蚯蚓纖溶活性蛋白聯合紫杉醇在制備抑制癌細胞的藥物中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種蚯蚓纖溶活性蛋白，是通過以下方法制備得到的：取新鮮蚯蚓，加水勻漿，靜置，離心得蛋白上清液，鹽析，離心，沉淀溶于水中，得蚯蚓纖溶活性蛋白粗提物，該粗提物經透析脫鹽、陰離子交換層析、凝膠過濾層析、凝膠柱脫鹽除雜操作，冷凍干燥成為固體粉末，并在分離過程中采用細胞實驗篩選活性蛋白，最終得到純化的蚯蚓纖溶活性蛋白。通過實驗研發現，蚯蚓纖溶活性蛋白與紫杉醇聯合使用，可以在體外抑制腫瘤細胞生長，因此，蚯蚓纖溶活性蛋白聯合紫杉醇可以用于制備抑制癌細胞的藥物。本發明還提供了一種抑制腫瘤細胞的聯合用藥物，包括蚯蚓纖溶活性蛋白以及紫杉醇，且任選的可以包括一種或多種可藥用載體。
【專利說明】蚯蚓纖溶活性蛋白聯合紫杉醇在制備抑制癌細胞的藥物中的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及蚯蚓纖溶活性蛋白聯合紫杉醇在制備抑制癌細胞增藥物中的應用，屬于抗癌藥物領域。
【背景技術】
[0002]癌癥已成為當前三大殺手之一。癌癥，又稱惡性腫瘤，因其具有局部浸潤和遠處轉移的特點，成為目前難以治愈的頑疾之一。
[0003]目前治療癌癥的主要方法有手術、化學療法以及放射療法。其中化學療法是指采用能夠殺死或抑制癌細胞生長、遷移、侵襲的藥物來治療癌癥。理想的治療癌癥的藥物是可以特異性的殺死癌細胞而不影響正常細胞的各項生理功能的，然而，不幸的是，到目前為止，尚未發現這種理想藥物。化療藥物主要是通過影響細胞的增殖分裂來殺死癌細胞，但同時它們對于一些可以快速增殖的正常細胞(比如骨髓細胞)也同樣具有殺傷作用。而且，治療癌癥的化學藥物如紫杉醇、長春新堿等在治療癌癥過程中會引發癌細胞的多藥耐藥性。因此，尋求一種新型無毒或毒性小的抗腫瘤藥物或者尋求一種新的用藥方式以便減少化療藥的劑量及毒性并降低細胞產生多藥耐藥性的可能性成為目前研究的重要方向。
[0004]蚯蚓，又名地龍。八十年代初日本學者從蚯蚓體內提取出一種能溶解血栓的酶類物質，此后，研究人員從不同種屬蚯蚓體內分離提取了組成成份不完全相同的蚯蚓纖溶酶(earthwormfibrinolyticenzyme,EFE)。Φ丘蝴纖溶酶是一組絲氨酸蛋白水解酶，既具有直接溶解纖維蛋白的纖溶酶活性，又具有纖溶酶原激活活性；相對分子質量為20~40KD，實驗表明該酶具有抗凝、溶纖作用，可降低血小板粘附活性、溶解血栓。
[0005]80年代 后期，蚯蚓提取物的抗腫瘤作用開始得到我國少數科技工作者的關注。初步研究顯示，蚯蚓提取物對胃癌、肺癌、食管癌等多種腫瘤有一定程度的抑制作用。研究者進一步研究發現蚯蚓纖溶酶粗提物有抑制腫瘤細胞生長的作用。對其作用機制研究發現，它可以降低癌細胞的粘附性，抑制癌細胞與血管內皮細胞的粘附從而有效抑制癌細胞的遷移。此外，有研究工作者發現蚯蚓纖溶酶僅對癌細胞有抑制作用而對正常細胞沒有或僅有較弱的抑制作用。
【發明內容】
[0006]針對上述現有技術，本發明提供了一種新的抑制癌細胞的聯合用藥物。
[0007]本發明是通過以下技術方案實現的:
