重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白（rLZ-8）在制備治療組織纖維化藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物制藥領(lǐng)域，重點(diǎn)涉及重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白（rLZ-8）在制備治療組織纖維化藥物中的應(yīng)用，經(jīng)過一系列實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白在治療器官纖維化方面與其他陽性對照藥比較具有治療效果顯著，無副作用等優(yōu)勢。
【專利說明】重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白(rLZ-8)在制備治療組織纖維化藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白(rLZ-8)在制備治療組織纖維化藥物中的應(yīng)用。具體涉及以小鼠作為實(shí)驗(yàn)對象，建立組織纖維化模型，設(shè)計(jì)合理的給藥途徑和劑量，定期檢測小鼠組織纖維化癥狀，以改善小鼠的生活質(zhì)量和延長小鼠壽命為治療目標(biāo)，評(píng)價(jià)重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白治療組織纖維化過程中的意義。
【背景技術(shù)】 [0002]纖維化(Fibrosis)能發(fā)生于多種器官，主要病理改變?yōu)槠鞴俳M織內(nèi)纖維結(jié)締組織增多，實(shí)質(zhì)細(xì)胞減少，持續(xù)進(jìn)展可致器官結(jié)構(gòu)破壞和功能減退，乃至衰竭，嚴(yán)重威脅人類健康和生命。
[0003]機(jī)體器官由實(shí)質(zhì)和間質(zhì)兩部分構(gòu)成。實(shí)質(zhì)是指器官的主要結(jié)構(gòu)和功能細(xì)胞，間質(zhì)由間質(zhì)細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成，分布在實(shí)質(zhì)細(xì)胞之間，主要起機(jī)械支撐和連接作用。此外細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成維持細(xì)胞生理活動(dòng)的微環(huán)境，是細(xì)胞之間的信號(hào)傳導(dǎo)的橋梁，參與多種生理病理過程，在組織創(chuàng)傷修復(fù)和纖維化過程中起重要作用。
[0004]以肺纖維化舉例說明，肺纖維化作為一種高致死率的疾病，在醫(yī)學(xué)界已經(jīng)越來越受到重視。其中，特發(fā)性肺纖維化是特發(fā)性間質(zhì)性肺炎中最為常見的一種，發(fā)病比例大約占43%~68%。目前，我們經(jīng)常說的肺纖維化疾病主要包括特發(fā)性肺纖維化、矽肺、過敏性肺泡炎以及放射線和藥物所導(dǎo)致的肺纖維化，還包括與膠原血管病相關(guān)聯(lián)的肺部炎癥等范圍較為廣泛的一類慢性肺部疾病。此外，各類的慢性以及急性的肺部疾病通常會(huì)伴有不同程度上的肺部炎癥和纖維化，它們均稱為肺間質(zhì)性疾病。各種不同病因引發(fā)的肺間質(zhì)性疾病的共同結(jié)局是肺間質(zhì)纖維化，也是引發(fā)呼吸衰竭的首要因素。
[0005]肺纖維化發(fā)病機(jī)理主要是多種炎性細(xì)胞以及相關(guān)的介質(zhì)參與的損傷過程引發(fā)的炎癥反應(yīng)、肺組織的纖維增生修復(fù)過程中膠原纖維的過量沉積，肺組織結(jié)構(gòu)被破壞，喪失了正常的氣體交換功能。肺纖維化是以肺實(shí)質(zhì)組織成纖維細(xì)胞的大量聚集、細(xì)胞外基質(zhì)沉積過量同時(shí)伴隨有肺組織的炎癥和損傷所致組織結(jié)構(gòu)破壞為病理特征。
