功能性流感病毒樣顆粒(vlp)的制作方法
【專利摘要】本發明涉及功能性流感病毒樣顆粒(VLP)。本發明公開并要求保護病毒樣顆粒(VLP)，這些VLP表達和/或含有季候性流感病毒蛋白、禽流感病毒蛋白和/或來自具有大流行潛力的病毒的流感蛋白。本發明包括包含所述蛋白的載體構建體、包含所述構建體的細胞、包含本發明VLP的制劑和疫苗。本發明還包含制備VLP和對脊椎動物施用VLP的方法，包括誘發針對季候性流感和禽流感，或它們的至少一種癥狀的顯著的免疫力的方法。
【專利說明】功能性流感病毒樣顆粒(VLP)
[0001]本申請是申請日為2006年10月18日、中國申請號為200680045850.7、發明名稱
為“功能性流感病毒樣顆粒(VLP) ”的發明申請的分案申請。。
[0002]本申請要求下列申請的優先權:2005年10月18日提交的臨時申請60/727，513 ；2006年5月10日提交的臨時申請60/780，847 ；2006年5月15日提交的臨時申請60/800,006 ;2006年7月17日提交的臨時申請60/831，196 ;2006年7月21日提交的臨時申請60/832，116 ;和2006年9月19日提交的臨時申請60/845，495 ;本文引證收錄上述申請的全部內容用于所有目的。
[0003]發明背景
[0004]流感病毒是正粘病毒科(Orthomyxoviridae)的成員(綜述見Murphy andWebster, 1996)。流感病毒有三個亞型，稱為A、B和C。流感病毒體含有分段的負義RNA基因組。流感病毒體包括下述蛋白:血凝素(HA)、神經氨酸酶(NA)、基質(Ml)、質子離子通道蛋白(M2)、核蛋白(NP)、聚合酶堿性蛋白I (PBl)、聚合酶堿性蛋白2(PB2)、聚合酶酸性蛋白(PA)、和非結構蛋白2 (NS2)蛋白。通、嫩、11和112是膜相關的，而咿、？81、？82、？4和吧2是核殼相關蛋白。NSl是不與病毒體顆粒結合而是特異于流感病毒感染細胞的唯一非結構蛋白。Ml蛋白是流感病毒顆粒中最豐富的蛋白。HA和NA蛋白是包膜糖蛋白，負責病毒附著和病毒顆粒侵入細胞，是病毒中和和保護性免疫所用的主要免疫顯性表位的來源。HA和NA蛋白都被認為是預防性流感疫苗最重要的組分。
[0005]流 感病毒感染通過病毒體表面HA蛋白附著于含唾液酸細胞受體(糖蛋白和糖脂)而被引發。NA蛋白介導唾液酸受體的加工，且病毒對細胞的侵入依賴于HA依賴性受體介導的胞吞作用。在內化的含流感病毒體的內體的酸性境界中，HA蛋白經歷構象變化，導致病毒和宿主細胞膜融合，隨后病毒脫殼，Ml蛋白在M2的介導下從核殼相關核糖核蛋白(RNP)釋放,進入細胞核以進行病毒RNA合成。針對HA分子的抗體可以通過中和病毒感染性來預防病毒感染，而針對NA蛋白的抗體介導它們對病毒復制早期步驟的作用。
[0006]目前得到許可的滅活甲型和乙型流感病毒疫苗是作為供非消化道施用的三價疫苗。這些三價疫苗是在含胚雞卵尿囊腔中作為單價的總物料產生，通過速率區帶離心或柱層析純化，用福爾馬林或丙內酯滅活，然后配制成特定年份人群中流行的兩株甲型和乙型流感病毒株的混合物。現有的商品化流感疫苗是全病毒(WV)或亞病毒體(SV，裂解或純化的表面抗原(split or purified surface antigen))病毒疫苗。WV疫苗含有完整的滅活病毒體。用諸如磷酸三正丁酯等溶劑處理過的SV疫苗(Flu-Shield, Wyeth-Lederle)含有幾乎所有的病毒結構蛋白和一些病毒包膜。用Triton X-100溶解的SV疫苗(Fluzone，Sanof 1-Aventis; Fluvirin, Novartis)主要含有HA單體、NA和NP的聚集物，盡管存在殘余量的其它病毒結構蛋白。最近FDA對一種活的減毒冷適應病毒疫苗(FluMist，MedImmune)授予了銷售許可，批準其作為鼻內投遞疫苗用于在5-17歲的健康兒童和青年及18-49歲的健康成人中針對甲型及乙型流感病毒所引起的疾病的自動免疫接種和預防的商業應用。
[0007]已經開發了數種重組產品作為候選的重組流感疫苗。這些手段均著眼于甲型流感病毒HA和NA蛋白的表達、生產和純化，包括使用桿狀病毒感染的昆蟲細胞(Crawford et al, 1999; Johansson, 1999; Treanor et al., 1996),病毒載體(Pushko etal., 1997;Berglund et al.，1999),和 DNA 疫苗構建體(Olsen et al.，1997)表達這些蛋白。
[0008]Crawford et al.(1999)證明桿狀病毒感染的昆蟲細胞中表達的流感HA能夠預防由H5和H7禽流感亞型引起的致死性流感疾病。同時，另一個小組證明桿狀病毒表達的流感HA和NA蛋白在動物中誘導的免疫應答優于一種常規疫苗所誘導的免疫應答(Johanssonet al.，1999)。將桿狀病毒表達的馬流感病毒血凝素的免疫原性和效力與一種同源DNA疫苗候選物進行了比較(Olsen et al.，1997)。總之，這些數據證明，使用各種實驗手段，在不同的動物模型中，用重組HA或NA蛋白均可誘導出針對流感病毒攻擊的高度保護。
[0009]Lakey等人(1996)顯示，在一項I期劑量升高安全性研究中，源自桿狀病毒的流感HA疫苗在人志愿者中得到了良好的耐受并且具有免疫原性。然而，在數個臨床點用數個劑量的由HA和/或NA蛋白組成的流感疫苗接種人志愿者進行第二期研究，結果表明重組亞單位蛋白疫苗沒有引發保護性免疫[G.Smith, Protein Sciences ;M.Perdue, USDA, Personal Communications]。這些結果表明，感染性病毒體HA和NA包膜粒(peplomer)表面上展示的構象表位在中和性抗體和保護性免疫的引發中是重要的。
[0010]關于在重組流感疫苗候選物中包含其它流感蛋白的問題，已經進行了若干研究，包括涉及流感核蛋白NP (單獨地或者與Ml蛋白組合地)的實驗(Ulmer et al., 1993;Ulmeret al., 1998;Zhou et al., 1995;Tsui et al.，1998)。這些由近似不變的內部病毒體蛋白構成的疫苗候選物可引發廣譜的免疫力，主要是細胞免疫(⑶4+和⑶8+記憶T細胞)。這些實驗涉及使用DNA或病毒基因載體。需要相對大量的注射DNA，因為使用較低劑量DNA的實驗結果顯示很少或沒有保護作用(Chen et al.，1998)。因此，需要進一步的臨床前和臨床研究來評估此類涉及流感NP和Ml的基于DNA的手段是否安全、有效和持久。
[0011]最近，為了嘗試開發更有效的流感疫苗，使用了顆粒蛋白作為流感M2蛋白表位的載體。開發基于M2的 疫苗的理論根據是在動物研究中M2蛋白引發了針對流感的保護性免疫(Slepushkin et al., 1995)。Neirynck et al.(1999)使用一種 23 個氨基酸長的 M2跨膜域作為與乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)的氨基末端融合配偶體，以將M2表位暴露在HBcAg殼體樣顆粒的表面上。然而，盡管全長M2蛋白和M2-HBcAg VLP在小鼠中均誘導可檢測的抗體和保護作用，將來的流感疫苗不大可能僅僅基于M2蛋白，因為M2蛋白每個病毒體中存在的拷貝數低，抗原性弱，不能引發結合游離流感病毒體的抗體，也不能阻斷病毒對細胞受體的附著(即中和病毒)。
[0012]由于先前的研究已經顯示，表面流感糖蛋白HA和NA是引發抗流感病毒保護性免疫的主要靶標，而且Ml提供抗流感細胞免疫的保守靶標，新疫苗候選物可能包含這些病毒抗原作為蛋白大分子顆粒，諸如病毒樣顆粒(VLP)。此外，具有這些流感抗原的顆粒可展示能引發針對多種流感病毒株的中和性抗體的構象表位。
[0013]數項研究已經證明，在使用哺乳動物表達質粒或者桿狀病毒載體的細胞培養中重組流感蛋白能夠自組裝成VLP (Gomez-Puertas et al., 1999; Neumann et al., 2000; Lathamand Galarza, 2001)。Gomez-Puertas et al.(1999)證明，流感 VLP 的高效形成依賴于病毒蛋白的表達水平。Neumann et al.(2000)建立了一種基于哺乳動物表達質粒的系統，用于完全從克隆的cDNA產生感染性的流感病毒樣顆粒。Latham和Galarza (2001)報道了在共表達HA、NA、M1和M2基因的重組桿狀病毒感染的昆蟲細胞中形成流感VLP。這些研究證明，流感病毒體蛋白在真核細胞中共表達時可自組裝。
[0014]發明概述
[0015]本發明提供一種病毒樣顆粒(VLP)，它包含流感病毒Ml蛋白和流感病毒H5及NI血凝素和神經氨酸酶蛋白。在一個實施方案中，Ml蛋白與H5和NI蛋白相比衍生自不同的流感病毒株。在另一個實施方案中，所述H5或NI來自H5N1進化枝(clade) I流感病毒。
[0016]本發明還提供在容許VLP形成的條件下，由包含編碼流感H5和NI蛋白及流感Ml蛋白的一種或多種核酸的真核細胞表達的VLP。在一個實施方案中，所述真核細胞選自酵母細胞、昆蟲細胞、兩棲動物細胞、禽類細胞和哺乳動物細胞。在另一個實施方案中，所述真核細胞是昆蟲細胞。
[0017]本發明還提供這樣的VLP，當它施用于人或動物時，在所述人或動物體中引發針對流感感染具有保護性的中和性抗體。
[0018]本發明還提供包含有效劑量的本發明VLP的免疫原性組合物。在一個實施方案中，所述組合物包含佐劑。
[0019]本發明還提供包含有效劑量的本發明VLP的疫苗。在一個實施方案中，所述疫苗至少包含第二種VLP，其包含來自不同流感病毒株的HA和NA。在另一個實施方案中，所述疫苗包含佐劑。
[0020]本發明還提供在動物中誘發顯著的抗流感病毒感染免疫的方法，其包括施用至少一個有效劑量的包含本發明VLP的疫苗。在一個實施方案中，將所述疫苗通過口服、皮內、鼻內、肌肉內、腹膜內、靜脈內或皮下施用于動物。
[0021]本發明還提 供本發明的VLP用于制備動物用疫苗的用途，其中該疫苗在所述動物中誘發顯著的抗流感病毒感染免疫。
[0022]本發明還提供制備本發明VLP的方法，其包括在真核細胞中表達Ml、HA和NA蛋白。
[0023]本發明提供包含流感VLP的疫苗，其中所述VLP包含流感Ml、HA和NA蛋白，其中所述疫苗在人體中誘導顯著的抗流感病毒感染免疫。在一個實施方案中，所述疫苗包含流感VLP，其中所述VLP基本上由流感Ml、HA和NA蛋白組成，其中所述疫苗在人體中誘導顯著的抗流感病毒感染免疫。在另一個實施方案中，所述疫苗包含流感VLP，其中所述VLP包含選自流感Ml、HA和NA蛋白的多種流感蛋白，其中所述疫苗在人體內誘導顯著的抗流感病毒感染免疫。
[0024]本發明還提供流感VLP用于制備疫苗的用途，其中所述VLP包含流感M1、HA和NA蛋白，其中所述疫苗在人體中誘導顯著的抗流感病毒感染免疫。
[0025]由此，本發明提供一種大分子蛋白結構，其包含(a)第一種流感病毒Ml蛋白和(b)附加結構蛋白，其可以包括:第二種或更多種流感病毒Ml蛋白；第一種、第二種或更多種流感病毒HA蛋白；第一種、第二種或更多種流感病毒NA蛋白；和第一種、第二種或更多種流感病毒M2蛋白。如果所述附加結構蛋白不是來自第二種或更多種流感病毒Ml蛋白，那么該組中所有的成員，例如第一種和第二種流感M2病毒蛋白，均包括在內。由此，本發明提供一種基本上由通過本發明方法產生的流感病毒結構蛋白所組成的功能性流感蛋白結構，包括亞病毒顆粒、VLP或殼粒結構，或者其部分、疫苗、多價疫苗以及它們的混合物。在一個特別優選的實施方案中，所述流感大分子蛋白結構包括流感病毒HA、NA和Ml蛋白，這些蛋白是從野生型病毒作為合成片段克隆的流感病毒基因的表達產物。
[0026]所述大分子蛋白結構還可以包括附加結構蛋白，例如核蛋白(NP)、來自非流感病毒(noninfluenza viruses)之外的物種的膜蛋白及來自非流感來源(non-1nfIuenzasource)的膜蛋白，這些蛋白衍生自禽類或哺乳動物來源及流感病毒的不同亞型，包括甲型和乙型流感病毒。本發明可包括嵌合大分子蛋白結構，其所包括的至少一種蛋白質的一部分具有不是由流感病毒所產生的模塊。
[0027]可以通過提供可在宿主細胞中由重組構建體自組裝的大分子蛋白結構來實現流感的預防。本發明的大分子蛋白結構能夠自組裝成同型或異型的病毒樣顆粒(VLP)，這些顆粒在HA和NA蛋白上展示構象表位，這些表位引發保護性的中和性抗體。所述組合物可以是疫苗組合物，其還含有載體或稀釋劑和/或佐劑。功能性流感VLP能引發針對一種或多種流感病毒株或病毒型的中和性抗體，取決于所述功能性流感VLP是否含有來自一種或多種病毒株或病毒型的HA和/或NA蛋白。所述疫苗包含的流感病毒蛋白可以是野生型流感病毒蛋白。優選地，含有流感VLP的結構蛋白或者其部分，可衍生自野生型流感病毒的多種病毒株。可以將所述流感疫苗施用于人或動物以引發針對一種或多種流感病毒株或病毒型的保護性免疫力。
[0028]本發明的大分子蛋白結構可以展現血凝素活性和/或神經氨酸酶活性。
[0029]本發明提供一種通過構建重組構建體來制備流感衍生的VLP的方法，其中所述重組構建體編碼流感結構基因(包括Ml、HA)和至少一種流感病毒衍生的結構蛋白。使用重組構建體，利用重組桿狀病毒轉染、感染或轉化合適的宿主細胞。在容許表達M1、HA和至少一種流感病毒衍生的結構蛋白的條件下培養所述宿主細胞，在所述宿主細胞中形成VLP。收獲含有功能性流感VLP的被感染細胞的培養液，并純化VLP。本發明還有一個特點在于用編碼第二種流感蛋白的第二重組構建體共轉染、共感染或共轉化宿主細胞，從而將第二種流感蛋白納入VLP中的額外步驟。這樣的結構蛋白可以衍生自流感病毒,包括NA、M2和NP，并且至少一種結構蛋白衍 生自禽類或哺乳動物來源。結構蛋白可以是甲型和乙型流感病毒。根據本發明，宿主細胞可以是真核細胞。此外，VLP可以是嵌合型VLP。