[0008]本發明的發明人通過實驗研發現，蚯蚓纖溶活性蛋白與紫杉醇聯合使用，可以在體外抑制腫瘤細胞生長，其特點是采用從蚯蚓體內提取分離純化出的純品纖溶活性蛋白與紫杉醇聯合作用，在體外應用于人乳腺癌細胞(MCF-7)，作用結果顯示:二者聯合作用時的抗腫瘤活性比兩種藥物單獨使用時的抗腫瘤活性之和相同或更強，且二者相互作用系數(CDI)〈1，表示二者聯合使用可發揮協同作用。因此，蚯蚓纖溶活性蛋白聯合紫杉醇可以用于制備抑制癌細胞的藥物。
[0009]所述蚯蚓纖溶活性蛋白，是從蚯蚓體內分離出的同時具有纖溶活性以及抗腫瘤活性的一種蛋白類物質，其制備方法如下:取新鮮蚯蚓，清洗干凈，加入蚯蚓質量I~4倍的水(優選二蒸水)，勻漿，靜置12小時，以便蚯蚓蛋白較為充分溶解；4000rpm離心20分鐘去除蚯蚓廢渣，得蛋白上清液；蛋白上清液用0°C硫酸銨鹽析(達到40%~60%飽和度)，離心，棄上清，得到的沉淀溶于水(優選二蒸水)中，得到蚯蚓纖溶活性蛋白粗提物，該粗提物經透析脫鹽、陰離子交換層析、凝膠過濾層析、凝膠柱脫鹽除雜操作，冷凍干燥成為固體粉末，并在分離過程中采用細胞實驗篩選活性蛋白，最終得到純化的蚯蚓纖溶活性蛋白(命名為D-5-S-2)。經電泳分析，該蚯蚓纖溶活性蛋白分子量在25kD左右。纖維蛋白平板實驗顯示，該蛋白具有很好的纖溶活性。
[0010]所述透析脫鹽截留分子量大于3500道爾頓，具體為:把透析袋(截留分子量>3500) 一端用夾子夾緊，將粗提物溶液過0.45 μ m濾器后置于夾好的透析袋中，蛋白液量不超過透析袋容積的2/3，將袋開口處用夾子密封，用二蒸水作透析介質，每隔2~4小時更換一次二蒸水，至使用氯化鋇溶液檢測透析介質時無法形成硫酸鋇沉淀即可。
[0011]所述陰離子交換層析具體為:將透析完全的蛋白粗提物溶液利用考馬斯亮藍法測蛋白濃度，過DEAE陰離子交換柱，上樣體積與柱體積相當，流動相A液為50MmpH8.0Tris-HCl 溶液，B 液為 IMNaCl50MmpH8.0Tris-HCl 溶液，流速為 2ml/min，梯度洗脫，收集5%~20%B液階段洗脫出的各個蛋白峰，以聚乙二醇20000溶液為透析介質進行濃縮脫鹽。考馬斯亮藍法測定蛋白濃度，計算各蛋白峰得率(即最終得到的蛋白峰的質量與最初上樣總蛋白質量的比值)。細胞實驗篩選活性，選擇活性和得率最高的蛋白(選擇原則為:得率相差不大時，選擇活性高的進一步分析，活性相差不大時，選擇得率高的進行實驗)進行下一步分析。結果見附圖1。
[0012]所述細胞實驗`篩選活性具體為:MCF_7細胞在細胞瓶內鋪滿(即達到瓶底面積的90%)時，傾去培養基，加入ImL0.25%胰酶消化，待細胞從瓶壁上脫落后，加入ImL培養基終止消化，lOOOrpm，離心5min，然后加入2mL培養基重懸，取10 μ L細胞懸液，稀釋至100 μ L，然后進行細胞計數，調整細胞密度為8*104/mL，以每孔100 μ L的比例將細胞懸液鋪至96孔板內，置于37°C，5%C02的培養箱內培養，12h后，將各個蛋白峰用培養基配制成適當濃度(50μ g/mLUOOy g/mL、200l.! g/mL)，吸凈96孔板內培養基，將蛋白藥液以每孔100微升的比例加入到各個孔中，每個濃度設立5個復孔，并設立空白對照組(即設5個孔，其內各加入100 μ L不含蛋白峰的培養基)，重新置于370C，5%C02的培養箱內培養，48小時后，對加藥組、對照組各孔內加入10微升CCK-8試劑，Ih后，以450nm為測定波長，670nm為參比波長，利用酶標儀測定吸光度值，根據公式:抑制率％= (Awa-AM)*100/Awa,計算抑制率百分t匕，抑制率％越高說明蛋白峰活性越好。結果見附圖2，各個蛋白峰抑制率比較圖，抑制活性最高的為DEAE-5號峰(簡稱D-5)。培養基為1640培養基，為現有技術中已有的常規培養基。
