一種血紅蛋白納米粒及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于遞送具有藥理活性化合物的血紅蛋白納米粒的制備方法，將血紅蛋白溶解在溶劑中，加入酸、堿或正負電荷聚電解質(zhì)，再加入變性劑，將藥理活性物質(zhì)包入其中形成血紅蛋白納米粒。經(jīng)本發(fā)明提供的方法形成的納米粒子可以達到80%以上的包封率，超過現(xiàn)有技術(shù)，形成了一種高效低耗的方法，此外，本發(fā)明所提供的方法能夠獲得最高達60%的載藥量，即納米粒中含有60%的藥理活性物質(zhì)。由于有更高的載藥量，在治療時，可以獲得更小的用藥體積，更短的用藥時間，對病人更方便。而較高的載藥量降低了遞送藥理活性物質(zhì)時蛋白的使用量，提高了產(chǎn)品的成本效率且不會受給藥體積的限制。
【專利說明】一種血紅蛋白納米粒及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及藥物制劑，具體涉及一種血紅蛋白納米粒及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]作為血紅細胞主要蛋白成分，血紅蛋白大量存在于人體，具有很好的生物相容性，存在很多與藥物結(jié)合的位點，可以作為藥物的載體遞送藥理活性物質(zhì)。蛋白質(zhì)作為藥物的載體，近年來成為藥劑領(lǐng)域研究熱點，尤其是利用納米技術(shù)將難溶性藥物通過共價或非共價結(jié)合的方式包裹于蛋白中，更是前沿技術(shù)。疏水性藥物與蛋白以非共價方式形成納米粒，其優(yōu)勢在于可以保持藥物的活性，同時實現(xiàn)靶向給藥，降低藥物的毒副作用。
[0003]目前血紅蛋白作為藥物載體主要以蛋白-藥物共價結(jié)合的方式實現(xiàn)，這種技術(shù)主要問題在于共價結(jié)合需要復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)步驟，過程及產(chǎn)物難以控制，且載藥量較低，難以實際應(yīng)用，僅在文獻中有所報道。
[0004]蛋白質(zhì)納米粒形成的方法，主要包括交聯(lián)劑交聯(lián)、去水溶劑法以及變性劑解折疊。如專利CN 200410066471 (阿魏酸鈉白蛋白納米粒制劑及其制備方法)，CN 201310076159(一種注射用載納米粒的微球系統(tǒng)及其制備方法)等，這些方法工藝復(fù)雜，對蛋白的結(jié)構(gòu)有可能有較大的破壞，而且交聯(lián)劑難以實現(xiàn)“定點”交聯(lián)的作用，所形成的的納米粒成分復(fù)雜。
[0005]中國申請201310101785.7公開了 “一種制備用于體內(nèi)遞送藥物活性物質(zhì)的蛋白納米粒的方法”，其中涉及到血紅蛋白納米粒及其制備包括以下步驟:(a) 用第一種溶劑溶解蛋白獲得蛋白溶液；所述的蛋白是白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、膜島素、血管內(nèi)皮抑素、血紅蛋白、肌紅蛋白、溶菌酶、免疫球蛋白、α-2-巨球蛋白、纖維連接蛋白、纖層蛋白、膠原蛋白、明膠、人造多肽與蛋白、或它們的組合；(b)在變性劑或者適合的變性條件下，將藥理活性物質(zhì)加入步驟(a)中所述的蛋白`溶液中，使蛋白展開與再折疊或自組裝，把藥理活性物質(zhì)包入蛋白，形成蛋白納米粒。
