一種木香硫酸化多糖及其制備方法和用途
【專利摘要】本發明公開了一種木香硫酸化多糖及其制備方法和用途。所述的木香硫酸化多糖是取代度為1.57～2.18，硫酸基取代位置在4位和6位的木香均一多糖的硫酸化衍生物，是由木香均一多糖經硫酸酯化反應獲得。實驗結果表明：本發明所述的木香硫酸化多糖無論在經典途徑還是旁路途徑都表現出理想的抗補體活性，其抗補體活性靶點為C1q、C1r、C1s、C3、C5和C9，優于陽性對照藥肝素，且不具有抗凝作用，是一種理想的抗補體抑制劑，可望作為抗補體活性成分用于制備保健食品或藥物制劑，具有廣闊的應用前景。
【專利說明】一種木香硫酸化多糖及其制備方法和用途
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種由木香均一多糖與氯磺酸-吡啶試劑經硫酸酯化反應獲得的木香硫酸化多糖及其制備方法和用途。
【背景技術】
[0002]補體系統是人體先天免疫的重要組成部分，在識別自身細胞和消滅外來微生物等生理過程中起著重要作用。目前研究普遍認為補體系統不僅參與體液免疫，而且參與細胞免疫，有超過30個血漿蛋白和細胞表面受體發揮作用，從加強B細胞或T細胞的作用直至直接導致細胞溶血。然而該系統的過度激活會引發很多疾病，如類風濕性關節炎、老年性癡呆、急性呼吸窘迫綜合征以及系統性紅斑狼瘡等多種疾病。目前臨床上使用的糖皮質激素、環磷酰胺、甲胺蝶呤等免疫抑制劑雖然對急性呼吸窘迫綜合征等補體過度激活相關疾病有一定治療作用，但該類藥物選擇性差，長期應用產生多種并發癥和副作用，因此尋找理想的補體抑制劑具有重要意義。
[0003]木香為菊科植物木香的干燥根，可用于行氣止痛，健脾消食，是重要的中草藥。目前國內關于木香多糖的報道有木香多糖的提取(馮婧等，云木香多糖提取工藝的優化，湖北農業科學，2012)，木香多糖含量測定(哈文秀等，苯酚-硫酸法測定藏木香中多糖含量，青海師范大學學報，2011)，木香多糖的結構研究(劉飛，木香、`蒲公英多糖的分離純化、結構分析及其藥理活性研究，上海中醫藥大學)，未見木香硫酸化多糖的報道。國外文獻關于木香的研究主要集中在小分子化合物，也未見木香均一多糖及其硫酸化衍生物的報道。
【發明內容】
[0004]針對現有技術存在的上述問題，本發明的目的是提供一種由木香均一多糖與氯磺酸-吡啶試劑經硫酸酯化反應獲得的木香硫酸化多糖及其制備方法和用途，以拓寬木香多糖的應用途徑。
[0005]為實現上述發明目的，本發明采用的技術方案如下:
[0006]本發明所述的木香硫酸化多糖，是取代度為1.57~2.18，硫酸基取代位置在4位和6位的木香均一多糖的硫酸化衍生物，是由木香均一多糖經硫酸酯化反應獲得。
[0007]所述的木香均一多糖是由中藥木香提取純化獲得的1，2連接的β -D果聚糖；以葡聚糖標準品為參考標準，其相對分子量Mw為3.9 X IO3道爾頓。
[0008]本發明所述的木香硫酸化多糖的一種制備方法，包括如下步驟:
[0009]a)制備氯磺酸-吡唳試劑并預冷至5~_5°C ；
[0010]b)制備木香均一多糖有機溶液并預冷至5~-5°c ；
[0011]c)將步驟b)獲得的木香均一多糖有機溶液滴加到步驟a)獲得的氯磺酸-吡啶試劑中，控制在0°C攪拌反應3~5小時；
[0012]d)結束反應，調節反應溶液的pH值至7~8，然后用1000道爾頓透析袋透析；
[0013]e)對經透析3天后的透析內液冷凍干燥，即得所述的木香硫酸化多糖。[0014]作為一種優選方案，步驟a)中所述的氯磺酸-吡啶試劑的制備，包括如下操作:
[0015]①將經分子篩干燥處理后的吡啶加入容器中，冷卻至5~_5°C ；