[0013]所述凝膠過濾層析具體為:濃縮脫鹽的D-5蛋白峰進行S200凝膠過濾層析，上樣體積2ml，流動相為0.15M氯化鈉溶液，流速為lml/min，收集蛋白峰，凍干濃縮，細胞實驗篩選活性(方法同陰離子交換柱細胞實驗活性篩選部分)，選擇活性和得率最高的蛋白(原則同上)進行下一步分析。結果見附圖3、4。[0014]所述凝膠柱脫鹽除雜具體為:采用GlO凝膠柱對上述篩選得到的具有活性的蛋白進行脫鹽操作，上樣量2ml,流動相為水(優選二蒸水),流速為lml/min,收集蛋白峰,凍干得固體粉末，即為蚯蚓纖溶活性蛋白(簡稱D-5-S-2)。
[0015]所述電泳分析采用SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳，具體為:將蚯蚓活性纖溶蛋白溶于二蒸水內，濃度為lmg/mL，按照5:1的比例加入6X上樣緩沖液使之最終變為IX。95°C，變性15min。配制濃縮膠以及12%的分離膠，在上樣孔內分別加入10微升(lmg/mL、
0.5mg/mL)的蛋白樣品、4微升的Marker。以甘氨酸-TRIS溶液為電泳緩沖液，以電壓為IlOV為條件，時間為1.5h。結束后將膠取出，采用考馬斯亮藍R-250染色液常溫染色lh，然后采用脫色液(乙醇:乙酸:水=1:1:8)進行脫色，蛋白條帶清晰可見。拍照成像。結果見附圖5。
[0016]所述纖維蛋白平板實驗測定纖溶活性，具體方法見2010版藥典第三部附錄ΧΠ重組鏈激酶生物活性測定法。結果見附圖6。
[0017]上述所用實驗術語均為所屬領域的常規術語，比如蛋白峰，其實際上表示的是蛋白峰所對應的洗脫液。
[0018]本發明還提供了一種抑制腫瘤細胞的聯合用藥物，包括蚯蚓纖溶活性蛋白以及紫杉醇，且任選的可以包括一種或多種可藥用載體。
[0019]所述蚯蚓纖溶活性蛋白以及紫杉醇的重量配比為80:1為佳。
[0020]所述可藥用載體為本領域技術人員所公知和常用的，如丸劑、片劑、膠囊劑等中的填充劑或載體物質，這些物質通常被保健專家認可用于這一目的且作為藥劑的非活性成分。
[0021 ] 所述聯合用藥物可以制成任意劑型。
[0022]應當理解，本發明所述的聯合使用包括以下兩種方式:
[0023]一是將蚯蚓纖溶活性蛋白及紫杉醇分別制成單獨的制劑，兩種制劑的劑型可以不同，并且紫杉醇可以采用其現有劑型。在使用時可以將這兩種藥物先后使用，也可以同時使用。將兩種藥物先后使用時，蚯蚓纖溶活性蛋白的單獨制劑可以首先使用。依次給藥時，給予第二種組分時第一種組分應該還未喪失其在體內的有效作用。
[0024]二是將蚯蚓纖溶蛋白及紫杉醇制成單一的復方制劑，使用時同時使用。
[0025]配制藥物組合物及使用時，需要產生作用的蚯蚓纖溶蛋白及紫杉醇的劑量可以改變，且最終由醫務人員決定，所考慮的因素包括患者年齡及疾病性質和嚴重程度。
[0026]就目前而言，紫杉醇的用藥方式多以靜脈注射為主(如力樸素、紫杉醇注射液等)，而類似于本發明中纖溶活性蛋白的蚯蚓纖溶酶給藥方式多為口服且多用于抗栓治療。本發明提到的纖溶活性蛋白目前在臨床上尚無用于治療腫瘤的例子。因而，在二者被制成單一的復方制劑時仍需要進行更多的分析研究。