[0006]該技術(shù)方案中血紅蛋白作為藥物載體形成納米粒，是在某些變性劑條件下，再加入藥理活性藥物，雖然該技術(shù)方案一定程度上能夠?qū)崿F(xiàn)活性物質(zhì)在體內(nèi)的傳遞。但實際應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，上述方法制備得到的血紅蛋白納米粒穩(wěn)定性及載藥量均有待改善，難以實際推廣應(yīng)用。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0007]本發(fā)明的目的在于提供一種全新的用于遞送具有藥理活性化合物的血紅蛋白納米粒的制備方法，所述方法以血紅蛋白作為納米載體，通過對制備方法的改進能夠進一步提高藥理活性物質(zhì)的載藥量，提高藥理活性藥物的生物利用度，保持藥理活性化合物的性質(zhì)穩(wěn)定，提聞祀向性等。
[0008]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
一種用于遞送具有藥理活性化合物的血紅蛋白納米粒的制備方法，將血紅蛋白溶解在溶劑中，加入酸、堿或正負電荷聚電解質(zhì)，再加入變性劑，將藥理活性物質(zhì)包入其中形成血紅蛋白納米粒。
[0009]發(fā)明人在研究中意外發(fā)現(xiàn)，在血紅蛋白表面帶上電荷，對其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與穩(wěn)定性有更好的控制作用，對后續(xù)形成的納米粒在保持藥理活性物質(zhì)穩(wěn)定性、藥效更有優(yōu)勢，包括具有更高的載藥能力。
[0010]其中，所述藥理活性物質(zhì)與血紅蛋白質(zhì)量比為1飛00:1000,優(yōu)選質(zhì)量比為50^600:1000,所述血紅蛋白納米粒粒徑不超過2 μ m,優(yōu)選粒徑20nnT600nm。
[0011]其中，血紅蛋白在溶劑含量范圍0.1%~10%。
[0012]酸、堿或正負電荷聚電解質(zhì)在溶液中的濃度范圍為1μΜ~0.1Μ。
[0013]變性劑與血紅蛋白的摩爾比為0.5~100:1。
[0014]本發(fā)明所述的制備方法，所述的藥理活性物質(zhì)包括姜黃素、紫杉醇、多西紫杉醇、非諾貝特、硝苯地平、5-氟尿嘧啶、洛莫司汀、藤黃酸、放線菌素D、冬凌草甲素、卡莫司汀、鬼臼毒素、阿霉素、伊立替康、布洛芬、雷帕霉素、絲裂霉素C或它們的組合。
[0015]其中優(yōu)選所述的藥理活性化合物為姜黃素。姜黃素儲存穩(wěn)定及水溶性很差，從而限制其在臨床上的應(yīng)用。本發(fā)明技術(shù)方案中，當(dāng)所述藥物活性化合物為姜黃素時，本發(fā)明所述的制備方法能夠解決姜黃素的疏水性，提高其生物活性。工藝流程簡單，形成粒徑大小均一、可控的納米制劑。
[0016]本發(fā)明的方法中的血紅蛋白包括但不局限于人血紅蛋白，牛血紅蛋白，豬血紅蛋白，馬血紅蛋白等其他種類血紅蛋白，以及它們的組合。
[0017]本發(fā)明所述的制備方法，其中溶解血紅蛋白的溶劑選自水、生理鹽水、糖、凍干保護劑，凍干保護劑是磷酸鹽、甘氨`酸、醋酸鹽、海藻糖、蔗糖、乙酰色氨酸、葡萄糖或它們的組合，具體的選擇為本領(lǐng)域技術(shù)人員所掌握，本發(fā)明優(yōu)選所述的溶劑為水、生理鹽水或者5%葡萄糖溶液。
[0018]其中，所述的納米粒子的平均直徑優(yōu)選為20 nm~600 nm ;最優(yōu)為50 nm~200nm。所述血紅蛋白溶液條件優(yōu)選在-10~80°C進行,最優(yōu)在0°C~55°C進行。
[0019]本發(fā)明技術(shù)方案再進一步提出了一種優(yōu)選制備姜黃素血紅蛋白納米粒的方法，所述方法包含以下步驟:在0°c~55°C條件下，用第一種溶劑溶解血紅蛋白獲得蛋白溶液，加入適量的酸堿或者正負電荷聚電解質(zhì)，將姜黃素加入上述的血紅蛋白溶液，從而引起蛋白展開與再折疊或自組裝，把疏水藥物姜黃素包在血紅蛋白中；將納米粒透析除去多余的小分子化合物或者進一步濃縮；對所得溶液進行脫水作用，制得能夠保存的藥物劑型。
