人脂肪間充質干細胞提取物及其凍干粉和應用的制作方法

人脂肪間充質干細胞提取物及其凍干粉和應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開人脂肪間充質干細胞提取物及其凍干粉和應用，該人脂肪間充質干細胞提取物是取傳代培養的P3～P30代人脂肪間充質干細胞，利用細胞生長液培養至細胞80%融合時，棄掉培養液，先用磷酸鹽緩沖液洗滌細胞三次，然后加入無血清培養液繼續培養72小時后，收集無血清培養液，而未被收集的細胞利用消化液消化后，超聲破碎儀破碎細胞，離心后收集上清；將收集的無血清培養液和收集的上清混合后，過濾，收集過濾液對其濃縮，再除菌處理后制備而得。本發明的人脂肪間充質干細胞提取物及其凍干粉具有多種生物學活性，可用于制備傷口愈合藥物或細胞修復藥物等生物醫藥產品，還可用于制備美白產品或皮膚抗皺產品等精細化工產品。
【專利說明】人脂肪間充質干細胞提取物及其凍干粉和應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及干細胞在生物醫藥或醫學美容中使用的技術，尤其涉及人脂肪間充質干細胞在生物醫藥或醫學美容中的使用。
【背景技術】
[0002]脂肪組織來源廣泛、取材容易、細胞分離效率高、給患者帶來的創傷較少、并且不涉及倫理問題，因此日益受到廣泛重視。
[0003]人脂肪間充質干細胞是脂肪組織中的一類多能性干細胞，其能夠分泌多種生物活性物質，包括蛋白質、多肽及細胞因子等，比如干細胞生長因子(SCGF)、血管內皮生長因子(VEGF)、胰島素樣生長因子(IGF)、肝細胞生長因子(HGF)和轉化生長因子等，這些細胞生長因子能夠控制或者維持受傷組織細胞，引導其自身修復。除此之外，人脂肪間充質干細胞中還含有多種膜蛋白質及生物活性因子等多種成分，這些成分相互協調相互補充，具有復雜的生理作用，能夠對許多組織器官產生影響，因此具有比較好的抗光老化、抗氧化、抗皺、美白肌膚、傷口愈合、細胞修復等功效。
[0004]目前，雖然已有研究利用特定的誘導條件體外誘導干細胞分泌上清用于醫療、化妝品等方面，但是這種條件培養基是應用特定的細胞因子誘導干細胞分泌某些特定的因子從而達到療效，細胞因子本身價格昂貴，使得干細胞的應用成本異常增高。
【發明內容】

[0005]本發明的目的在于針對現有技術的不足，提供一種具有多種生物學活性，可用于生物醫藥、精細化工領域的人脂肪間充質干細胞提取物。
[0006]本發明的另一個目的是提供上述人脂肪間充質干細胞提取物在制備傷口愈合藥物或細胞修復藥物等生物醫藥產品，或在制備美白產品或皮膚抗皺產品等精細化工產品中的應用。
[0007]本發明的另一個目的是提供上述人脂肪間充質干細胞提取物的凍干粉。
[0008]本發明的另一個目的是提供上述人脂肪間充質干細胞提取物凍干粉的制備方法。
[0009]本發明的另一個目的是提供上述人脂肪間充質干細胞提取物的凍干粉在制備傷口愈合藥物或細胞修復藥物等生物醫藥產品，或在制備美白產品或皮膚抗皺產品等精細化工產品中的應用。
[0010]本發明的上述目的是通過如下方案予以實現的:
人脂肪間充質干細胞提取物，該提取物是由如下方法制備而得:
步驟1.將人脂肪間充質干細胞經原代分離培養后，進行傳代培養，取傳代培養的P3~P30代人脂肪間充質干細胞，利用細胞生長液培養至細胞80%融合時，棄掉培養液，先用磷酸鹽緩沖液洗滌細胞三次，然后加入無血清培養液繼續培養72小時后，收集無血清培養液，而未被收集的細胞進行后續處理；步驟2.將步驟I未被收集的細胞利用消化液消化后，超聲破碎儀破碎細胞，離心后收集上清； 步驟3、