[0030]本發明的另一個特點是一種配制含有流感VLP的藥品的方法，該方法是通過向宿主細胞中導入編碼流感病毒基因的重組構建體，并容許重組流感病毒蛋白在細胞中自組裝成為功能性的同型或異型VLP。分離并純化流感VLP，并配制含有該流感VLP的藥品。所述藥品可以進一步包含佐劑。此外，本發明提供一種配制藥品的方法，該方法是通過將此類含有流感VLP的藥品與脂質小泡，即非離子性脂質小泡混合。由此，功能性的同型或異型VLP可作為覆包膜的顆粒從被感染細胞出芽(bud)。出芽的流感VLP可以通過超離心或柱層析分離純化為藥品，并單獨地或者與佐劑諸如Novasomes? (Novavax, Inc產品)等配制成藥物產品，諸如疫苗。Novasomes?.提供增強的免疫效應，在美國專利N0.4，911，928中對其有進一步描述，通過提述納入本文。
[0031]本發明提供一種檢測脊椎動物中針對流感病毒感染的體液免疫的方法，該方法是通過提供包含有效抗體檢測量的流感病毒蛋白的測試試劑，所述流感病毒蛋白具有流感病毒大分子結構的至少一個構象表位。將測試試劑與來自需要檢查流感病毒感染的脊椎動物的體液樣品接觸。讓樣品中包含的流感病毒特異性抗體與流感病毒大分子結構的構象表位結合以形成抗原-抗體復合物。將這些復合物從未結合的復合物中分離出來，并使它們與可檢測地標記的免疫球蛋白結合劑接觸。測定結合于所述復合物的可檢測地標記的免疫球蛋白結合劑的量。
[0032]可以如下檢測來自懷疑感染了流感病毒的動物或人的標本中的流感病毒，即通過提供具有產生可檢測信號的標記物或者連接于可檢測地標記的試劑、并且對流感病毒顆粒的至少一種構象表位具有特異性的抗體。使標本與抗體接觸，并讓抗體與流感病毒結合。利用所述可檢測標記物確定標本中流感病毒的存在。
[0033]本發明提供治療、預防和產生保護性免疫應答的方法，所述方法是通過對脊椎動物施用有效量的本發明的組合物。
[0034]或者，所述流感VLP藥品可以配制成實驗室試劑，用于流感病毒結構研究和臨床診斷測定。本發明還提供用于通過施用有效量的本發明的組合物來治療流感病毒的試劑盒和使用指導。
[0035]本發明還提供包含HA、NA和Ml蛋白的VLP，所述HA、NA和Ml蛋白衍生自能夠在脊椎動物中導致發病(morbidity)或死亡(mortality)的禽流感病毒。在一個實施方案中，所述HA、NA和Ml蛋白衍生自甲型禽流感病毒。在另一個實施方案中，HA選自H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15 和 H16,而 NA 選自 N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8和N9。在另一個實施方案中，所述HA和NA蛋白分別是H5和NI。在另一個實施方案中，所述HA和NA蛋白分別是H9和N2。在另一個實施方案中，所述HA和/或NA分別展現血凝素活性和/或神經氨酸酶活性。在一個實施方案中，VLP基本上由HA、NA和Ml蛋白組成，也就是說，這些蛋白基本上是VLP中僅有的流感蛋白。
[0036]本發明還提供一種產生VLP的方法，其包括將編碼禽流感病毒蛋白的載體轉染到合適的宿主細胞中，并在容許形成VLP的條件下表達所述禽流感病毒蛋白。在一個實施方案中，該方法涉及用僅編碼HA、NA和Ml流感蛋白的重組DNA分子轉染宿主細胞。
[0037]本發明還包 括一種包含VLP的抗原性制劑，所述VLP含有衍生自能夠在脊椎動物中導致發病和死亡的禽流感病毒的HA、NA和Ml蛋白。在另一個實施方案中，HA選自Hl、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15 和 H16,而 NA 選自 N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8和N9。在另一個實施方案中，所述HA和NA蛋白分別是H5和NI。在另一個實施方案中，所述HA和NA蛋白分別是H9和N2。在另一個實施方案中，將所述抗原性制劑通過口服、皮內、鼻內、肌肉內、腹膜內、靜脈內或皮下施用于受試者。
[0038]本發明進一步提供對脊椎動物進行抗禽流感病毒免疫接種的方法，其包括對所述脊椎動物施用誘導保護量的VLP，所述VLP包含衍生自禽流感病毒的HA、NA和Ml蛋白。
[0039]本發明還包括在受試者中誘導針對流感病毒感染或其至少一種癥狀的顯著的免疫力的方法，其包括施用至少一個有效劑量的流感VLP。在一個實施方案中，所述VLP基本上由HA、NA和Ml組成。在另一個實施方案中，所述VLP包含流感蛋白，其中所述流感蛋白由HA、NA和Ml組成。在另一個實施方案中，所述HA和/或NA分別展現血凝素和/或神經氨酸酶活性。
[0040]本發明還包括在受試者中誘導針對流感病毒感染或其至少一種癥狀的顯著的免疫力的方法，其包括施用至少一個有效劑量的禽流感VLP。在一個實施方案中，所述流感VLP基本上由禽類HA、NA和Ml組成。在另一個實施方案中，所述流感VLP包含流感蛋白，其中所述流感蛋白由禽類HA、NA和Ml組成。
[0041]本發明還包括在受試者中誘導針對流感病毒感染或其至少一種癥狀的顯著的免疫力的方法，其包括施用至少一個有效劑量的季候性流感VLP。在一個實施方案中，所述流感VLP基本上由季候性HA、NA和Ml組成。在另一個實施方案中，所述流感VLP包括流感蛋白，其中所述流感蛋白由季候性HA、NA和Ml組成。
[0042]本發明還包括在受試者中誘導針對流感病毒感染或其至少一種癥狀的顯著的免疫力的方法，其包括施用至少一個有效劑量的至少一種季候性流感VLP。在一個實施方案中，所述流感VLP包含季候性流感HA、NA和Ml。在另一個實施方案中，所述流感VLP基本上由季候性流感HA、NA和Ml組成。
[0043]本發明進一步包括在受試者中誘導針對流感病毒感染或其至少一種癥狀的顯著的保護性抗體應答的方法，其包括施用至少一個有效劑量的流感VLP。
[0044]本發明包括在受試者中誘導針對流感病毒感染或其至少一種癥狀的顯著的保護性細胞免疫應答的方法，其包括施用至少一個有效劑量的流感VLP。
[0045]本發明還包括配制疫苗的方法,所述疫苗在受試者中誘導針對流感病毒感染或其至少一種癥狀的顯著的免疫力，所述方法包括向所述制劑中加入有效劑量的流感VLP。在一個實施方案中，所述針對流感病毒感染或其至少一種癥狀的顯著的免疫力是通過一個劑量賦予的。在另一個實施方案中，所述針對流感病毒感染或其至少一種癥狀的顯著的免疫力是通過多個劑量賦予的。
[0046]本發明還包括一種含有流感VLP的疫苗，其中所述疫苗當施用于受試者時誘導針對流感病毒感染或其至少一種癥狀的顯著的免疫力。在一個實施方案中，所述流感VLP是禽流感VLP。在另一個實施方案中，所述流感VLP是季候性流感VLP。
[0047]本發明還包括一種含有流感VLP的抗原性制劑，其中所述疫苗當施用于受試者時誘導針對流感病毒感染 或其至少一種癥狀的顯著的免疫力。在一個實施方案中，所述流感VLP是禽流感VLP。在另一個實施方案中，所述流感VLP是季候性流感VLP。
[0048]附圖簡要說明
[0049]圖1描述禽流感甲型/香港/1073/99 (H9N2)病毒神經氨酸酶(NA)基因的核苷酸序列(SEQ ID NO:1) ο
[0050]圖2描述禽流感甲型/香港/1073/99 (H9N2)病毒血凝素(HA)基因的核苷酸序列(SEQ ID NO:2)ο
[0051]圖3描述禽流感甲型/香港/1073/99 (H9N2)病毒基質蛋白Ml (Ml)基因的核苷酸序列(SEQ ID NO:3)。
[0052]圖4描述構建用于表達禽流感甲型/香港/1073/99 (H9N2)HA、NA和Ml蛋白的重組桿狀病毒所用轉移載體。圖4中的(A)描述表達各個基因的轉移載體，圖4中的(B)描述用于基因的多重表達的轉移載體。
[0053]圖5描述禽流感甲型/香港/1073/99 (H9N2)HA、NA和Ml蛋白在Sf_9S細胞中的表達。
[0054]圖6描述通過蔗糖密度梯度方法純化禽流感甲型/香港/1073/99 (H9N2) VLP。
[0055]圖7描述通過凝膠過濾層析檢測流感病毒蛋白。Western印跡分析中所用的抗體如下:(A)兔抗H9N2 ； (b)鼠抗Ml單抗；(C)鼠抗BACgp64。[0056]圖8描述通過電子顯微術檢測禽流感甲型/香港/1073/99 (H9N2)蛋白，包括亞病毒顆粒、VLP和VLP復合物。
[0057]圖9描述純化的禽流感甲型/香港/1073/99 (H9N2) VLP的血凝素活性。
[0058]圖10描述純化的禽流感甲型/香港/1073/99 (H9N2) VLP的神經氨酸酶活性。
[0059]圖11描述在小鼠中使用純化的禽流感甲型/香港/1073/99 (H9N2) VLP進行重組流感免疫原性研究所用的免疫和取血時間表。
[0060]圖12描述在用重組流感H9N2VLP免疫的小鼠中免疫原性研究的結果。圖12中的(a)描述來自用重組VLP免疫的BALB/c小鼠的血清，其中的VLP由來自禽流感甲型/香港/1073/99 (H9N2)的HA、NA和Ml蛋白組成。圖12中的(b)描述將來自用滅活甲型禽流感病毒H9N2免疫的新西蘭白兔的血清與含有滅活甲型禽流感病毒H9N2 (泳道I和3)或冷適應甲型禽流感病毒H9N2 (泳道2和4)的Western印跡反應。
[0061]圖13描述初次免疫和再次免疫之后BALB/c小鼠中的幾何平均抗體應答。
[0062]圖14描述BALB/c小鼠中的血清血凝素抑制(HI)應答。
[0063]圖15描述用H9N2流感攻擊的BALB/c小鼠中的體重減輕(%)。
[0064]圖16描述用H9N2攻擊后3天和5天的肺病毒效價。
[0065]圖17A、17B和17C描述用H3N2VLP免疫小鼠后針對甲型/福建/411/2002的抗體應答。
[0066]圖18A和18B描 述小鼠IgG抗體同種型。
[0067]圖19描述用H9N2VLP疫苗免疫的SD大鼠中的血凝素抑制(HI)抗體應答。
[0068]圖20A和20B描述BALB/c小鼠中針對有和沒有佐劑的不同劑量H9N2VLP的血凝素抑制(HI)抗體應答。
[0069]圖21描述BALB/c小鼠中在不同劑量的VLP之間的血清血凝素抑制(HI)應答。
[0070]圖22描述在雪貂中的血清血凝素抑制(HI)應答。
[0071]圖23描述雪貂施用不同病毒株的H3N2VLP后21和42天時抽取的血清的血清血凝素抑制(HI)應答。
[0072]圖24描述肌肉內接種低劑量H5N1 (越南/1203/2003) VLP的小鼠的抗HA抗體(終點稀釋效價)。
[0073]圖25描述鼻內接種低劑量H5N1 (越南/1203/2003) VLP的小鼠的抗HA抗體(終點稀釋效價)。
[0074]圖26描述制造、分離和純化本發明VLP的一個實例。
[0075]圖27描述通過肌肉內給藥H3N2VLP接種小鼠，然后通過鼻內用甲型/Aichi/2/68x31(H3N2)病毒攻擊。
[0076]圖28描述通過鼻內給藥H3N2VLP接種小鼠，然后通過鼻內用甲型/Aichi/2/68x31(H3N2)病毒攻擊。
[0077]圖29描述用H9N2VLP疫苗接種后用H9N2病毒鼻內攻擊的雪貂洗鼻液中的病毒脫落(shedding)。
[0078]圖30A、30B、30C、30D、30E、30F、30G和30H描述用不同劑量的甲型/福建/411/2002 (H3N2) VLP肌肉內或鼻內接種后針對不同的流感病毒H3N2株進行測試時小鼠中的血凝素抑制(HI)抗體應答。[0079]發明詳述
[0080]如本文所用的，術語“桿狀病毒”，又稱桿狀病毒科(baculoviridae)，是指節肢動物有包膜DNA病毒的一個科,該科的成員可以用作表達載體在昆蟲細胞培養中生成重組蛋白。病毒體含有一種或多種桿狀核殼，所述核殼還有環狀超螺旋雙鏈DNA分子(Mr54X 106-154X IO6)。用作載體的病毒通常是苜猜銀紋夜蛾(Autographa californica)核多角體病毒(NVP)。導入基因的表達是處于通常調控大核包涵體(在被感染細胞中病毒包埋在大核包涵體內)多角體蛋白組分的強啟動子的控制之下。
[0081]如本文所用的，術語“衍生自”指起源或來源，可包括天然存在的、重組的、未純化的、或者純化的分子。本發明的蛋白和分子可以衍生自流感或非流感分子。
[0082]如本文所用的，術語“第一種”流感病毒蛋白，即第一種流感病毒Ml蛋白，是指衍生自某一具體流感病毒株的蛋白質，例如Ml、HA、NA和M2。第一種流感病毒的株或型不同于第二種流感病毒蛋白的株或型。因此，“第二種”流感病毒蛋白，即第二種流感病毒Ml蛋白，是指衍生自第二種流感病毒株的蛋白，例如Ml、HA、NA和M2，其中第二種流感病毒株是不同于第一種流感病毒蛋白的株或型。
[0083]如本文所用的，術語“血凝素活性”是指含HA蛋白、VLP或它們的部分所具有的結合紅細胞(紅血球)并使之凝集的能力。
[0084]如本文所用的，術語“神經氨酸酶活性”是指含NA蛋白、VLP或它們的部分所具有的從底物(包括蛋白質，例如胎球蛋白)切除唾液酸殘基的酶活性。
[0085]如本文所用的，術語“異型的”(heterotypic)是指一種或多種不同型或株的病毒。
[0086]如本文所用的，術語“同型的”(heterotypic)是指一種型或株的病毒。
[0087]如本文所用的，術語“大分子蛋白結構”是指一種或多種蛋白的構造(construction)或排列(arrangement)。
[0088]如本文所用的，術語“多價”疫苗是指針對多種流感病毒株或病毒型的疫苗。
[0089]如本文所用的，術語“非流感的”(non-1nfluenza)是指非衍生自流感病毒的蛋白或分子。
[0090]如本文所用的，術語“疫苗”是指死亡或弱化的病原體的制備物，或者衍生的抗原性決定簇的制備物，用于誘導針對所述病原體的抗體或免疫力的形成。給予疫苗以提供針對疾病(例如由流感病毒導致的流感)的免疫力。本發明提供具有免疫原性并提供保護的疫苗組合物。此外，術語“疫苗”還指免疫原(例如VLP)的懸液或溶液，其被施用于脊椎動物以產生保護性免疫力，即減輕感染相關疾病的嚴重性的免疫力。
