含植物成分的細菌纖維素復合羊膜細胞外基質敷料制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種含有天然植物成分的細菌纖維素復合羊膜細胞外基質敷料的制備方法。涉及一種醫用材料的制備技術。包括：選取能分泌細菌纖維素的菌株活化制備成種子醪液，然后將菌株濃度為30～50wt%的種子醪液與含有天然迷迭香凍干粉的培養基混合后置于培養容器中靜置培養得到含有天然植物成分的細菌纖維素膜；取羊膜細胞外基質膜浸泡在培養基中，待其完全潤濕后平鋪于細菌纖維素膜上表面；繼續靜置培養1～6h，經純化處理，滅菌后得到一種含有天然植物成分的細菌纖維素復合羊膜細胞外基質敷料。本發明制備工藝簡單易行、成本低、材料來源廣泛，制備的敷料具有殺菌、保濕、吸收傷口滲出液及加速傷口愈合等性能，適用于各類慢性皮膚創傷。
【專利說明】含植物成分的細菌纖維素復合羊膜細胞外基質敷料制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及醫用材料的制備【技術領域】，特別是指一種含有天然植物成分的細菌纖維素復合羊膜細胞外基質敷料的制備方法。
【背景技術】
[0002]羊膜是從細胞滋養層衍化而來，是兩層胎膜的內層。正常羊膜薄而明，不含有血管、神經和淋巴管等結構，厚度為20~500 μ m。羊膜具有5層結構可分為:上皮層、基底膜層、致密層、纖維母細胞層、海綿層。去除細胞后的羊膜細胞外基質材料中含有膠原、糖蛋白、蛋白多糖、整合素和板層體等多種成分，表達多種生長因子及其mRNA的相關蛋白，能為細胞的增殖、分化提供豐富的營養成分，有利于細胞的生長繁殖；基底膜層較厚，有利于表皮細胞的貼附和遷移，促進上皮化，防止其凋亡；致密層與海綿層的膠原纖維形成疏松的三維立體構型；組織相容性好，不表達人類白細胞抗原，無誘導排斥反應；容易得到，且可塑性好，易于加工處理。大量研究證實，羊膜作為生物敷料對于治療大面積燒傷、燙傷等皮膚損傷具有良好的效果。但由于羊膜薄而柔軟、保溫保水性差、創面滲出多是易溶失，同時生物力學性能較差，操作有一定難度，使其在生物敷料應用中受到限制。
[0003]細菌纖維素是一種天然的生物高聚物，具有超精細網狀結構，由直徑3~4納米的微纖組合成40~60納米粗的纖維束，并相互交織形成發達的超精細網絡結構。且其化學純度非常高，由于細菌纖維素具有良好的生物相容性、濕態時高的機械強度、良好的液體吸收性能和保濕性能，使其在醫學生物材料發展中表現出極大的優勢，可作為理想的可降解載體材料應用于傷口敷料、藥物載體材料等諸多領域。國外采用單純的細菌纖維素作為濕性敷料已有報道，并且已經產業化用于臨床。
[0004]迷迭香(Rosmarinus officinatis L.)又名油安草,別名艾菊,系唇形科迷迭香屬植物，多年生常綠亞灌木。迷迭香提取物中最重要是迷迭香抗氧化劑及迷迭香精油。迷迭香天然抗氧化劑結構穩定，不容易分解，耐190°C高溫，其抗氧化效果好，且不具毒性。迷迭香植物中含有酚、酸、酮、萜等多種化合物，在食品、醫藥、工業上得到了廣泛的應用。迷迭香提取物具有良好的抗菌性能，對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草桿菌、漢遜氏酵母菌、青霉、黑曲霉、黃曲霉和桔青霉均有很好的抑制效果；迷迭香提取物用于治療慢性傷口可以減少炎癥、增強傷口收縮、有助于上皮組織及肉芽組織的重建，并且能夠提高傷口血管化和膠原蛋白的形成。綜上所述，將含有天然迷迭香提取物成分的細菌纖維素與羊膜細胞外基質材料結合得到具有三維網絡結構的復合材料，可以制備出兼具組織相容性、抗菌、保濕、吸收傷口滲出液、加速傷口愈合以及機械性能良好的濕性敷料。