將步驟I收集的無血清培養液和步驟2收集的上清混合后，過濾，收集過濾液對其濃縮，所得濃縮液再進行除菌處理后，則制備得到所需人脂肪間充質干細胞提取物。
[0011]上述步驟I中，所述將人脂肪間充質干細胞經原代分離培養中，原代分離方法和培養方法采用本領域技術人員的常規操作即可。
[0012]上述步驟I中，所述細胞生長液是指含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養液，并且該培養液中還含有抗細菌抗生素；所述抗細菌抗生素為青霉素和鏈霉素兩種，其中青霉素在細胞生長液中的終濃度為200 U/ml，鏈霉素在細胞生長液中的終濃度為250 U/ml ;所述含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養液為向市售的基礎DMEM/F12培養液中加入終濃度為10%的胎牛血清，并加入終濃度為200 U/ml的青霉素和終濃度為250 U/ml的鏈霉素即為本發明的細胞生長液。
[0013]上述步驟I中，所述磷酸鹽緩沖液為pH值為7.0~7.2的PBS溶液。
[0014]上述步驟I中，所述細胞在無血清培養液中繼續培養72小時，這里的無血清培養液為市售產品。
[0015]上述步驟I中，具體操作時，將傳代培養的不同代細胞分別進行處理，如:將P3代的人脂肪間充質干細胞利用細胞生長液培養至細胞80%融合時，棄掉培養液，先用磷酸鹽緩沖液洗滌細胞三次，然后將細胞加入到無血清培養液中繼續培養72小時后，收集得到P3的無血清培養液；將P4代的人脂肪間充質干細胞利用細胞生長液培養至細胞80%融合時，棄掉培養液，先用磷酸鹽緩沖液洗滌細胞三次，然后將細胞加入到無血清培養液中繼續培養72小時后，收集得到P4代的無血清培養液等等；然后將P3~P30代人脂肪間充質干細胞分別得到的無血清培養液收集合并后，則得到實施例1收集的無血清培養液；同時，將P3~P30代人脂肪間充質干細胞分別得到的未被收集的細胞收集合并后，一起進行后續處理。
[0016]上述步驟2中，所述消化液為0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA混合消化液，該混合消化液先經0.22Mm的濾膜過濾除菌后才能用于本發明；所述0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA混合消化液為本領域技術人員進行細胞實驗時常用的一種消化液，其配制方法按照教科書上給出的配制方法，均可實現本發明；如可采用如下方法配制:取0.25g胰蛋白酶粉、20mgEDTA粉末和100ml 0.01mol/L的PBS，先用少量PBS溶解胰蛋白酶粉，然后將EDTA粉末和其余的PBS加入混合后，置于37°C水浴中，待徹底溶解液體呈透明為止，用G5抽濾，分裝置于4°C冰箱中保存即可。
[0017]上述步驟2中，所述超聲破碎儀破碎細胞，其破碎條件為4°C、400W、超聲3s、間隔6s, 99個循環。
[0018]上述步驟2中，所述離心為17000g、30min。
[0019]上述步驟3中，所述將步驟I收集的無血清培養液和步驟2收集的上清混合，這里步驟I收集的無血清培養液和步驟2收集的上清的混合比例為1: 1，體積比。
[0020]上述步驟3中，所述過濾是采用孔徑為0.45Mm的濾膜過濾。
[0021]上述步驟3中，所述濃縮是采用截留分子量為3KD的過濾膜進行濃縮脫鹽。
[0022]上述步驟3中，所述濃縮是指濃縮至原體積的1/10，也就是說，將過濾液濃縮后得到濃縮液，所述濃縮液的體積是過濾液的1/10。
[0023]上述步驟3中，所述將濃縮液進行除菌處理，這里的除菌處理是將濃縮液采用無菌的0.22Mm濾膜過濾除菌。