[0091]如本文所用的，術語“顯著的免疫力”是指這樣的免疫應答:當對脊椎動物施用本發明的VLP時，該脊椎動物中存在免疫系統的誘導，導致所述脊椎動物中流感感染的預防、流感感染的改善或者與流感病毒感染相關的至少一種癥狀的減輕。顯著的免疫力還可以指在已施用本發明VLP并已誘導了免疫應答的哺乳動物中> 40的血凝抑制(HI)效價。
[0092]如本文使用的，術語“佐劑”是指這樣的化合物，當其與特定的免疫原(例如VLP)在制劑中組合使用時，增大或以其它方式改變或修飾由此所致的免疫應答。免疫應答的修飾包括抗體免疫應答和細胞免疫應答之一或二者的強度增大或特異性增寬。免疫應答的修飾還可以意味著特定的抗原特異性免疫應答的降低或抑制。
[0093]如本文所用的，術語“免疫刺激物”是指通過身體自身的化學信使(細胞因子)增強免疫應答的化合物。這些分子包括具有免疫刺激、免疫強化和促炎癥活性的各種細胞因子、淋巴因子和趨化因子，諸如白細胞介素(例如IL-1、IL-2、IL-3、IL_4、IL-12、IL-13)；生長因子(例如粒細胞-巨噬細胞(GM)集落刺激因子(CSF));及其它免疫刺激分子，諸如巨噬細胞炎癥因子，Flt3配體，B.71 ;B7.2等。免疫刺激物分子可以在與流感VLP相同的制劑中施用，或者可以另行施用。可以施用蛋白質或者編碼該蛋白質的表達載體來產生免疫刺激效應。
[0094]如本文所用的，“有效劑量”一般指足以誘導免疫力、預防和/或改善流感病毒感染或減輕流感感染的至少一種癥狀、和/或增強另一個劑量的VLP的效力的本發明VLP的量。有效劑量可以指足以延遲流感感染發作或使之最小化的VLP的量。有效劑量還可以指在流感感染的治療或管理中提供治療益處的VLP的量。此外，有效劑量是就單獨或與其它療法組合在流感病毒感染的治療或管理中提供治療益處的本發明VLP而言的量。有效劑量還可以是足以增強受試者(例如人)自己針對后來與流感病毒接觸的免疫應答的量。免疫力的水平可以通過例如測量中和性分泌抗體和/或血清抗體的量來加以監測，所述測量例如通過曬斑中和(plaque neutralization)、補體結合(complement fixation)、酶聯免疫吸附、或微中和(microneutralization)測定來進行。在疫苗的情況下，“有效劑量”是預防疾病或降低癥狀嚴重性的劑量。
[0095]如本文所用的，術語“禽流感病毒”是指主要見于鳥類中，但也可感染人類或其它動物的流感病毒。在一些情況下，禽流感病毒可以從一個人傳播或擴散至另一個人。感染人的禽流感病毒具有導致流感大流行，即導致人類中的發病和死亡的潛力。當出現新的流感病毒株(人對其不具有天然免疫力的病毒)，其擴散經過各個地點并可能遍及全球，同時感染很多人時，即出現大流行。
[0096]如本文所用的，術語“季候性流感病毒”是指就某一流感季候而言，已根據全球各國家流感中心(National Influenza Centers)進行的流行病學調查確定為正在人群內傳播的流感病毒株。這些流行病學研究結果以及某些分離的流感病毒被送到世界衛生組織(WHO)的四個參考實驗室之一以進行詳細研究，其中一個實驗室設置在亞特蘭大的疾病控制和預防中心(Centers for Disease Control and Prevention(CDC))。這些實驗室測試針對現有疫苗制備的抗體 與流行中的病毒和新流感病毒反應的良好程度。將該信息和有關流感活動情況的信息匯總并提交到美國食品和藥品管理局(FDA)的一個顧問委員會以及WHO的會議上。這些會議的結果是選擇三種病毒(甲型流感病毒的兩個亞型和乙型流感病毒的一個亞型)進入用于下個秋季和冬季的流感疫苗。該選擇在北半球于2月份進行，在南半球于9月份進行。通常，每年改變疫苗中三種病毒株中的一種或兩種。
[0097]如本文所用的，術語“顯著保護性的抗體應答”是指脊椎動物(例如人)展現的、由針對流感病毒的抗體介導的、預防或改善流感感染或減輕其至少一種癥狀的免疫應答。本發明的VLP可以刺激產生抗體(例如中和性抗體)，所述抗體阻止流感病毒進入細胞、結合所述流感病毒從而阻斷該病毒復制、和/或保護宿主細胞不受感染和破壞。
[0098]如本文所用的，術語“顯著保護性的細胞免疫”是指脊椎動物(例如人)展現的、由針對流感病毒的T淋巴細胞和/或其它白細胞介導的、預防或改善流感感染或減輕其至少一種癥狀的免疫應答。細胞免疫的一個重要方面涉及細胞溶解性T細胞(CTL)所致的抗原特異性應答。CTL針對與主要組織相容性復合物(MHC)編碼蛋白結合呈遞并表達在細胞表面的肽抗原具有特異性。CTL幫助誘導和促進細胞內微生物的破壞或感染了這些微生物的細胞的溶解。細胞免疫的另一個方面涉及T輔助細胞所致的抗原特異性應答。T輔助細胞幫助刺激非特異性效應細胞的功能，并使這些效應細胞的活性集中指向在其表面上展示與MHC分子結合的肽抗原的細胞。“細胞免疫應答”還指由活化T細胞和/或其它白細胞(包括衍生自CD4+和CD8+T細胞的細胞)所產生的細胞因子、趨化因子以及其它此類分子的產生。
[0099]如本文所用的，術語“基于全群體的顯著免疫力”是指對群體中的個體施用的本發明VLP所致的免疫力。所述群體中的所述個體中的免疫力，導致所述個體中流感感染的預防、改善，或者與流感病毒感染相關的至少一種癥狀的減輕，并防止所述流感病毒擴散到群體中其它個體。術語“群體”定義為個體(例如學童、老人、健康個體等等)的群組，可包括地理區域(例如具體的城市、學校、小區、工作場所、國家(country)、州(state),等)。
[0100]如本文所用的，術語“抗原性制劑”或“抗原性組合物”是指這樣的制備物:當將它施用于脊椎動物，尤其是鳥類或哺乳動物時，會誘導免疫應答。
[0101]如本文所用的，術語“脊椎動物”或“受試者”或“患者”是指脊索動物亞門(subphylum cordata)的任何成員，包括但不限于人和其它靈長類,包括非人靈長類,例如黑猩猩和其它猿類和猴類物種。家畜(farm animals)，如牛、綿羊、豬、山羊和馬；家養動物，如狗和貓；實驗動物，包括嚙齒類如小鼠、大鼠和豚鼠；鳥類，包括家禽、野鳥和獵禽，如雞、火雞和其它鶉雞類鳥類，鴨、鵝等等也是非限制性的例子。該定義中包含術語“哺乳動物”和“動物”。意圖覆蓋成體和新生個體。
[0102]雖然現有在最優條件下60-80%有效的特異性滅活病毒疫苗，流感仍然是一個普遍的公共健康問題。當這些疫苗有效時，通常通過防止病毒感染而避免患病。抗原性差異的積累(抗原性轉變和抗原性漂移)可導致疫苗失效。例如，甲型禽流感H9N2與人流感病毒甲型/悉尼/97(H3N2)在豬中共流行(co-circulate)，導致基因重排列和具有大流行潛力的人流感病毒新株的出現(Peiris et al.，2001)。在發生此類抗原性轉變的情況下，現有的疫苗不大可能提供足夠的保護。
[0103]缺乏流感疫苗方案的另一個原因是現有疫苗引發的免疫力持續時間相對較短。流感控制措施的進一步缺乏反映了現有疫苗的使用受到限制，這是由于疫苗的反應原性以及對幼兒、老年人和對商業許可的滅活病毒流感疫苗的制造中使用的卵組分過敏的人的副作用。
[0104]此外，滅活的流感病毒疫苗往往缺少HA和NA構象表位或者所含HA和NA構象表位發生了改變，而這些表位引發中和性抗體并且在抗病免疫中起重要作用。因此，滅活病毒疫苗和某些重組單體流感亞基蛋白疫苗賦予的保護不足。另一方面，大分子蛋白結構，例如殼粒、亞病毒顆粒和/或VLP，含有多拷貝的展示構象表位的天然蛋白，有利于獲得最優的疫苗免疫原性。
[0105]本發明描述將禽流感甲型/香港/1073/99 (H9N2)病毒HA、NA和Ml基因單獨或串聯地克隆到單一桿狀病毒表達載體中，以及生產由重組流感結構蛋白構成的流感疫苗候選物或試劑；在桿狀病毒感染的昆蟲細胞中，這些重組流感結構蛋白自組裝成功能性和免疫原性同型大分子蛋白結構，包括亞病毒流感顆粒和流感VLP。
[0106]本發明描述將人流感甲型/悉尼/5/97和甲型/福建/411/2002 (H3N2)病毒HA、NA、Ml、M2和NP基因克隆到桿狀病毒表達載體中，以及生產由流感結構蛋白構成的流感疫苗候選物或試劑；在桿狀病毒感染的昆蟲細胞中，這些流感結構蛋白自組裝成功能性和免疫原性同型大分子蛋白結構，包括亞病毒流感顆粒和流感VLP。
[0107]此外，本發明描述將人流感甲型/悉尼/5/97和甲型/福建/411/2002(H3N2)病毒的HA基因和禽流感甲型/香港/1073/99 (H9N2)的HA、NA和Ml基因串聯地克隆到單一桿狀病毒表達載體中，以及生產由流感結構蛋白構成的流感疫苗候選物或試劑；在桿狀病毒感染的昆蟲細胞中，這些流感結構蛋白自組裝成功能性和免疫原性同型大分子蛋白結構，包括亞病毒流感顆粒和流感VLP。
[0108]本發明的VLP
[0109]本發明的流感VLP有用于制備針對流感病毒的疫苗。該系統的一個重要特征是能夠用不同亞型的HA和/或NA或其它病毒蛋白代替表面糖蛋白，從而可以每年更新新的流感抗原性變體或為流感大流行做準備。當這些糖蛋白的抗原性變體被鑒定時，可以更新VLP以包含這些新變體(例如用于季候性流感疫苗)。此外，來自潛在大流行性病毒如H5N1的表面糖蛋白，或其它具有大流行性潛力的HA、NA組合，也可納入VLP中，而不用擔心釋放出已有數十年未在人類中流行的基因。這是因為這些VLP沒有感染性，不會復制且不能致病。因此，該系統可用于每年創造新的候選流感疫苗，和/或在任何需要的時候創造流感大流行性疫苗。
[0110]有16種不同的血凝素(HA)和9種不同的神經氨酸酶(NA)，它們都已在野生鳥類中找到。野生鳥類是所有類型的甲型流感病毒的主要天然儲庫，并且被認為是所有其它脊椎動物中的所有類型的甲型流感病毒的來源。這些亞型由于它們表面上的血凝素(HA)和神經氨酸酶(NA)的變化而不同。HA和NA蛋白的許多不同組合是可能的。每種組合代表一種不同的甲型流感病毒類型。此外，每種類型根據其8種基因的每一種中發現的不同突變可以進一步分類為多種病毒株。
[0111]所有已知類型的 甲型流感病毒均可在鳥類中找到。通常，禽流感病毒不感染人類。但是，某些禽流感病毒可發生與穿越物種屏障的能力相關聯的遺傳變異。這樣的病毒能夠造成大流行，因為人類對此病毒沒有天然免疫力，能夠容易地從人到人傳播。1997年香港，在一次家禽禽流感爆發中，禽流感病毒從鳥類傳到了人類。該病毒被鑒定為流感病毒H5N1。這種病毒導致18人發生嚴重的呼吸道病情,其中6人死亡。從那時起，全世界人類中發生了越來越多的已知H5N1感染病例，這些人中大約半數已經死亡。
[0112]因此，本發明包括從禽流感病毒、具有大流行潛力的流感病毒和/或季候性流感病毒克隆HA、NA和Ml核苷酸到表達載體中。本發明還描述由自組裝成功能性VLP的流感蛋白構成的流感疫苗候選物或試劑的生產。所有病毒蛋白組合都必須與Ml核苷酸共表達。
[0113]本發明的VLP包括流感HA、NA和Ml蛋白或由它們組成。在一個實施方案中，所述VLP包含來自禽流感病毒、大流行性流感病毒和/或季候性流感病毒的HA，和來自禽流感病毒、大流行性流感病毒和/或季候性流感病毒的NA，其中所述HA選自Hl、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15 和 H16，所述 NA 選自 N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8和N9。在另一個實施方案中，本發明包括基本上由HA、NA和Ml組成的VLP。所述HA和NA可以來自上面所列的HA和NA。這些VLP可包含可忽略濃度的其它流感蛋白和/或蛋白雜質。在另一個實施方案中，所述流感 VLP包含流感蛋白，其中所述流感蛋白由HA、NA和Ml蛋白組成。這些VLP含有HA、NA和Ml，并可含有其它細胞組分如細胞蛋白、桿狀病毒蛋白、脂質、碳水化合物等，但不含有其它流感蛋白(除了 M1、HA和/或NA的片段之外)。在另一個實施方案中，當表達在VLP表面上時，HA和/或NA可分別展現血凝素活性和/或神經氨酸酶活性。
[0114]在另一個實施方案中，所述VLP包含H5N1病毒的HA和NA，以及Ml蛋白(該Ml蛋白可以來自也可以不來自同一病毒株)。在另一個實施方案中，所述VLP基本上由H5N1病毒的HA和NA以及Ml蛋白組成。這些VLP可以包含可忽略濃度的其它流感蛋白和/或蛋白雜質。在另一個實施方案中，所述VLP由H5N1病毒的HA和NA以及Ml蛋白組成。在另一個實施方案中，所述流感VLP包含流感蛋白，其中所述流感蛋白由H5、NI和Ml蛋白組成。這些VLP含有H5、N9和Ml，并可含有其它細胞組分如細胞蛋白、桿狀病毒蛋白、脂質、碳水化合物等，但不含有其它流感蛋白(除了 M1、H5和/或NI的片段之外)。在另一個實施方案中，當表達在VLP表面上時，H5和/或NI可分別展現血凝素活性和/或神經氨酸酶活性。在另一個實施方案中，所述VLP包含H9N2病毒的HA和NA，以及Ml蛋白。在另一個實施方案中，所述VLP基本上由H9N2病毒的HA和NA，以及Ml蛋白組成。這些VLP可以包含可忽略濃度的其它流感蛋白和/或蛋白雜質。在另一個實施方案中，所述VLP由H9N2病毒的HA和NA，以及Ml蛋白組成。在另一個實施方案中，所述流感VLP包含流感蛋白，其中所述流感蛋白由H9、N2和Ml蛋白組成。這些VLP含有H9、N2和Ml，并可含有其它細胞組分如細胞蛋白、桿狀病毒蛋白、脂質、碳水化合物等，但不含有其它流感蛋白(除了 M1、H9和/或N2的片段之外)。在另一個實施方案中，當表達在VLP表面上時，H9和/或N2可分別展現血凝素活性和/或神經氨酸酶活性。