[0016]②控制在5~_5°C下，向預冷后的吡啶中逐滴滴加氯磺酸；
[0017]③滴畢，在室溫下攪拌至形成淡黃色澄清液體。
[0018]作為進一步優選方案，氯磺酸與吡啶的體積比為1:2~2:1。
[0019]作為一種優選方案，步驟b)中所述的木香均一多糖有機溶液為木香均一多糖溶解于甲酰胺中形成的溶液。
[0020]作為進一步優選方案，步驟b)中所述的木香均一多糖有機溶液的濃度為10~50
暈克/毫升°
[0021]本發明所述的木香硫酸化多糖的一種用途，是作為抗補體活性成分之一或唯一活性成分用于制備保健食品或藥物制劑。
[0022]本發明所述的藥物制劑可以是任何一種適合于臨床使用的劑型，包括固體制劑(如膠囊、片劑、顆粒劑等)、半固體制劑(如軟膏等)、液體制劑(如口服液、混懸劑、乳劑等)、
注射劑等。
[0023]與現有技術相比，本發明具有如下顯著性進步:
[0024]I)由經典途徑和旁路途徑溶血活性實驗結果表明:本發明所述的木香硫酸化多糖無論在經典途徑還是旁路途徑都表現出理想的抗補體活性，其抗補體活性靶點為Clq、Clr、Cls,C3,C5和C9，優于陽性對照藥肝素；
[0025]2)由抗凝血實驗結果表明:本發明所述的木香硫酸化多糖與空白對照相比，沒有延長復鈣時間(RT)和凝血酶時間(TT)，不具有抗凝作用，是一種理想的抗補體抑制劑；
[0026]3)本發明所述的木香硫酸化多糖的制備工藝簡單，質量穩定，適于規模化生產，可望作為抗補體活性成分用于制備保健食品或藥物制劑，使用安全，無副作用之憂，具有廣闊的應用前景和市場價值。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0027]圖1為本發明實施例1制備的木香硫酸化多糖(簡記為:APS_2)的高效液相色譜圖；
[0028]圖2為本發明實施例1制備的木香硫酸化多糖(簡記為:APS_2)的紅外光譜圖；
[0029]圖3為本發明實施例1制備的木香硫酸化多糖(簡記為:APS_2)的核磁共振譜圖；
[0030]圖4為本發明實施例2制備的木香硫酸化多糖(簡記為:APS_lb)的高效液相色譜圖；
[0031]圖5為本發明實施例2制備的木香硫酸化多糖(簡記為=APS-1b)的紅外光譜圖；
[0032]圖6為本發明實施例3制備的木香硫酸化多糖(簡記為:APS_la)的高效液相色譜圖；
[0033]圖7為本發明實施例3制備的木香硫酸化多糖(簡記為:APS_la)的紅外光譜圖；
[0034]圖8為本發明實施例1-3制備的木香硫酸化多糖與肝素在經典途徑的抗補體活性比較；
[0035]圖9為本發明實施例1-3制備的木香硫酸化多糖與肝素在旁路途徑的抗補體活性比較；[0036]圖10為本發明實施例1-3制備的木香硫酸化多糖與肝素的復鈣時間(RT)比較；
[0037]圖11為本發明實施例1-3制備的木香硫酸化多糖與肝素的凝血酶時間(TT)比較。
【具體實施方式】
[0038]下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的保護范圍。本發明中所述的木香均一多糖的制備及其結構的鑒定方法可參見碩士論文(劉飛，木香、蒲公英多糖的分離純化、結構分析及其藥理活性研究，上海中醫藥大學)的第一章和第二章內容。
[0039]實施例中所用的木香均一多糖的具體制備過程如下:
[0040]一、取木香根莖5kg，用自來水洗凈，室溫晾干，加12倍體積的水浸泡一夜，80°C煎煮3h，用紗布過濾，殘渣重復上述過程兩次；合并三次濾液，濃縮至3L左右，4000r/min離心，取上清液，加入4倍體積的95%乙醇并不斷攪拌，過夜，離心，得沉淀，再將沉淀溶于水，1000Da透析袋透析2天，再濃縮凍干后得到木香粗多糖180.6g，記為APS ；
