一種葉酸介導的peg-氧化石墨烯負載阿霉素納米粒及其制備方法
【專利摘要】本發明涉及一種葉酸介導的PEG-氧化石墨烯負載阿霉素納米粒及其制備方法。本發明以葉酸和PEG對其進行功能化修飾，最后負載模型藥物阿霉素制備而成，本發明增加了納米粒的載藥量，提高了藥物靶向性，顯著延長了血漿半衰期和平均滯留時間，進而提高了阿霉素治療效果，本發明能夠降低阿霉素的毒副作用，延長藥物滯留時間并且提高藥物的靶向性，從而增強其抗腫瘤療效。本發明對于一些抗腫瘤譜廣，但副作用嚴重，毒性大的藥物具有重要的臨床意義。
【專利說明】一種葉酸介導的PEG-氧化石墨烯負載阿霉素納米粒及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種葉酸介導的PEG-氧化石墨烯負載阿霉素納米粒及其制備方法，屬于醫藥【技術領域】。
【背景技術】
[0002]阿霉素又稱多柔比星(Doxrubincin，DOX)，化學名為10-[ (3_氨基_2，3，6_三去氧^-來蘇己吡喃基)-氧]-7，8，9，10-四氫-6，8，11-三羥基-8-(羥乙酰基)_1_甲氧基-5，12-萘二酮。DOX是一種周期非特異性抗癌化療藥物，本品對各期細胞均有作用，但對S期的早期最為敏感，M期次之，而對Gl、S和G2期有延緩作用。其作用機制在于可直接作用于DNA，插入DNA的雙螺旋鏈，使其特征結構解旋，改變DNA的模板性質，抑制DNA聚合酶從而既抑制DNA，也抑制RNA合成。此外，本品具有形成超氧基自由基的功能，并有特殊破壞細胞膜結構和功能的作用，適用于急性白血病(淋巴細胞性和粒細胞性)、惡性淋巴瘤、乳腺癌、肺癌(小細胞和非小細胞肺癌)、卵巢癌、骨及軟組織肉瘤、腎母細胞瘤、膀胱癌、甲狀腺癌、前列腺癌、頭頸部鱗癌、睪丸癌、胃癌、肝癌等。臨床應用其鹽酸鹽注射液，常與其它抗癌藥物如長春堿、氟尿嘧啶、環磷酰胺等聯合用藥，已進入臨床的新劑型是其脂質體制劑，最早上市的制劑是美國Sequus開發的多喜(doxil)，主要用于治療復發性卵巢癌和人體免疫缺陷病毒(HIV)引起的難以醫治的卡巴氏肉瘤。
[0003]目前臨床應用的抗腫瘤化療藥物對腫瘤細胞的殺傷作用明顯，但卻無法選擇性的避開正常組織細胞，對人體造 成嚴重的毒副作用、療效差，而且易發生腫瘤細胞耐藥性。
[0004]石墨烯作為目前最理想的二維納米材料，其基本結構單元為無機材料中最穩定的苯六元環，具有獨特的二維結構和大的比表面積，以碳原子SP2雜化連接的單層石墨可以通過π-π作用負載藥物。同時單層石墨上面的含氧基團可以和藥物之間形成氫鍵作用，兩種載藥途徑可有效提高藥物負載效率減少藥物用量，降低毒副作用。
[0005]石墨烯作為藥物載體現在研究最多的是應用PEG對其進行表面修飾，一方面可以改善其親水性，提高生物相容性；另一方面可降低網狀內皮系統對微粒的識別，延長微粒在體內的半衰期。通過實體瘤的高通透性和滯留效應(enhanced permeability andretention effect, EPR)濃集于腫瘤部位,實現祀向治療腫瘤的目的。
[0006]在對石墨烯主動靶向修飾的研究中，葉酸介導的配體-受體靶向葉酸受體高度表達的惡性腫瘤部位的研究一直是熱點。研究表明葉酸作為腫瘤細胞的主動靶向頭基不僅具有廣譜性，而且也適用于耐藥腫瘤細胞的放化療，并且在分子大小、穩定性、免疫原型、成本等方面比其它受體如單克隆受體更具優勢。
[0007]目前尚無葉酸介導的PEG-氧化石墨烯負載阿霉素納米粒及制備方法的公開報道，本發明采用葉酸介導的PEG-氧化石墨烯負載DOX制備納米粒，增加載藥量，提高藥物的靶向性，顯著延長血漿半衰期和平均滯留時間，提高DOX治療效果，降低毒副作用，對阿霉素靶向制劑的臨床應用具有重要意義。
【發明內容】
[0008]本發明目的是提供一種葉酸(FA)介導的PEG-氧化石墨烯負載阿霉素納米粒，它具有靶向性好，載藥量高，血漿半衰期和平均滯留時間長，毒副作用小，能夠顯著提高藥物療效等特點。
[0009]本發明的另一個目的是提供一種葉酸介導的PEG-氧化石墨烯負載阿霉素納米粒的制備方法。
