用于乳腺癌的診斷、預后和治療的基于MicroRNA的方法和組合物的制作方法

用于乳腺癌的診斷、預后和治療的基于MicroRNA的方法和組合物的制作方法
【專利摘要】本發明提供了用于乳腺癌的診斷、預后和治療的新的方法和組合物。本發明還提供了鑒定抗乳腺癌試劑的方法。
【專利說明】用于乳腺癌的診斷、預后和治療的基于MicroRNA的方法和組合物
[0001]本申請是分案申請，其直接母案申請是申請日為2006年7月31日、申請號為201110319534.7的同名發明專利申請；其原始母案申請是申請日為2006年7月31日、申請號為200680036598.3的同名發明專利申請。
[0002]發明背景
[0003]乳腺癌是美國和全球范圍內的婦女的重大健康問題。盡管在疾病的檢測和治療上已取得了進步，但乳腺癌仍然是婦女中癌癥相關性死亡的第二大病因，在美國其每年影響著180，000多位婦女。對于北美的婦女，一生中患乳腺癌的概率現在為八分之一。
[0004]目前沒有用于治療或預防乳腺癌的普遍成功的方法。目前乳腺癌的治療依賴于早期診斷(例如，通過常規的乳腺篩查方法)和侵入性治療的組合，其可包括多種治療例如手術、放射療法、化學療法和激素療法中的一種或多種。通常基于許多預后參數(包括特異性腫瘤標記的分析)來選擇特定乳腺癌的療程。參見，例如，Porter-Jordan和Lippman, BreastCancer8:73-100(1994)。
[0005]盡管BRCAl和BRCA2的發現在鑒定參與乳腺癌的關鍵遺傳因素中是非常重要的步驟，但已逐漸清楚BRCAl和BRCA2的突變只解釋部分對乳腺癌的遺傳易感性(Nathanson，K.L.等人，Human Mol.Gen.10(7):715-720 (2001);Anglican Breast Cancer StudyGroup.Br.J.Cancer83(10):1301-08(2000);和 Syrjakoski K.，等人，J.Natl.CancerInst.92:1529-31 (2000))。盡管對乳腺癌的治療進行了大量研究，但乳腺癌仍然難以有效地診斷和治療，并且乳腺癌患者中觀察到的高死亡率表明疾病的診斷、治療和預防需要提聞。
[0006]MicroRNA(微RNA)是通過與信使RNA (mRNA)靶雜交和引發其的翻譯抑制或較不常見地引起其降解來控制基因表達的小的`、非編碼RNA種類。miRNA的發現和研究已揭示在生物發育和各種細胞過程例如細胞分化、細胞生長和細胞死亡中發揮重要作用的miRNA介導的基因調控機制(Cheng，A.M.，等人，Nucleic Acids Res.33:1290-1297(2005))。近年來的研究表明特定miRNA的異常表達可參與人的疾病例如神經障礙(neurological disorder)(Ishizuka, A.,等人，Genes Dev.16:2497-2508 (2002))和癌癥。具體地，已在人慢性淋巴細胞性白血病中發現miR-16-l和/或miR_15a的不當表達(misexpression) (Calin, G.A.,等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.99:15524-15529 (2002))。
[0007]包含所有已知的人microRNA的微陣列的發展和應用已允許同時分析樣品中的每一種 miRNA 的表達(Liu, C.G.，等人，Proc Natl.Acad.Sci U.S.A.101:9740-9744 (2004))。這些microRNA微陣列不僅已用于確認miR-16-l在人CLL細胞中擺脫控制，而且還用于產生與良好建立的人CLL的臨床病理特征關聯的miRNA表達特征譜(Calin，G.A.，等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.101:1175-11760 (2004))。