[0024]上述制備的人脂肪間充質干細胞提取物經過實驗研究證實，其具有很多種生物學活性，可用于制備傷口愈合藥物或細胞修復藥物等生物醫藥產品，還可用于制備美白產品或皮膚抗皺產品等精細化工產品。
[0025]本發明的人脂肪間充質干細胞提取物雖然具有多種生物學活性，應用領域廣泛，但是其生物學活性受各種外界條件限制，保存起來不方便，因此本發明還提供人脂肪間充質干細胞提取物的凍干粉，該凍干粉就是將本發明的人脂肪間充質干細胞提取物經本領域常用的凍干粉制備方法制備的凍干粉；凍干粉是在無菌環境下將藥液冷凍成固態，抽真空將水分升華干燥而成的無菌粉，凍干粉的制備方法是本領域比較成熟的技術，本發明采用任何一種凍干粉的制備方法，都可以得到所需的人脂肪間充質干細胞提取物凍干粉。
[0026]為了取得更好的醫藥學效果，本發明還特別針對上述人脂肪間充質干細胞提取物的特點，研發了人脂肪間充質干細胞提取物凍干粉的制備方法，該制備方法包括如下步驟:
向人脂肪間充質干細胞提取物中加入賦形劑和水，混合后過濾除菌，然后進行凍干處理，則制備得到所需人脂肪間充質干細胞提取物凍干粉。
[0027]上述凍干粉的制備方法中，所述賦形劑采用甘露醇、海藻糖或蔗糖中的任意一種。
[0028]上述凍干粉的制備方法中，所述賦形劑的用量:賦形劑占人脂肪間充質干細胞提取物總重量的5~10%。
[0029]上述凍干粉的制備方法中，所述水采用超純水。
[0030]上述凍干粉的制備方法中，加入超純水至最終體積為100ml。
[0031]上述凍干粉的制備方法中，所述凍干處理是指凍干溫度為-20~_35°C、真空度為50~200Pa，凍干48小時。
[0032]本發明的人脂肪間充質干細胞提取物凍干粉同樣具有多種生物學活性，可用于制備傷口愈合藥物或細胞修復藥物等生物醫藥產品，還可用于制備美白產品或皮膚抗皺產品等精細化工產品。
[0033]本發明的人脂肪間充質干細胞提取物凍干粉制備方法簡單，易于保存和運輸。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0034]圖1為人脂肪間充質干細胞的流式細胞檢測圖；
圖2為人脂肪間充質干細胞提取物凍干粉對HDF細胞生長的影響結果柱狀圖；
圖3為人脂肪間充質干細胞提取物凍干粉對細胞內SOD酶活性的影響結果柱狀圖；圖中，I為人脂肪間充質干細胞提取物凍干粉2(^g/ml組；2為人脂肪間充質干細胞提取物凍干粉lOPg/ml組；3為模型組；4為陽性對照組；5為陰性對照組；其中:**P ^ 0.01,氺P ^ 0.05 ；
圖4為5個實驗組的小鼠血漿中SOD酶活性的檢測結果柱狀圖；
圖中，I為人脂肪間充質干細胞提取物凍干粉2(^g/ml組；2為人脂肪間充質干細胞提取物凍干粉lOPg/ml組；3為模型組；4為陽性對照組；5為陰性對照組；其中:**P ^ 0.01,氺P ^ 0.05 ；
圖5為5個實驗組的小鼠血漿中GPx活性的檢測結果柱狀圖；
圖中，I為人脂肪間充質干細胞提取物凍干粉2(^g/ml組；2為人脂肪間充質干細胞提取物凍干粉lOPg/ml組；3為模型組；4為陽性對照組；5為陰性對照組；其中:**P ^ 0.01,氺P ^ 0.05 ；
圖6為5個實驗組的小鼠血漿中MDA含量的檢測結果柱狀圖。
[0035]圖中，I為人脂肪間充質干細胞提取物凍干粉2(^g/ml組；2為人脂肪間充質干細胞提取物凍干粉lOPg/ml組；3為模型組；4為陽性對照組；5為陰性對照組；其中:**P ^ 0.01, *P = 0.05。
【具體實施方式】
[0036]下面結合具體實施例對本發明做進一步地描述，但具體實施例并不對本發明做任何限定。 [0037]實施例1人脂肪間充質干細胞的原代分離、培養及鑒定