[0115]在另一個實施方案中，所述VLP包含來自乙型流感病毒的HA和NA，以及Ml蛋白。乙型流感病毒通常僅見于人類。和甲型流感病毒不同，這些病毒不根據亞型分類。乙型流感病毒可在人類中導致發病和死亡，但與甲型流感病毒相比，其相關的流行嚴重程度一般較小。在另一個實施方案中，所述VLP基本上由來自乙型流感病毒的HA和NA，以及Ml蛋白組成。這些VLP可以包含可忽略濃度的其它流感蛋白和/或蛋白雜質。在另一個實施方案中，所述流感VLP包含流感蛋白，其中所述流感蛋白由HA、NA和Ml蛋白組成。這些VLP含有HA、NA和Ml，并可含有其它細胞組分如細胞蛋白、桿狀病毒蛋白、脂質、碳水化合物等，但不含有其它流感蛋白(除 了 M1、HA和/或NA的片段之外)。在另一個實施方案中，所述VLP由乙型流感病毒的HA和NA，以及Ml蛋白組成。在另一個實施方案中，當表達在VLP表面上時，HA和/或NA可分別展現血凝素活性和/或神經氨酸酶活性。
[0116]本發明還涵蓋在本發明VLP之上或之中表達的所述流感蛋白的變體。這些變體可在所述組分蛋白的氨基酸序列中包含改變。術語“變體”就多肽而言是指相對于參考序列改變了一個或多個氨基酸的氨基酸序列。變體可具有“保守的”改變，其中用于替換的氨基酸具有類似的結構或化學性質，例如用異亮氨酸替換亮氨酸。或者，變體可具有“非保守的”改變，例如用色氨酸替換甘氨酸。類似的次要變化還可包括氨基酸缺失和/或插入。使用本領域公知的計算機程序，例如DNASTAR軟件，可以找到確定哪些氨基酸殘基可供替換、插入或缺失而不消除生物學活性或免疫學活性的指導。
[0117]天然變體可由于抗原性漂移而產生。抗原性漂移是病毒蛋白中隨時間不斷發生的細小變化。因此，感染了某一特定流感病毒株的人產生針對該病毒的抗體，當新病毒株出現時，針對較舊病毒株的抗體不再識別該較新的病毒，而可能發生再感染。這就是每個季候都有新流感疫苗的原因。此外，流感病毒中的某些改變可導致流感病毒跨種傳播。例如，某些禽流感病毒發生與穿越物種屏障能力相關的遺傳變異。這樣的病毒能夠造成大流行，因為人類對此病毒沒有天然免疫力，該病毒能夠容易地從人到人傳播。所述流感蛋白的天然發生的變異是本發明的一個實施方案。
[0118]描述可應用于本發明的分子生物學技術例如克隆、突變、細胞培養等的通用教科書包括:Berger 和 Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods inEnzymology volume152Academic Press,Inc., San Diego,Calif.(Berger);Sambrook etal., Molecular Cloning—A Laboratory Manual(3rd Ed.), Vol.1-3，Cold Spring HarborLaboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.，2000 ( “Sambrook，，)和 Current Protocolsin Molecular Biology, F.M.Ausubel et al., eds., Current Protocols, 由 GreenePublishing Associates, Inc.和 John ffiley&Sons, Inc.聯合出版(“Ausubel”)。這些教科書描述了誘變、載體的使用、啟動子和許多其它相關的題目，例如HA和/或NA分子的克隆和突變等。因此，本發明也涵蓋使用已知的蛋白質工程和重組DNA技術的方法來改進或改變表達在本發明VLP之上或之中的流感蛋白的特性。有多種誘變類型可用于產生和/或分離變體HA、NA和/或Ml分子和/或用于進一步修飾/突變本發明的多肽。它們包括但不限于定點誘變、隨機點誘變、同源重組(DNA改組)、使用含尿嘧啶模板進行誘變、寡核苷酸定點誘變、硫代磷酸酯修飾的DNA誘變、使用缺口雙鏈體DNA的誘變等等。其它合適的方法包括點錯配修復(point mismatch repair),使用修復缺陷的宿主株的誘變，限制選擇和限制純化，缺失誘變，通過全基因合成的誘變，雙鏈斷裂修復等等。誘變，例如涉及嵌合構建體的誘變，也包含在本發明中。在一個實施方案中，可通過天然存在的分子或經過改變或突變的天然存在的分子，例如序列、序列比較、物理性質、晶體結構等等的已知信息來指導誘變。
[0119]本發明還包括當表達在VLP之上或之中時顯示顯著的生物學活性(例如能夠引發有效的抗體應答)的流感蛋白變體。這樣的變體包括缺失、插入、倒序(inversion)、重復，和替代，根據本領域已知的一般規則來選擇它們使其對活性幾乎不產生影響。
[0120]克隆所述流感蛋白的方法是本領域已知的。例如，可以從感染了流感病毒的細胞提取聚腺苷酸化mRNA，通過RT-PCR從中分離出編碼特定流感蛋白的流感基因。所得產物基因可以作為DNA插入片段克隆到載體中。術語“載體”是指可用于擴增核酸和/或在生物體、細胞或細胞組分之間轉移核酸的工具。載體包括自主復制或可整合到宿主細胞的染色體中的質粒、病毒、噬菌體、原病毒、噬菌粒、轉座子、人工染色體等等。載體還可以是非自主復制性的裸RNA多核苷酸、裸DNA多核苷酸、在同一鏈中包含DNA和RNA 二者的多核苷酸、聚賴氨酸偶聯的DNA或RNA、肽偶聯的DNA或RNA、脂質體偶聯的DNA等等。在許多但不是所有的通常實施方案中，本發明的載體是質粒或桿粒(bacmid)。
[0121 ] 因此，本發明包括這樣的核苷酸，它們編碼HA、NA和/或Ml流感蛋白，克隆到能在細胞中表達的表達載體中，其中所述載體誘導VLP的形成。“表達載體”是能夠促進納入其中的核酸的表達和復制的載體，例如質粒。典型地，要表達的核酸與啟動子和/或增強子“可操作地連接”，并受該啟動子和/或增強子的轉錄調控。在一個實施方案中，所述編碼來自禽流感病毒、大流行性流感病毒和 /或季候性流感病毒的HA的核苷酸選自H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15 和 H16。在另一個實施方案中，所述編碼來自禽流感病毒、大流行性流感病毒和/或季候性流感病毒的NA的核苷酸選自N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8和N9。在另一個實施方案中，所述載體由編碼HA、NA和/或Ml流感蛋白的核苷酸組成。在另一個實施方案中，所述載體由編碼HA、NA和Ml流感蛋白的核苷酸組成。優選的表達載體是桿狀病毒載體。克隆了編碼所述流感蛋白的核苷酸之后，對所述核苷酸可以進一步加以操作。例如，本領域技術人員可以突變編碼區的特定堿基來產生變體。變體可在編碼區、非編碼區或者編碼區和非編碼區二者中含有改變。這樣的變體可增加流感蛋白的免疫原性或去除蛋白或RNA中的剪接位點。例如，在一個實施方案中，將流感M蛋白(全長)上的供體和受體剪接位點突變，以避免M mRNA被剪接成Ml和M2轉錄物。在另一個實施方案中，將HA工程化以去除或突變剪切位點。例如，野生型H5HA具有含多個堿性氨基酸的剪切位點(RRRKR)。該野生型序列使得HA對宿主中或表達這些HA的系統中可能存在的多種遍在蛋白酶更為敏感。在一個實施方案中，去除這些氨基酸可以降低HA對多種蛋白酶的敏感性。在另一個實施方案中，可突變該剪切位點以去除該剪切位點(例如突變成RESR)。
[0122]本發明還使用編碼NA、HA和Ml的核酸和多肽。在一個實施方案中，流感NA核酸或蛋白與 SEQ ID N01、ll、31、32、39、38、46、47、54 或 55 至少 85%、90%、95%、96%、97%、98% 或99%同一。在另一個實施方案中，流感HA核酸或蛋白與SEQ ID N02、10、56、57、58、27、28、29、30、37、36、33、34、35、42、43、44、45、50、51、52 或 53 至少 85%、90%、95%、96%、97%、98% 或99%同一。在另一個實施方案中，流感Ml核酸或蛋白與SEQ ID N012、40、41、48或49至少85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99% 同一。
[0123]在一些實施方案中，突變包含這樣的變化:這些變化產生沉默的替換、添加或缺失，但不改變被編碼蛋白的性質或活性或者生成這些蛋白的方式。可以出于多種原因而產生核苷酸變體，例如為了最優化特定宿主的密碼子表達(將人mRNA中的密碼子改變為昆蟲細胞例如Sf9細胞偏好的那些密碼子)。參見美國專利公布2005/0118191，本文通過提述收錄其全部內容用于所有目的。本發明的最優化密碼子序列的例子在下文公開(例如SEQID42、44、46、48、50、52 和 54)。
[0124]此外，可將核苷酸測序以保證克隆的是正確的編碼區，且不含有任何不希望的突變。可以將這些核苷酸亞克隆到表達載體(例如桿狀病毒)中用于在任何細胞中表達。上文僅僅是如何克隆流感病毒蛋白的一個例子。本領域技術人員理解，其它方法也是可用和可能的。
[0125]本發明還提供這樣的構建體和/或載體，其包含編碼流感病毒結構基因包括NA、Ml和/或HA的禽類、大流行性和/或季候性核苷酸。所述載體可以是例如噬菌體、質粒、病毒或逆轉錄病毒載體。所述編碼禽流感病毒、大流行性流感病毒和/或季候性流感病毒結構基因包括NA、M1和/或HA的構建體和/或載體應與合適的啟動子可操作地連接，這樣的啟動子的非限制性例子有諸如AcMNPV多角體蛋白啟動子(或其它桿狀病毒)，λ噬菌體PL啟動子，大腸桿菌(E.coli) lac、phoA和tac啟動子、SV40早期和晚期啟動子，和逆轉錄病毒LTR的啟動子。取決于希望的宿主細胞和/或表達率，本領域技術人員將知道其它合適的啟動子。表達構建體將進一步含有轉錄起始、終止位點，以及被轉錄區域中用于翻譯的核糖體結合位點。所述構建體所 表達的轉錄物的編碼部分優選在要翻譯的多肽的起始處包含翻譯起始密碼子，而在該多肽末尾處的合適位置上含有終止密碼子。[0126]表達載體優選包含至少一種選擇標記。這樣的標記包括用于真核細胞培養的二氫葉酸還原酶、G418或新霉素抗性，以及用于培養大腸桿菌和其它細菌的四環素、卡那霉素或氨芐青霉素抗性基因。優選的載體包括病毒載體，例如桿狀病毒、痘病毒(例如牛痘病毒、禽痘病毒(avipox virus)、金絲雀痘病毒、禽痘病毒、浣熊痘病毒、豬痘病毒等等)、腺病毒(例如犬腺病毒)、皰疹病毒和逆轉錄病毒。可用于本發明的其它載體包括用于細菌的載體，包括 pQE70、pQE60 和 pQE_9, pBluescript 載體，Phagescript 載體，pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A、ptrc99a、pKK223_3、pKK233_3、pDR540、pRIT5。優選的真核載體包括 pFastBaclpWINEO、pSV2CAT、pOG44、pXTl 和 pSG、pSVK3、pBPV、pMSG 和 pSVL。其它合適的載體是本領域技術人員顯而易見的。在一個實施方案中，所述包含編碼禽流感病毒、大流行性流感病毒和/或季候性流感病毒結構基因(包括HA、Ml和/或NA)的核苷酸的載體是pFastBac。在另一個實施方案中，所述包含由編碼禽流感病毒、大流行性流感病毒和/或季候性流感病毒結構基因(包括HA、M1和/或NA)的核苷酸組成的插入片段的載體是pFastBacο
[0127]接下來，可以將重組載體轉染、感染或轉化到合適的宿主細胞中。由此，本發明提供這樣的宿主細胞:它們包含載體(或多個載體)，所述載體含有編碼HA、Ml和/或NA且容許HA、Ml和/或NA在可形成VLP的條件下于所述宿主細胞中表達的核酸。
[0128]在一個實施方案中，上述重組構建體可以用來轉染、感染或轉化，并可以在真核細胞和/或原核細胞中表達HA、NA和Ml流感蛋白。真核宿主細胞包括酵母、昆蟲、禽類、植物、秀麗隱桿線蟲(C.elegans)(或線蟲)和哺乳動物宿主細胞。昆蟲細胞的非限制性例子有:草地夜蛾(Spodoptera frugiperda) (Sf)細胞、例如 Sf9> Sf21，粉紋夜蛾(Trichoplusiani)細胞，例如High Five細胞，和果蠅S2細胞。真菌(包括酵母)宿主細胞的例子有釀酒酵母(S.cerevisiae)、乳克魯維酵母(Kluyveromyces lactis;K.1actis)、假絲酵母屬(Candida)物種包括白色假絲酵母(C.albicans)和光滑假絲酵母(C.glabrata)、構巢曲霉(Aspergillus nidulans)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe; S.pombe)、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)、和解脂耶羅酵母(Yarrowia Iipolytica)。哺乳動物細胞的例子有COS細胞、幼倉鼠腎細胞、小鼠L細胞、LNCaP細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、人胚腎(HEK)細胞和非洲綠猴細胞、CVl細胞、HeLa細胞、MDCK細胞、Vero和!fep-2細胞。非洲爪蟾(Xenopus Iaevi s)卵母細胞,或兩棲動物來源的其它細胞也可以使用。原核宿主細胞包括細菌細胞，例如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)和分枝桿菌。
[0129]可以將載體，例如包含HA、NA和/或Ml多核苷酸的載體根據本領域公知的技術轉染到宿主細胞中。例如，可通過磷酸鈣共沉淀、電穿孔、顯微注射、脂轉染和利用多胺轉染試劑的轉染來將核酸導入真核細胞。在一個實施方案中，所述載體是重組桿狀病毒。在另一個實施方案中，所述重組桿狀病毒被轉染到真核細胞中。在一個優選的實施方案中，所述細胞是昆蟲細胞。在另一個實施方案中，所述昆蟲細胞是Sf9細胞。
[0130]在另一實施方案中，所述載體和/或宿主細胞包含這樣的核苷酸:所述核苷酸編碼選自 H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15 和 H16 的禽流感病