[0008]使用miCToRNA微陣列鑒定microRNA組群(其在正常細胞和乳腺癌細胞之間差異表達)(即，表達特征譜或表達譜)的用途可幫助精確識別參與乳腺癌的特異性miRNA。此外，這些miRNA的假定的靶的鑒定可幫助闡明它們的致病作用。本發明提供了用于乳腺癌的診斷、預后和治療的新的方法和組合物。
[0009]發明概述
[0010]本發明部分基于相對于正常對照細胞，在乳腺癌細胞中差異表達的miRNA的乳腺癌特異性特征譜(Signature)的鑒定。
[0011]因此，本發明包括診斷受試者是否具有乳腺癌或處于發生乳腺癌的風險中的方法，該方法包括測量來自受試者的受試樣品中的至少一種miR基因產物的水平和將受試者樣品中的miR基因產物的水平與對照樣品中的相應的miR基因產物的水平比較。相對于對照樣品中的相應的miR基因產物的水平，受試樣品中的miR基因產物的水平的改變(例如增加、降低)表明受試者具有乳腺癌或處于發生乳腺癌的風險中。在某些實施方案中，所述至少一種 miR 基因產物選自 miR-125b-l、miR125b-2、miR-145、miR-21、miR-155、miR-10b 和其組合。
[0012]可使用許多本領域技術人員熟知的技術測量所述至少一種miR基因產物的水平。在一個實施方案中，使用Northern印跡分析測量所述至少一種miR基因產物的水平。在另一個實施方案中，可這樣測量至少一種miR基因產物的水平:從獲自受試者的受試樣品反轉錄RNA以提供一組靶寡聚脫氧核苷酸，使靶寡聚脫氧核苷酸對包含miRNA特異性探針寡核苷酸的微陣列雜交以提供受試樣品的雜交譜(hybridization profile),然后將受試樣品的雜交譜與從對照樣品產生的雜交譜進行比較。相對于對照樣品，受試樣品中至少一種miRNA的信號的改變表明受試者具有乳腺癌或處于發生乳腺癌的風險中。在特定的實施方案中，微陣列包含相當大部分的人miRNome的miRNA特異性探針寡核苷酸。在其他實施方案中，微陣列包含選自miR-145、miR-21、miR-155、miR-10b、miR-009-1 (miR131_l)、miR-34 (miR-170)、miR-102 (miR_29b)、miR-123 (miR-126)、miR-140-as、miR_125a、miR-125b_l、miR-125b_2、miR-194、miR-204、miR-213、let_7a_2、let_7a_3、let_7d(let-7d_vl)、let_7f-2、let_7i(let-7d_v2)、miR-101-1、miR_122a、miR-128b、miR-136、miR-143、mi`R-149、miR-191、miR-196-l、miR-196-2、miR-202、miR-203、miR-205、miR-206、miR-210和其組合的一種或多種miRNA的miRNA特異性探針寡核苷酸。
[0013]本發明也提供了診斷與一種或多種預后標記關聯的乳腺癌的方法，該方法包括測量來自受試者的乳腺癌受試樣品中的至少一種miR基因產物的水平和將所述乳腺癌受試樣品中的至少一種m i R基因產物的水平與對照樣品中相應的m i R基因產物的水平進行比較。可使乳腺癌與一種或多種與乳腺癌相關的不利預后標記例如但不限于雌激素受體的表達、孕酮受體的表達、陽性淋巴節轉移、高增殖指數、可檢測的P53的表達、晚期腫瘤期和高血管侵襲關聯。在一個實施方案中，這樣測量所述至少一種miR基因產物的水平，即從獲自受試者的受試樣品反轉錄RNA以提供一組靶寡聚脫氧核苷酸，使靶寡聚脫氧核苷酸對包含miRNA特異性探針寡核苷酸的微陣列雜交，從而提供受試樣品的雜交譜，然后將受試樣品的雜交譜與從對照樣品產生的雜交譜進行比較。相對于對照樣品，受試樣品中至少一種miRNA的信號的改變表明受試者具有與該一種或更多種預后標記關聯的乳腺癌或處于發生與該一種或更多種預后標記關聯的乳腺癌的風險中。