1、人脂肪間充質干細胞的原代分離和培養
將通過脂肪抽吸術獲取的人體腹部皮下脂肪組織抽提液(術前己排除內分泌疾病及傳染病)800g離心，用PBS緩沖液沖洗，浸泡，再800gX4min洗滌3次；剔除肉眼可見的血管及結蹄組織，用眼科剪將其充分剪碎后放入50ml離心管，加入2倍體積0.2%膠原酶、I倍體積1%BSA和雙抗，混勻，封口，放入搖床中37°C消化45min，至糊狀為止；
加入等體積的含體積分數為10%胎牛血清的低糖DMEM終止消化，1800r/min離心IOmin,離心后分為3層，上層為油脂及未消化完全的脂肪組織，中層為上清液，下層為脂肪干細胞和紅細胞等混合細胞的沉淀；
棄上層和中層，下層加入完全培養基重懸細胞沉淀，70Mm細胞篩網過濾，將濾過后的濾液調整細胞濃度為5 X IO5單核細胞/mL接種于T-25cm2培養瓶中，37°C、5%C02、飽和濕度培養，48h后換液，加入脂肪干細胞完全培養基繼續培養。
[0038]2、人脂肪間充質干細胞的鑒定
采用流式細胞儀進行人脂肪間充質干細胞的鑒定，結果如圖1所示，細胞中CD29、⑶44、⑶90呈陽性表達，⑶49d、⑶71呈弱陽性，而⑶34、⑶45呈陰性表達，因此可判定為人脂肪間充質干細胞。
[0039]實施例2人脂肪間充質干細胞提取物
本實施例的人脂肪間充質干細胞提取物，該提取物是由如下方法制備而得:
步驟1.將經過鑒定的傳代培養的P3~P30代人脂肪間充質干細胞，利用細胞生長液(所述細胞生長液是向市售的基礎DMEM/F12培養液中加入終濃度為10%的胎牛血清以及終濃度為200 U/ml的青霉素和終濃度為250 U/ml的鏈霉素制備而得)培養至細胞80%融合時，棄掉培養液，先用磷酸鹽緩沖液(所述磷酸鹽緩沖液為PH值為7.0~7.2的PBS溶液)洗滌細胞三次，然后加入市售的無血清培養液繼續培養72小時后，收集P3~P30代各代人脂肪間充質干細胞分別得到的無血清培養液并合并，而未被收集的細胞進行后續處理；
步驟2.將步驟I未被收集的細胞利用消化液(所述消化液為0.25%胰蛋白酶-0.0296EDTA混合消化液，且該混合消化液經0.22Mffl的濾膜過濾除菌)消化后，加入步驟I用的細胞生長液終止消化，4°C、3000g、離心5min ;PBS洗滌細胞3次，并重懸細胞，放于冰上利用超聲破碎儀破碎細胞，破碎條件為400W、超聲3s、間隔6s，99個循環；待液體變澄清后，4°C、17000g、離心30min收集上清，將P3~P30代各代人脂肪間充質干細胞分別得到的上清收集并合并；步驟3、
將步驟I收集的無血清培養液和步驟2收集的上清以1:1的體積比混合后，利用
0.45Mffl濾器過濾溶液，收集過濾液并將該過濾液濃縮至原體積的十分之一，所得濃縮液用無菌的0.22ΜΠ1濾膜過濾除菌，則制備得到本實施例的人脂肪間充質干細胞提取物溶液。
[0040]實施例3人脂肪間充質干細胞提取物凍干粉
采用BCA法對實施例2制備的人脂肪間充質干細胞提取物溶液進行蛋白濃度測定，酶標儀測定A570的吸光度，得到實施例2制備的人脂肪間充質干細胞提取物溶液的蛋白濃度，然后根據該蛋白濃度，按照需凍干溶液的最終質量加入賦形劑甘露醇(甘露醇占人脂肪間充質干細胞提取物總重量的5%)和50~60°C的超純水混勻，并調節至蛋白終濃度為50.0±0.5μδ/πι1,過濾除菌，然后凍干處理，凍干溫度為-20~-35°C，真空度為50~200Pa，凍干時間48小時，則制得所需的人脂肪間充質干細胞提取物凍干粉；凍干粉按照Iml量/支分裝。
[0041]人脂肪間充質 干細胞提取物凍干粉的質量標準如下所示:
(I)外觀