[0010]本發明采用葉酸介導的PEG-氧化石墨烯作為載體材料，通過磁力攪拌法制備葉酸介導的PEG-氧化石墨烯負載阿霉素納米粒(載DOX的PEG-GO-FA納米粒，即D0X*PEG-G0_FA)，其中，阿霉素與載體材料的質量比為I~5:1。
[0011]PEG-GO-FA 的制備
[0012](I)氧化石墨(GO)的制備與純化
[0013]稱取約1.0g石墨置于研缽中，加入約50g NaCl共同研磨約IOmin后，加蒸餾水將NaCl溶解，再抽濾將NaCl溶液除去，所得石墨濾餅在低于20°C的溫度下放置至徹底干燥，向石墨中加入23mL質量濃度為98%的硫酸和約0.8g硝酸鈉，持續攪拌12h，在溫度低于20°C的條件下，加入約5.0g高錳酸鉀。然后于40°C攪拌30min，于90°C攪拌90min，加入46mL的蒸餾水，提高溫度至105°C，繼續攪拌25min，最后加入10mL30%雙氧水和140mL的蒸餾水，趁熱過濾，用質量分數為5%的鹽酸溶液和蒸餾水交替洗滌濾餅，直至濾液中無SO42-離子(用BaC12溶液檢測)，于真空條件下干燥24h，密封保存待用。
[0014](2) GO 的羧化
[0015]取200mL燒杯，加入IOOmL去離水，稱取約IOOmg GO加至燒杯中，超聲分散，分別將5g NaOH和5g ClCH2COONa加入到燒杯中，水浴超聲2h，向燒杯中加入質量分數為5%的稀鹽酸洗滌、離心，反復多次直至PH呈中性，然后，將產物轉移至透析袋中(MW8000~14000 )，以去離子水為透析介質透析48h，并每12h更換一次介質，以去除產物溶液中的所有離子。將產物溶液烘干，即得羧化的GO (GO-COOH)0
[0016](3)葉酸(FA)介導的PEG-氧化石墨烯(PEG-GO-FA)的制備
[0017]稱取IOOmg的FA加入到反應瓶中，量取16mL 二甲基亞砜(DMSO)分次加入到反應瓶中并超聲使FA充分溶解，加入IOOmg G0-C00H并超聲分散后加入約214.2mg DCC(N，N’ - 二環己基碳二亞胺)、292mg NHSCN-羥基琥珀酰亞胺)和20 μ L吡啶，超聲活化2h，開始30min控制溫度在18°C，隨后2h內逐漸升溫至30°C，攪拌條件下加入PEG-NH2約700mg，30°C、氮氣保護下攪拌反應24h，反應結束后加入IOmL蒸餾水并于4°C水浴冷卻lh，20000r/min離心30min,0.8 μ m有機微孔濾膜過濾,將濾液轉移至透析袋中于碳酸氫鈉溶液(pH為8~9)中透析24h,再以去離子水為介質透析至無DMSO異味,最后將透析袋內溶液冷凍干燥，得黑色疏松粉末即為PEG-G0-FA。
[0018]載DOX的功能化石墨烯(PEG-GO-FA)納米粒(祀向納米粒)的制備，步驟如下:
[0019]稱取D0X，用pH7.0的PBS溶解，按阿霉素與載體材料的質量比為I~5:1稱取載體材料PEG-GO-FA混勻，置于磁力攪拌器上，室溫下以300~1000r/min轉速避光攪拌12~48h，經高分子超濾膜O IOOk)過濾，分別收集濾餅和濾液，濾餅反復以緩沖液沖洗，所得濾餅即為載DOX的PEG-GO-FA納米粒(D0X*PEG_G0_FA)，將產物于4°C保存。[0020]本發明所取得的技術效果:
[0021]本發明增加了納米粒的載藥量，提高了藥物靶向性，顯著延長了血漿半衰期和平均滯留時間，進而提高了阿霉素治療效果，本發明能夠降低阿霉素的毒副作用，延長藥物滯留時間并且提高藥物的靶向性，從而增強其抗腫瘤療效。本發明對于一些抗腫瘤譜廣，但副作用嚴重，毒性大的藥物具有重要的臨床意義。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0022]圖1為D0X*PEG-G0-FA納米粒粒徑分布圖；[0023]圖2為D0X*G0、D0X*PEG-G0_FA納米粒中DOX釋放曲線(n=3)圖；其中，曲線Al、曲線 A2 為 D0X*PEG-G0-FA (ρΗ=5.5 ▲、ρΗ=7.4 B),曲線 B1、曲線 Β2 為 D0X*G0，(ρΗ=5.5 ▲、ρΗ=7.4 _)。