[0027]本發明主要公開了一種新型聯合用藥方法，即蚯蚓纖溶活性蛋白與紫杉醇聯合使用在體外抑制腫瘤細胞生長。其特點是采用從蚯蚓體內提取分離純化出的純品纖溶活性蛋白與紫杉醇聯合作用，在體外應用于人乳腺癌細胞(MCF-7)。作用結果顯示:二者聯合作用時的抗腫瘤活性比兩種藥物單獨使用時的抗腫瘤活性之和相同或更強，且二者相互作用系數(CDI)〈1，表示二者聯合使用可發揮協同作用。這一聯合用藥的方法可以減少紫杉醇對正常細胞的損傷，取得了所 屬領域技術人員預料不到的技術效果。【專利附圖】
【附圖說明】
[0028]圖1:過陰離子交換柱(DEAE)后分離出的各個蛋白峰結果圖
[0029]圖2:過DEAE后各個蛋白峰抑制MCF-7細胞生長的活性比較
[0030]圖3:DEAE-5號峰過S200凝膠柱后的結果圖
[0031]圖4:DEAE-5號峰過S200凝膠柱后各個蛋白峰抑制MCF-7細胞生長的活性比較圖
[0032]圖5:純化的蚯蚓纖溶活性蛋白(D-5-S-2)電泳結果圖
[0033]圖6:純化的蚯蚓纖溶活性蛋白纖維蛋白平板實驗結果圖
[0034]圖7:蚯蚓纖溶活性蛋白粗提物與紫杉醇單獨及聯合使用48h后對人乳腺癌細胞(MCF-7)的抑制作用。
[0035]圖8:蚯蚓纖溶活性蛋白與紫杉醇單獨以及聯合使用24h后對人乳腺癌細胞(MCF-7)抑制作用。
[0036]圖9:蚯蚓纖溶活性蛋白與紫杉醇單獨以及聯合使用48h后對人乳腺癌細胞(MCF-7)抑制作用。
【具體實施方式】
[0037]下面結合實施例對本發明作進一步的說明。
[0038]實施例蚯蚓纖溶活性蛋白與紫杉醇聯合作用于人乳腺癌細胞(MCF-7)
[0039]1、蚯蚓纖溶活性蛋白粗提物聯合紫杉醇對MCF-7的作用
[0040](DMCF-7細胞傳代，0.25%胰酶消化后，加入培養基(1640培養基)終止消化，1000rpm,離心5分鐘，棄上清，將細胞用2mL培養基吹散，稀釋到一定濃度，按每孔6000個細胞鋪至96孔板內，待細胞貼壁完全后,準備加藥。
[0041](2)取新鮮蚯蚓50g，清洗干凈，加入蚯蚓質量2倍的二蒸水，勻漿，靜置12小時，以便蚯蚓蛋白較為充分溶解；4000rpm離心20分鐘去除蚯蚓廢渣，得蛋白上清液；蛋白上清液用0°C硫酸銨鹽析(達到40%~60%飽和度),離心,棄上清,得到的沉淀溶于二蒸水中，透析脫鹽后，凍干，得到蚯蚓纖溶活性蛋白粗提物。
[0042](3)將蚯蚓纖溶活性蛋白粗提物溶于適量超純水，考馬斯亮藍法測蛋白濃度，過
0.22濾器除菌，備用。
[0043](4)將蚯蚓纖溶活性蛋白以及紫杉醇按一定濃度梯度稀釋好(如表1所示)，每孔100 μ Lo每個濃度設四個復孔。
[0044]表1:蚯蚓纖溶活性蛋白粗提物以及紫杉醇加藥濃度
藥物濃度(Ug/mL)?23
蚯蚓纖溶活性蛋白 50100200
[0045]粗提物(EFP)
^紫杉醇(Tax)^ 0.5I2
二者聯合作用EFP 100+Tax I EFP 200+Tax I[0046](5)48小時后采用CCK-8法測定細胞存活率。結果見圖7。
[0047]結果顯示，蚯蚓纖溶活性蛋白粗提物有抑制MCF-7細胞生長的作用，而且與紫杉醇聯合使用時發揮協同作用，二者相互作用系數〈I。
[0048]2純化的蚯蚓纖溶活性蛋白聯合紫杉醇對MCF-7的作用
