茶樹來源的3種microRNA及其應用的制作方法
【專利摘要】茶樹來源的3種microRNA及其應用，屬于藥物【技術領域】。本發明提供了3種來源于茶樹的microRNA序列和microRNA前體序列，以及其在腫瘤、糖尿病、脂肪肝和呼吸系統疾病治療中的用途。
【專利說明】茶樹來源的3種microRNA及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于藥物【技術領域】，具體涉及3種來源于茶樹的microRNA及其應用。
【背景技術】
[0002]microRNA (miRNA)是近年來研究較多的“明星分子”。由18-25個核苷酸組成的非編碼RNA，首先由核基因組轉錄，形成帶帽狀結構和多聚腺苷尾巴的初級miRNA(pr1-miRNA)o Pr1-miRNA經核酸酶Drosha處理后形成約70nt的含莖環節后的前體miRNA(pre-miRNA),其后又經核酸酶剪切為成熟的miRNA。miRNA通過堿基非完全配對與靶基因mRNA 3’UTR序列結合,引導沉默復合體(RNA-1nduced silencing complex,RISC)降解mRNA或抑制mRNA的翻譯,從而調控基因的表達。一個miRNA可結合多個祀基因，而一個mRNA也可由多個miRNA共同調節。這種復雜的調節網絡既可以通過一個miRNA來調控多個基因的表達，也可以通過幾個miRNA的組合來精細調控某個基因的表達。據推測，miRNA調節著人類三分之一的基因。
[0003]研究證明，miRNA廣泛參與細胞活動的一系列生理及病理活動過程，包括細胞發育、細胞調亡、細胞代謝、腫瘤形成、病毒感染及免疫應答等。miRNA作為調控細胞功能的關鍵因子，其與人體疾病的發生發展密切相關。當生物體體內Dicer酶缺失或不足時，內源性miRNA無法正常生成，從而導致干細胞的丟失和細胞周期的改變、早期胚胎體致死和器官發育異常。MiR-17在肺生長發育中也起到重要作用。缺乏miR-17基因的胚胎具有嚴重的肺部發育不良，但沒有某特定的分支缺陷；在miR-17基因缺失小鼠中表現為B細胞發育緩慢，嚴重的肺及心臟發育缺陷，并將導致出生后不久死亡。肺內特異性過表達miR-17則表現出內皮細胞過度增生，抑制肺內皮祖細胞的分化。在肺內炎性反應中，內毒素可以引起巨噬細胞中miR-132，miR-146a, miR-155表達水平增加，miR-125b表達水平下降。另一個炎癥系統中重要的miRNA是miR-155，它在病毒或細菌刺激的巨噬細胞中表達增加，更有意義的是，miR-155是唯一受細菌或病毒刺激后表達都增加的miRNA。miRNA廣泛參與腫瘤的病理過程，Let-7基因家族能調控N-Ras和K-Ras mRNA表達，其編碼的miRNA與肺癌的發生密切相關，其革巴點包括Ras家族和非組蛋白染色體蛋白HMGA2(high-mobility groupprotein A2)。
[0004]由于miRNA不僅在基因位置上保守，序列上也呈現出高度的同源性。那么一些植物內源性的核苷酸類物質通過日常飲食吸收進入體內后,可被體內的Dicer酶剪切，產生一類類似于miRNA的核苷酸類物質，進而影響人體mRNA的表`達。茶葉是很多人日常生活中的必需品，茶葉在人體保健和醫藥方面有很多的研究和應用。來源于茶葉的miRNA是否能夠通過飲用的方式進入人體，并調節人體內的相應基因的表達，進而對人體健康產生或好或壞的影響，這是一個很有意思，也很有意義的課題。如果我們能夠找到茶葉中相應的miRNA在人體內發現并調節相應基因的證據，進而研究其靶基因相應的功能，可能會對于茶葉保健或者醫療方面的分子機理有更加深入的認識。
[0005]為了驗證這些檢測到的植物miRNA序列的確來源于植物，對人/小鼠血清的totalRNA進行高碘酸鈉處理，對人/小鼠血清中檢測到的幾個植物miRNA進行miRNA測序和qPCR鑒定。由于高碘酸鈉為強氧化劑，能夠氧化動物來源的miRNA的2’、3’位自由羥基，導致動物來源的miRNA在進行miRNA測序和qPCR時不被檢測到或者檢測豐極低。植物來源的miRNA由于其末端本身是2-0-甲基化修飾的，高碘酸鈉處理對對其結構不產生影響，所以在進行miRNA測序和qPCR時其檢測表達量幾乎不產生變化。從而證明幾個miRNA的確來源于植物。