[0041]二、將APS經蒸餾水溶解后，經DEAE-cellulose纖維素離子色譜柱層析，分別以水、0.1M、0.2M、0.5M NaCl緩沖溶液洗脫，苯酚-硫酸法檢測收集；冷凍干燥得水部分，記為APS-W ；
[0042]三、取APS-WlOOmg，加3mL去離子水50°C水浴溶解，放冷至室溫，1000Orpm離心IOmin,得上清液,經凝膠色譜柱Sephacryl ? S-100分離，蛋白Versatiler System檢測，以水為洗脫液，體積流量1.0mL/min,流出液6min/管，示差檢測器，苯酚-硫酸法檢測，依次得到兩個組分，分別記為APS-Wl和APS-W2 ；
[0043]四、取APS-WllOOmg，加3mL水溶解，1000Orpm離心lOmin，得上清液，經凝膠色譜柱Sephacryl? S-100分離，方法同步`驟三，苯酚-硫酸法顯色，根據洗脫曲線收集各多糖部分，冷凍干燥，即得所述的木香均一多糖:為1，2連接的β -D果聚糖，其相對分子量Mw為
3.9Χ IO3道爾頓(以葡聚糖標準品為參考標準);其NMR譜圖如圖3中的曲線a所示，其經無畸變極化轉移增強譜圖(如圖3中的曲線b所示)；關于該木香均一多糖的結構分析內容詳見上述碩士論文的第二章內容。
[0044]實施例1:木香硫酸化多糖APS-2的制備
[0045]將經分子篩干燥處理后的吡啶ImL加入附有磁力攪拌裝置的容器中，冰浴冷卻至5~_5°C，逐滴加入2mL氯磺酸，滴畢，在室溫下攪拌至形成淡黃色澄清液體，制得氯磺酸-吡啶試劑，備用；
[0046]取IOOmg上述木香均一多糖，用經分子篩干燥處理后的甲酰胺3mL溶解，冰浴至(TC，逐滴加入到已冰浴到0°C的氯磺酸-吡啶試劑中，冰浴下攪拌反應5h ;結束反應，將反應體系置于冰浴中，用5M的NaOH水溶液調節pH值至7~8，用1000道爾頓透析袋透析3天，取透析袋內液冷凍干燥，即得木香硫酸化多糖，簡記為APS-2。
[0047]分子量測定:
[0048]以高效凝膠滲透色譜法(HPGPC)檢測，流動相0.2mol/L NaCl溶液，流速為0.8mL/min，柱溫為40°C，檢測器為示差檢測器，色譜柱為Shodex KS-804和KS-802串聯，以不同分子量的葡聚糖標準品制作標準曲線，然后根據樣品的洗脫時間與標準曲線對照，用AgilentGPC軟件計算其分子量，測得其分子量為1.1 X IO3道爾頓(以葡聚糖標準品為參考標準)。[0049]高效液相色譜測試:
[0050]所獲得的木香硫酸化多糖APS-2的HPLC液相圖譜如圖1所示，可見其有部分降解。
[0051]取代度(DS)的測定:
[0052]氯化鋇-明膠法測定APS-2的取代度:
[0053]試劑配制:0.5%明膠溶液:2g明膠加400mL蒸餾水，60°C水浴加熱溶解；1%氯化鋇溶液:1172.8mg BaCl2.Η20，用0.5%明膠溶液定容至IOOmL即得；標準硫酸鉀溶液:硫酸鉀105°C恒重，準確稱取108.8mg, IM HCl溶液溶解后，定容至100mL。
[0054]標準曲線測定:取九支均用10~30%硝酸溶液清洗后的潔凈試管，分別記為O~8號，在O號和I號中不加硫酸鉀標準溶液，從2號開始依次加入20、40、70、100、130、160、200 μ L硫酸鉀標準溶液。O號管加200 μ L水，其余各管補加IM HCl至200 μ L，加3.8mL3wt%的三氯乙酸水溶液；0號管加1.0mL明膠溶液，其余各管加1.0mL氯化鋇-明膠水溶液，立即搖勻，15min后，以O號(不含標準液)做參比測定在360nm的濁度OD36tl ；
