用于治療慢性疼痛的多肽的制作方法
【專利摘要】本發明公開了用于治療慢性疼痛的多肽，多肽的基序為ASADPGH，基序通過可選的連接基團偶聯有跨膜轉運信號段。本發明的多肽，既可以抑制神經元內Fyn調節的NR2磷酸化，又不影響Fyn活性，可以很好地治療慢性疼痛。
【專利說明】用于治療慢性疼痛的多肽
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種多肽，特別涉及一種用于治療慢性疼痛的多肽。
【背景技術】[0002]慢性疼痛(主要分為炎性痛、神經病理性疼痛)的特征是痛覺過敏(hyperalgesia)、異常性疼痛(allodynia)、自發性疼痛(spontaneous pain)等,其發生都涉及到神經突觸可塑性變化導致的中樞致敏(central sensitization),對于疼痛的發生而言，脊髓背角(spinal cord dorsal horn, S⑶H)被譽為疼痛之旅的起點，S⑶H的突觸信號傳遞能夠接受復雜的、兩相的、且是活性依賴的神經調節，在這種調節之下，從周圍神經系統的感覺傳入被精確地編碼并被傳入大腦。當外周傷害性刺激通過初級傳入神經元的整合調節(包括免疫細胞、膠質細胞等與神經元的對話等)激活了脊髓背角(spinal corddorsal horn, S⑶H)的感覺神經元后，將引起突觸后神經元末梢的去極化，激活末梢上NR。研究表明，NR的過度激活是慢性疼痛中樞致敏發生的不可或缺的重要環節。
[0003]NR是谷氨酸受體的離子型受體，由功能亞基(NMDA rec印torl，NRl)和調節亞基(NMDA receptor2, NR2)組成，NR2 又分 NR2A、NR2B、NR2C 及 NR2D。NRl 和一種 NR2 可能還有NR3組成完整的NR離子通道。生理情況下，配體與NR結合后，NR通道(存在于功能亞基)開放，陽離子內流，尤其是Ca2+的內流，這種基本的電活動(基礎活性)是NR相關的生理功能賴以存在的基礎。如前所述，NR的過度活化在慢性疼痛中樞致敏的產生和維持方面起關鍵作用。
[0004]目前，不同類型的新的鎮痛藥正在開發之中，以NR為靶點，設法抑制NR的過度激活一直以來是慢性疼痛等神經病變的研究熱點。抑制NR的激活通常可以使用NR拮抗劑，然而，這些拮抗劑都具有神經毒作用，拮抗劑阻斷NR基礎電活動時會破壞NR依賴的生理功能。總之，以NR為靶點設計治療疾病的策略首先應該不影響NR的基礎電活動，減少對NR依賴的生理功能的干擾。對于NR通道而言，陽離子內流的結構基礎存在于NR的功能亞基，而陽離子內流的強度等(NR的活性)受調節亞基NR2調節，因此，通過調控NR2來調節NR活性是治療慢性疼痛的新策略。發明人在之前的研究中利用SiRNA沉默NR2B減輕了病理神經痛大鼠的痛覺過敏，這印證了以NR2為靶點治療慢性疼痛的可行性。NR2的酪氨酸磷酸化變化是NR2調節NR活性的最基本方式，NR2酪氨酸磷酸化，則NR活性增強，反之，去磷酸化則使NR活性降低，因此，干預NR2的酪氨酸磷酸化治療NR過度活化導致的病理生理改變可能是避免阻斷NR，減少對NR依賴的生理功能干擾的有效途徑。