[0005]本專利采用微生物發酵培養方法原位復合羊膜細胞外基質材料。含有天然迷迭香提取物成分的細菌纖維素材料與羊膜細胞外基質材料，通過細菌纖維素納米纖維與羊膜細胞外基質材料致密層與海綿層的膠原纖維相互作用且納米纖維相互貫穿，形成鏈接緊密的復合材料。本發明制備工藝簡單易行、成本低、材料來源廣泛，制備的敷料具有殺菌、保濕、吸收傷口滲出液及加速傷口愈合等性能，適用于各類慢性皮膚創傷。
【發明內容】
[0006]本發明的目的是提供一種含有天然植物成分的細菌纖維素復合羊膜細胞外基質敷料的制備方法。涉及一種醫用材料的制備技術。本發明制備工藝簡單易行、成本低、材料來源廣泛，制備的敷料具有殺菌、保濕、吸收傷口滲出液及加速傷口愈合等性能，適用于糖尿病足潰瘍、下肢靜脈性潰瘍、壓瘡、供皮區傷口等各類慢性皮膚創傷。
[0007]本發明公開了一種含有天然植物成分的細菌纖維素復合羊膜細胞外基質敷料的制備方法，包括:選取能分泌細菌纖維素的菌株活化制備成種子醪液，然后將菌株濃度為30~50wt%的種子醪液與含有天然迷迭香凍干粉的發酵培養基混合后置于培養容器中靜置培養得到含有天然植物成分的細菌纖維素膜；取羊膜細胞外基質膜浸泡在培養基中，待其完全潤濕后平鋪于細菌纖維素膜上表面；繼續靜置培養I~6h，經純化處理，滅菌后得到一種含有天然植物成分的細菌纖維素復合羊膜細胞外基質敷料。
[0008]作為優選的技術方案:
其中，如上所述的一種含有天然植物成分的細菌纖維素復合羊膜細胞外基質敷料的制備方法，所述的能分泌細菌纖維素的菌株是指木醋桿菌、根瘤菌屬、八疊球菌屬、假單胞菌屬、無色桿菌屬、產堿菌屬、氣桿菌屬或固氮菌屬中的一種或幾種。
[0009]如上所述的一種含有天然植物成分的細菌纖維素復合羊膜細胞外基質敷料的制備方法，所述的含有天然迷迭香凍干粉的發酵培養基是指每IL的乙醇水溶液中含有天然迷迭香凍干粉10~50g、磷酸氫二鈉4~16g、磷酸二氫鉀4~16g、酵母膏4~20g、蛋白胨4~20g，其中乙醇水溶液濃度為50~70wt%。
[0010]如上所述的一種含有天然植物成分的細菌纖維素復合羊膜細胞外基質敷料的制備方法，所述的靜置培養是指種子醪液與含有天然迷迭香凍干粉的發酵培養基混合后置于培養容器中靜置培養5~7d，其中種子醪液與含有膠原溶液的發酵培養基混合后在培養容器內的液面高度為0.5~3cm。通常情況下，細菌纖維素膜漂浮于培養液的上方，細菌纖維素在發酵培養過程中會消耗一部分培養基，同時一部分培養基通過蒸發失去。本專利中所述的方法通過控制培養液用量在合理范圍，培養基用量過少將影響細菌纖維素的生物合成，過多則影響羊膜細胞外基質材料有效平鋪于細菌纖維素膜上表面。
[0011]如上所述的一種含有天然植物成分的細菌纖維素復合羊膜細胞外基質敷料的制備方法，所述的含有天 然植物成分的細菌纖維素膜是指靜置培養得到的水凝膠細菌纖維素膜，厚度為I~3cm，其中細菌纖維素的三維網絡納米纖維上均勻附著有含天然迷迭香提取物成分的化學物質。發酵過程中細菌首先在培養基中大量擴增并生物合成纖維素微纖，含有天然迷迭香提取物成分的化學物質黏附在纖維素微纖上，隨著發酵時間延長形成纖維素納米纖維，并且在納米纖維上均勻附著迷迭香提取物成分；最終形成含有天然迷迭香提取物成分的水凝膠狀細菌纖維素膜。