[0055]樣品測定:準確稱取3~4mg干燥的APS-2于IOmL安瓿瓶中，加4mLlmol/L HCl溶液封口(稱重)，105°C水解6h,冷卻至室溫后(稱重),取重量無變化的水解后樣品1.5mL在I X 104rpm下離心IOmin,小心吸取上清液200 μ L,四份,其余操作同標準曲線；結果表明，APS-2的取代度為2.18。計算公式如下:
[0056]DS=162Xff%/(96-80 Xff%)X100%
[0057]其中，ff%為硫酸基含量。
`[0058]IR 和 NMR 分析:
[0059]取2mg的APS-2，用KBr壓片，做IR分析；其紅外圖譜如圖2所示，在1259.29cm_1處出現了硫酸基的特征吸收峰，證明APS-Wl已被硫酸化；
[0060]取30mg的APS-2,重水交換后用核磁共振儀Brucker AM-400做NMR分析,結果如圖3中的曲線c所示，APS-2中的硫酸基取代在APS-Wl的4位和6位，3位部分取代。
[0061]實施例2:木香硫酸化多糖APS-1b的制備
[0062]將經分子篩干燥處理后的吡啶ImL加入附有磁力攪拌裝置的容器中，冰浴冷卻至5~_5°C，逐滴加入ImL氯磺酸，滴畢，在室溫下攪拌至形成淡黃色澄清液體，制得氯磺酸-吡啶試劑，備用；
[0063]取IOOmg上述木香均一多糖，用經分子篩干燥處理后的甲酰胺3mL溶解，冰浴至(TC，逐滴加入到已冰浴到0°C的氯磺酸-吡啶試劑中，冰浴下攪拌反應5h ;結束反應，將反應體系置于冰浴中，用5M的NaOH水溶液調節pH值至7~8，用1000道爾頓透析袋透析3天，取透析袋內液冷凍干燥，即得木香硫酸化多糖，簡記為APS-lb。
[0064]分子量測定:
[0065]參照實施例1的方法測APS-1b的分子量；
[0066]Agilent GPC軟件測得所得其分子量為1.4X IO3道爾頓(以葡聚糖標準品為參考標準)。
[0067]高效液相色譜測試:
[0068]參照實施例1的方法，對木香硫酸化多糖APS-1b進行HPLC測試，液相圖譜如圖4所示，可見其有部分降解。[0069]取代度(DS)的測定:
[0070]參照實施例1測定APS-1b的取代度；結果表明，APS-1b的取代度為1.98。
[0071]IR 和 NMR 分析:
[0072]參照實施例1對APS-1b做IR分析；結果如圖5所示，在1259.29cm_1處出現了硫酸基的特征吸收峰，證明其已被硫酸化；
[0073]參照實施例1對APS-1b做NMR分析；結果圖3中的曲線d所示，APS-1b硫酸基取代在4位和6位。
[0074]實施例3:木香硫酸化多糖APS-1a的制備
[0075]將經分子篩干燥處理后的吡啶ImL加入附有磁力攪拌裝置的容器中，冰浴冷卻至5~_5°C，逐滴加入ImL氯磺酸，滴畢，在室溫下攪拌至形成淡黃色澄清液體，制得氯磺酸-吡啶試劑，備用；
[0076]取IOOmg上述木香均一多糖，用經分子篩干燥處理后的甲酰胺3mL溶解，冰浴至(TC，逐滴加入到已冰浴到0°C的氯磺酸-吡啶試劑中，冰浴下攪拌反應3h ;結束反應，將反應體系置于冰浴中，用5M的NaOH水溶液調節pH值至7~8，用1000道爾頓透析袋透析3天，取透析袋內液冷凍干燥，即得木香硫酸化多糖，簡記為APS-la。
[0077]分子量測定:
[0078]參照實施例1的方法測APS-1a的分子量；
[0079]Agilent GPC軟件測得所得其分子量為1.8X IO3道爾頓(以葡聚糖標準品為參考標準)。
[0080]高效液相色譜測試:
[0081 ] 參照實施例1的方法，對木香硫酸化多糖APS-1a進行HPLC測試，液相圖譜如圖6所示，可見其有部分降解。
[0082]取代度(DS)的測定:
[0083]參照實施例1測定APS-1a的取代度；結果表明，APS-1a的取代度為1.57。
[0084]IR 和 NMR 分析:
[0085]參照實施例1對APS-1a做IR分析；結果如圖7所示，在1232.29cm—1處出現了硫酸基的特征吸收峰，證明其已被硫酸化；
[0086]參照實施例1對APS-1a做NMR分析；結果如圖3中的曲線e所示，APS-1a硫酸基取代在4位和6位。
[0087]實施例4:藥效學實驗
[0088]一、木香硫酸化多糖的體外抗補體藥效學實驗
[0089]I)補體經典途徑的溶血活性測定:取確定的臨界濃度的補體與供試品混勻，加入適量BBS(巴比妥緩沖液)、溶血素和體積分數為2%的綿羊紅細胞的BBS溶液，同時設置多糖對照組、補體組和全溶血組，具體配比按照表1所示；37°C水浴30min后，在4°C下以3500r/min離心IOmin,每管分別取上清液0.2mL,用酶標儀在405nm下測定吸光度；以檢測物濃度作為X軸，溶血抑制率作為Y軸作圖，計算CP5tl值；
[0090]表1補體經典途經溶血實驗中所加入各成分的體積(mL)
[0091]
【權利要求】
1.一種木香硫酸化多糖，其特征在于:是取代度為1.57~2.18，硫酸基取代位置在4位和6位的木香均一多糖的硫酸化衍生物，是由木香均一多糖經硫酸酯化反應獲得。
2.如權利要求1所述的木香硫酸化多糖，其特征在于:所述的木香均一多糖是由中藥木香提取純化獲得的1，2連接的β -D果聚糖。
3.如權利要求2所述的木香硫酸化多糖，其特征在于:所述的木香均一多糖以葡聚糖標準品為參考標準，其相對分子量Mw為3.9 X IO3道爾頓。
4.一種制備權利要求1所述的木香硫酸化多糖的方法，其特征在于，包括如下步驟: a)制備氯磺酸-吡唳試劑并預冷至5~-5°C； b)制備木香均一多糖有機溶液并預冷至5~-5°C； c)將步驟b)獲得的木香均一多糖有機溶液滴加到步驟a)獲得的氯磺酸-吡啶試劑中，控制在0°C攪拌反應3~5小時； d)結束反應，調節反應溶液的pH值至7~8，然后用1000道爾頓透析袋透析； e)對經透析3天后的透析內液冷凍干燥，即得所述的木香硫酸化多糖。
5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，步驟a)中所述的氯磺酸-吡啶試劑的制備包括如下操作: ①將經分子篩干燥處理后的吡啶加入容器中，冷卻至5~-5°C； ②控制在5~-5°C下，向預冷后的吡啶中逐滴滴加氯磺酸； ③滴畢，在室溫下攪拌至形成淡黃色澄清液體。
6.如權利要求5所述的方法，其特征在于:氯磺酸與吡啶的體積比為1:2~2:1。
7.如權利要求4所述的方法，其特征在于:步驟b)中所述的木香均一多糖有機溶液為木香均一多糖溶解于甲酰胺中形成的溶液。
8.如權利要求4或7所述的方法，其特征在于:步驟b)中所述的木香均一多糖有機溶液的濃度為10~50暈克/毫升。
9.一種權利要求1所述的木香硫酸化多糖的用途，其特征在于:以其作為抗補體活性成分之一或唯一活性成分用于制備保健食品或藥物制劑。
【文檔編號】A61K31/737GK103833869SQ201410065608
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2014年2月26日 優先權日:2014年2月26日
【發明者】王順春, 范洪偉, 劉飛, 施松善, 李寧, 朱超, 王崢濤, 胡之璧 申請人:上海中醫藥大學