觀察人脂肪間充質干細胞提取物凍干粉產品為白色、粉末狀。按標示量用Iml超純水溶解后為澄清、透明的淡紅色溶液。
[0042](2) pH值的測定
采用精密PH計測定人脂肪間充質干細胞提取物凍干粉的pH值。首先根據操作說明書利用標準液對PH計進行校正，再對干細胞提取物凍干粉水溶液進行測定。人脂肪間充質干細胞提取物凍干粉水溶液的PH值在6.5~7.5之間。
[0043]實施例4人脂肪間充質干細胞提取物凍干粉體外抗光老化試驗
(I) MTT法測定人脂肪間充質干細胞提取物凍干粉對人真皮成纖維細胞生長的影響檢測樣品:實施例3制備的人脂肪間充質干細胞提取物凍干粉(蛋白含量為50.0±0.5μδ / 支)。
[0044]受試生物體:HDF細胞。
[0045]具體步驟如下所示:
(1)利用10%(v/v)FBS 的 DMEM/F12 培養基(青霉素 200 U/ml、鏈霉素 250 U/ml,pH7.2)培養HDF細胞，當細胞密度達到100%融合時，利用細胞消化液消化細胞，調整細胞濃度為為I X 105cell/ml，接種至Ij 96孔板中，每孔100 μ 1，設定4個復孔，37°C、5%C02、飽和濕度的細胞培養箱中繼續培養；
(2)24h后，棄去培養基，用含1%FBS的DMEM/F1培養基稀釋干細胞提取物至終濃度為400 μ g/ml、200μ g/ml、100 μ g/ml、50 μ g/ml、25 μ g/ml、12.5 μ g/ml、6.25 μ g/ml,每孔加入ΙΟΟμ 1，設定4個復孔，對照組加入1%FBS的DMEM/F12培養基。37°C、5%C02、飽和濕度的細胞培養箱中繼續培養；(3)48h后，加入20 μ I/孔的MTT溶液，繼續培養4h，棄上清，加入DMS0100 μ I/孔，避光震蕩15min，利用酶標儀在波長為570nm、參考波長為630nm處測定吸光度，并計算細胞存活率。
[0046]細胞存活率(％)=(實驗組平均吸光度值/對照組平均吸光度值)X 100%
實驗結果如圖2所示，人脂肪間充質干細胞提取物凍干粉在濃度=400 μ g/ml時對HDF
細胞無明顯的抑制作用，鏡下觀察細胞也無明顯的死亡等癥狀。實驗組與對照組相比較，其細胞存活率沒有明顯的差異，說明沒有出現顯著的細胞死亡，而當人脂肪間充質干細胞提取物凍干粉濃度=100 μ g/ml時能夠促進HDF細胞的生長。
[0047](2)人脂肪間充質干細胞提取物凍干粉對紫外損傷人真皮成纖維細胞的保護作用 檢測樣品:實施例3制備的人脂肪間充質干細胞提取物凍干粉(蛋白含量為
50.0±0.5μδ / 支)。
[0048]受試生物體:HDF細胞。
[0049]具體步驟如下所示:
(1)當人真皮成纖維細胞生長至80%融合時，用UVA紫外線照射細胞，每天照射2小時，共照射4天，陰性對照組用錫紙包住細胞培養瓶。在顯微鏡下觀察細胞的形態，發現細胞開始出現皺縮，個別細胞漂浮在培養基中；第五天，加入人脂肪間充質干細胞提取物凍干粉，蛋白終濃度分別為20 μ g/ml和10 μ g/ml，維生素C20 μ g/ml作為陽性對照，繼續培養48h，收集細胞；
(2)人脂肪間充質干細胞提取物凍干粉對細胞內SOD酶活性的影響:胰酶消化后，細胞在1500g、4°C條件下離心lOmin。細胞沉淀懸浮在遇冷的緩沖液中(50mM的Tris - HCl,5mM EDTA和I mM DTT)進行超聲，裂解液在10000g、4°C條件下離心lOmin，上清利用SOD檢測試劑盒根據其說明方法進行分析。
[0050]結果如圖3所示，人脂肪間充質干細胞提取物凍干粉蛋白濃度無論是20μ g/ml，還是10 μ g/ml都不同程度地提高了細胞內SOD酶的活性，從而減少因紫外線輻射誘導產生的氧自由基對細胞的攻擊和損害，降低細胞的死亡率，從而起到保護細胞的作用，達到抗光老化的功效。