[0049]所述純化的蚯蚓纖溶活性蛋白是對上述蚯蚓纖溶活性蛋白粗提物進一步純化得到的:粗提物經透析脫鹽、陰離子交換層析、凝膠過濾層析、凝膠柱脫鹽除雜操作，并冷凍干燥成為固體粉末，即為蚯蚓纖溶活性蛋白。經電泳分析，該蚯蚓纖溶活性蛋白分子量在25kD左右。纖維蛋白平 板實驗顯示，該蛋白具有很好的纖溶活性。
[0050]所述透析脫鹽截留分子量大于3500道爾頓，具體為:把透析袋(截留分子量>3500) 一端用夾子夾緊，將粗提物溶液過0.45 μ m濾器后置于夾好的透析袋中，蛋白液量不超過透析袋容積的2/3，將袋開口處用夾子密封，用二蒸水作透析介質，每隔2~4小時更換一次二蒸水，至使用氯化鋇溶液檢測透析介質時無法形成硫酸鋇沉淀即可。
[0051]所述陰離子交換層析具體為:將透析完全的蛋白粗提物溶液利用考馬斯亮藍法測蛋白濃度，過DEAE陰離子交換柱，上樣體積與柱體積相當，流動相A液為50MmpH8.0Tris-HCl 溶液，B 液為 IMNaCl50MmpH8.0Tris-HCl 溶液，流速為 2ml/min，梯度洗脫，收集5%~20%B液階段洗脫出的各個蛋白峰，以聚乙二醇20000溶液為透析介質進行濃縮脫鹽。考馬斯亮藍法測定蛋白濃度，計算各蛋白峰得率(即最終得到的蛋白峰的質量與最初上樣總蛋白質量的比值)。細胞實驗篩選活性，選擇活性和得率最高的蛋白(選擇原則為:得率相差不大時，選擇活性高的進一步分析，活性相差不大時，選擇得率高的進行實驗)進行下一步分析。結果見附圖1。
[0052]所述細胞實驗篩選活性具體為:MCF_7細胞在細胞瓶內鋪滿(達到瓶底面積的90%)時，傾去培養基，加入ImL0.25%胰酶消化，待細胞從瓶壁上脫落后，加入ImL培養基終止消化，lOOOrpm，離心5min，然后加入2mL培養基重懸，取10 μ L細胞懸液，稀釋至100 μ L，然后進行細胞計數，調整細胞密度為8*104/mL，以每孔100 μ L的比例將細胞懸液鋪至96孔板內，置于37°C，5%C02的培養箱內培養，12h后，將各個蛋白峰用培養基配制成適當濃度(50μ g/mLUOOy g/mL、200l.! g/mL)，吸凈96孔板內培養基，將蛋白藥液以每孔100微升的比例加入到各個孔中，每個濃度設立5個復孔，并設立空白對照組(即設5個孔，其內各加入100 μ L不含蛋白峰的培養基)，重新置于370C，5%C02的培養箱內培養，48小時后，對加藥組、對照組各孔內加入10微升CCK-8試劑，Ih后，以450nm為測定波長，670nm為參比波長，利用酶標儀測定吸光度值，根據公式:抑制率％= (Αμ^-Α^^ΜΙΟΟ/Αμ.，計算抑制率百分t匕，抑制率％越高說明蛋白峰活性越好。結果見附圖2，各個蛋白峰抑制率比較圖，抑制活性最高的為DEAE-5號峰(簡稱D-5)。
[0053]所述凝膠過濾層析具體為:濃縮脫鹽的D-5蛋白峰進行S200凝膠過濾層析，上樣體積2ml，流動相為0.15M氯化鈉溶液，流速為lml/min，收集蛋白峰，凍干濃縮，細胞實驗篩選活性(方法同陰離子交換柱細胞實驗活性篩選部分)，選擇活性和得率最高的蛋白進行下一步分析。結果見附圖3、4。