毒、大流行性流感病毒和/或季候性流感病毒HA蛋白。在另一實施方案中，所述載體和/或宿主細胞包含這樣的核苷酸:所述核苷酸編碼選自N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8和N9的NA蛋白。在另一實施方案中，所述載體和/或宿主細胞包含流感HA、M1和/或NA。在另一實施方案中，所述載體和/或宿主細胞基本上由HA、Ml和/或NA組成。在又一實施方案中，所述載體和/或宿主細胞由包括HA、Ml和NA的流感蛋白組成。這些載體和/或宿主細胞包含HA、NA和M1，并可含有其它細胞組分諸如細胞蛋白、桿狀病毒蛋白、脂質、碳水化合物等，但不含有其它的流感蛋白(除了 M1、HA和/或NA的片段之外)。在另一實施方案中，所述核苷酸編碼這樣的HA和/或NA:當它們表達在VLP表面上時，分別展現血凝素活性和/或神經氨酸酶活性。
[0131]本發明還提供將增加VLP產生效率的構建體和方法。例如，去除蛋白質中的剪切位點以增加蛋白質表達(見上文)。其它方法包括向HA、NA和/或Ml蛋白添加前導序列以增加轉運效率。例如，可將異源信號序列與HA、NA和/或Ml流感蛋白融合。在一個實施方案中，所述信號序列可衍生自昆蟲細胞的基因，且融合于流感HA蛋白(用于在昆蟲細胞中表達)。在另一個實施方案中，信號肽是幾丁質酶信號序列，其可在桿狀病毒表達系統中高效地工作。在其它實施方案中，在流感蛋白之間互相交換前導序列可提供更好的蛋白轉運。例如，已證明H5血凝素轉運到顆粒表面的效率較低。而H9血凝素靶向表面和整合到表面中的效率更高。因此，在一個實施方案中，將H9前導序列與H5蛋白融合。
[0132]另一種增加VLP產生效率的方法是針對具體的細胞類型對編碼HA、NA和/或Ml蛋白的核苷酸進行密碼子優化。例如，為在Sf9細胞中表達而對核酸進行密碼子優化(見美國專利公布2005/0118191，本文通過提述收錄其全部內容用于所有目的)。下文公開了用于Sf9細胞的經過密碼子優化的序列的例子(例如SEQ ID42、44、46、48、50、52和54)。在一個實施方案中，經過密碼子優化的流感蛋白的核酸序列與SEQ ID N042、44、46、48、50、52和54的任一序列有至少85%、90%、95%、96、97、98或99%的同一性。
[0133]本發明還提供產生VLP的方法，所述方法包括在可形成VLP的條件下表達禽類、大流行性和/或季候性流感蛋白。取決于所選的表達系統和宿主細胞，在表達重組蛋白和形成VLP的條件下培養用表達載體轉化的宿主細胞，來產生VLP。合適的培養條件的選擇在本領域普通技術人員的技術之內。
[0134]培養經過工程化而產生本發明VLP的細胞的方法包括但不限于分批、分批補料、連續和灌流(perfusio n)細胞培養技術。細胞培養意思是在生物反應器(發酵室)中使細胞生長和增殖，其中細胞在生物反應器中增殖并表達蛋白(例如重組蛋白)以供純化分離用。典型地，細胞培養在生物反應器中無菌、溫度和大氣受控的條件下進行。生物反應器是用于培養細胞的腔室(chamber)，其中可以監控環境條件例如溫度、大氣、攪拌和/或pH。在一個實施方案中，所述生物反應器是不銹鋼室。在另一個實施方案中，所述生物反應器是預
滅菌的塑料袋(例如Cellbagi丸:，Wave Biotech, Bridgewater, NJ)。在另一實施方案中，所述預滅菌的塑料袋為大約50L到1000L的袋子。
[0135]然后用保持VLP完整性的方法來分離這些VLP，例如通過梯度離心，例如氯化銫、蔗糖和碘克沙醇(iodixanol)梯度離心，以及標準純化技術，包括例如離子交換和凝膠過濾層析。
[0136]下面是如何制備、分離和純化本發明VLP的一個例子。通常VLP是由重組細胞系產生的，其中這些細胞系經過工程化而在細胞培養(見上文)中生長時產生VLP。可以利用圖26所示的方案實現VLP的生產。本領域技術人員將會理解，可以使用其它的方法來制備和純化本發明的VLP，因此本發明不限于所述的方法。[0137]本發明的VLP的生產可首先將Sf9細胞(未感染的)接種到搖瓶中，使細胞隨著生長繁殖而擴增和規模放大(例如從125ml瓶到50L Wave袋)。培養細胞所用的培養基為合適的細胞系配制(優選無血清培養基，例如昆蟲培養基ExCel 1-420，JRH)。然后，用重組桿狀病毒以效率最高的感染復數(例如每個細胞約I個到約3個噬斑形成單位)感染所述細胞。一旦發生感染，流感HA、NA和Ml蛋白即從病毒基因組表達，自組裝成VLP，并在感染后大約24到72小時從細胞分泌出來。通常，當細胞處于生長的對數中期(4-8X106個細胞/ml)且至少約90%生存時，感染效率最高。
[0138]可以在感染后大約48到96小時，當細胞培養基中VLP水平接近最大值但尚未發生廣泛的細胞裂解之前收獲本發明的VLP。收獲時的Sf9細胞密度和生存力可以為:大約0.5X IO6個細胞/ml到大約1.5 X IO6個細胞/ml，生存力至少為20%，如染料排除測定所示。然后，移出培養基并將其澄清。可以向培養基中加入NaCl至濃度為大約0.4到大約1.0M,優選到大約0.5M，以避免VLP聚集。可利用一次性使用的預滅菌中空纖維0.5或1.00 μ m筒式濾器或類似的裝置進行切向流過濾(TFF)，來從含有本發明VLP的細胞培養基中去除細胞和細胞碎片。
[0139]接著，可以使用一次性使用的、預滅菌的500，000分子量截留中空纖維筒式濾器通過超濾來濃縮經過澄清的培養基中的VLP。可以將經過濃縮的VLP對10倍體積的含0.5MNaCl的pH7.0到8.0的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)滲濾來去除殘余的培養基成分。
[0140]可以將經過濃縮、滲濾的VLP置于含0.5M NaCl的pH7.2PBS緩沖液中20%_60%不連續蔗糖梯度上，于大約4°C到大約10°C 6，500 Xg離心18小時來進一步純化。通常，VLP將在大約30%到大約40%蔗糖之間或者在界面上(在20%和60%的分步梯度中)形成顯著可見的條帶，可從梯度中收集該條帶并保存。可稀釋該產物使其含有200mM NaCl,以準備純化過程的下一步。該產物含有VLP，并可能含有完整的桿狀病毒顆粒。
[0141]可以通過陰離 子交換層析或者44%等密度鹿糖墊層(cushion)離心來進一步純化VLP。在陰離子交換層析中，將來自蔗糖梯度(見上文)的樣品加載到裝有帶陰離子介質(例如Matrix Fractogel EMD TMAE)的柱子中，并通過鹽梯度(從大約0.2M到大約1.0MNaCl)洗脫，該梯度可以將VLP與其它雜質(例如桿狀病毒和DNA/RNA)分開。在蔗糖墊層方法中，將含有VLP的樣品添加到44%蔗糖墊層，并在30，OOOg離心約18小時。VLP在44%蔗糖的頂部形成條帶，而桿狀病毒沉淀于底部，其它雜質蛋白停留在頂部的0%蔗糖層中。收集VLP峰或VLP帶。
[0142]如果希望，可以將完整的桿狀病毒滅活。可以通過化學方法，例如福爾馬林或β-丙內酯(BPL)滅活。還可以主要使用本領域已知的選擇性沉淀和層析方法，如上文例舉的，來實現完整桿狀病毒的去除和/或滅活。滅活方法包括將含有VLP的樣品在0.2%BPL中于大約25°C到大約27°C溫育3小時。還可以將含有VLP的樣品在0.05%BPL于4°C溫育3天，然后在37°C溫育I小時，來滅活桿狀病毒。
[0143]滅活/去除步驟后，可使含有VLP的產物經過另一滲濾步驟以去除任何來自滅活步驟的試劑和/或任何殘余的蔗糖，并將VLP置入期望的緩沖液(例如PBS)中。含有VLP的溶液可以通過本領域已知的方法(例如無菌過濾)滅菌，并保存在冰箱或低溫冰箱中。
[0144]上述技術可以在多種 規模上實施。例如，T形瓶(T-flasks)、搖瓶、轉瓶、乃至工業級容量的生物反應器。生物反應器可包括不銹鋼槽或預滅菌的塑料袋(例如，WaveBiotech, Bridgewater, NJ出售的系統)。本領域技術人員將知道用于其目的的最佳選擇。
[0145]桿狀病毒表達載體的擴增和生產，以及用重組桿狀病毒感染細胞以生產重組流感VLP，可以在昆蟲細胞，例如前文所述的Sf9昆蟲細胞中實現。在一個優選的實施方案中，所述細胞是用產生流感VLP的工程化重組桿狀病毒感染的SF9細胞。
[0146]藥物或疫苗制劑和施用
[0147]本文中有用的藥物組合物含有可藥用載體和本發明的VLP，其中所述載體，包括任何合適的稀釋劑或賦形劑，包括本身不誘導產生對接受該組合物的脊椎動物有害的免疫應答、并且可以在不引起任何異常毒性的條件下施用的任何藥劑。如本文所用的，術語“可藥用”意思是經過聯邦或州政府監管部門批準，或者在美國藥典、歐洲藥典或其它公認的藥典中記載用于脊椎動物，更具體地用于人類中。這些組合物可以用作疫苗和/或抗原性組合物，用于在脊椎動物中誘導保護性免疫應答。
[0148]所述本發明的藥物制劑包括含流感Ml、HA和/或NA蛋白的VLP和可藥用的載體或賦形劑。可藥用載體包括但不限于鹽水、緩沖鹽水、右旋糖、水、甘油、無菌等滲緩沖水溶液，和它們的組合。Remington’s Pharmaceutical Sciences (Mack Pub.C0.N.J.current edition)提供了可藥用載體、稀釋劑和其它賦形劑的全面討論。制劑必須適合施用模式。在一個優選的實施方案中，制劑適于施用給人，優選制劑是無菌、非顆粒性(non-particulate)和/或非熱原性的。
[0149]如果期望，組合物還可以含有次要量的潤濕劑或乳化劑，或pH緩沖劑。組合物可以是固體形式，例如適于重構的凍干粉末；液體溶液；懸液；乳液；片劑；丸劑；膠囊；持續釋放制劑；或粉劑。口服制劑可包含標準的載體，例如藥品級的甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等等。
[0150]本發明還提供藥包(pharmaceutical pack)或試劑盒(kit);其包含一個或多個容器，所述容器裝有本發明疫苗制劑的一種或多種成分。在一個優選的實施方案中，所述試劑盒包含兩個容器， 其一裝有VLP，另一個裝有佐劑。所述容器還可以伴有通告，該通告采取由監管藥品或生物制品的生產、使用或銷售的政府部門規定的形式，反映該部門對為人體施用而生產、使用或銷售的許可。
[0151]本發明還提供VLP制劑包裝在標示組合物數量的密封容器例如安瓿或小藥囊(sachette)中。在一個實施方案中，VLP組合物作為液體提供，在另一個實施方案中，作為密封容器中的干燥無菌凍干粉末或無水濃縮物提供，并且可以例如用水或鹽水重構為供施用于受試者的合適濃度。優選地，VLP組合物作為密封容器中的干燥無菌凍干粉末提供，單位劑量優選為大約I P g、大約5 μ g、大約10 μ g、大約20 μ g、大約25 μ g、大約30 μ g、大約50 μ g、大約100 μ g、大約125 μ g、大約150 μ g或大約200 μ g。或者，VLP組合物的單位劑量小于約I μ g(例如大約0.08 μ g,大約0.04 μ g ;大約0.2 μ g、大約0.4 μ g、大約0.8 μ g、大約0.5 μ g或更少、大約0.25 μ g或更少，或大約0.1 μ g或更少)，或多于大約125 μ g (例如大約150 μ g或更多、大約250 μ g或更多、或大約500 μ g或更多)。這些劑量可以以總VLP或HA的μ g數測量。VLP組合物應當在自凍干粉末重構后大約12小時內、優選約6小時內、約5小時內、約3小時內、或約I小時內施用。
[0152]在一個作為選擇的實施方案中，VLP組合物作為標示VLP組合物的數量和濃度的密封容器中的液體形式提供。優選地，VLP組合物在密封容器中以至少約50μ g/ml、優選至少約100 μ g/ml、至少約200 μ g/ml、至少500 μ g/ml、或至少lmg/ml的濃度提供。
[0153]通常，本發明的流感VLP以足以刺激針對一種或多種流感病毒株的免疫應答的有效量或數量(如上文定義的)施用。優選地，施用本發明的VLP引發針對至少一種流感病毒的顯著的免疫力。典型地，可以根據例如年齡、身體健康狀況、體重、性別、飲食、施用時間和其它臨床因素，在該范圍內調節該劑量。預防性疫苗制劑是全身施用的，例如通過使用針頭和注射器或無針頭注射裝置進行皮下或肌肉內注射來施用。或者，疫苗制劑是鼻內施用的，通過滴劑、大顆粒氣溶膠(大于約10微米)、或噴霧到上呼吸道中。雖然上述任何投遞途徑均產生免疫應答，但鼻內施用還帶來額外的益處，即在流感病毒進入的部位引發粘膜免疫。
[0154]由此，本發明還包括誘導受試者中針對流感病毒感染或其至少一種癥狀的顯著免疫力的疫苗或抗原性組合物的配制方法，包括對所述制劑添加有效劑量的流感VLP。
[0155]雖然優選的是以單個劑量刺激顯著的免疫力，但可以通過相同或不同的途徑施用額外的劑量來達到所需效果。例如，在新生兒和嬰兒中，可能需要多次施用來引發足夠的免疫水平。根據維持足夠水平的抗流感感染保護的需要，可以在整個兒童期以一定間隔繼續進行施用。類似地，特別容易受到反復或嚴重的流感感染的成年人，例如衛生保健工作者、日間護理工作者、幼兒的家人、老年人、以及心肺功能受損的個體等，可能需要進行多次免疫來建立和/或維持保護性免疫應答。可以通過例如測量中和性分泌和血清抗體的量來監測誘導產生的免疫力的水平，并根據引發和維持期望的保護水平的需要來調整劑量或重復接種。