[0006]因肺纖維化的發(fā)病機(jī)理并不十分清楚，故在治療方面還存在著一些困難。以前醫(yī)生只是用一些非特異性抗炎藥物減少炎癥反應(yīng)來減輕纖維化程度；或是用糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑等藥物來緩解病人的病癥，但并沒有對纖維化的根源進(jìn)行根治，故治療效果并不是很理想。通常在治療過程中伴隨有其他的并發(fā)癥發(fā)生或是治療藥物的副作用過大而導(dǎo)致?lián)p傷其他的器官，同時(shí)也不能很好的改善病人的生活質(zhì)量。因此，不斷的研究新的藥物成為一種迫切需求。目前，深入的研究肺纖維化發(fā)病機(jī)制后，人們猜想通過阻斷發(fā)病的早期的炎癥反應(yīng)或是減輕修復(fù)過程中膠原的過量沉積的治療方法是可以有效的治療肺纖維化，由此建立了多種新治療方法。現(xiàn)在一般認(rèn)為，加強(qiáng)對肺纖維化的臨床診斷和早期識(shí)別，對治療是非常有必要的。了解肺纖維化的一些臨床表現(xiàn)能更早的進(jìn)行確診，為治療爭取寶貴的時(shí)間；對肺纖維化發(fā)病機(jī)制的研究可以找出最佳的治療方法。[0007]針對目前的治療組織纖維化藥物都有很嚴(yán)重的副作用，而且并不能非常有效地改善小鼠的生活質(zhì)量或是延長壽命，尋找一種能解決上述問題的藥物顯得十分重要。本研究主要探討重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白rLZ-8用于預(yù)防和治療藥物誘導(dǎo)的組織纖維化。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0008]本發(fā)明涉及重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白rLZ-8在制備治療組織纖維化藥物中的應(yīng)用，經(jīng)過一系列實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白在治療組織纖維化過程中，藥效顯著，與其他陽性對照樣比較具有治療效果顯著，無副作用等優(yōu)勢。具體
【發(fā)明內(nèi)容】
如下:
本發(fā)明采用實(shí)驗(yàn)鼠作為研究對象，分別設(shè)計(jì)并建立了不同組織纖維化模型，其中，以博來霉素(BLM)作為肺纖維化的造模用藥，霧化法造模技術(shù)，建立小鼠肺組織纖維化模型；以多柔比星(Dox)作為心肌纖維化造模用藥，采用尾靜脈注射法建立小鼠心肌纖維化模型；采用順鉬(CDDP)作為腎臟纖維化造模用藥，腹腔注射法建立小鼠腎臟纖維化模型；以體積分?jǐn)?shù)為50%四氯化碳(CCl4)橄欖油溶液作為肝臟纖維化造模用藥，采用背部皮下注射法建立大鼠肝臟纖維化模型；通過設(shè)置對照實(shí)驗(yàn)法對比說明重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白在治療組織纖維化過程中的作用，以組織纖維化的生化參數(shù)改變作為主要考察參數(shù)，利用SPSS統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，在治療組織纖維化方面rLZ-8與其它陽性藥比較具有顯著差異，無明顯的毒副作用產(chǎn)生。
[0009]本發(fā)明的有益之處在于:本發(fā)明所提供的重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白(rLZ-8)在治療組織纖維化方面具有顯著療效，采用了 4種典型的組織纖維化病例為代表，說明了 rLZ-8在治療組織纖維化病癥中的應(yīng)用是顯而易見的，在肺組織纖維化實(shí)施例中我們可以看到，rLZ-8與陽性藥的治療效果具有明顯的差異和優(yōu)勢，并且沒有伴隨的副反應(yīng)發(fā)生，延長了患病小鼠的生命，在心臟 、腎臟、肝臟的實(shí)驗(yàn)中，rLZ-8的治療效果具有明顯的差異和優(yōu)勢，在組織創(chuàng)傷恢復(fù)和纖維化含量以及大鼠模型血清中ALT (U/L)、AST (U/L)、ALB (g/L)的活力恢復(fù)方面具有積極的影響，同時(shí)與陽性對照組相比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，部分實(shí)驗(yàn)中期在治療組出現(xiàn)纖維化大幅減少甚至消失，是發(fā)明人始料未及的，同時(shí)也是rLZ-8所能達(dá)到的最佳效果。