[0020]作為本發(fā)明的最佳實施方法，制備姜黃素血紅蛋白納米粒的方法包含以下步驟:稱取IOOmg人血紅蛋白，加入IOmL純水，加入適量聚乙烯胺水溶液，溫度保持25°C，形成血紅蛋白水溶液10mg/mL，加入二硫蘇糖醇150微升，10分鐘后，加入2mL姜黃素乙醇溶液(10mg/mL),離心除去沉淀,取上清，即所得納米粒,粒徑分布2(T200nm。
[0021]這里制得的納米粒平均粒徑為50~200nm，可包載占粒子總重量約I~60%的藥理活性化合物。
[0022]本發(fā)明所述的“納米粒”，指的是小的粒子，一般為復(fù)合體，在轉(zhuǎn)運和性質(zhì)方面為一個整體。本發(fā)明所制備的血紅蛋白納米粒平均粒徑小于2000 nm。一個更好的區(qū)間是20 nm到200 nm。而且,本發(fā)明所制備的血紅蛋白納米粒能夠結(jié)合高達60%的藥理活性化合物。
[0023]本發(fā)明中所述的將藥理活性化合物包入血紅蛋白，指的是藥理活性物質(zhì)可以通過蛋白的展開和再折疊，進入蛋白特定區(qū)域。一般來說，藥理活性物質(zhì)為:經(jīng)動物實驗或臨床試驗，能夠產(chǎn)生藥理反應(yīng)的化合物。本發(fā)明中的藥理活性物質(zhì)特指疏水性化合物。包括如下的化合物，但是不僅僅限于此:抗腫瘤藥物，心血管藥物，抗炎藥物，降糖藥物，中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物，免疫抑制藥物，以及抗病毒藥物。
[0024]本發(fā)明涉及的疏水性藥理活性物質(zhì)可以包括，但是不僅僅局限于此:姜黃素、紫杉醇、多西紫杉醇、非諾貝特、硝苯地平、5-氟尿嘧啶、洛莫司汀、藤黃酸、放線菌素D、冬凌草甲素、卡莫司汀、鬼白毒素、阿霉素、伊立替康、布洛芬、雷帕霉素、絲裂霉素C或它們的組 [0025]在一個更優(yōu)化的范圍中，疏水性藥理活性物質(zhì)為姜黃素。
[0026]本發(fā)明方法中的步驟中用溶劑溶解血紅蛋白獲得蛋白溶液。這里的蛋白溶液指的是溶液中包括血紅蛋白和能夠溶解血紅蛋白的溶劑。在蛋白溶液中使用的溶劑如下，但不僅僅局限于此:水，生理鹽水，糖，凍干保護劑和蛋白穩(wěn)定劑，在更精確的范圍，溶劑包括水，氯化鈉溶液，磷酸鹽溶液，醋酸溶液，甘氨酸溶液，三羥甲基氨基甲烷溶液，過氧化氫水溶液，谷胱甘肽水溶液，葡萄糖溶液，海藻糖溶液，甘露醇溶液，蔗糖溶液，乙酰色氨酸溶液，辛酸鈉溶液，以及它們的混合物。
[0027]在一個更加精確的范圍，蛋白溶液中的溶劑包括水，磷酸鹽，醋酸鹽和氯化鈉溶液。本發(fā)明中所使用的蛋白溶液中的溶劑的濃度只要適合溶解蛋白和蛋白再折疊，都是可行的。
[0028]實驗表明，本發(fā)明中的溶劑溶解血紅蛋白的反應(yīng)參數(shù)對于形成納米粒來說，是非常重要的。一般來說，要獲得一個理想的結(jié)果，本發(fā)明中的溶劑溶解蛋白后須在-10°C到80°C范圍之間反應(yīng)。一個比較精確的范圍是從(TC到55°C。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠清楚溶劑溶解血紅蛋白需要一段時間以使得蛋白充分的溶解。這時間取決于使用溶劑的種類，溶劑的含量，溶劑的濃度和其他的一些因素。一般來說，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠充分意識到，反應(yīng)過程和反應(yīng)過程的每一個步驟都需要充足的時間，舉一個例子，反應(yīng)過程需要5分鐘到8小時不等。
[0029]本發(fā)明的第二個步驟加入適量酸堿或正負電荷聚電解質(zhì)條件下，將藥理活性物質(zhì)加入到經(jīng)過溶劑溶解的血紅蛋白溶液中，使蛋白展開與再折疊或者自組裝。這里使用的適量酸堿或正負電荷聚電解質(zhì)指的是能誘導(dǎo)血紅蛋白改變它們的三維或者二級結(jié)構(gòu)的溶液。一般來說，適量酸、堿或正負電荷聚電解質(zhì)能夠使蛋白表面帶有一定的電荷，從而引起結(jié)構(gòu)的變化。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠充分意識到蛋白表面帶有電荷指的是在蛋白加入適量酸堿或正負電荷聚電解質(zhì)后，由于離子電離產(chǎn)生的帶電基團或離子聚于蛋白表面而形成的靜電斥力和吸引力而發(fā)生的改變。