[0005]NR2酪氨酸磷酸化由神經元非受體依賴的蛋白激酶家族(Src family proteinkinases, SFKs)調節。Fyn是脊髓神經元中富含的SFKs成員，Fyn催化NR2酪氨酸磷酸化，是許多信號通路調節NR2磷酸化的信號交匯點。盡管NR2A或NR2B的C-末端的多個酪氨酸殘基可以被SFKs家族磷酸化，但NR2B Tyrl472位點的磷酸化主要由Fyn調節，一些學者認為NR2B就是NR參與疼痛的調節亞基，因此，S⑶H中突觸后Fyn調節NR2特別是NR2B酪氨酸磷酸化在慢性疼痛中的作用備受關注。諸多的研究表明，慢性疼痛大鼠痛覺過敏的維持依賴于Fyn調節的NR2B Tyrl472位點的酪氨酸磷酸化，多種信號分子可通過Fyn催化NR2尤其是NR2B的磷酸化進而引起炎性疼痛或神經病理痛的發生。這些結果提示，干預神經元內Fyn調節的NR2尤其是NR2B的酪氨酸磷酸化可以治療慢性疼痛如炎性疼痛。干預神經元內Fyn對NR2的酪氨酸磷酸化可以使用Fyn抑制劑，然而，這種方法特異性差，由于同源家族的酶的催化區域具有保守性，而Fyn是廣泛存在于體內多種組織的酪氨酸蛋白激酶，使用激酶抑制劑抑制Fyn的活性會影響神經系統以外組織Fyn的生理作用。從遺傳性干預的角度，我們也可以通過基因療法抑制Fyn的表達，目前還沒有可應用于臨床的具有高轉染效率、合適的半衰期、特異性和靶向性高的siRNA分子體內給藥系統。
【發明內容】
[0006]本發明的目的在于提供一種既可以抑制神經元內Fyn調節的NR2磷酸化，又不影響Fyn活性的多肽。
[0007]本發明的另一個目的在于提供一種治療慢性疼痛的制劑。
[0008]本發明所采取的技術方案是:
一種用于治療慢性疼痛的多肽，其基序為ASADPGH (SEQ ID NO:1)，基序通過可選的連接基團偶聯有跨膜轉運信號段。
[0009]優選的，上述治療慢性疼痛的多肽中偶聯的跨膜轉運信號段為跨膜轉運肽。
[0010]優選的，上述跨膜轉運肽為Tat蛋白轉導域中的片段短肽。跨膜轉運肽的序列為YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO:2)。
[0011]特別的，用于治療慢性`疼痛的多肽的序列為ASADPGH-YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO:3)。
[0012]一種治療慢性疼痛的制劑，含有上述的多肽。
[0013]本發明的有益效果是:
本發明的多肽，既可以抑制神經元內Fyn調節的NR2磷酸化，又不影響Fyn活性，可以很好地治療慢性疼痛。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0014]圖1是NR磷酸化活化和炎性疼痛的治療機理圖；
圖2是Tat-FynP對培養脊髓神經細胞NR2B酪氨酸磷酸化蛋白水平的影響圖；
圖3是不同肽對Fyn活性的影響圖。
【具體實施方式】
[0015]一種用于治療慢性疼痛的多肽，其基序為ASADPGH，基序通過可選的連接基團偶聯有跨膜轉運信號段。
[0016]跨膜轉運信號段的作用在于提供細胞轉動信號，將使細胞將目的肽轉運至細胞內起效。優選的，跨膜轉運信號段為跨膜轉運肽。優選的，上述跨膜轉運肽為Tat蛋白轉導域中的片段短肽。跨膜轉運肽的序列為YGRKKRRQRRR。當然，也可以使用其他的跨膜轉運信號段，以促進多肽進行細胞內發揮作用。
[0017]特別的，用于治療慢性疼痛的多肽的序列為ASADPGH-YGRKKRRQRRR。[0018]一種治療慢性疼痛的制劑，含有上述的多肽。