【具體實施方式】
[0024]下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但實施例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護范圍內。
[0025]實施例1
[0026]取約D0X1.2mg,精密稱定，用ρΗ7.0的PBS緩沖液8mL溶解，與1.2mg載體材料PEG-GO-FA混勻，置于磁力攪拌器上，室溫下以300r.mirT1避光攪拌48h，經高分子超濾膜
100k)過濾，分別收集濾餅和濾液，濾餅反復以緩沖液沖洗即為D0X*PEG-G0_FA納米粒，將產物于4°C保存。
[0027]實施例2
[0028]取約D0X2.4mg,精密稱定，用ρΗ7.0的PBS緩沖液8mL溶解，與L 2mg載體材料PEG-GO-FA混勻，置于磁力攪拌器上，室溫下以700r.mirT1避光攪拌24h，經高分子超濾膜
100k)過濾，分別收集濾餅和濾液，濾餅反復以緩沖液沖洗即為D0X*PEG-G0_FA納米粒。將產物于4°C保存。
[0029]實施例3
[0030]取約D0X3.6mg,精密稱定，用ρΗ7.0的PBS緩沖液8mL溶解，與L 2mg載體材料PEG-GO-FA混勻，置于磁力攪拌器上，室溫下以1400r ^irT1避光攪拌12h，經高分子超濾膜
100k)過濾，分別收集濾餅和濾液，濾餅反復以緩沖液沖洗即為D0X*PEG-G0_FA納米粒。將產物于4°C保存。
[0031]實施例4
[0032]取約D0X4.8mg,精密稱定，用ρΗ7.0的PBS緩沖液8mL溶解，與1.2mg載體材料PEG-GO-FA混勻，置于磁力攪拌器上，室溫下以1400r ^irT1避光攪拌12h，經高分子超濾膜
100k)過濾，分別收集濾餅和濾液，濾餅反復以緩沖液沖洗即為D0X*PEG-G0_FA納米粒。將產物于4°C保存。
[0033]實施例5
[0034]取約D0X6.0mg,精密稱定，用ρΗ7.0的PBS緩沖液8mL溶解，與1.2mg載體材料PEG-GO-FA混勻，置于磁力攪拌器上，室溫下以1400r ^irT1避光攪拌12h，經高分子超濾膜100k)過濾，分別收集濾餅和濾液，濾餅反復以緩沖液沖洗即為D0X*PEG-G0_FA納米粒。將產物于4°C保存。
[0035]試驗例I載DOX的PEG-GO-FA納米粒包封率的測定
[0036]采用高效液相法測定游離藥物量，將結果帶入公式:
[0037]
【權利要求】
1.一種葉酸介導的PEG-氧化石墨烯負載阿霉素納米粒，其特征在于，采用葉酸介導的PEG-氧化石墨烯作為載體材料，通過磁力攪拌法制得葉酸介導的PEG-氧化石墨烯負載阿霉素納米粒，其中，阿霉素與載體材料的質量比為I~5:1。
2.根據權利要求1所述的葉酸介導的PEG-氧化石墨烯負載阿霉素納米粒，其特征在于，所述阿霉素與載體材料的質量比為3:1。
3.制備權利要求1所述的葉酸介導的PEG-氧化石墨烯負載阿霉素納米粒的方法，具體包括以下步驟: 稱取DOX，用pH7.0的PBS溶解，按阿霉素與載體材料的質量比為I~5:1稱取載體材料PEG-GO-FA混勻，置于磁力攪拌器上，室溫下以300~1000r.mirT1轉速避光攪拌12~48h，經高分子超濾膜O 100k)過濾，分別收集濾餅和濾液，濾餅反復以緩沖液沖洗，所得濾餅即為載DOX的PEG-GO-FA納米粒(D0X*PEG_G0_FA)，將產物于4°C保存。
4.如權利要求1或2所述的葉酸介導的PEG-氧化石墨烯負載阿霉素納米粒在制備抗腫瘤藥物中的應用。
【文檔編號】A61K31/704GK103784407SQ201410066632
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年2月26日 優先權日:2014年2月26日
【發明者】吳琳華, 紀宏宇, 唐景玲, 史士強, 石淑貞, 莊宇婷 申請人:哈爾濱醫科大學