[0010]【專利附圖】
【附圖說明】:
圖1 rLZ-8對腎纖維化的組織損傷對比的影響 圖2 rLZ-8對腎纖維化間質(zhì)中膠原成分含量的影響
【具體實(shí)施方式】
[0011 ] 實(shí)施例1:小鼠肺組織纖維化模型的建立 實(shí)驗(yàn)材料
昆明鼠雌性，體重范圍在18-22g，博來霉素(BLM)，羥脯氨酸試劑盒，丙二酮試劑盒，免疫組化染色試劑盒，抗體，HE染色試劑，醫(yī)用霧化器，透明玻璃容器，常規(guī)試劑(NaCl、多聚甲醛、PBS等)，解剖刀具，正置熒光顯微鏡，小鼠墊料及飼料，Real time PCR試劑盒，PCR特異引物，冰凍切片機(jī)及石蠟切片機(jī)。
[0012]實(shí)驗(yàn)方法與操作
霧化法造模、肺泡灌洗技術(shù)、冰凍及石蠟切片技術(shù)、HE染色及Masson氏三色染色技術(shù)、ELISA法檢測灌洗液中蛋白的變化、流式法檢測灌洗液中的炎性細(xì)胞的量。
[0013]建模實(shí)驗(yàn):1)建模實(shí)驗(yàn)分組:分設(shè)3個(gè)組，分別為生理鹽水組(A組)、BLM低劑量組(B組4mg/mL)、BLM高劑量組(C組8mg/mL)，每組12只小鼠。將各組12只鼠分為兩個(gè)小組每組6只，分別放入長寬高各為20cm的透明玻璃容器里，做好相應(yīng)的標(biāo)記，用醫(yī)用超聲霧化器分別將生理鹽水和BLM以霧狀的形式噴到相應(yīng)的透明玻璃器里，2)建模給藥操作程序:每次霧化量為Iml,關(guān)閉玻璃罩封閉15 min,鼠放回籠內(nèi)休息5min,此操作重復(fù)6次。3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察:每天9時(shí)和17時(shí)記錄小鼠的死亡情況并隨時(shí)觀察活動(dòng)情況。分別于飼養(yǎng)3天、7天、14天和21天的4個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死小鼠取肺觀察小鼠肺外觀、顏色、肺表面的變化情況；取肺后先進(jìn)行支氣管肺泡灌洗，然后取肺組織一部分做石蠟切片，進(jìn)行HE染色的組織學(xué)檢測；另取一部分肺組織做RT-PCR，進(jìn)行RNA水平的檢測。根據(jù)組織學(xué)分析和RNA水平，蛋白水平和炎性細(xì)胞量的變化來評(píng)價(jià)肺纖維化的模型建立是否可用。下表是按Szapiel等的方法評(píng)價(jià)肺組織病理變化嚴(yán)重程度的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。
[0014]表1 Szapiel肺組織病理變化等級(jí)
【權(quán)利要求】
1.重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白(rLZ-8)在制備治療組織纖維化藥物中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利I所述組織纖維化，其特征在于包括肺組織纖維化。
3.如權(quán)利I所述組織纖維化，其特征在于包括心臟組織纖維化。
4.如權(quán)利I所述組織纖維化，其特征在于包括腎臟組織纖維化。
5.如權(quán)利I所述組織纖維化，其特征在于包括肝臟組織纖維化。
6.如權(quán)利I所述藥物，其特征在于該藥物制劑核心成分是由權(quán)利要求1所述的重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白(rLZ-8)和任選的藥學(xué)可接受的輔劑組成。
7.如權(quán)利要求1所述的藥物制劑給藥途徑為口服和非腸道給藥，其中，口服包括口服液，片劑，丸劑和膠囊；非腸道給藥包括外用藥和注射劑。
【文檔編號(hào)】A61P1/16GK103751765SQ201410048713
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年2月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月12日
【發(fā)明者】孫非, 梁重陽, 張喜田 申請人:張喜田, 孫非