[0012]如上所述的一種含有天然植物成分的細菌纖維素復合羊膜細胞外基質敷料的制備方法，所述的羊膜細胞外基質材料是指來源安全，經處理去除細胞、脂肪和可溶性抗原并且干燥滅菌的脫細胞生物羊膜。新鮮羊膜取自健康剖宮產產婦的胎盤，產前血清學檢查排除乙肝、丙肝、梅毒及獲得免疫缺陷綜合征，取材處理均在無菌操作下完成；經處理去除細胞、脂肪、可溶性抗原，一般采用冷凍干燥法進行干燥并經輻照滅菌。
[0013]如上所述的一種含有天然植物成分的細菌纖維素復合羊膜細胞外基質敷料的制備方法，所述的鋪于含有天然植物成分的細菌纖維素膜上表面是指羊膜細胞外基質材料的海綿層與含有天然植物成分的細菌纖維素膜上表面相接觸。羊膜細胞外基質材料具有5層結構可分為:上皮層、基底膜層、致密層、纖維母細胞層、海綿層。其中致密層與海綿層的膠原纖維形成疏松的三維立體構型，有利于細菌纖維素膜中的纖維素納米纖維與其形成相互貫穿的網絡結構。基底膜層含有IV型和V型膠原、層粘連蛋白、纖維連接蛋白及各種螯合蛋白，能夠促進種子細胞的分化、增殖和遷移。因此，在制備敷料時將羊膜細胞外基質材料的海綿層與細菌纖維素膜上表面相接觸，有利于細菌纖維素膜的纖維素納米纖維進入海綿層的疏松膠原纖維內部，同時保持了基底膜層的生物活性。
[0014]如上所述的一種含有天然植物成分的細菌纖維素復合羊膜細胞外基質敷料的制備方法，所述的純化處理是指復合材料在1~3wt%的氫氧化鈉水溶液30~60°C浸泡12~24h，并用去離子水清洗至中性。本專利中選用較低濃度的氫氧化鈉在低溫下對復合材料進行處理，氫氧化鈉溶液浸泡能夠徹底去除菌體蛋白和粘附在細菌纖維素膜上的殘余培養基，確保復合材料的內毒素符合醫用植入性材料的要求，同時低濃度氫氧化鈉可以防止在處理過程中影響羊膜細胞外基質材料中含有的諸多蛋白及生長因子。
[0015]如上所述的一種含有天然植物成分的細菌纖維素復合羊膜細胞外基質敷料的制備方法，所述的含有天然植物成分的細菌纖維素復合羊膜細胞外基質敷料是指含有天然植物成分的細菌纖維素膜與羊膜細胞外基質的復合材料，其中羊膜細胞外基質位于敷料的上層，含有天然植物成分的細菌纖維素膜位于敷料的下層，并且羊膜細胞外基質材料的致密層與海綿層中的膠原纖維與含有天然植物成分的細菌纖維素膜中的納米纖維相互貫穿，形成鏈接緊密的復合材料。
[0016]如上所述的一種含有天然植物成分的細菌纖維素復合羊膜細胞外基質敷料的制備方法，所述的一種含有天然植物成分的細菌纖維素復合羊膜細胞外基質敷料在使用時，位于敷料上層的羊膜細胞外基質與皮膚傷口接觸。
[0017]本發明的另一目的是提供一種含有天然植物成分的細菌纖維素復合羊膜細胞外基質敷料，其特征是:包含細菌纖維素、迷迭香和羊膜細胞外基質。
[0018]與現有技術相比，本發明的有益效果是:
本專利采用微生物發酵培養方法原位復合羊膜細胞外基質材料。含有天然迷迭香提取物成分的細菌纖維素材料與羊膜細胞外基質材料，通過細菌纖維素納米纖維與羊膜細胞外基質材料致密層與海綿層的膠原纖維相互作用且納米纖維相互貫穿，形成鏈接緊密的復合材料。在保證復合材料的組織相容性、生物活性的前提下，有效增強了材料的機械性能，抗菌性能；所含的天然迷迭香提取物成分可以減少傷口炎癥、增強傷口收縮、有助于上皮組織及肉芽組織的重建，并且能夠提高傷口血管化和膠原蛋白的形成。本發明制備工藝簡單易行、成本低、材料來源廣泛，制備的敷料具有殺菌、保濕、吸收傷口滲出液及加速傷口愈合等性能，適用于糖尿病足潰瘍、下肢靜脈性潰瘍、壓瘡、供皮區傷口等各類慢性皮膚創傷。