[0054]所述凝膠柱脫鹽除雜具體為:采用GlO凝膠柱對上述篩選得到的具有活性的蛋白進行脫鹽操作，上樣量2ml，流動相為二蒸水，流速為lml/min，收集蛋白峰，凍干得固體粉末，即為蚯蚓纖溶活性蛋白(簡稱D-5-S-2)。[0055]所述電泳分析采用SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳，具體為:將蚯蚓活性纖溶蛋白溶于二蒸水內，濃度為lmg/mL，按照5:1的比例加入6X上樣緩沖液使之最終變為IX。95°C，變性15min。配制濃縮膠以及12%的分離膠，在上樣孔內分別加入10微升(lmg/mL、
0.5mg/mL)的蛋白樣品、4微升的Marker。以甘氨酸-TRIS溶液為電泳緩沖液，以電壓為IlOV為條件，時間為1.5h。結束后將膠取出，采用考馬斯亮藍R-250染色液常溫染色lh，然后采用脫色液(乙醇:乙酸:水=1:1:8)進行脫色，蛋白條帶清晰可見。拍照成像。結果見附圖5。
[0056]所述纖維蛋白平板實驗測定纖溶活性，具體方法見2010版藥典第三部附錄ΧΠ重組鏈激酶生物活性測定法。結果見附圖6。
[0057]其它操作同上述I各步驟。鋪兩塊96孔板。蚯蚓纖溶活性蛋白以及紫杉醇的濃度配比關系如表2所示。
[0058]表2:蚯蚓纖溶活性蛋白以及紫杉醇加藥濃度
【權利要求】
1.蚯蚓纖溶活性蛋白，其特征在于:是通過以下方法制備得到的:取新鮮蚯蚓，清洗干凈，加入蚯蚓質量1~4倍的水，勻衆，靜置12小時；4000rpm離心20分鐘得蛋白上清液；蛋白上清液用0°C硫酸銨鹽析，離心，棄上清，得到的沉淀溶于水中，得到蚯蚓纖溶活性蛋白粗提物，該粗提物經透析脫鹽、陰離子交換層析、凝膠過濾層析、凝膠柱脫鹽除雜操作，冷凍干燥成為固體粉末，并在分離過程中采用細胞實驗篩選活性蛋白，最終得到純化的蚯蚓纖溶活性蛋白； 所述透析脫鹽截留分子量大于3500道爾頓； 所述陰離子交換層析具體為:將透析完全的蛋白粗提物溶液過DEAE陰離子交換柱，上樣體積與柱體積相當，流動相A液為50MmpH8.0Tris-HCl溶液，B液為IMNaCl50MmpH8.0Tris-HCl溶液，梯度洗脫，收集5%~20%B液階段洗脫出的各個蛋白峰，以聚乙二醇20000溶液為透析介質進行濃縮脫鹽；考馬斯亮藍法測定蛋白濃度，計算各蛋白峰得率，并進行細胞實驗篩選活性，選擇活性和得率最高的蛋白，選擇原則為:得率相差不大時，選擇活性高的，活性相差不大時，選擇得率高的；選擇后，進行下一步凝膠過濾層析； 所述凝膠過濾層析具體為:上述選擇的活性和得率最高的蛋白進行S200凝膠過濾層析，流動相為0.15M氯化鈉溶液，收集蛋白峰，凍干濃縮，細胞實驗篩選活性，選擇活性和得率最高的蛋白，進行下一步凝膠柱脫鹽； 所述凝膠柱脫鹽除雜具體為:采用GlO凝膠柱對上述篩選得到的蛋白進行脫鹽操作，流動相為水，收集蛋白峰，凍干得固體粉末，即為蚯蚓纖溶活性蛋白。
2.根據權利要求1所述的蚯蚓纖溶活性蛋白，其特征在于:所述細胞實驗篩選活性的方法具體為:MCF-7細胞在細胞瓶內鋪滿時，傾去培養基，加入ImL0.25%胰酶消化，待細胞從瓶壁上脫落后，加入ImL培養基終止消化，1000rpm,離心5min,然后加入2mL培養基重懸，取10 μ L細胞懸液，稀釋至100 μ L，然后進行細胞計數，調整細胞密度為8*104/mL，以每孔100 μ L的比例將細胞懸液鋪至96孔板內，置于37°C，5%C02的培養箱內培養，12h后，將各個蛋白峰用培養基配制成適當濃度，吸凈96孔板內培養基，將蛋白藥液以每孔100微升的比例加入到各個孔中，重新置于37°C，5%C02的培養箱內培養，48小時后，各孔內加入10微升CCK-8試劑，Ih后，以450nm為測定波長，670nm為參比波長，利用酶標儀測定吸光度值，計算各蛋白峰的抑制率百分比。