[0030]其中所述酸為有機酸或無機酸，所述有機酸選自酒石酸、草酸、蘋果酸、枸椽酸、抗壞血酸、苯甲酸、水楊酸、咖啡酸中的一種或幾種；所述的無機酸選自硝酸、硫酸、鹽酸或醋酸中的一種或幾種；所述的堿為有機堿或無機堿，所述無機堿選自氫氧化鈉和/或氫氧化鉀；所述有機堿為帶有氨基的有機化合物，優(yōu)選堿性氨基酸，更優(yōu)選精氨酸、賴氨酸或組氨酸。
[0031]所述正負電荷聚電解質(zhì)指結(jié)構(gòu)單元上含有能蟲直的基里的線型或支化的合成/天然水溶性高分子，包括聚酸類及聚堿類電解質(zhì)。[0032]所述的聚酸類電解質(zhì)指電離后成為陰離子高分子，優(yōu)選為聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚苯i遙磺酸、聚乙烯磺酸、聚乙烯遴藍或其組合；所述的聚堿類電解質(zhì)指電離后成為陽離子高分子,優(yōu)詵為聚乙烯亞胺、聚乙烯胺、聚乙烯吡啶或其組合。
[0033]進一步而言，本發(fā)明所述酸、堿或正負電荷聚電解質(zhì)優(yōu)選為酸優(yōu)選為鹽酸、硝酸、草石酸、抗壞血酸，堿優(yōu)選為氫氧化鈉、氫氧化鉀、堿性氨基酸(如精氨酸、賴氨酸或組氨酸)，正電荷聚電解質(zhì)優(yōu)選聚丙烯酸，負電荷聚電解質(zhì)優(yōu)選聚乙烯亞胺。
[0034]本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠認識到所加的適量酸堿或正負電荷聚電解質(zhì)，包括它們的濃度范圍變化，在溶液中濃度范圍一般為1μΜ~0.1M達到的效果是使蛋白表面帶有“最低限度”的電荷量，在此效果下蛋白結(jié)構(gòu)有展開折疊的變化。
[0035]第三個步驟，加入適量變性劑，在上一步加入酸堿及正負聚電解質(zhì)后，帶電荷的蛋白在變性劑條件下結(jié)構(gòu)更容易展開。
[0036]此處的適量是指變性劑與血紅蛋白的摩爾比為0.5~100:1，優(yōu)選范圍廣20:1。
[0037]本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠意識到本發(fā)明的范圍和精髓是變動的。解折疊的物質(zhì)是變化的，同時許多的藥理活性物質(zhì)是可使用的。本發(fā)明將會在下面的實施例中得到更加明確和清晰地描述。
[0038]本發(fā)明的有益效果在于:
首先，經(jīng)本發(fā)明提供的方法形成的納米粒子可以達到80%以上的包封率，超過現(xiàn)有技術(shù)，形成了一種高效低耗的方法；其次，本發(fā)明所提供的方法能夠獲得最高達60%的載藥量，即納米粒中含有60%的藥理活性物質(zhì)。由于有更高的載藥量，在治療時，可以獲得更小的用藥體積，更短的用藥時間，對病人更方便。較高的載藥量降低了遞送藥理活性物質(zhì)時蛋白的使用量，提高了產(chǎn)品的成本效率；最后，現(xiàn)有技術(shù)提供的較低載藥能力不能滿足高劑量給藥，因為高劑量的給藥需要很大的給藥體積。然而，本實驗發(fā)明的具有高載藥能力的納米粒不會受給藥體積的限制。
[0039]通過本發(fā)明制備的納米粒的另一個有益效果是，納米粒能夠特異性的遞送藥理活性物質(zhì)。且保證藥理活性藥物更有效發(fā)揮作用，如制備形成的姜黃素-血紅蛋白納米粒與游離姜黃素相比，具有很好的殺傷腫瘤細胞的作用。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0040]圖1為姜黃素-血紅蛋白納米粒子掃描電鏡圖；