[0156]因此，在一個實施方案中，誘發受試者中針對流感病毒感染或其至少一種癥狀的顯著免疫力的方法包括施用至少一個有效劑量的流感VLP，其中所述VLP包含流感HA、NA和Ml蛋白。在另一個實施方案中，誘發受試者中針對流感病毒感染或其至少一種癥狀的顯著免疫力的方法包括施用至少一個有效劑量的流感VLP，其中所述VLP基本上由流感HA、NA和Ml組成。所述VLP可包含可忽略濃度的其它流感蛋白和/或蛋白雜質。在另一個實施方案中，誘發受試者中針對流感病毒感染或其至少一種癥狀的顯著免疫力的方法包括施用至少一個有效劑量的流 感VLP，其中所述VLP由流感HA、NA和Ml組成。在另一個實施方案中，所述流感HA、NA和Ml衍生自季候性流感和/或禽流感病毒。在另一個實施方案中，誘發受試者中針對流感病毒感染或其至少一種癥狀的顯著免疫力的方法包括施用至少一個有效劑量的包含流感蛋白的流感VLP，其中所述流感蛋白由HA、NA和Ml蛋白組成。這些VLP包含HA、NA和Ml，并可含有其它細胞組分諸如細胞蛋白、桿狀病毒蛋白、脂質、碳水化合物等，但不含有其它的流感蛋白(除了 M1、HA和/或NA的片段之外)。在另一個實施方案中，所述HA和/或NA分別展現血凝素活性和/或神經氨酸酶活性。在另一個實施方案中，所述受試者是哺乳動物。在另一個實施方案中，所述哺乳動物是人。在另一個實施方案中，所述方法包括通過以一個劑量施用所述制劑而誘發針對流感病毒感染或其至少一種癥狀的顯著的免疫力。在另一個實施方案中，所述方法包括通過以多個劑量施用所述制劑而誘發針對流感病毒感染或其至少一種癥狀的顯著的免疫力。
[0157]包含VLP的組合物(疫苗和/或抗原性制劑)的施用方法包括，但不限于，非消化道施用(例如皮內、肌肉內、靜脈內和皮下)、硬膜外、和粘膜(例如鼻內和口腔或肺途徑或通過栓劑)。在一個具體實施方案中，本發明的組合物通過肌肉內、靜脈內、皮下、透皮或皮內施用。組合物可以通過任何方便 的途徑施用，例如通過輸注或推注，通過經由上皮或粘膜皮膚襯里(例如口腔粘膜、結腸、結膜、鼻咽、口咽、陰道、尿道、膀胱和腸粘膜等)的吸收，并且可以與其它生物學活性劑一起施用。在一些實施方案中，本發明含VLP組合物的鼻內或其它粘膜施用途徑所誘發的抗體或其它免疫應答可顯著高于其它施用途徑。在另一個實施方案中，本發明含VLP組合物的鼻內或其它粘膜施用途徑可誘發這樣的抗體或其它免疫應答，所述應答將誘發針對其它流感病毒株的交叉保護。施用可以是全身性的或者是局部的。
[0158]在又一個實施方案中，所述疫苗和/或抗原性制劑以這樣的方式施用，使得其靶向粘膜組織，以在免疫部位引發免疫應答。例如，可以通過口服含有具備特定粘膜靶向性質的佐劑的組合物，來靶向粘膜組織例如腸相關淋巴樣組織(GALT)進行免疫。還可以靶向其它粘膜組織，例如鼻咽淋巴樣組織(NALT)和支氣管相關淋巴樣組織(BALT)。
[0159]本發明的疫苗和/或抗原性制劑還可以按照劑量日程表(dosage schedule)來施用，例如用疫苗組合物進行一次初次施用，隨后進行多次加強施用。在具體的實施方案中，第二個劑量的組合物在初次施用后大約兩周到一年，優選約I個月、約2個月、約3個月、約4個月、約5個月到約6個月施用。進一步，可以在第二個劑量之后，且在初次施用后大約3個月到大約兩年甚至更長時間，優選約4個月、約5個月、或者約6個月、或者約7個月到約I年施用第三個劑量。當施用第二個劑量后在受試者的血清和/或尿或者粘膜分泌物中沒有檢測到或者檢測到低水平的特異性免疫球蛋白時，可任選地施用第三個劑量。在一個優選的實施方案中，第二個劑量在第一次施用后大約I個月施用，而第三個劑量在第一次施用后大約6個月施用。在另一個實施方案中，第二個劑量在第一次施用后大約6個月施用。
[0160]在另一個實施方案中，所述本發明的VLP可用作為聯合療法的一部分施用。例如，本發明的VLP可以與其它免疫原性組合物和/或抗病毒劑(例如金剛烷胺(Amantadine)、金剛乙胺(Rimantadine)、扎那米韋(Zanamivir)和奧塞米韋(Osteltamivir))共同配制。
[0161]本領域技術人員可以容易地確定藥物制劑的劑量，例如通過首先鑒定可有效引發預防性或治療性免疫應答的劑量，例如通過測量病毒特異性免疫球蛋白的血清效價或通過測量血清樣品或尿樣品或粘膜分泌物中抗體的抑制比。所述劑量可以由動物研究確定。用于研究流感病毒的動物的非限制性清單包括豚鼠、敘利亞地鼠(Syrian hamster)、栗鼠(chinchilla)、刺 猬、雞、大鼠、小鼠和雪貂(ferret)。大多數動物不是流感病毒的天然宿主，但仍可用于該疾病的各個方面的研究。例如，可以對任何上述動物定量給予疫苗候選物，例如本發明的VLP，以部分地表征誘發的免疫應答，和/或確定是否生成了任何中和性抗體。例如，已經在小鼠模型中進行了許多研究，因為小鼠體型小，而且它們的成本低使得研究者可以進行大規模研究。但是，小鼠的小體型也增加了迅捷觀察任何疾病臨床體征的難度，而且小鼠不是人類中疾病的預測性模型。
[0162]雪貂已經廣泛地用于人流感病毒感染及其作用過程的各個方面的研究。如果沒有雪貂的應用，對流感病毒免疫的許多現代概念的發展是不可能的(Maher et al.2004)。已經證明雪貂是研究流感的良好模型，原因有如下數方面:就臨床體征、發病機制和免疫力而言，雪貂中的流感感染非常近似于人中的流感感染；人類甲型和乙型流感病毒天然地感染雪貂，從而使人們有機會對完全受控的群體進行研究以觀察感染傳播、疾病和流感病毒糖蛋白中氨基酸序列變異之間的相互影響；而且雪貂還具有其它使其成為解析該疾病表現的理想模型的體質特征。例如，雪貂和人顯示非常近似的流感感染臨床體征，這些體征看起來依賴于宿主年齡、病毒株、環境條件、繼發細菌感染的程度和其它許多變量。因此，相比于小鼠或者上述其它任何模型，本領域技術人員可以更容易地將來自雪貂模型的流感疫苗的效力與劑量方案與人相關聯。
[0163]此外，本領域技術人員可以進行人體臨床研究來確定用于人的優選有效劑量。這樣的臨床研究是常規的，且為本領域公知。要使用的確切劑量還將依賴于施用途徑。可以從衍生自體外或動物試驗系統的劑量-應答曲線外推得到有效劑量。
[0164]本領域還公知，可以使用免疫應答的非特異性刺激物來增強具體組合物的免疫原性，這樣的刺激物稱為佐劑。實驗上已經使用佐劑來促進針對未知抗原的免疫力的普遍增加(見美國專利N0.4，877，611)。免疫規程使用佐劑來刺激應答已有多年，因此，本領域普通技術人員對佐劑是熟知的。有些佐劑影響抗原呈遞的方式。例如，當蛋白抗原被明礬沉淀時，免疫應答增加。抗原的乳化也可延長抗原呈遞的持續時間。本發明的范圍意圖涵蓋Vogel 等人“A Compendium of Vaccine Adjuvants and Excipients (2nd Edition),，，(本文通過提述收錄該文獻全部內容用于所有目的)中所述任何佐劑的引入。
[0165]示例性的佐劑包括完全弗氏佐劑(一種非特異性免疫應答刺激物，含有已殺死的結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis))、不完全弗氏佐劑和氫氧化招佐劑。其它佐劑包括GMCSP、BCG、氫氧化鋁、MDP化合物諸如thur_MDP和nor_MDP、CGP (MTP-PE)、脂質A和單磷酰脂質A(MPL)。還設想使用RIBI，其在2%角鯊烯/TWeen80乳液中含有從細菌提取的3種成分:MPL、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)和細胞壁骨架(CWS)。還可以使用MF-59、Novasomes?, MHC 抗原。
[0166]在本發明的一個實施方案中，所述佐劑是少片層(paucilamellar)脂質小泡,其具有大約2到10個雙層，它們排列成多個基本呈球形的殼，由水性層隔開，圍繞著不含脂質雙層的無定形中心大空腔。少片層脂質小泡可以通過數種方式起作用來刺激免疫應答:作為非特異性刺激物、作為抗原載體、作為其它佐劑的載體，以及這些方式的組合。例如，當通過混合抗原與預先形成的小泡，使得抗原相對于小泡保持在胞外(extracellular)的方法制備疫苗時，少片層脂質小泡起非特異性免疫刺激物的作用。通過將抗原包被在小泡的中心空腔中，小泡起到免 疫刺激物和抗原載體兩方面的作用。在另一個實施方案中，小泡主要由非磷脂小泡構成。在另一個實施方案中，小泡是Novasomes。Novasomes?是大約IOOnm到大約500nm范圍的少片層非磷脂小泡。它們包含Bri j72、膽固醇、油酸和角鯊烯。Novasomes已被證明是流感抗原的有效佐劑(參見美國專利5，629，021,6, 387，373和4，911，928，本文通過提述收錄它們的全部內容用于所有目的)。
[0167]在一個方面，使用藥劑來達到佐劑的效果，例如使用明礬，其以磷酸鹽緩沖鹽水中大約0.05到大約0.1%的溶液使用。或者，VLP可以制成與合成糖聚合物(Carbopol?)的混
合物，所述聚合物以大約0.25%的溶液使用。有些佐劑，例如某些從細菌獲得的有機分子，作用于宿主而非抗原。一個例子是胞壁酰二肽(N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺[MDP]),—種細菌肽聚糖。在其它實施方案中，血藍蛋白和血紅蛋白(hemoerythrin)也可與本發明的VLP—起使用。在某些實施方案中優選使用來自鑰孔I戚的血藍蛋白(KLH)，但可以使用其它軟體動物和節肢動物血藍蛋白和血紅蛋白。
[0168]還可以使用各種多糖佐劑。例如，各種肺炎球菌多糖佐劑對小鼠抗體應答的效用已經有描述(Yin et al., 1989) 0產生最佳應答的劑量或者在其它方面不產生抑制的劑量應當如指示地使用(Yin et al.，1989)。多糖的多胺變化形式是特別優選的,例如幾丁質和殼聚糖，包括脫乙酰幾丁質。在另一個實施方案中，胞壁酰二肽的親脂性雙糖-三肽衍生物描述用于由磷脂酰膽堿和磷脂酰甘油形成的人工脂質體中。
[0169]兩親性物質和表面活性物質,例如阜苷和衍生物例如QS21 (Cambridge Biotech)構成用于本發明的VLP的另一類佐劑。非離子型嵌段共聚物表面活性劑(Rabinovich etal.，1994)也可以使用。寡核苷酸是另一類有用的佐劑(Yamamoto et al.，1988)。Quil A和香菇多糖(Ientinen)是其它可用于本發明某些實施方案中的佐劑。
[0170]另一類佐劑是脫毒的內毒素，例如美國專利N0.4，866，034的精制脫毒內毒素。這些精制脫毒內毒素可在脊椎動物中有效產生佐劑應答。當然，脫毒內毒素可以與其它佐劑組合使用以制備多佐劑制劑。例如，特別考慮脫毒內毒素與海藻糖二霉菌酸酯的組合，如美國專利N0.4，435，386所述的。還考慮脫毒內毒素與海藻糖二霉菌酸酯和內毒素糖脂的組合(美國專利N0.4，505，899)，以及脫毒內毒素與細胞壁骨架(CWS)的組合或者與CWS和海藻糖二霉菌酸酯的組合，如美國專利N0.4，436，727,4, 436，728和4，505，900所述的。我們預想，僅有CWS和海藻糖二霉菌酸酯而無脫毒內毒素的組合也是有用的，如美國專利N0.4，520,019 中所述的。
[0171]本領域技術人員將會知道能夠與根據本發明的疫苗偶聯的不同種類的佐劑，這些包括烷基溶血磷脂(ALP) ;BCG;和生物素(包括生物素化的衍生物)，以及其它。本文特別考慮使用的某些佐劑有來自革蘭氏細胞(Gram-cells)的磷壁酸。這些包括脂磷壁酸(lipoteichoic acids, LTA)、核糖醇憐壁酸(ribitol teichoic acids, RTA)和甘油憐壁酸(glycerol teichoic acid, GTA)。它們的合成對應物的活性形式也可以用于本發明(Takada et al., 1995)。
[0172]例如，如果希望激發抗體或隨后獲得活化T細胞，多種佐劑，即使是那些通常不用于人的佐劑，仍可用于其它脊椎動物。佐劑或細胞可能造成的毒性或其它不良作用，例如使用未受照射的腫瘤細胞時可能發生的毒性或其它不良作用，在此情況下是不相干的。
[0173]另一種 誘發免疫應答的方法可以通過將本發明的VLP與“免疫刺激物” 一起配制來實現。這些“免疫刺激物”是身體自有的增加免疫系統應答的化學信使(細胞因子)。免疫刺激物包括但不限于具有免疫刺激性、免疫強化和促炎癥活性的各種細胞因子、淋巴因子和趨化因子，例如白細胞介素(例如IL-1、IL-2、IL-3、IL_4、IL-12、IL-13);生長因子(例如粒細胞-巨噬細胞(GM)集落刺激因子(CSF));和其它免疫刺激性分子，例如巨噬細胞炎性因子，Flt3配體、B7.1、B7.2等等。免疫刺激性分子可以與流感VLP在相同的制劑中施用，或者可以另行施用。可以施用蛋白質或者編碼該蛋白質的表達載體來產生免疫刺激效應。
[0174]刺激抗流感免疫應答的方法
[0175]本發明的VLP可用于制備刺激免疫應答的組合物，所述免疫應答賦予針對流感病毒的免疫力或顯著的免疫力。粘膜免疫和細胞免疫均可貢獻于抗流感感染和疾病的免疫力。在上呼吸道中局部分泌的抗體是針對自然感染的抗性中的主要因素。分泌型免疫球蛋白A(sIgA)參與上呼吸道的保護,血清IgG參與下呼吸道的保護。感染所誘發的免疫應答抵御同一病毒或抗原性類似的病毒株的再次感染。流感病毒頻繁發生不可預測的變化，因此，自然感染后，宿主免疫提供的針對人群中流行的新病毒株的有效保護期可能僅有數年。[0176]本發明的VLP當施用于脊椎動物(例如人)時可以在所述脊椎動物中誘發顯著的免疫力。顯著的免疫力由針對本發明的流感VLP的免疫應答導致，在所述脊椎動物中保護或改善流感病毒感染或者至少減輕流感病毒感染的癥狀。在一些情況下，如果所述脊椎動物被感染，所述感染將是無癥狀的。所述應答可能不是完全保護性的應答。在此情況下，如果所述脊椎動物感染了流感病毒，該脊椎動物與未經免疫的脊椎動物相比將經歷減輕的癥狀或者較短的癥狀持續時間。