[0051]實施例5人脂肪間充質干細胞提取物凍干粉對紫外線引起小鼠皮膚光老化的保護作用
一、實驗方案
1、檢測樣品:實施例3制備的人脂肪間充質干細胞提取物凍干粉(蛋白含量為50.0±0.5μδ / 支)。
[0052]2、試驗方法:
2.1動物飼養:4周齡SP F級雌性昆明小鼠(體重20±2g)，廣東省醫學實驗中心提供，適應性飼養一周后，剔除小鼠背部毛，裸露皮膚棉結約2cm2，進行試驗。試驗過程中正常給水和飼料。
[0053]2.2實驗分組及藥物處理:小鼠分為五組，每組5只，分別進行如下操作:
第I組:用生理鹽水溶解人脂肪間充質干細胞提取物凍干粉，制備得到人脂肪間充質干細胞提取物凍干粉濃度為2(^g/ml的溶液；將前述人脂肪間充質干細胞提取物凍干粉濃度為2(^g/ml的溶液涂抹到小鼠上，涂抹量為Iml/只，I次/天(照射前)，然后紫外照射；第2組:用生理鹽水溶解人脂肪間充質干細胞提取物凍干粉，制備得到人脂肪間充質干細胞提取物凍干粉濃度為lOPg/ml的溶液；將前述人脂肪間充質干細胞提取物凍干粉濃度為lOPg/ml的溶液涂抹到小鼠上，涂抹量為Iml/只，I次/天(照射前)，然后紫外照射；第3組:模型組，該組的小鼠不涂抹人脂肪間充質干細胞提取物凍干粉，紫外照射；
第4組:陽性對照組，用生理鹽水溶解維生素C (VitC)制備得到維生素濃度為2(^g/ml的溶液，將該溶液涂抹于小鼠上，涂抹量為Iml/只，I次/天(照射前)，然后紫外照射；第5組:陰性對照組，該組的小鼠什么也不涂抹，也不紫外照射。
[0054]紫外線照射的具體操作:對小鼠給藥Ih待藥物被吸收后進行紫外照射，第一周每天照射lh，第二周每天照射2h，第三周每天照射3h，從第4周開始每天照射4h，總共照射42天；紫外線的強度為:UVA:0.25mJ/cm2/s, UVB:0.02mJ/cm2/s ;待照射完成后，將老鼠處死，進行各項指標的檢測；對老鼠進行放血，血清在2500g、4°C條件下離心4min，取上清進行各項指標的檢測。
[0055]3、檢測項目: 血漿中SOD酶、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)及丙二醛(MDA)含量的測定:對小鼠進行放血,在2500g、4°C條件下離心4min,收集上清；
SOD的活性，GPx的活性以及MDA的含量利用南京建成生物工程研究所提供的診斷試劑盒根據供應商的說明書進行測定分析。
[0056]皮膚組織切片HE染色，觀察皮膚結構的變化:取小鼠背部剔除毛的皮膚，10%的甲醛溶液固定，常規石蠟切片，HE染色觀察。
[0057]4、實驗結果
圖4為5個實驗組的小鼠血漿中SOD酶活性的檢測結果柱狀圖，由圖4可以看出:模型組小鼠體內的SOD酶活性7.26±2.24U/ml，而第I組小鼠體內SOD酶活性為53.3±5.99U/ml，第2組小鼠體內SOD酶活性為37.26±2.24U/ml ;干細胞提取物保護的小鼠體內SOD酶活性雖然沒有恢復到正常對照組水平，但是與模型組和陽性藥VitC組比較，均具有大幅度的提高，說明干細胞提取物能夠更加有效清除或者協助動物體內抗氧化系統清除體內的氧自由基等有害物質，從而使抗氧化平衡系統保持穩定。
[0058]圖5是5個實驗組的小鼠血漿中GPx活性的檢測結果柱狀圖，從圖5可以看出，第I組小鼠和第2組小鼠的GPx活性都比模型組和陽性藥VitC組要好，從而保護了小鼠皮膚；其中第I組和第2組受試小鼠血漿中GPx酶活性分別是=1125.33 + 104.47U/ml,811.27 ±125.88U/ml ;模型組小鼠血漿中 GPx 酶活性是 591.55 ±176.47U/ml。