圖2為姜黃素-血紅蛋白納米粒子透射電鏡圖；
圖3為姜黃素-血紅蛋白納米粒子粒徑分布圖；
圖4為姜黃素-血紅蛋白納米粒中姜黃素穩(wěn)定性；
圖5為姜黃素-血紅蛋白納米粒在coco2細胞中的毒性。
【具體實施方式】
[0041]以下均是基于本發(fā)明的代表性實施例，但下述實施例不會在任何方面限制本發(fā)明的保護范圍。
[0042]實施實例1
姜黃素-人血紅蛋白納米粒制備稱取IOOmg人血紅蛋白，加入IOmL純水,加入適量氫氧化鈉水溶液,溫度保持25°C,形成血紅蛋白水溶液10mg/mL，加入巰基乙醇150微升，10分鐘后，加入2mL姜黃素乙醇溶液(10mg/mL),離心除去沉淀,取上清，即所得納米粒,粒徑分布2(T300nm。
[0043]實施實例2
姜黃素-人血紅蛋白納米粒制備
稱取IOOmg人血紅蛋白，加入IOmL純水,加入適量氫氧化鈉水溶液,溫度保持25°C,形成血紅蛋白水溶液10mg/mL,加入尿素溶液150微升，10分鐘后，蛋白沉淀,加入2mL姜黃素乙醇溶液(10mg/mL),放入透析袋中透析24h,離心除去沉淀,取上清，即所得納米粒,粒徑分布 2(T200nm。
[0044]實施實例3
姜黃素-人血紅蛋白納米粒制備
稱取IOOmg人血紅蛋白，加入IOmL純水，加入適量鹽酸水溶液，溫度保持25°C，形成血紅蛋白水溶液10mg/mL，加入巰基乙醇150微升，10分鐘后，加入2mL姜黃素乙醇溶液(10mg/mL),離心除去沉淀,取上清，即所得納米粒,粒徑分布2(T200nm。
[0045]實施實例4
姜黃素-人血紅蛋白納米粒制備
稱取IOOmg人血紅蛋白，加入IOmL純水，加入適量聚丙烯酸水溶液，溫度保持25°C，形成血紅蛋白水溶液10mg/mL,加入二硫蘇糖醇150微升，10分鐘后,加入2mL姜黃素乙醇溶液(10mg/mL),離心除去沉淀,取上清，即所得納米粒,粒徑分布2(T200nm。
[0046]實施實例5`
姜黃素-人血紅蛋白納米粒制備
稱取IOOmg人血紅蛋白，加入IOmL純水，加入適量聚乙烯胺水溶液，溫度保持25°C，形成血紅蛋白水溶液10mg/mL,加入二硫蘇糖醇150微升，10分鐘后,加入2mL姜黃素乙醇溶液(10mg/mL),離心除去沉淀,取上清，即所得納米粒,粒徑分布2(T200nm。
[0047]實施實例6
姜黃素-人血紅蛋白納米粒制備
稱取IOOmg人血紅蛋白，加入IOmL純水，加入適量聚丙烯酸水溶液，溫度保持25°C，形成血紅蛋白水溶液10mg/mL，加入巰基乙醇150微升，10分鐘后，加入2mL姜黃素乙醇溶液(10mg/mL),離心除去沉淀,取上清，即所得納米粒,粒徑分布2(T200nm。
[0048]實施實例7
姜黃素-人血紅蛋白納米粒制備
稱取IOOmg人血紅蛋白，加入IOmL純水，加入適量精氨酸水溶液，溫度保持35°C，形成血紅蛋白水溶液10mg/mL，加入巰基乙醇150微升，10分鐘后，加入2mL姜黃素乙醇溶液(10mg/mL),離心除去沉淀,取上清，即所得納米粒,粒徑分布2(T200nm。
[0049]實施實例8
紫杉醇-人血紅蛋白納米粒制備
稱取IOOmg人血紅蛋白，加入IOmL純水，加入適量谷氨酸水溶液，溫度保持35°C，形成血紅蛋白水溶液10mg/mL，加入巰基乙醇150微升，10分鐘后，加入2mL紫杉醇乙醇溶液(10mg/mL),離心除去沉淀,取上清，即所得納米粒,粒徑分布2(T200nm。[0050]實施實例9
多西紫杉醇-血紅蛋白納米粒制備
稱取IOOmg人血紅蛋白，加入IOmL純水，加入適量精氨酸水溶液，溫度保持35°C，形成血紅蛋白水溶液10mg/mL，加入巰基乙醇150微升，10分鐘后，加入2mL多西紫杉醇乙醇溶液(10mg/mL),離心除去沉淀,取上清，即所得納米粒,粒徑分布2(T200nm。
[0051]實施實例10
非諾貝特-血紅蛋白納米粒制備
本實施例與實施例1相同，僅改變姜黃素為非諾貝特，粒徑分布為2(T200nm。