[0177]在一個實施方案中，本發明包括誘發受試者體內針對流感病毒感染或其至少一種癥狀的顯著的免疫力的方法，包括施用至少一個有效劑量的流感VLP。在另一個實施方案中，所述顯著的免疫力的誘導減少流感癥狀的持續時間。在另一個實施方案中，誘發受試者體內針對流感病毒感染或其至少一種癥狀的顯著的免疫力的方法包括施用至少一個有效劑量的流感VLP，其中所述VLP包含流感HA、NA和Ml蛋白。在另一個實施方案中，所述流感VLP包含流感蛋白，其中所述流感蛋白由HA、NA和Ml蛋白構成。這些VLP含有HA、NA和M1，并可含有其它細胞組分諸如細胞蛋白、桿狀病毒蛋白、脂質、碳水化合物等，但不含有其它的流感蛋白(除了 M1、HA和/或NA的片段之外)。在另一個實施方案中，誘發受試者體內針對流感病毒感染或其至少一種癥狀的顯著的免疫力的方法包括施用至少一個有效劑量的流感VLP，其中所述VLP基本上由HA、NA和Ml組成。所述VLP可包含可忽略濃度的其它流感蛋白和/或蛋白雜質。在另一個實施方案中，誘發受試者體內針對流感病毒感染或其至少一種癥狀的顯著的免疫力的方法包括施用至少一個有效劑量的流感VLP，其中所述VLP由流感HA、NA和Ml組成。在另一個實施方案中，所述HA和/或NA分別展現血凝素活性和/或神經氨酸酶活性。在另一個實施方案中，所述受試者是哺乳動物。在另一個實施方案中，所述哺乳動物是人。在又一個實施方案中，所述VLP與佐劑或免疫刺激物一起配制。
[0178]最近，人們共同致力于構建針對具有產生大流行潛力的禽流感病毒的疫苗。這是因為多種禽流感病毒已經跨越了物種屏障而直接感染了人類，使人患病，而且在一些情況下導致死亡。這些病毒是H5N1、H9N2和H7N7(Cox et al.，2004)。最近一項研究考察了使用滅活H5N1流感病毒作為疫苗的潛力。該疫苗的配方與現有已許可上市的許可滅活疫苗相似。該研究的結論是使用滅活的H5N1病毒的確在人類中誘導了免疫應答，但所給的劑量很高(90 μ g禽流感,相比于 15 μ g的許可疫苗)(Treanor et al.，2006)。大量的禽流感抗原對于世界范圍的接種計劃而言是不切實際的。如下文說明的，本發明的VLP當施用于脊椎動物時在所述脊椎動物中誘發免疫應答。
[0179]因此，本發明涵蓋誘發受試者體內針對流感病毒感染或其至少一種癥狀的顯著的免疫力的方法，包括施用至少一個有效劑量的禽流感VLP。在另一個實施方案中，所述顯著的免疫力的誘發減少流感癥狀的持續時間。在另一個實施方案中，所述免疫力的誘發是來自施用含至少0.2 μ g禽類HA的本發明VLP。在另一個實施方案中，所述免疫力的誘發是來自施用含至少0.2 μ g禽類HA到至少15 μ g禽類HA的本發明VLP。施用可以分為一個或更多個劑量進行，但有利的是以一個劑量進行。在另一個實施方案中，所述VLP禽類HA衍生自禽流感H5N1。
[0180]在另一個實施方案中，本發明包括誘發受試者體內針對禽流感病毒感染或其至少一種癥狀的顯著的免疫力的方法，包括施用至少一個有效劑量的禽流感VLP，其中所述VLP包含禽流感HA、NA和Ml。在另一 個實施方案中，所述禽流感VLP包含禽流感蛋白，其中所述禽流感蛋白由HA、NA和Ml蛋白組成。這些VLP含有HA、NA和Ml，并可含有其它細胞組分諸如細胞蛋白、桿狀病毒蛋白、脂質、碳水化合物等，但不含有其它的流感蛋白(除了 Ml、HA和/或NA的片段之外)。在另一個實施方案中，所述誘發受試者體內針對禽流感病毒感染或其至少一種癥狀的顯著的免疫力的方法包括施用至少一個有效劑量的禽流感VLP，其中所述VLP基本上由禽流感HA、NA和Ml組成。所述VLP可包含可忽略濃度的其它流感蛋白和/或蛋白雜質。在另一個實施方案中，所述誘發受試者體內針對流感病毒感染或其至少一種癥狀的顯著的免疫力的方法包括施用至少一個有效劑量的流感VLP，其中所述VLP由禽流感HA、NA和Ml蛋白組成。在另一個實施方案中，所述禽流感HA和NA分別是H5N1。在另一個實施方案中，所述禽流感HA和NA分別是H9N2。在另一個實施方案中，所述禽流感HA和NA分別是H7N7。在另一個實施方案中，所述禽流感HA和/或NA分別展現血凝素活性和/或神經氨酸酶活性。在另一個實施方案中，所述受試者是哺乳動物。在另一個實施方案中，所述哺乳動物是人。在又一個實施方案中，所述VLP與佐劑或免疫刺激物一起配制。
[0181]在另一個實施方案中，所述禽流感VLP在脊椎動物中誘發的免疫應答，與配制方式類似于現有許可上市的許可滅活疫苗的相似禽流感抗原相比，效力增加到大約2倍，大約4倍，大約8倍，大約16倍，大約32倍，大約64倍，大約128倍(或更高)。現有制劑包括全滅活病毒(例如甲醛處理的)疫苗、裂解(split)病毒(化學性破壞的)疫苗、和亞單位(純化糖蛋白)疫苗。確定疫苗效力的方法在本領域是已知和常規的。例如，可進行微中和測定和凝血抑制測定來確定禽類VLP疫苗相對于配制方式類似于現有許可上市的許可滅活疫苗的禽流感抗原的效力。在一個實施方案中，當對脊椎動物施用大約0.2μ g、大約0.4 μ g、大約0.6 μ g、大約0.8 μ g、大約I μ g、大約2 μ g、大約3 μ g、大約4 μ g、大約5 μ g、大約6 μ g、大約7 μ g、大約9 μ g、大約10 μ g、大約15 μ g、大約20 μ g、大約25 μ g、大約30 μ g、大約35 μ g、40 μ g、大約45 μ g、大約50 μ g或更多的VLP和配制方式類似于現有許可上市滅活疫苗的抗原(即:VLP中相當量的HA和/或NA，和以配制方式類似于許可滅活疫苗和/或任何其它抗原的相當量的HA和/或NA)時，實現上述效力增加。可以根據HA含量來測量。例如，I μ g的本發明VLP為含HA的VLP溶液中的I μ g HA或者可以VLP重量測量。
[0182]人們每年接受季候性流感疫苗以減少每年流感病例的發生。目前，在美國有兩種亞型的甲型流 感和乙 型流感流行。因此，現有疫苗是三價的，以提供針對流行中病毒株的保護。每年不同的流感病毒株或流感病毒變體改變。因此，大多數年份中制造并施用新疫苗組合物。滅活疫苗是通過在含胚雞蛋中擴增病毒來生產的。采集尿囊液，濃縮并純化病毒后加以滅活。因此，現有的許可流感病毒疫苗可能含有痕量的殘余卵蛋白，因此不應給予對蛋有過敏性超敏反應的人。此外，蛋的供應必須是有組織的，而且用于生產疫苗的病毒株必須在下一個流感季候前數個月選定，這樣就限制了該方法的靈活性，經常導致生產和分配的遲延和短缺。而且，一些流感病毒株在含胚雞蛋中復制不好，這可能對能夠生長并配制成疫苗的流感病毒株構成限制。
[0183]如上所述，本發明VLP的生產不需要蛋。這些VLP是藉由細胞培養系統制備的。因此，本發明涵蓋誘發受試者體內針對流感病毒感染或其至少一種癥狀的顯著的免疫力的方法，包括施用至少一個有效劑量的季候性流感VLP。如上文討論的，季候性流感病毒是指就某一流感季候而言，已根據全球各國家流感中心進行的流行病學調查確定為正在人群內傳播的流感病毒株。所述研究結果以及某些分離的流感病毒被送到世界衛生組織(WHO)的四個參考實驗室之一以進行詳細研究，其中一個實驗室設置在亞特蘭大的疾病控制和預防中心(⑶C)。這些實驗室測試針對現有疫苗制備的抗體與流行中的病毒和新流感病毒反應的良好程度。將該信息和有關流感活動情況的信息匯總并提交到美國食品和藥品管理局(FDA)的一個顧問委員會以及WHO的會議上。這些會議的結果是選擇三種病毒(甲型流感病毒的兩個亞型和乙型流感病毒的一個亞型)進入用于下個秋季和冬季的流感疫苗。該選擇在北半球于2月份進行，在南半球于9月份進行。通常，每年改變疫苗中三種病毒株中的一種或兩種。在另一個實施方案中，所述顯著的免疫力的誘導減少流感癥狀的持續時間。
[0184]在另一個實施方案中，本發明包含誘發受試者體內針對季候性流感病毒感染或其至少一種癥狀的顯著的免疫力的方法，包括施用至少一個有效劑量的季候性流感VLP，其中所述VLP包含季候性流感HA、NA和Ml蛋白。在另一個實施方案中，所述季候性流感VLP包含季候性流感蛋白，其中所述流感蛋白由HA、NA和Ml蛋白構成。這些VLP含有HA、NA和M1，并可含有其它細胞組分諸如細胞蛋白、桿狀病毒蛋白、脂質、碳水化合物等，但不含有其它的流感蛋白(除了 M1、HA和/或NA的片段之外)。在另一個實施方案中，所述誘發受試者體內針對季候性流感病毒感染或其至少一種癥狀的顯著的免疫力的方法包括施用至少一個有效劑量的季候性流感VLP，其中所述VLP基本上由季候性流感HA、NA和Ml組成。所述VLP可包含可忽略濃度的其它流感蛋白和/或蛋白雜質。在另一個實施方案中，誘發受試者體內針對流感病毒感染或其至少一種癥狀的顯著的免疫力的方法包括施用至少一個有效劑量的流感VLP，其中所述VLP由季候性流感HA、NA和Ml組成。在另一個實施方案中，所述禽流感HA和/或NA分別展現血凝素活性和/或神經氨酸酶活性。在另一個實施方案中，所述受試者是哺乳動物。在另一個實施方案中，所述哺乳動物是人。在又一個實施方案中，所述VLP與佐劑或免疫刺激物一起配制。
[0185]通常，本發明的季候性流感VLP的施用數量足以刺激針對一種或多種季候性流感病毒株的顯著的免疫力。在一個實施方案中，將所述VLP與包含不同流感亞型蛋白(如上面列出的)的其它VLP—起摻混。在另一個實施方案中，制劑是三價制劑，包含具有來自至少兩種甲型流感亞型和/或至少 一種乙型流感亞型的季候性流感HA和/或NA蛋白的VLP的混合物。在另一個實施方案中，所述乙型亞型是通過與上面所述相同的方法制備的。在另一個實施方案中，多價組合物包含一種或多種如上所述的本發明VLP。
[0186]在另一個實施方案中，本發明的VLP (禽類或季候性VLP)可引發這樣的免疫應答，所述免疫應答將提供針對多于一種流感病毒株的保護。由具體亞類的、具體病毒株構建的流感VLP對脊椎動物的交叉保護可誘發針對不同毒株和/或亞類的流感病毒的交叉保護。下文的實施例顯示，本發明的VLP能夠誘發與不同病毒株和/或亞類的交叉反應性。
[0187]體液免疫系統產生針對不同流感抗原的抗體，其中HA特異性抗體對于中和病毒及由此防止疾病是最重要的。NA特異性抗體預防感染的有效性較低，但它們減少被感染細胞釋放病毒。粘膜組織是許多病原體包括流感的主要侵入門戶，而粘膜免疫系統提供了除天然免疫之外針對感染的第一道防線。SIgA，從某種程度上說還有IgM，是針對粘膜病原體的主要中和性抗體，防止病原體進入，并且可以在細胞內作用以抑制病毒復制。鼻分泌物含有中和性抗體，特別是針對流感HA和NA的中和性抗體，其主要為IgA同種型且為局部產生。在原發感染過程中，可以通過酶聯免疫吸附測定在鼻沖洗液中檢出對HA特異性的所有三個主要的Ig類型(IgG、IgA和IgM)，雖然IgA和IgM比IgG更常被檢出。IgA，從某種程度上說還有IgM，均在局部活躍地分泌，而IgG是作為血清分泌物衍生的。在具有局部IgA應答的受試者中，也觀察到血清IgA應答。由自然感染刺激的局部IgA應答持續至少3-5個月，并且可以在局部檢出流感特異性IgA定向的記憶細胞。IgA也是繼發感染后局部分泌物中的主要Ig同種型，并且在后續感染時在血清中檢測到IgA應答。活病毒疫苗誘發的局部產生的中和性抗體的存在與野生型病毒攻擊后的感染抵抗力和病情相關聯。
[0188]針對流感感染的抵抗力或病情與針對HA和NA抗體的局部和/或血清水平相關。血清抗HA抗體是最經常被測量的抗流感保護相關指標(Cox et al.，1999)。自然流感感染后在大約80%的受試者中可檢測到保護性血清抗體(凝血抑制(HI)效價> 40)應答。在正常受試者(Cox et al., 1994)和正經歷流感感染的個體中存在產生所有三種主要Ig類型的B細胞。在人類中，血清抗體在流感感染的抵抗力和恢復中起作用。人類中針對HA和NA的血清抗體水平可以與實驗感染和自然感染后的病情抵抗力相關聯。在原發感染過程中，在10-14天內可檢測到三種主要Ig類型。IgA和IgM水平在2周后達到峰值然后開始降低，而IgG水平在4-6周達到峰值。雖然初次應答中IgG和IgM是主要的，在二次免疫應答中IgG和IgA占主要地位。
[0189]由此，本發明包含誘發受試者中針對流感病毒感染或其至少一種癥狀的顯著的保護性抗體應答的方法，包括施用至少一個有效劑量的流感VLP。在另一個實施方案中，所述顯著的保護性抗體應答的誘發減少流感癥狀的持續時間。在另一個實施方案中，誘發受試者中針對流感病毒感染或其至少一種癥狀的顯著的保護性抗體應答的方法包括施用至少一個有效劑量的流感VLP，其中所述VLP包含流感HA、NA和Ml蛋白。
[0190]在另一個實施方案中，本發明包括誘發受試者體內針對流感病毒感染或其至少一種癥狀的顯著的保護性抗體應答的方法，包括施用至少一個有效劑量的流感VLP，其中所述VLP基本上由流感HA、NA和Ml組成。所述VLP可包含可忽略濃度的其它流感蛋白和/或蛋白雜質。在另一個實施方案中，所述VLP包含流感蛋白，其中所述流感蛋白由HA、NA和Ml組成。這些VLP含有HA、NA和 Ml，并可含有其它細胞組分諸如細胞蛋白、桿狀病毒蛋白、月旨質、碳水化合物等，但不含有其它的流感蛋白(除了 Ml、HA和/或NA的片段之外)。在另一個實施方案中，誘發受試者體內針對流感病毒感染或其至少一種癥狀的顯著的免疫力的方法包括施用至少一個有效劑量的流感VLP，其中所述VLP由流感HA、NA和Ml組成。在另一個實施方案中，其中所述流感HA、NA和Ml衍生自季候性流感和/或禽流感。在另一個實施方案中，所述HA和/或NA分別展現血凝素活性和/或神經氨酸酶活性。在另一個實施方案中，所述受試者是哺乳動物。在另一個實施方案中，所述哺乳動物是人。在又一個實施方案中，所述VLP與佐劑或免疫刺激物一起配制。
[0191]如本文所用的，術語“抗體”是包含一個或多個基本上或者部分地由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段編碼的多肽的蛋白質。公認的免疫球蛋白基因包括K、λ、α、Y、δ、ε和μ恒定區基因和無數免疫球蛋白可變區基因。輕鏈分為K或λ。重鏈分為Υ、μ、α、δ或ε，它們進而分別定義免疫球蛋白的類型:IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。典型的免疫球蛋白(抗體)結構單位由四聚體構成。每個四聚體由同樣的兩對多肽鏈組成，每對具有一條“輕”(大約25kD)鏈和一條“重”(大約50-70kD)鏈。每條鏈的N末端定義一個大約100-110個或更多氨基酸的可變區，它主要負責抗原識別。抗體作為完整的免疫球蛋白存在，或者作為若干通過各種肽酶消化而產生的、已充分表征的片段存在。