[0059]圖6是5個實驗組的小鼠血漿中MDA含量的檢測結果柱狀圖，從圖6可以看出，陰性對照組的MDA含量最低6.54±0.66nmol/ml，模型組的MDA含量最高25.92±1.16nmol/ml，人脂肪間充質干細胞提取物有效地降低了 MDA的含量，保持了體內抗氧化平衡系統。
[0060]5個實驗組的小鼠皮膚組織的檢測結果如下所示:
第I組:皮膚結構完整且清晰，和正常皮膚組織沒有明顯的差別，表皮及真皮層均未見明顯增厚，未見炎癥細胞浸潤等現象；
第2組:真皮內的膠原纖維排列較為整齊，皮膚附件有少許的增生；
第3組(模型組):小鼠表皮厚度明顯增加，真皮厚度急劇減少，膠原纖維異常增長且排列紊亂，皮膚附件也出現明顯的增生，呈現出皮膚初期老化的特征；第4組(陽性對照組):表皮有一定的增生現象，皮膚深層膠原纖維排列較為松散；
第5組(陰性對照組):皮膚正常，沒有明顯的裂痕和增生現象，沒有初期老化的特征。
[0061]由于維生素C是已知的具有良好防曬效果的藥物，因此作為本實驗的陽性藥，而最終結果表明本發明的人脂肪間充質干細胞提取物凍干粉的不同劑量組都有較好的對紫外線引起小鼠皮膚光老化的保護或修復作用，效果等同于或大于陽性對照組。
[0062]實施例6人脂肪間充質干細胞提取物凍干粉的毒性評價
本實施例的人脂肪間充質干細胞提取物凍干粉的毒性評價分為人脂肪間充質干細胞提取物凍干粉的小鼠急性經口毒性試驗(一次限量法)、人脂肪間充質干細胞提取物凍干粉的大鼠急性經皮毒性試驗(一次限量法)和人脂肪間充質干細胞提取物凍干粉的家兔皮膚光毒性試驗。
[0063]一、人脂肪間充質干細胞提取物凍干粉的小鼠急性經口毒性試驗(一次限量法) 樣品:實施例3制備的人脂肪間充質干細胞提取物凍干粉。
[0064]受試生物體:昆明小鼠。
[0065]試驗方法:
前期體外實驗的結果表明，人脂肪間充質干細胞提取物凍干粉基本無毒，因此采用一次限量法證實其對生物體的安全性，即一次最大灌胃劑量采用其10倍實效標示藥量(50.0±0.5Pg /支X 10支)的受試物對10只昆明小鼠(雌雄各半，體重為20.0g± 0.2g)進行灌胃，觀察其毒性反應，當未引起動物死亡，則不再進行多個劑量的急性經口毒性試驗。
[0066]觀察期限:14天。
[0067]實驗結果觀察:未觀察到試驗動物有任何不良反應，亦沒有動物死亡。
[0068]二、人脂肪間充質干細胞提取物凍干粉的大鼠急性經皮毒性試驗(一次限量法) 樣品:實施例3制備的人脂肪間充質干細胞提取物凍干粉。
[0069]受試生物體:SD大鼠(廣東省動物實驗中心)。
[0070]試驗方法:
前期體外實驗的結果表明，人脂肪間充質干細胞提取物凍干粉基本無毒，因此采用一次限量法進一步證實其對生物體的安全性，即用10只動物(雌雄各半，體重為149.1±12.48)，皮膚涂抹200011^ /kg體重劑量的干細胞提取物水溶液，當未引起動物死亡，則不再進行多個劑量的急性經皮毒性試驗。
[0071]觀察期限:14天。
[0072]觀察結果:未觀察到試驗動物有任何不良反應,亦沒有動物死亡。
[0073]三、人脂肪間充質干細胞提取物凍干粉的家兔皮膚光毒性試驗 樣品:實施例3制備的人脂肪間充質干細胞提取物凍干粉。
[0074]受試生物體:成年白色家兔(廣東省動物實驗中心)50只，雌性各半。
[0075]UV 光源:波長為 320nm ~400nm 的 UVA。
[0076]照射時間:1.5h。
[0077]試驗步驟:
進行正式光毒試驗前18~24h，將家兔脊柱兩側皮膚去毛，試驗部位皮膚需完好，無損傷及異常；備4塊去毛區，每塊去毛面積約為2cmX 2cm，去毛皮的試驗安排如表1所示；將動物固定，根據下表，在動物去毛區I和2分別涂敷Iml含l(^g/ml、2(^g/ml受試物水溶液；30min后，左側(去毛區I和3)用鋁箔復蓋，膠帶固定，右側用UVA進行照射，結束后分別于
1、24、48和72h觀察皮膚反應，根據皮膚刺激反應評分表判斷是否對皮膚有刺激反應，結果如表2所示。
[0078]表1動物去毛區的試驗安排
【權利要求】
1.人脂肪間充質干細胞提取物，其特征在于該人脂肪間充質干細胞提取物是由如下方法制備而得: 步驟1.將人脂肪間充質干細胞經原代分離培養后，進行傳代培養，取傳代培養的P3~P30代人脂肪間充質干細胞，利用細胞生長液培養至細胞80%融合時，棄掉培養液，先用磷酸鹽緩沖液洗滌細胞三次，然后加入無血清培養液繼續培養72小時后，收集無血清培養液，而未被收集的細胞進行后續處理； 步驟2.將步驟I未被收集的細胞利用消化液消化后，超聲破碎儀破碎細胞，離心后收集上清； 步驟3、 將步驟I收集的無血清培養液和步驟2收集的上清混合后，過濾，收集過濾液對其濃縮，所得濃縮液再進行除菌處理后，則制備得到所需人脂肪間充質干細胞提取物。
2.根據權利要求1所述人脂肪間充質干細胞提取物，其特征在于所述步驟I中，細胞生長液是指含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養液，該培養液中還含有終濃度為200 U/ml的青霉素和終濃度為250 U/ml的鏈霉素。
3.根據權利要求1所述人脂肪間充質干細胞提取物，其特征在于所述步驟2中，消化液為經0.22Mm的濾膜過濾除菌的0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA混合消化液。
4.根據權利要求1所述人脂肪間充質干細胞提取物，其特征在于所述步驟2中，超聲破碎儀破碎細胞的條件為4°C、400W、超聲3s、間隔6s，99個循環。
5.根據權利要求1所 述人脂肪間充質干細胞提取物，其特征在于所述步驟3中，步驟I收集的無血清培養液和步驟2收集的上清的混合比例為1:1，體積比。
6.根據權利要求1所述人脂肪間充質干細胞提取物，其特征在于所述步驟3中，過濾是采用孔徑為0.45ΜΠ1的濾膜過濾，濃縮是采用截留分子量為3KD的過濾膜濃縮至原體積的的1/10，除菌處理是采用無菌的0.22ΜΠ1濾膜過濾除菌。
7.權利要求1-6所述任一項的人脂肪間充質干細胞提取物在制備傷口愈合藥物、細胞修復藥物、美白產品或皮膚抗皺產品中的應用。
8.人脂肪間充質干細胞提取物凍干粉，其特征在于該凍干粉是由權利要求1-6所述任一項的人脂肪間充質干細胞提取物經凍干處理制備而得。
9.權利要求8所述人脂肪間充質干細胞提取物凍干粉的制備方法，其特征在于該制備方法包括如下步驟: 向人脂肪間充質干細胞提取物中加入賦形劑和水，混合后過濾除菌，然后進行凍干處理，則制備得到人脂肪間充質干細胞提取物凍干粉；所述賦形劑采用甘露醇、海藻糖或蔗糖中的任意一種，賦形劑占人脂肪間充質干細胞提取物總重量的5~10% ;所述凍干處理的凍干溫度為-20~-35°C、真空度為50~200Pa，凍干48小時。
10.權利要求8所述人脂肪間充質干細胞提取物凍干粉在制備傷口愈合藥物、細胞修復藥物、美白產品或皮膚抗皺產品中的應用。
【文檔編號】A61K35/34GK103784474SQ201410037863
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年1月26日 優先權日:2014年1月26日
【發明者】陳海佳, 王一飛, 舒輝萍, 劉秋英, 馬巖巖 申請人:廣州賽萊拉生物科技有限公司