[0052]實施實例11
硝苯地平-血紅蛋白納米粒制備
本實施例與實施例1相同，僅改變姜黃素為硝苯地平，粒徑分布為2(T200nm。
[0053]實施實例12
5-氟尿喃唳-血紅蛋白納米粒制備
本實施例與實施例1 相同，僅改變姜黃素為5-氟尿嘧啶，粒徑分布為2(T200nm。
[0054]實施實例13
洛莫司汀-血紅蛋白納米粒制備
本實施例與實施例1相同，僅改變姜黃素為洛莫司汀，粒徑分布為2(T200nm。
[0055]實施實例14
藤黃酸-血紅蛋白納米粒制備
本實施例與實施例1相同，僅改變姜黃素為藤黃酸，粒徑分布為2(T200nm。
[0056]實施實例15
放線菌素D -血紅蛋白納米粒制備
本實施例與實施例1相同，僅改變姜黃素為放線菌素D，粒徑分布為2(T200nm。
[0057]實施實例16
冬凌草甲素-血紅蛋白納米粒制備
本實施例與實施例1相同，僅改變姜黃素為冬凌草甲素，粒徑分布為2(T200nm。
[0058]實施實例17
卡莫司汀-血紅蛋白納米粒制備
本實施例與實施例1相同，僅改變姜黃素為卡莫司汀，粒徑分布為2(T200nm。
[0059]實施實例18
鬼臼毒素-血紅蛋白納米粒制備
本實施例與實施例1相同，僅改變姜黃素為鬼臼毒素，粒徑分布為2(T200nm。
[0060]實施實例19
阿霉素-血紅蛋白納米粒制備
本實施例與實施例1相同，僅改變姜黃素為阿霉素，粒徑分布為2(T200nm。
[0061]實施實例20
伊立替康-血紅蛋白納米粒制備
本實施例與實施例1相同，僅改變姜黃素為伊立替康，粒徑分布為2(T200nm。
[0062]實施實例21布洛芬-血紅蛋白納米粒制備
本實施例與實施例1相同，僅改變姜黃素為布洛芬，粒徑分布為2(T200nm。
[0063]實施實例22
雷帕霉素-血紅蛋白納米粒制備
本實施例與實施例1相同，僅改變姜黃素為雷帕霉素，粒徑分布為2(T200nm。
[0064]試驗例I
對實例5所制得納米粒子進行掃描電鏡表征，所用儀器為日本日立公司S-3400型掃描電鏡，結(jié)果見圖1。如圖1所示，所得的納米粒為球形，大小約150nm，球形的納米粒子在溶液中有很好的穩(wěn)定性。
[0065]對實例5所制得納米粒子進行透射電鏡表征，所用儀器為日本產(chǎn)JEM-2100透射電鏡(加速電壓200kv)結(jié)果見圖2。如圖2所示，納米粒的形態(tài)為球形，大小在IOOnm左右，大小均一。
[0066]對實例5所制得納米粒子進行粒徑分布測定:所用儀器為BIC 90plus ParticleSize Analyzer,平均粒徑為80.4nm分布區(qū)間為42.3~153.5nm，結(jié)果如圖3所示。
[0067]對實例5所制得姜黃素-血紅蛋白納米粒中姜黃素的UV光譜穩(wěn)定性進行測定，所用儀器為日本島津UV-2450分光光度計，結(jié)果見圖4。從圖4中可以看出，姜黃素的紫外吸收峰形在一個月后依然沒有明顯變化，說明形成納米粒后姜黃素的性質(zhì)沒有變化，保證了其藥理活性。
[0068]實例5所制得的姜黃素-血紅蛋白納米粒在Caco-2細胞中的毒性結(jié)果見圖5。從圖5中可以看出，納米粒與游離姜黃素殺傷Caco-2細胞的能力相當(dāng)。
[0069]對其他實施例所制備的血紅蛋白納米粒重復(fù)上述試驗，所得試驗結(jié)果基本一致，其中以實施例5所制備的姜黃素-血紅蛋白納米粒質(zhì)量最佳。
[0070]試驗例2
為了驗證加入酸、堿或正負電荷聚電解質(zhì)對納米粒形成的影響，將實施例1，2，3，4，5，6中步驟2 (即加入酸、堿或正負電荷電解質(zhì))除去，得到對照例1-6，對其進行綜合性能檢測，結(jié)果見表1、2:
表1 (制備中加入酸、堿或正負電荷電解質(zhì))
【權(quán)利要求】