【發明內容】
[0006]針對現有技術存在的問題，本發明的目的在于設計提供3種來源于茶樹的治療腫瘤、糖尿病、脂肪肝和呼吸系統疾病的microRNA及其應用的技術方案。
[0007]所述的用于制備治療腫瘤、糖尿病、脂肪肝和呼吸系統疾病的藥物，其特征在于包含3種茶樹microRNA的任一種，所述的3種茶樹microRNA分別為cs1-miRl、csi_miR2和cs1-miR3,所述的csiniRl核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示,所述的csi_miR2核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述的cs1-miR3核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
[0008]所述的用于制備治療腫瘤、糖尿病、脂肪肝和呼吸系統疾病的藥物，其特征在于3種茶樹microRNA的前體RNA包含如下序列:csi_miRl前體核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，cs1-miR2前體核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，csi_miR3前體核苷酸序列如SEQ IDNO:6所示。
[0009]所述的用于制備治療腫瘤、糖尿病、脂肪肝和呼吸系統疾病的藥物，其特征在于所述的茶樹包含如下任何一種:山茶屬植物茶樹、瘤葉短蕊茶、白毛紅山茶、油茶、山茶、厚短蕊茶、拎木屬植物拎木和崗茶。
[0010]所述的3種茶樹microRNA在制備治療腫瘤、糖尿病、脂肪肝和呼吸系統疾病藥物中的應用，其特征在于包含cs1-miRl、csi_miR2和csi_miR3中的任一種，所述的csi_miRl核苷酸序列如SEQ ID NO:1所 示,所述的cs1-miR2核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示,所述的cs1-miR3核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
[0011]所述的應用,其特征在于3種茶樹microRNA的前體RNA包含如下序列:csi_miRl前體核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，cs1-miR2前體核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，cs1-miR3前體核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
[0012]所述的應用，其特征在于所述的茶樹包含如下任何一種:山茶屬植物茶樹、瘤葉短蕊茶、白毛紅山茶、油茶、山茶、厚短蕊茶、拎木屬植物拎木和崗茶。
[0013]本發明一方面提供了一種治療肺部感染性疾病的藥物，該藥物具有抗腫瘤細胞增殖，降低II型糖尿病高血糖，改善肝臟脂肪積聚及其所產生的炎癥，抑制病毒誘導的肺損傷、肺水腫、肺炎，降低支氣管黏液分泌等藥理作用，本發明另一方面確定了一種治療腫瘤、糖尿病、脂肪肝和呼吸系統疾病的藥物的應用，其可作為治療非小細胞肺癌、肝癌、II型糖尿病、非酒精性脂肪肝炎、急性肺炎、流感病毒性肺炎。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0014]圖lcs1-miRl~3 二級莖環節構；
圖2PT-PCR檢測不同茶樹植物中cs1-miRl~3的表達，M:50 bp DNA ladder ；1~8:依次是茶樹(Camellia sinensis)、瘤葉短蕊茶(C.muricatala Chang)、白毛紅山茶(C.albovillosa)、油茶(C.0lifera Abel)、山茶(C.Japounica Linn.)、厚短蕊茶(C.pachyandra)、憐木(Eurya acuminatissima Merr)、崗茶(Eurya chinensis)；
圖3cs1-miRl~3對荷瘤小鼠A549及!fepG2腫瘤組織中相關基因表達的影響；