在特定的實施方案中，微陣列包含選自 miR-26a、miR_26b、miR-102 (miR_29b)、miR-30a_5p、miR_30b、miR_30c、miR_30d、miR-185、miR-191、miR-206、miR-212、let_7c、miR-9-2、miR-15-a、miR-21、miR-30a_s、miR-133a-l、miR-137、miR-153-2、miR-154、miR_181a、miR-203、miR-213、let_7f_l、let_7a_3、let_7a_2、miR-9-3、miR-10b、miR_27a、miR_29a、miR-123、miR-205、let_7d、miR-145、miR-16a、miR-128b和其組合的miRNA的至少一種miRNA特異性探針寡核苷酸。
[0014]本發明也包括治療受試者中的乳腺癌的方法，其中至少一種miR基因產物在受試者的癌細胞中擺脫控制(例如，下調，上調)。當該至少一種分離的miR基因產物在乳腺癌細胞中被下調時，該方法包括施用有效量的該至少一種分離的miR基因產物，從而使受試者中的癌細胞的增殖被抑制。在一個實施方案中，方法包括施用有效量的該至少一種分離的miR基因產物，條件是該miR基因不是miR-15a或miR-16-l，這樣受試者的癌細胞的增殖被抑制。當所述至少一種分離的miR基因產物在癌細胞中被上調時，所述方法包括給受試者施用有效量的至少一種用于抑制所述至少一種miR基因表達的化合物，這樣乳腺癌細胞的增殖被抑制。
[0015]在相關的實施方案中，本發明提供了治療受試者的乳腺癌的方法，其包括確定相對于對照細胞，來自受試者的乳腺癌細胞中的至少一種miR基因產物的量。如果miR基因產物在乳腺癌細胞中脫離控制，則該方法進一步包括改變在乳腺癌細胞中表達的該至少一種miR基因產物的量。如果癌細胞中表達的miR基因產物的量低于對照細胞中表達的miR基因產物的量，那么該方法包括施用有效量的至少一種分離的miR基因產物。在一個實施方案中，miR基因產物不是miR-15a或miR-16-l。如果癌細胞中表達的miR基因產物的量比對照細胞中表達的miR基因產物的量大，那么該方法包括給受試者施用有效量的至少一種用于抑制該至少一種miR基因的表達的化合物。在一個實施方案中，miR基因產物不是miR-15a 或 miR-16-l。
[0016]本發明還提供了用于治療乳腺癌的藥物組合物。在一個實施方案中，藥物組合物包含至少一種分離的miR基因產物和藥學上可接受的載體。在特定的實施方案中，該至少一種miR基因產物相應于miR基因產物，該基因產物相對于合適的對照細胞在乳腺癌細胞中具有減少的表達水平。在某些實施方案中，分離的miR基因產物選自miR-145、miR-10b、miR-123 (miR-126)、miR-140-as、miR_125a、miR-125b_l、miR-125b_2、miR-194、miR-204、let-7a-2、let_7a_3、let_7d (let-7d_vl)、let_7f_2、miR-101-1、miR-143 和其組合。
[0017]在另一個實施方案中，本發明的藥物組合物包含至少一種miR表達抑制性化合物。在特定的實施方案中，該至少一種m i R表達抑制性化合物對于m i R基因是特異性的，所述miR基因的表達在乳腺癌細胞中比在對照細胞中強。在某些實施方案中，miR表達抑制化合物對于選自 miR-21、miR-155、miR-009-1 (miR131_l)、miR-34 (miR-170)、miR-102(miR-29b),miR-213,let_7i(let-7d_v2)、miR-122a、miR-128b、miR-136、miR-149、miR-191、miR-196-1、miR-196-2、miR-202、miR-203、miR-206、miR-210、miR-213 和其組合的一種或多種miR基因產物是特異性的。