1.一種用于遞送具有藥理活性化合物的血紅蛋白納米粒的制備方法，其特征在于，將血紅蛋白溶解在溶劑中，加入酸、堿或正負電荷聚電解質(zhì)，再加入變性劑，將藥理活性物質(zhì)包入其中形成血紅蛋白納米粒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于:所述藥理活性物質(zhì)與血紅蛋白質(zhì)量比為1~600:1000，優(yōu)選質(zhì)量比50-600:1000所述血紅蛋白納米粒粒徑不超過2 μ m，優(yōu)選粒徑 20nm~600nm。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的制備方法，其特征在于:所述血紅蛋白為人血紅蛋白，牛血紅蛋白，豬血紅蛋白或馬血紅蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的制備方法，其特征在于:所述的藥理活性物質(zhì)包括姜黃素、紫杉醇、多西紫杉醇、非諾貝特、硝苯地平、5-氟尿嘧啶、洛莫司汀、藤黃酸、放線菌素D、冬凌草甲素、卡莫司汀、鬼日毒素、阿霉素、伊立替康、布洛芬、雷帕霉素、絲裂霉素C或它們的組合；優(yōu)選所述的藥理活性化合物為姜黃素。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項所述的制備方法，其特征在于:所述酸、堿或正負電荷聚電解質(zhì)在-10°C~80°C的溫度下加入，優(yōu)選0~55°C。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項所述的制備方法，其特征在于:所述酸為有機酸或無機酸，所述有機酸選自酒石酸、草酸、蘋果酸、枸椽酸、抗壞血酸、苯甲酸、水楊酸、咖啡酸中的一種或幾種；所述的無機酸選自硝酸、硫酸、鹽酸或醋酸中的一種或幾種；所述的堿為有機堿或無機堿，所述無機堿選自氫氧化鈉和/或氫氧化鉀；所述有機堿為帶有氨基的有機化合物，優(yōu)選堿性氨基酸，更優(yōu)選精氨酸、賴氨酸或組氨酸；所述正負電荷聚電解質(zhì)指結(jié)構(gòu)單元上含有能電離的基團的線型或支化的合成/天然水溶性高分子，包括聚酸類及聚堿類電解質(zhì)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于:所述的聚酸類電解質(zhì)指電離后成為陰離子高分子，優(yōu)選為聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚苯乙烯磺酸、聚乙烯磺酸、聚乙烯磷酸或其組合；所述的聚堿類電解質(zhì)指電離后成為陽離子高分子，優(yōu)選為聚乙烯亞胺、聚乙烯胺、聚乙烯吡唳或其組合。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項所述所述的制備方法，其特征在于:所述的變性劑為甲醇、乙醇、丙酮、巰基乙醇、尿素、二硫蘇糖醇、過甲酸、戊二醛、乙二醛或其中任意組合。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項所述的制備方法，其特征在于:血紅蛋白在溶劑含量范圍0.1%~10% ;酸、堿或正負電荷聚電解質(zhì)在溶液中的濃度范圍為1 μ M^0.1M ;變性劑與血紅蛋白的摩爾比為0.5~100:1，優(yōu)選1~20:1。
10.權(quán)利要求1-9任一項所述的制備方法制備的血紅蛋白納米粒。
【文檔編號】A61P35/00GK103861115SQ201410099459
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年3月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月18日
【發(fā)明者】楊伊林, 胡一橋, 支楓, 王開開, 賈雪峰, 周在剛 申請人:常州市第一人民醫(yī)院, 南京大學(xué), 常州諾方醫(yī)藥生物技術(shù)有限公司