圖4cs1-miRl~3對II型糖尿病小鼠胰島細胞形態的影響；
圖5cs1-miRl~3對非酒精性脂肪肝炎大鼠肝細胞病理形態的影響；
圖6cs1-miRl~3對流感病毒性小鼠肺組織病理形態的影響。
【具體實施方式】
[0015]以下結合實施例來進一步說明本發明。
[0016]實施例1:miRNA的篩選及鑒定
選擇新鮮的茶樹葉片，分別用于喂食小鼠和miRNA測序(2個生物學重復)。兩組ICR小鼠(18~20 g)，共計24只，分別禁食12 h后，對照組喂食小鼠飼料，實驗組灌食茶樹葉片。不同的時間點采集相應小鼠的肝臟組織和血清，分別提取total RNA。喂食小鼠飼料組0h、3h的血清樣本RNA等量混合進行I個miRNA測序，3h、6h的血清樣本RNA等量混合進行一個miRNA測序；喂食小鼠飼料組0h、3h的肝臟樣本RNA等量混合進行I個miRNA測序，3h、6h的肝臟樣本RNA等量混合進行一個miRNA測序。灌食茶樹葉片組樣本采集和測序如上。根據測序結果，選擇在茶樹葉片miRNA測序中發現并有較高表達豐度，在喂食小鼠飼料的小鼠組織/血清miRNA測序中未發現或者表達豐度很低，在灌食茶樹葉片組的小鼠組織/血清miRNA測序中發現并有較高表達豐度的miRNA，這些miRNA作為植物來源的miRNA在小鼠體內發揮生物學功能的可能性很大。對于這些植物來源的miRNA (選擇3-5個表達豐度相對高的)，通過qPCR分別在喂食小鼠飼料/灌食茶樹葉片的血清/肝臟RNA和茶樹葉片RNA進行鑒定。最終選擇小鼠cs`1-miRl:UGUCAGUUUGUCAAAUAAA (該序列如SEQ ID NO:1 所示)；cs1-miR2:UGGUAGUUGGUGGUAGUGGUAG (該序列如 SEQ ID NO:2 所示)；csi_miR3:GGGUGCAGAGACAGCCAGA (該序列如SEQ ID NO:3所示)，其前體序列分別為cs1-miRl前體:AUCCCAGAACUAACAGAGGAAAGAAGAGCUUCUGUCAGGAAAGGAAGGCAAUUAUGGUAAUGUCAGUUUGUCAAAUAAAUU ⑶ AAAAACA ⑶ UUCAAA ⑶ AAACGCAUA ⑶⑶ GGGAAGAUGAAUUAUGG ⑶ CACAGAG^^GCUCUUCCUUAGAUCCAGG(該序列如SEQ ID NO:4所示);csi_miR2前體:GAACUUUUGUGUUUGAUUU⑶⑶GGAACCAAUGAUG⑶⑶ AUCAAG⑶UA⑶ CAG ⑶UUCCAGCC ⑶⑶G⑶ A ⑶UG⑶ G⑶ A⑶G ⑶ AGGCAUCAUGGACAGAGCACACGCAAUCAAAGACC(該序列如 SEQ ID NO:5 所示);csi_miR3 前體:UUCCUCUGGUGUGUACUUGUCAUCCAGCACAGUGGGUGCAGAGACAGCCAGAGCUC(該序列如 SEQ ID NO:6 所示)。比較其表達量在喂食小鼠飼料/灌食茶樹后隨著時間變化的趨勢，基本判定這些miRNA是來自于茶葉灌食。通過RNA 二級結構分析軟件,確定cs1-miRl前體、csi_miR2前體和csi_miR3前體的二級結構如圖1所示。
[0017]實施例2:3種miRNA在植物中的分布
采用改進的CTAB法從茶樹葉片中提取和富集小分子RNAs。具體如下:(1)每個樣品取
0.1 g茶樹嫩葉片在液氮中迅速研碎，轉移到含有600 μι CTAB緩沖液(2% CTAB;100 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0 ；20 mmol/L EDTA ；1.4 mol/L NaCl ；2% β -巰基乙醇)的 1.5 ml 離心管中，混勻后，65°C水浴20 min。(2)4°C 8 000 r/min離心10 min，上清液被轉移到新的離心管中，用氯仿/異戊醇(24:1)抽提2次。(3)上清液再次被轉移到新的離心管中，加入1/4 體積的 10 mol/L LiCl,混勻后，-20°C沉淀 2 h。(4) 4°C 10 000 r/min 離心 10 min,棄上清，用 300 μ? DEPC 水溶解沉淀，加入 50 μ? 50% PEG8000 和 50 μ? 5 mol/L NaCl，混勻后，冰浴2 h。(5)4°C 10 000 r/min離心10 min，上清液被轉移到新的離心管中，加入1/10體積的3 mol/L NaAc (pH 5.2)和2.5倍體積的無水乙醇，混勻后_70°C沉淀I h。