[0019]【具體實施方式】[0020]下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
[0021]實施例1:
選取能 分泌細菌纖維素的木醋桿菌活化制備成種子醪液，然后將菌株濃度為50wt%的種子醪液與含有天然迷迭香凍干粉的發酵培養基混合。所述的含有天然迷迭香凍干粉的發酵培養基是指每IL的乙醇水溶液中含有天然迷迭香凍干粉30g、磷酸氫二鈉16g、磷酸二氫鉀16g、酵母膏20g、蛋白胨20g，其中乙醇水溶液濃度為70wt%。混合后的溶液置于培養容器中，混合液在培養容器內的液面高度為3cm，靜置培養5d得到膜厚度為3cm的水凝膠狀含有天然迷迭香提取物成分的細菌纖維素膜。
[0022]將來源安全，經處理去除細胞、脂肪和可溶性抗原并且干燥滅菌的羊膜細胞外基質材料浸泡在培養基中，待其完全潤濕后平鋪于細菌纖維素膜上表面。其中，羊膜細胞外基質材料的海綿層與含有天然植物成分的細菌纖維素膜上表面相接觸。繼續靜置培養lh，得到的復合材料置于lwt%的氫氧化鈉水溶液60°C浸泡12h，并用去離子水清洗至中性，得到一種含有天然植物成分的細菌纖維素復合羊膜細胞外基質敷料。其中羊膜細胞外基質位于敷料的上層，含有天然植物成分的細菌纖維素膜位于敷料的下層，并且羊膜細胞外基質材料的致密層與海綿層中的膠原纖維與含有天然植物成分的細菌纖維素膜中的納米纖維相互貫穿，形成鏈接緊密的復合材料。該敷料在使用時，位于敷料上層的羊膜細胞外基質與皮膚傷口接觸。
[0023]實施例2:
選取能分泌細菌纖維素的根瘤菌屬和假單胞菌屬活化制備成種子醪液，然后將菌株濃度為40wt%的種子醪液與含有天然迷迭香凍干粉的發酵培養基混合。所述的含有天然迷迭香凍干粉的發酵培養基是指每IL的乙醇水溶液中含有天然迷迭香凍干粉20g、磷酸氫二鈉Hg、磷酸二氫鉀Hg、酵母膏18g、蛋白胨18g，其中乙醇水溶液濃度為70wt%。混合后的溶液置于培養容器中，混合液在培養容器內的液面高度為2cm,靜置培養5d得到膜厚度為2.5cm的水凝膠狀含有天然迷迭香提取物成分的細菌纖維素膜。
[0024]將來源安全，經處理去除細胞、脂肪和可溶性抗原并且干燥滅菌的羊膜細胞外基質材料浸泡在培養基中，待其完全潤濕后平鋪于細菌纖維素膜上表面。其中，羊膜細胞外基質材料的海綿層與含有天然植物成分的細菌纖維素膜上表面相接觸。繼續靜置培養2h，得到的復合材料置于2wt%的氫氧化鈉水溶液50°C浸泡12h，并用去離子水清洗至中性，得到一種含有天然植物成分的細菌纖維素復合羊膜細胞外基質敷料。其中羊膜細胞外基質位于敷料的上層，含有天然植物成分的細菌纖維素膜位于敷料的下層，并且羊膜細胞外基質材料的致密層與海綿層中的膠原纖維與含有天然植物成分的細菌纖維素膜中的納米纖維相互貫穿，形成鏈接緊密的復合材料。該敷料在使用時，位于敷料上層的羊膜細胞外基質與皮膚傷口接觸。
[0025]實施例3:
選取能分泌細菌纖維素的八疊球菌屬和產堿菌屬活化制備成種子醪液，然后將菌株濃度為30被％的種子醪液與含有天然迷迭香凍干粉的發酵培養基混合。所述的含有天然迷迭香凍干粉的發酵培養基是指每IL的乙醇水溶液中含有天然迷迭香凍干粉10g、磷酸氫二鈉12g、磷酸二氫鉀12g、酵母膏16g、蛋白胨16g,其中乙醇水溶液濃度為60wt%。混合后的溶液置于培養容器中，混合液在培養容器內的液面高度為Icm,靜置培養6d得到膜厚度為Icm的水凝膠狀含有天然迷迭香提取物成分的細菌纖維素膜。
[0026]將來源安全，經處理去除細胞、脂肪和可溶性抗原并且干燥滅菌的羊膜細胞外基質材料浸泡在培養基中，待其完全潤濕后平鋪于細菌纖維素膜上表面。其中，羊膜細胞外基質材料的海綿層與含有天然植物成分的細菌纖維素膜上表面相接觸。繼續靜置培養3h，得到的復合材料置于3wt%的氫氧化鈉水溶液30°C浸泡16h，并用去離子水清洗至中性，得到一種含有天然植物成分的細菌纖維素復合羊膜細胞外基質敷料。其中羊膜細胞外基質位于敷料的上層，含有天然植物成分的細菌纖維素膜位于敷料的下層，并且羊膜細胞外基質材料的致密層與海綿層中的膠原纖維與含有天然植物成分的細菌纖維素膜中的納米纖維相互貫穿，形成鏈接緊密的復合材料。該敷料在使用時，位于敷料上層的羊膜細胞外基質與皮膚傷口接觸。
[0027]實施例4:
選取能分泌細菌纖維素的木醋桿菌、氣桿菌屬和固氮菌屬活化制備成種子醪液，然后將菌株濃度為50wt%的種子醪液與含有天然迷迭香凍干粉的發酵培養基混合。所述的含有天然迷迭香凍干粉的發酵培養基是指每IL的乙醇水溶液中含有天然迷迭香凍干粉50g、磷酸氫二鈉10g、磷酸二氫鉀10g、酵母膏10g、蛋白胨10g，其中乙醇水溶液濃度為60wt%。混合后的溶液置于培養容器中，混合液在培養容器內的液面高度為0.5cm,靜置培養6d得到膜厚度為2cm的水凝膠狀含有天然迷迭香提取物成分的細菌纖維素膜。
[0028]將來源安全，經處理去除細胞、脂肪和可溶性抗原并且干燥滅菌的羊膜細胞外基質材料浸泡在培養基中，待其完全潤濕后平鋪于細菌纖維素膜上表面。其中，羊膜細胞外基質材料的海綿層與含有天然植物成分的細菌纖維素膜上表面相接觸。繼續靜置培養3h，得到的復合材料置于lwt%的氫氧化鈉水溶液30°C浸泡24h，并用去離子水清洗至中性，得到一種含有天然植物成分的細菌纖維素復合羊膜細胞外基質敷料。其中羊膜細胞外基質位于敷料的上層，含有天然植物成分的細菌纖維素膜位于敷料的下層，并且羊膜細胞外基質材料的致密層與海綿層中的膠原纖維與含有天然植物成分的細菌纖維素膜中的納米纖維相互貫穿，形成鏈接緊密的復合材料。該敷料在使用時，位于敷料上層的羊膜細胞外基質與皮膚傷口接觸。
[0029]實施例5:
選取能分泌細菌纖維素的木醋桿菌和無色桿菌屬活化制備成種子醪液，然后將菌株濃度為40wt%的種子醪液與含有天然迷迭香凍干粉的發酵培養基混合。所述的含有天然迷迭香凍干粉的發酵培養基是指每IL的乙醇水溶液中含有天然迷迭香凍干粉40g、磷酸氫二鈉4g、磷酸二氫鉀4g、酵母膏4g、蛋白胨4g,其中乙醇水溶液濃度為50wt%。混合后的溶液置于培養容器中，混合液在培養容器內的液面高度為2cm,靜置培養7d得到膜厚度為2cm的水凝膠狀含有天然迷迭香提取物成分的細菌纖維素膜。