[0018]本發明還包括鑒定抗乳腺癌試劑的方法，其包括對細胞提供受試試劑和測量細胞中至少一種miR基因產物的水平。在一個實施方案中，該方法包括對細胞提供受試試劑和測量至少一種與乳腺癌細胞中減少的表達水平相關的miR基因產物的水平。相對于合適的對照細胞，細胞中miR基因產物水平的增加表明受試試劑為抗乳腺癌試劑。在特定的實施方案中，所述與乳腺癌細胞中減少的表達水平相關的至少一種miR基因產物選自miR-145、miR-10b、miR-123 (miR-126)、miR-140-as、miR_125a、miR-125b_l、miR-125b_2、miR-194、miR-204、let_7a_2、let_7a_3、let_7d (let-7d_vl)、let-7f-2、miR-101_l、miR-143 和其組人
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[0019]在其他實施方案中，該方法包括對細胞提供受試試劑，和測量至少一種與乳腺癌細胞中增加的表達水平相關的miR基因產物的水平。相對于合適的對照細胞，細胞中miR基因產物水平的減少表明受試試劑為抗乳腺癌試劑。在特定的實施方案中，所述與乳腺癌細胞中增加的表達水平相關的至少一種miR基因產物選自miR-21、miR-155、miR-009-1 (miR131_l)、miR-34 (miR-170)、miR-102 (miR_29b)、miR-213、let-7i (let-7d-v2)、miR_122a、miR_128b、miR-136、miR-149、miR-191、miR-196-1、miR-196-2、miR-202、miR-203、miR-206、miR-210、miR-213 和其組合。
[0020]附圖概述
[0021]本專利或申請文件包含至少一個彩色附圖。具有彩色附圖的本專利或專利申請的拷貝在請求和支付必要的費用后由專利局提供。
[0022]圖1描述了由聚類分析產生的顯示基于差異microRNA表達(P〈0.05)區分乳腺癌組織與正常組織的樹。圖底部的條塊標示癌癥組群(紅色)或正常乳腺組織(黃色)。
[0023]圖2是描述基于PAM分析，各樣品為癌組織或正常組織的概率(0.0至1.0)的圖。借助表2中顯示的miR特征譜正確地預測了所有乳腺癌和正常組織。
[0024]圖3A是描述使用miR_125b互補探針檢測的miR_125b在正常樣品和來自乳腺癌患者(P)的幾個腫瘤樣品 中的表達水平的Northern印跡。U6探針用于標準化各樣品的表達水平。
[0025]圖3B是描述使用miR-145互補探針檢測的miR-145在正常樣品和來自乳腺癌患者(P)的幾個腫瘤樣品中的表達水平的Northern印跡。U6探針用于標準化各樣品的表達水平。
[0026]圖3C是描述使用miR-21互補探針檢測的miR-21在正常樣品和來自乳腺癌患者(標記為編號的患者)的幾個腫瘤樣品中的表達水平的Northern印跡。U6探針用于標準化各樣品的表達水平。
[0027]圖3D是描述microRNA miR-125b、miR_145和miR-21在不同乳腺癌細胞系中的表達水平的Northern印跡。也確定了各microRNA在來自正常組織樣品中的表達水平。U6探針用于標準化各樣品的表達水平。
[0028]圖4A是列出在與雌激素受體的存在(ER+)或不存在(ER-)相關的乳腺癌樣品中差異表達的miRNA的表。
[0029]圖4B是列出在與孕酮受體的存在(PR+)或不存在(PR-)相關的乳腺癌樣品中差異表達的miRNA的表。
[0030]圖4C是列出在與腫瘤的I期(pTl)或2或3期(pT2_3)相關的乳腺癌樣品中差異表達的miRNA的表。
[0031]圖4D是列出在與淋巴結轉移的存在(pNO)或不存在(pN10+)相關的乳腺癌樣品中差異表達的miRNA的表。
[0032]圖4E是列出在與血管侵襲的存在或不存在相關的乳腺癌樣品中差異表達的miRNA的表。