[0019]發明人所在課題組在研究中發現，Fyn與NR2的結合是一種由突觸后致密物(postsynaptic density protein, PSD)蛋白 PSD-93 介導的非直接連接，而且，PSD-93 只介導SFKs家族的Fyn與NR2的結合。實質上Fyn與PSD-95結合也以同樣的方式介導NR2磷酸化。PSD-93/95是胞質內一種特殊的銜接蛋白，其N-末端含有PDZ1，PDZ2，PDZ3三個PDZ結構域(與ESD-95，Dig, and ZO-1蛋白同源)又被稱為PDZ結構域蛋白。作為PDZ結構域蛋白的主要成員，PSD-93/95通過Η)Ζ2結構域與NR結合在一起。Fyn是一種非受體依賴的蛋白激酶，它通過酶作用區域以外的SH2結構域與PSD-93/95的TOZ3結構域的直接結合從而與NR形成復合體介導NR磷酸化，這種結合是不依賴于激酶磷酸化程度的獨特的物理結合方式，Fyn C末端Tyr去磷酸化及激酶結構域的Tyr磷酸化(Tyr420)都可以使Fyn激活，與通常認為的磷酸酶下調受體的磷酸化相反，酪氨酸磷酸酶α使突觸內Fyn去磷酸化反而促進這種復合物的形成，進而上調NR2酪氨酸磷酸化。慢性疼痛如炎性痛時，許多信號分子可間接或直接作用于Fyn促進NR2磷酸化。
[0020]總之，PSD-93/95始終與NR連接在一起，當刺激信號傳入時，PSD-93/95的TOZ3結構域再與Fyn SH2結構域結合，使Fyn、PSD-93/95、NR串集在一起，導致NR磷酸化活化(圖1A)。據此，發明人設想，可以通過抑制Fyn SH2與PSD-93/95PDZ3的相互作用，可以抑制Fyn與PSD93/95及NR的串集，從而抑制NR的磷酸化活化，防止或逆轉中樞致敏，達到對炎性疼痛的治療作用(圖1B)。該策略基于抑制Fyn SH2結構域與TOZ3結構域相互作用的策略，不影響NR通道的完整性，保留NR的基礎電活動，因此對NR依賴的生理功能干擾小或無干擾，不影響Fyn對神經系統NR2以外其它蛋白的磷酸化調節及其它組織器官Fyn的作用。[0021 ] 下面結合實驗及實 驗數據，進一步說明本發明。
[0022]以下實驗中的所使用的Tat-FynP的具體序列為ASADPGH-YGRKKRRQRRR。
[0023]Tat-FynP對培養脊髓神經細胞NR2B酪氨酸磷酸化蛋白水平的影響 Tat-FynP,FynP.mTat-FynP分別加入預先用Fyn激動劑孵育的培養細胞及未加激動劑
的培養細胞，孵育后細胞裂解液按常規步驟提取蛋白分兩份(另一分備NR2B總蛋白水平檢測)，利用特異性P-NR2B抗體,通過Western-blot觀察各組酪氨酸磷酸化NR2B蛋白水平的變化。
[0024]40yg總蛋白上樣，每樣上二塊平行膠，以確定蛋白分子量及上樣一致性，SDS-PAGE電泳分離后，以濕轉法電轉移至PVDF膜上，條件為150mA2小時，轉移緩沖液:25mmol/L Tris，190mmol/L甘氨酸，0.05%SDS，20%甲醇，轉移完畢后，將PVDF膜浸入封閉液，4 °C 過夜，封閉液成分:1%BSA 的 Buffer A (10mmol/T, Tris, 100mmol/L NaCl，
0.l%Tween20)。加入用封閉液稀釋的一抗(1:1000羊抗p_NR2B，均為Santa Cruz公司)，Buffer A洗膜10分鐘X 3次，加入二抗(1:300的生物素標記的馬抗羊或羊抗兔IgG，北京中山)，37°C孵育30分鐘，洗膜3次，加入3抗(1:300辣根酶標記鏈酶卵白素，北京中山)，Buffer A洗膜3次，最后將膜放入DAB溶液中顯色，一旦蛋白帶的顏色深度達到要求，即用ddH20漂洗，終止反應，之后拍攝膜照片。將PVDF膜上的目的蛋白條帶在Gel Doc2000凝膠成像系統上分析處理,磷酸化NR2B蛋白含量以ODuX面積表示。