[0030]將來源安全，經處理去除細胞、脂肪和可溶性抗原并且干燥滅菌的羊膜細胞外基質材料浸泡在培養基中，待其完全潤濕后平鋪于細菌纖維素膜上表面。其中，羊膜細胞外基質材料的海綿層與含有天然植物成分的細菌纖維素膜上表面相接觸。繼續靜置培養6h，得到的復合材料置于3wt%的氫氧化鈉水溶液40°C浸泡18h，并用去離子水清洗至中性，得到一種含有天然植物成分的細菌纖維素復合羊膜細胞外基質敷料。其中羊膜細胞外基質位于敷料的上層，含有天然植物成分的細菌纖維素膜位于敷料的下層，并且羊膜細胞外基質材料的致密層與海綿層中的膠原纖維與含有天然植物成分的細菌纖維素膜中的納米纖維相互貫穿，形成鏈接緊密的復合材料。該敷料在使用時，位于敷料上層的羊膜細胞外基質與皮膚傷口接觸。
[0031]實施例6:
含有天然植物成分的細菌纖維素復合羊膜細胞外基質敷料的皮下埋置實驗實驗方法:取健康SD大鼠30只，性別不限，分為實驗組和對照組，消毒，采用乙醚吸入麻醉，常規無菌操作，切開背部皮膚，實驗組背部植入5張I X Icm2敷料(分別取實施例1-5所制備的含有天然植物成分的細菌纖維素復合羊膜細胞外基質敷料)，對照組切開后即縫合。觀察動物術后一般情況和傷口愈合情況。術后1、2、4周處死各組動物，取出植入敷料戊二醛固定，常規包埋切片，HE染色，光鏡觀察植入物周圍淋巴細胞、巨噬細胞浸潤情況。
[0032]實驗表明:手術當天動物清醒后即可正常進食，傷口無紅腫、滲液等炎性反應，所有創面均可良好愈合，手術切口無I例發生感染，動物無死亡、驚厥、中風等毒性反應，植入物周圍軟組織未見發黑、壞死、化膿、積液等表現，組織學觀察術后I周，植入物周圍有大量淋巴細胞，2周時，僅少量淋巴細胞，4周時，基本無淋巴細胞存在。證實本發明的敷料無生物學毒性，有良好的組織相容性。
[0033]實施例7
含有天然植物成分的 細菌纖維素復合羊膜細胞外基質敷料對糖尿病足潰瘍大鼠的治療實驗
運用高脂飼料配合鏈脲佐菌素誘導的大鼠2型糖尿病，使用燙傷儀制成深II度燙傷誘導皮膚潰瘍制成糖尿病足潰瘍大鼠模型。大鼠為SD雄性大鼠，SPF級，體重(180±10)g，共30只，每組5只，共6組，其中一組為對照，另5組分別施用實施例1-5制備的含有天然植物成分的細菌纖維素復合羊膜細胞外基質敷料。高脂飼料的制備方法為:首先，將大麥15%，小麥31%，玉米15%，麩皮15%，魚粉6%按比例攪拌混合均勻后，加入豆柏、油、鹽混勻后加壓成型制成基礎飼料，然后，將基礎飼料73 %，豬油20 %，奶粉2 %，膽固醇I %，蔗糖4 %按比例攪拌混合均勻后加壓成型制成高脂飼料，成品為圓柱塊狀。高脂飼料喂養8周后，1.5%鏈脲佐菌素溶解于PH值4.5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液按35mg/kg的劑量左下腹注射。使用SQL-5Q燙傷儀，溫度90°C，接觸時間10S，壓力9.8N，面積4cm2，麻醉后于后背部皮膚進行燙傷。造模成功后，用碘伏清潔創面，用本發明的含有天然植物成分的細菌纖維素復合羊膜細胞外基質敷料外敷創面，然后用無菌紗布包扎，I天換藥I次，以潰瘍面積和血白細胞總數為指標統計平均愈合時間，結果見表1。
[0034]表1對糖尿病足潰瘍大鼠的平均愈合時間比較(n=5)
【權利要求】
1.一種含有天然植物成分的細菌纖維素復合羊膜細胞外基質敷料，其特征是:包含細菌纖維素、迷迭香和羊膜細胞外基質。
2.一種含有天然植物成分的細菌纖維素復合羊膜細胞外基質敷料的制備方法，其特征是:選取能分泌細菌纖維素的菌株活化制備成種子醪液，然后將菌株濃度為30~50wt%的種子醪液與含有天然迷迭香凍干粉的發酵培養基混合后置于培養容器中靜置培養得到含有天然植物成分的細菌纖維素膜；取羊膜細胞外基質膜浸泡在培養基中，待其完全潤濕后平鋪于細菌纖維素膜上表面；繼續靜置培養I~6h，經純化處理，滅菌后得到一種含有天然植物成分的細菌纖維素復合羊膜細胞外基質敷料。