3.權利要求1所述的蚯蚓纖溶活性蛋白的制備方法，其特征在于:取新鮮蚯蚓，清洗干凈，加入蚯蚓質量I~4倍的水，勻漿，靜置12小時；4000rpm離心20分鐘得蛋白上清液；蛋白上清液用0°C硫酸銨鹽析，離心，棄上清，得到的沉淀溶于水中，得到蚯蚓纖溶活性蛋白粗提物，該粗提物經透析脫鹽、陰離子交換層析、凝膠過濾層析、凝膠柱脫鹽除雜操作，冷凍干燥成為固體粉末，并在分離過程中采用細胞實驗篩選活性蛋白，最終得到純化的蚯蚓纖溶活性蛋白； 所述透析脫鹽截留分子量大于3500道爾頓； 所述陰離子交換層析具體為:將透析完全的蛋白粗提物溶液過DEAE陰離子交換柱，上樣體積與柱體積相當，流動相A液為50MmpH8.0Tris-HCl溶液，B液為IMNaCl50MmpH8.0Tris-HCl溶液，梯度洗脫，收集5%~20%B液階段洗脫出的各個蛋白峰，以聚乙二醇20000溶液為透析介質進行濃縮脫鹽；考馬斯亮藍法測定蛋白濃度，計算各蛋白峰得率，并進行細胞實驗篩選活性，選擇活性和得率最高的蛋白，選擇原則為:得率相差不大時，選擇活性高的，活性相差不大時，選擇得率高的；選擇后，進行下一步凝膠過濾層析； 所述凝膠過濾層析具體為:上述選擇的活性和得率最高的蛋白進行S200凝膠過濾層析，流動相為0.15M氯化鈉溶液，收集蛋白峰，凍干濃縮，細胞實驗篩選活性，選擇活性和得率最高的蛋白，進行下一步凝膠柱脫鹽； 所述凝膠柱脫鹽除雜具體為:采用GlO凝膠柱對上述篩選得到的蛋白進行脫鹽操作，流動相為水，收集蛋白峰，凍干得固體粉末，即為蚯蚓纖溶活性蛋白。
4.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于:所述細胞實驗篩選活性的方法具體為:MCF-7細胞在細胞瓶內鋪滿時，傾去培養基，加入ImL0.25%胰酶消化，待細胞從瓶壁上脫落后，加入ImL培養基終止消化，1000rpm,離心5min,然后加入2mL培養基重懸,取10 μ L細胞懸液，稀釋至100 μ L，然后進行細胞計數，調整細胞密度為8*104/mL，以每孔100 μ L的比例將細胞懸液鋪至96孔板內，置于37°C，5%C02的培養箱內培養，12h后，將各個蛋白峰用培養基配制成適當濃度，吸凈96孔板內培養基，將蛋白藥液以每孔100微升的比例加入到各個孔中，重新置于37°C，5%C02的培養箱內培養，48小時后，各孔內加入10微升CCK-8試劑，Ih后，以450nm為測定波長，670nm為參比波長，利用酶標儀測定吸光度值，計算各蛋白峰的抑制率百分比。
5.權利要求1所述的蚯蚓纖 溶活性蛋白聯合紫杉醇在制備治療抑制癌細胞的藥物中的應用。
6.一種抑制腫瘤細胞的聯合用藥物，其特征在于:包括權利要求1所述的蚯蚓纖溶活性蛋白以及紫杉醇，且任選的可以包括一種或多種可藥用載體。
7.根據權利要求6所述的抑制腫瘤細胞的聯合用藥物，其特征在于:所述蚯蚓纖溶活性蛋白與紫杉醇的重量配比為80:1。
【文檔編號】A61P35/00GK103755801SQ201410029654
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年1月22日 優先權日:2014年1月22日
【發明者】吉愛國, 陳曉彤, 宋淑亮, 梁浩 申請人:山東大學（威海）