[0025]實驗結果如圖2所示。此數據表明本發明的多肽Tat-FynP，可以抑制神經元內Fyn調節的NR2 (本實驗中為NR2B)磷酸化。[0026]Tat-FynP對Fyn激酶活性的影響(驗證其特異作用或祀向作用)
通過放射性免疫技術測定Fyn激酶活性。
[0027]用放射性免疫技術試劑盒分別測定Tat-FynP、FynP, mTat-FynP孵育的脊髓神經細胞Fyn激酶活性變化。Tat-FynP的劑量分別采用可以抑制Fyn與PSD-95相互作用的量的10倍。
[0028]通過超聲破碎法提取孵育的細胞蛋白，通過lory法測定蛋白濃度。激酶活性檢測:加入 20μ1 proteinA/G Plus Agarose, 4°C 水平搖床 100rpm30min, 7000rpm 離心取上清液。500 μ g蛋白中加入Fyn抗體4°C搖床,離心,buffer洗漆沉淀,上述步驟3次后bufferA重懸沉淀。構建[Y -32p]ATP反應體系,將10 μ I反應體系加入混合液孵育20min,終止反應后SDS-PAGE電泳，轉移至硝酸纖維素膜上，2h，_70°C，黑暗環境中壓片48_72h，顯影、定影。圖像經過數據系統分析處理。結果如圖3所示。各組Fyn活性無顯著差異，說明本發明的多肽，不影響Fyn活性。
[0029]Tat-FynP預先鞘內注射對微量甲醛炎性痛模型大鼠痛行為的影響
動物分為正常組、炎性疼痛組(CFA)，炎性疼痛組又分模型制作前預先鞘內注射Tat-FynP、FynP、mTat-FynP組，分別于左后肢足底注射微量甲醛前及注射后ld、3d、4d和5d測定大鼠MWT和TWD。結果發現Tat-FynP鞘內注射預處理對炎性疼痛大鼠具有治療作用。
[0030]造模前各組大鼠的兩種疼痛行為學指標比較差異均無統計學意義(P>0.05);與正常大鼠組比較，CFA組第4d (相當于鞘內注射治療藥物后3d)即可觀察到患足的MWT值下降非常顯著，TWD值明顯延長，與模型前基礎值和NS組比較差異有統計學意義(P〈0.01)，且這種變化趨勢持續至鞘內注射后5d。Tat-FynP組能使大鼠患足MWT值的下降幅度及TWD值的上升幅度減少，與CFA組比較有顯著差異(P〈0.01 )，而FynP組及mTat-FynP組大鼠MWT和TWD值的與CFA組比較無顯著差異(P>0.05)。(表la，表lb)。
[0031]表la、各組大鼠造模前及鞘內注射后或相應時間點MWT的變化
【權利要求】
1.一種用于治療慢性疼痛的多肽，其基序為ASADPGH，基序通過可選的連接基團偶聯有跨膜轉運信號段。
2.根據權利要求1所述的多肽，其特征在于:所述跨膜轉運信號段為跨膜轉運肽。
3.根據權利要求2所述的多肽，其特征在于:所述跨膜轉運肽為Tat蛋白轉導域中的片段短肽。
4.根據權利要求3所述的多肽，其特征在于:所述跨膜轉運肽的序列為YGRKKRRQRRR。
5.根據權利要求4所述的多肽，其特征在于:所述多肽的序列為ASADPGH-YGRKKRRQRRR。
6.一種治療慢性疼 痛的制劑，其特征在于:所述制劑中含有上述任意一項權利要求所述的多肽。
【文檔編號】A61K38/08GK103804500SQ201410030755
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2014年1月22日 優先權日:2014年1月22日
【發明者】陸建華, 彭捷, 何洹, 孫梅 申請人:廣州軍區廣州總醫院