3.如權利要求2所述的一種含有天然植物成分的細菌纖維素復合羊膜細胞外基質敷料的制備方法，其特征在于:所述的能分泌細菌纖維素的菌株是指木醋桿菌、根瘤菌屬、八疊球菌屬、假單胞菌屬、無色桿菌屬、產堿菌屬、氣桿菌屬或固氮菌屬中的一種或幾種。
4.如權利要求2所述的一種含有天然植物成分的細菌纖維素復合羊膜細胞外基質敷料的制備方法，其特征在于:所述的含有天然迷迭香凍干粉的發酵培養基是指每IL的乙醇水溶液中含有天然迷迭香凍干粉10~50g、磷酸氫二鈉4~16g、磷酸二氫鉀4~16g、酵母膏4~20g、蛋白胨4~20g，其中乙醇水溶液濃度為50~70wt%。
5.如權利要求2所述的一種含有天然植物成分的細菌纖維素復合羊膜細胞外基質敷料的制備方法，其特征在于:所述的靜置培養是指種子醪液與含有天然迷迭香凍干粉的發酵培養基混合后置于培養容器中靜置培養5~7d，其中種子醪液與含有膠原溶液的發酵培養基混合后在培養容器內的液面高度為0.5~3cm。
6.如權利要求2所述的一種含有天然植物成分的細菌纖維素復合羊膜細胞外基質敷料的制備方法，其特征 在于:含有天然植物成分的細菌纖維素膜是指靜置培養得到的水凝膠細菌纖維素膜，厚度為I~3cm，其中細菌纖維素的三維網絡納米纖維上均勻附著有含天然迷迭香提取物成分的化學物質。
7.如權利要求2所述的一種含有天然植物成分的細菌纖維素復合羊膜細胞外基質敷料的制備方法，其特征在于:所述的羊膜細胞外基質材料是指來源安全，經處理去除細胞、脂肪和可溶性抗原并且干燥滅菌的脫細胞生物羊膜。
8.如權利要求2所述的一種含有天然植物成分的細菌纖維素復合羊膜細胞外基質敷料的制備方法，其特征在于:所述的平鋪于含有天然植物成分的細菌纖維素膜上表面是指羊膜細胞外基質材料的海綿層與含有天然植物成分的細菌纖維素膜上表面相接觸。
9.如權利要求2所述的一種含有天然植物成分的細菌纖維素復合羊膜細胞外基質敷料的制備方法，其特征在于:所述的純化處理是指復合材料在I~3wt%的氫氧化鈉水溶液30~60°C浸泡12~24h，并用去離子水清洗至中性。
10.如權利要求2所述的一種含有天然植物成分的細菌纖維素復合羊膜細胞外基質敷料的制備方法，其特征在于:所述的含有天然植物成分的細菌纖維素復合羊膜細胞外基質敷料是指含有天然植物成分的細菌纖維素膜與羊膜細胞外基質的復合材料，其中羊膜細胞外基質位于敷料的上層，含有天然植物成分的細菌纖維素膜位于敷料的下層，并且羊膜細胞外基質材料的致密層與海綿層中的膠原纖維與含有天然植物成分的細菌纖維素膜中的納米纖維相互貫穿，形成鏈接緊密的復合材料。
11.如權利要求2所述的一種含有天然植物成分的細菌纖維素復合羊膜細胞外基質敷料的制備方法，其特征在于:所述的一種含有天然植物成分的細菌纖維素復合羊膜細胞外基質敷料在使用時，位于敷料上層的羊膜細胞外基質與皮膚傷口接觸。
【文檔編號】A61L15/28GK103893816SQ201410061448
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年2月24日 優先權日:2014年2月24日
【發明者】鐘春燕, 鐘宇光 申請人:鐘春燕