[0033]圖4F是列出在與高(MIB-D30)或低(MIB_1〈20)增殖指數(PI)相關的乳腺癌樣品中差異表達的miRNA的表。[0034]圖4G是列出在與p53的陽性(p53+)或陰性(p53_)免疫染色相關的乳腺癌樣品中差異表達的miRNA的表。
[0035]發明詳述
[0036]本發明部分基于特定miRNA和microRNA的鑒定，所述miRNA的表達相對于正常對照細胞，在乳腺癌細胞中發生改變，所述microRNA的表達在與特定的預后特征相關的乳腺癌細胞中相對于缺乏這些特征的乳腺癌細胞發生改變。
[0037]如在此處可互換使用，“miR基因產物”、“microRNA”、“miR”或“miRNA”意指來自miR基因的未加工的或加工的RNA轉錄物。由于miR基因產物不翻譯成蛋白質，術語“miR基因產物”不包括蛋白質。未加工的miR基因轉錄物也稱為“miR前體”，其通常包含長度大約為70-100個核苷酸的RNA轉錄物。可通過使用RNA酶(例如，Dicer,Argonaut或RNA酶III，例如大腸桿菌(E.coli)RNA酶III))進行降解來將miR前體加工成具有活性的19-25個核苷酸的RNA分子。該19-25個核苷酸的活性RNA分子也稱為“經加工的”miR基因轉錄物或“成熟的” miRNA。
[0038]可通過天然加工途徑(例如，使用完整的細胞或細胞裂解物)或通過合成加工途徑(例如，使用分離的加工酶例如分離的Dicer、Argonaut或RNA酶III)從miR前體獲得具有活性的19-25個核苷酸的RNA分子。要理解也可通過生物學或化學合成直接產生19-25核苷酸的活性RNA分子，而不用從miR前體加工而來。
[0039]表1中提供了 187個miR基因產物的序列。以5’至3’的方向給出此處的所有核酸序列。此外，用斜體字表示基因，用正常型表示基因產物；例如，mir-17是基因，而miR-17是基因產物。
[0040]本發明包括診斷受試者是否具有乳腺癌或處于發生乳腺癌的風險中的方法，該方法包括測量來自受試者的乳腺癌受試樣品中的至少一種miR基因產物的水平和將受試樣品中的miR基因產物的水平與對照樣品中`相應的miR基因產物的水平進行比較。如此處所用的，“受試者”可以是具有或懷疑具有乳腺癌的任何哺乳動物。在特定的實施方案中，受試者是具有或懷疑具有乳腺癌的人。
[0041]乳腺癌可以是乳腺癌的任何形式和可以與一種或更多種預后標記或特征(包括，但不限于，雌激素受體的表達、孕酮受體的表達、淋巴節轉移、高增殖指數、可檢測的p53的表達、晚期腫瘤期和高血管侵襲)相關。預后標記可以與不利的或消極的預后關聯，或其可與好的或積極的預后關聯。
[0042]表1-人miR基因產物序列
[0043]
【權利要求】
1.miRNA特異性探針寡核苷酸在制備診斷劑中的用途，所述診斷劑用于通過測量來自受試者的受試樣品中的至少一種miR基因產物的水平來診斷所述受試者是否具有乳腺癌或處于發生乳腺癌的風險中，其中相對于對照樣品中的相應miR基因產物的水平，受試樣品中的miR基因產物水平的改變表明受試者具有乳腺癌或處于發生乳腺癌的風險中， 其中所述至少一種miR基因產物是miR-125b-2。
2.權利要求1的用途，其中使用Northern印跡分析法測量所述至少一種miR基因產物的水平。
3.miRNA特異性探針寡核苷酸在制備診斷劑中的用途，所述診斷劑用于通過測量來自受試者的乳腺癌樣品中至少一種miR基因產物的水平來診斷所述受試者中與一種或多種預后標記相關的乳腺癌，其中相對于對照樣品中相應miR基因產物的水平，受試樣品中所述至少一種miR基因產物的水平的改變表明受試者患有與所述一種或多種預后標記相關的乳腺癌， 其中所述miR基因產物是miR-125b-2。
