度大 于等于95%。
【文檔編號(hào)】A61L27/56GK103877616SQ201410101559
【公開日】2014年6月25日 申請(qǐng)日期:2014年3月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月18日
【發(fā)明者】敖英芳, 黃洪杰, 張辛, 邵振興, 陳海峰, 周春燕 申請(qǐng)人:北京大學(xué)第三醫(yī)院