(6)4°C 10 000 r/min 離心 20 min,用 300 M-1 DEPC 水溶解沉淀，加入 3 M-1 RNase-freeDNase I和I μ? RNase抑制劑，37°C酶解3 h。(7)用氯仿/異戊醇(24:1)抽提I次，上清液加入1/10體積的3 mol/L NaAc (pH 5.2)和2.5倍體積的無水乙醇，混勻后_70°C沉淀I h。(8)4°C 10 000 r/min離心20 min，用20 μ? DEPC水溶解沉淀，然后在2.5%的瓊脂糖凝膠上檢測小分子RNA的完整性。
[0018]采用莖環RT-PCR方法來檢測鑒定茶樹中保守miRNA。采用表1中引物完成RT-PCR 反應。
[0019]表1采用莖環引物鑒定miRNAs的引物序列
【權利要求】
1.用于制備治療腫瘤、糖尿病、脂肪肝和呼吸系統疾病的藥物，其特征在于包含3種茶樹microRNA 的任一種，所述的 3 種茶樹 microRNA 分別為 cs1-miRl、csi_miR2 和 csi_miR3,所述的cs1-miRl核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示,所述的csi_miR2核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示，所述的cs1-miR3核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
2.如權利要求1所述的用于制備治療腫瘤、糖尿病、脂肪肝和呼吸系統疾病的藥物，其特征在于3種茶樹microRNA的前體RNA包含如下序列:csi_miRl前體核苷酸序列如SEQID NO:4所示，cs1-miR2前體核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，csi_miR3前體核苷酸序列如 SEQ ID NO:6 所示。
3.如權利要求1所述的用于制備治療腫瘤、糖尿病、脂肪肝和呼吸系統疾病的藥物，其特征在于所述的茶樹包含如下任何一種:山茶屬植物茶樹、瘤葉短蕊茶、白毛紅山茶、油茶、山茶、厚短蕊茶、拎木屬植物拎木和崗茶。
4.3種茶樹microRNA在制備治療腫瘤、糖尿病、脂肪肝和呼吸系統疾病藥物中的應用，其特征在于包含cs1-miRl、csi_miR2和csi_miR3中的任一種，所述的cs1-miRl核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述的cs1-miR2核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述的csi_miR3核苷酸序列如SEQ ID NO: 3所示。
5.如權利要求4所述的應用,其特征在于3種茶樹microRNA的前體RNA包含如下序列:cs1-miRl前體核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，csi_miR2前體核苷酸序列如SEQ IDNO:5所示，cs1-miR3前體核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
6.如權利要求4所述的應用，其特征在于所述的茶樹包含如下任何一種:山茶屬植物茶樹、瘤葉短蕊茶、白毛紅山茶、油茶、山茶、厚短蕊茶、拎木屬植物拎木和崗茶。
7.如權利要求4所述的應用，其特征在于所述的腫瘤為肺癌和肝癌，所述的糖尿病為 II型糖尿病，所述的脂肪 肝為非酒精性脂肪肝炎，所述的呼吸系統疾病為急性肺炎和流感病毒性肺炎。
【文檔編號】A61K48/00GK103816549SQ201410091296
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2014年3月13日 優先權日:2014年3月13日
【發明者】余陳歡, 應華忠, 鐘宇森, 金曉音, 呂宇, 方杰 申請人:浙江省醫學科學院