4.miRNA特異性探針寡核苷酸在制備微陣列中的用途，所述微陣列用于通過如下步驟診斷受試者是否具有乳腺癌或處于發生乳腺癌的風險中，所述步驟包括: (1)從獲自受試者的受試樣品反轉錄RNA以提供一組靶寡聚脫氧核苷酸； (2)使靶寡聚脫氧核苷酸與包含miRNA特異性探針寡核苷酸的微陣列雜交以提供受試樣品的雜交譜；和 (3)將受試樣品的雜交譜與從對照樣品產生的雜交譜進行比較， 其中至少一種miRNA的信號的改變表明受試者具有乳腺癌或處于發生乳腺癌的風險中；和 其中所述微陣列包含至少一種包含miR-125b-2的miRNA的miRNA特異性探針寡核苷酸。
5.權利要求4的用途,其中相對于從對照樣品產生的信號,至少一種miRNA的信號被下 調。
6.權利要求4的用途，其中微陣列還包含一種或多種選自miR-21、miR-155、miR-145、miR-009-1 (miR131_l)、miR-34 (miR-170)、miR-102 (miR_29b)、miR-123 (miR-126)、miR-140-as、miR_125a、miR-125b_l、miR-10b、miR-194、miR-204、miR-213、let_7a_2、let_7a_3、let_7d(let-7d_vl)、let_7f_2、let_7i(let-7d_v2)、miR-101-1、miR_122a、miR-128b、miR-136、miR-143、miR-149、miR-191、miR-196-l、miR-196-2、miR-202、miR-203、miR-206、miR-210和其組合的miRNA的miRNA特異性探針寡核苷酸。
7.miRNA特異性探針寡核苷酸在制備微陣列中的用途，所述微陣列用于通過如下步驟診斷受試者是否具有與受試者中一種或多種不利預后標記相關的乳腺癌或處于發生這種乳腺癌的風險中，所述步驟包括: (1)從獲自受試者的受試樣品反轉錄RNA以提供一組靶寡聚脫氧核苷酸； (2)使靶寡聚脫氧核苷酸與包含miRNA特異性探針寡核苷酸的微陣列雜交以提供所述受試樣品的雜交譜；和 (3)將受試樣品的雜交譜與從對照樣品產生的雜交譜進行比較， 其中信號的改變表明受試者具有具有與一種或多種不利預后標記相關的乳腺癌或處于發生這種乳腺癌的風險中；和其中所述微陣列包含至少一種包含miR-125b-2的miRNA的至少一種miRNA特異性探針寡核苷酸。
8.權利要求7的用途，其中所述一種或多種不利的預后標記選自雌激素受體的表達、孕酮受體的表達、陽性淋巴節轉移、高增殖指數、可檢測的P53的表達、晚期腫瘤期和高血管侵襲。
9.權利要求7的用途，其中微陣列還包含選自miR-26a、miR_26b、miR-102(miR-29b)、miR-30a_5p、miR_30b、miR_30c、miR_30d、miR-185、miR-191、miR-206、miR-212、let_7c、miR-9-2、miR-15-a、miR-21、miR-30a_s、miR-133a_l、miR-137、miR-153-2、miR-154、miR-181a、miR-203、miR_213、let_7f-l、let_7a_3、let-7a-2、miR-9-3、miR-10b、miR_27a、miR-29a、miR-123、miR-205、let_7d、miR-145、miR_16a、miR_128b 和其組合的 miRNA 的至少一種miRNA特異性探針寡核苷酸。
10.miR-125b-2在制造用于治療乳腺癌的藥劑中的用途。
11.權利要求10的用途，其中miR-125b-2按配方制造為包含miR-125b_2或其生理上可接受的鹽，以及藥學上可接受的載體的藥物組合物。
12.miR-125b-2 在制造用于抑制癌細胞增殖的藥劑中的用途。
【文檔編號】A61K48/00GK103820562SQ201410086649
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2006年7月31日 優先權日:2005年8月1日
【發明者】C·M·克勞斯, G·A·卡琳 申請人:俄亥俄州立大學研究基金會