[0192]細胞介導的免疫也在流感感染的恢復中起作用，還可以防止流感相關的并發癥。已經在被感染受試者的血液和下呼吸道分泌物中檢出了流感特異性細胞淋巴細胞。流感感染細胞的細胞溶解是由CTL與流感特異性抗體和補體共同介導的。在被感染或接種疫苗的個體中，初次細胞毒性應答可于6-14天后在血液中檢測到，并在第21天以前消失(Enniset al.，1981)。流感特異性CTL在體外培養中展現交叉反應特異性，從而，它們溶解感染了相同類型流感而非其它類型(例如甲型流感而非乙型流感病毒)的細胞。識別內部非糖基化蛋白，M、NP和PB2的CTL已得到分離(Fleischer et al.，1985)。CTL應答在甲型流感病毒株之間有交叉反應性(Gerhard et al.，2001),并且在與抗體共同使病毒擴散最小化中是重要的(Nguyen et al.，2001)。
[0193]細胞介導的免疫也在流感感染的恢復中起作用，還可以防止流感相關的并發癥。已經在被感染受試者的血液和下呼吸道分泌物中檢出了流感特異性細胞淋巴細胞。流感感染細胞的細胞溶解是由CTL與流感特異性抗體和補體共同介導的。在被感染或接種疫苗的個體中，初次細胞毒性應答可于6-14天后在血液中檢測到，并在第21天以前消失(Enniset al.，1981)。流感特異性CTL在體外培養中展現交叉反應特異性，從而，它們溶解感染了相同類型流感而非其它類型(例如甲型流感而非乙型流感病毒)的細胞。識別內部非糖基化蛋白，M、NP和PB2的CTL已得到分離(Fleischer et al.，1985)。CTL應答在甲型流感病毒株之間有交叉反應性(Gerhard et al.，2001),并且在與抗體共同使病毒擴散最小化中是重要的(Nguyen et al.，2001)。.[0194]由此，本發明包括誘發受試者體內針對流感病毒感染或其至少一種癥狀的顯著的保護性細胞免疫應答的方法，包括施用至少一個有效劑量的流感VLP。在另一個實施方案中，誘發受試者體內針對流感病毒感染或其至少一種癥狀的顯著的免疫力的方法包括施用至少一個有效劑量的流感VLP，其中所述VLP由流感HA、NA和Ml組成。在另一個實施方案中，所述流感VLP包含流感蛋白，其中所述流感蛋白由HA、NA和Ml蛋白組成。這些VLP含有HA、NA和M1，并可含有其它 細胞組分諸如細胞蛋白、桿狀病毒蛋白、脂質、碳水化合物等，但不含有其它的流感蛋白(除了 M1、HA和/或NA的片段之外)。在另一個實施方案中，其中所述流感HA、NA和Ml衍生自季候性流感和/或禽流感病毒。在另一個實施方案中，所述HA和/或NA分別展現血凝素活性和/或神經氨酸酶活性。在另一個實施方案中，所述受試者是哺乳動物。在另一個實施方案中，所述哺乳動物是人。在又一個實施方案中，所述VLP與佐劑或免疫刺激物一起配制。
[0195]如上所述，本發明的VLP (例如禽流感和/或季候性流感VLP)預防或減輕受試者中流感感染的至少一種癥狀。流感的癥狀是本領域公知的。它們包括發熱、肌痛、頭痛、嚴重不適、干咳、咽喉痛、體重減輕和鼻炎。因此，本發明的方法包括預防或減輕與流感病毒感染相關的至少一種癥狀。癥狀的減輕可以主觀地或者客觀地確定，例如受試者自我評估、由內科醫生評估、或通過實施合適的測定或測量(例如體溫)，包括例如生活質量評價、流感感染或其它癥狀的進展減慢、流感癥狀的嚴重程度降低或者合適的測定(例如抗體效價(titer)和/或T細胞激活測定)。客觀評價包括動物和人的評價。
[0196]免疫實施咨詢委員會(AdvisoryCommittee on Immunization Practices, ACIP)所提倡的主要流感控制策略是對具有流感嚴重并發癥風險的人，特別是> 65歲的人進行疫苗接種。但是，每年的流感流行仍未減輕，并給我們的社會帶來了重大的健康和財政負擔(Glaser et al.，1996)。在過去的20年中(1976-1999)，流感相關全因超額死亡數(influenza-associated all cause excess deaths)發生了顯著的增加。從 1990 年到1999年,每年流感相關全因死亡數超過50，000 (Thompson et al.，2003)。雖然過去10年內^ 65歲的人的疫苗覆蓋率增加到了 65%，但流感相關全因超額死亡數未出現相應的減少。
[0197]因此，流感預防和控制的另一策略是對健康兒童和個體進行普遍接種。兒童的流感感染率、流感所致的就醫疾病率和入院率均較高(Neuzil et al.，2000)。兒童在學校、家庭和社區內的流感傳播中扮演著重要的角色。用現有流感疫苗對某個社區中大約80%的學童進行接種減少了成人中的呼吸系統疾病和老年人中的超額死亡(Reichert etal.，2001)。這種理念被稱為社區免疫力或者“群體免疫力”(herd immunity)，并被認為對于保護社區免于疾病具有重要意義。由于被接種的人具有能中和流感病毒的抗體，他們將流感病毒傳播給其他人的可能性大大降低。從而，即使沒有經過接種的人(以及接種已經減弱或者疫苗不完全有效的人)往往可以受到群體免疫力的防護，因為他們周圍經過接種的人不得病。群體免疫力隨著經過接種的人的百分比增加而更為有效。人們認為，為了實現群體免疫力，社區中大約95%的人必須得到疫苗的保護。未經免疫的人可增加他們和別人患病的機會。
[0198]因此，本發明包括通過對社區中的人群施用本發明的VLP，對人群或社區誘發針對流感病毒感染的顯著的保護性免疫，以在免疫受損的個體或未接種個體中減少流感病毒感染發生率的方法。在一個實施方案中，通過施用本發明的VLP對大多數學齡兒童進行抗流感病毒免疫。在另一個實施方案中，通過施用本發明的VLP對社區中大多數健康個體進行抗流感病毒免疫。在另一個實施方案中，本發明的VLP是“動態接種”策略的一個部分。動態接種是指堅定地生產低效力的疫苗，該疫苗與新發的大流行性病毒株相關，但由于抗原性漂移而可能不會在哺乳動物中提供完全的保護(見Germann et al.，2006)。由于將來大流行性病毒株的身份的不確定性，儲備匹配良好的大流行性病毒株幾乎是不可能的。但是，用匹配性不高但可能有效的 疫苗進行接種可能延緩大流行性病毒的擴散和/或減少流感病毒大流行株癥狀的嚴重程度。
[0199]本發明還涵蓋一種包含流感VLP的疫苗，其中所述疫苗當施用于受試者時誘發針對流感病毒感染或其至少一種癥狀的顯著的免疫力。在另一個實施方案中，所述顯著的免疫力的誘發減少流感癥狀的持續時間。在另一個實施方案中，所述疫苗在受試者中誘發針對流感病毒感染或其至少一種癥狀的顯著的免疫力，包括含有流感HA、NA和Ml蛋白的VLP。在另一個實施方案中，一種所述疫苗在受試者中誘發針對流感病毒感染或其至少一種癥狀的顯著的免疫力，包含基本上由流感HA、NA和Ml蛋白組成的VLP。所述VLP可含有可忽略濃度的其它流感蛋白和/或蛋白雜質。在另一個實施方案中，一種所述疫苗在受試者中誘發針對流感病毒感染或其至少一種癥狀的顯著的免疫力，包含由流感HA、NA和Ml蛋白組成的VLP。在另一個實施方案 中，一種所述疫苗在受試者中誘發針對流感病毒感染或其至少一種癥狀的顯著的免疫力，包含含有流感蛋白的VLP，其中所述流感蛋白由HA、NA和Ml蛋白組成。這些VLP含有HA、NA和Ml，并可含有其它細胞組分諸如細胞蛋白、桿狀病毒蛋白、月旨質、碳水化合物等，但不含有其它的流感蛋白(除了 Ml、HA和/或NA的片段之外)。在另一個實施方案中，所述流感HA、NA和Ml蛋白衍生自禽流感和/或季候性流感病毒。在另一個實施方案中，所述HA和/或NA分別展現血凝素活性和/或神經氨酸酶活性。在另一個實施方案中，所述受試者是哺乳動物。在另一個實施方案中，所述哺乳動物是人。在又一個實施方案中，所述VLP與佐劑或免疫刺激物一起配制。在另一個實施方案中，所述疫苗施用于哺乳動物。在又一個實施方案中，所述哺乳動物是人。
[0200]通過下面的實施例進一步說明本發明，這些實施例不應解釋為限制性的。本文通過提述收錄本申請中引用的所有參考文獻、專利和已公開的專利申請，以及附圖和序列表。
實施例
[0201]實施例1
[0202]材料和方法
[0203]使用桿狀病毒桿粒載體表達系統在草地夜蛾細胞(Sf_9S細胞系；ATCCPTA-4047)中表達禽流感甲型/香港/1073/99 (H9N2)病毒HA、NA和Ml基因。HA、NA和Ml基因是利用從禽流感甲型/香港/1073/99 (H9N2)病毒分離的RNA通過逆轉錄和聚合酶鏈式反應(PCR)合成的(圖1、2和3)。逆轉錄和PCR使用對禽流感甲型/香港/1073/99 (H9N2)病毒HA、NA和Ml基因特異性的寡核苷酸引物(表1)。首先將這些基因的cDNA拷貝克隆到細菌亞克隆載體PCR2.1T0P0中。從所得的三種基于pCR2.1T0P0的質粒將HA、NA和Ml基因插入桿狀病毒轉移載體pFastBac I (InVitrogen)中AcMNPV多角體蛋白啟動子的下游，得到三種基于PFastBacl的質粒:pHA、pNA和pMl，它們分別表達這些流感病毒基因。然后，構建了編碼HA和Ml基因二者的、基于pFastBacl的單一質粒pHAM，這兩個基因分別位于不同的多角體蛋白啟動子的下游(圖4)。測定了 pNA質粒中NA基因和鄰近的5’-和3’-區域的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)(圖1)。同時，也使用pHAM質粒測定了 HA和Ml基因及鄰近區域的核苷酸序列(SEQ ID NO:2和3)(圖2和3)。
[0204]最后，將來自pHAM 質粒的一個編碼HA和Ml表達盒的限制性DNA片段克隆到pNA質粒中。由此得到編碼禽流感甲型/香港/1073/99 (H9N2)病毒HA、NA和Ml基因的質粒pNAHAM(圖 4)。
[0205]使用質粒pNAHAM構建重組桿狀病毒，該病毒含有整合到基因組中的流感病毒NA、HA和Ml基因，這些基因分別在不同的桿狀病毒多角體蛋白啟動子的下游。用所得的重組桿狀病毒感染允許性Sf-9S昆蟲細胞，結果這三種流感基因在每個感染了這些重組桿狀病毒的Sf-9S細胞中共表達。
[0206]感染后(p.1.)經過72小時，使用HA特異性和Ml特異性抗體通過SDS-PAGE分析、考馬斯藍蛋白染色和Western免疫印跡分析對Sf_9S細胞中的表達產物進行表征(圖5)。使用針對流感病毒甲型/香港/1073/99 (H9N2)激發產生的兔抗體(CDC，Atlanta, Ga.，USA)或者針對流感Ml蛋白的小鼠單克隆抗體(Serotec，UK)進行Western免疫印跡分析。Western免疫印跡分析檢測到了具有期望分子量的HA、NA和Ml蛋白(分別為64kd、60kd和31kd)。相比于該測定中檢測到的HA蛋白的量，NA蛋白與針對流感甲型/香港/1073/99 (H9N2)病毒的兔血清顯示較低的反應性。對于可檢測的NA蛋白的量的解釋包括:與HA蛋白相比，感染了重組桿狀病毒的Sf-9S細胞的NA蛋白表達水平較低；在Western免疫印跡測定中的致變性條件下NA與 該血清的反應性較低(由于膜結合的凝膠電泳過程中重要的NA表位喪失)；與HA-抗體相比NA-抗體親合力較低；或者血清中NA-抗體豐度較低。
[0207]對于來自感染了表達甲型/香港/1073/99 (H9N2)HA、NA和Ml蛋白的重組桿狀病毒的Sf-9S細胞的培養基也進行了流感病毒的探測。對經過澄清的培養上清液進行27，OOOrpm的超離心，以濃縮流感病毒的高分子(量)蛋白復合物，例如亞病毒顆粒、VLP、VLP復合物以及可能存在的由流感HA、NA和Ml蛋白構成的其它自組裝顆粒物。將離心沉淀的蛋白產物重懸在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS，pH7.2)中，然后在不連續的20-60%蔗糖分步梯度上進行超離心來進一步純化。從鹿糖梯度收集級分并利用SDS-PAGE分析、Western免疫印跡分析和電子顯微術進行分析。
[0208]通過考馬斯藍染色和Western免疫印跡分析在多個蔗糖密度梯度級分中檢測到了具有期望分子量的流感HA和Ml蛋白(圖6，表1)。這提示來自被感染的Sf-9S細胞的流感病毒蛋白在大分子量復合物(如殼粒結構、亞病毒顆粒、VLP和/或VLP復合物)中是聚集的。考馬斯藍染色和Western免疫印跡分析對NA蛋白的檢出不穩定,這可能是由于兔抗流感血清在Western免疫印跡分析中不能識別變性的NA蛋白所致,但在神經氨酸酶活性測定中穩定地檢出了 NA蛋白(圖10)。
[0209]表1
級分效價
【權利要求】
1.一種病毒樣顆粒(VLP)，其包含流感病毒Ml蛋白和流感病毒H5和NI血凝素和神經氨酸酶蛋白。
2.一種疫苗，其包含有效劑量的權利要求1的VLP。
3.—種在動物中誘發針對流感病毒感染的顯著的免疫力的方法，其包括施用至少一個有效劑量的權利要求2的疫苗。
4.權利要求1的VLP用于制備動物用疫苗的用途，其中所述疫苗在所述動物中誘發針對流感病毒感染的顯著的免疫力。
5.制備權利要求1的VLP的方法，其包括在真核細胞中表達所述Ml、HA和NA蛋白。
6.一種包含流感VLP的疫苗，其中所述VLP包含流感M1、HA和NA蛋白，其中所述疫苗在人體中誘發針對流感病毒感染的顯著的免疫力。
7.一種在人體中誘發針對流感病毒感染的顯著的免疫力的方法，其包括施用至少一個有效劑量的權利要求6的疫苗。
8.流感VLP用于制備疫苗的用途，其中所述VLP包含流感M1、HA和NA蛋白，其中所述疫苗在人體中誘發 針對流感病毒感染的顯著的免疫力。
【文檔編號】A61P31/16GK103865892SQ201410085506
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2006年10月18日 優先權日:2005年10月18日
【發明者】蓋爾.史密斯, 里克.布賴特, 彼得.普什科, 張金友, 庫塔布.馬穆德 申請人:諾瓦瓦克斯股份有限公司