一種具有微流體通道的血管化組織結(jié)構(gòu)及其制備方法

一種具有微流體通道的血管化組織結(jié)構(gòu)及其制備方法
【專利摘要】一種具有微流體通道的血管化組織結(jié)構(gòu)及其制備方法，屬于組織工程及復(fù)合材料成形【技術(shù)領(lǐng)域】。該血管化組織結(jié)構(gòu)包括組織結(jié)構(gòu)主體、分支血管部分、毛細血管層和保護層。本發(fā)明實現(xiàn)稀溶液、細胞和水凝膠的復(fù)合成形。組織結(jié)構(gòu)主體由含細胞的水凝膠噴射而成，水凝膠網(wǎng)格間分布了含或不含細胞的稀溶液；分支血管孔道由含細胞的水凝膠預(yù)留，孔道內(nèi)分布了含或不含細胞的稀溶液，分支血管管壁為多孔結(jié)構(gòu)；毛細血管層由合成高分子稀溶液噴涂或噴射形成，或由含細胞的稀溶液噴涂或噴射形成；支撐部分與保護層部分由合成或天然高分子溶液堆積成形；成形結(jié)構(gòu)體兩端有血管接口或呈開放式多通道，可用于體內(nèi)移植或體外培養(yǎng)，促使血管化的發(fā)展。
【專利說明】一種具有微流體通道的血管化組織結(jié)構(gòu)及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種具有微流體通道的血管化組織結(jié)構(gòu)及其制備方法，屬于組織工程及復(fù)合材料成形【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]組織工程技術(shù)與器官制造技術(shù)為人類組織器官的修復(fù)再造提供了可能，其中涉及到生物學(xué)、材料學(xué)、機械學(xué)等學(xué)科。目前已經(jīng)能夠再造骨、軟骨、皮膚、肝臟、肌肉、等組織或器官前體，但器官制造的技術(shù)尚處于發(fā)展階段，急需解決血管化的問題，因為血管在器官中正常發(fā)揮新陳代謝的作用是器官制造的前提。
[0003]快速成形(RP,Rapid Prototyping)技術(shù)又叫增材制造(AM, AdditiveManufacturing),利用材料的逐層堆積實現(xiàn)結(jié)構(gòu)體的成形。國外許多科研組已實現(xiàn)基于RP技術(shù)的含細胞三維結(jié)構(gòu)體的組裝或打印，如美國克萊姆森大學(xué)的三維噴墨生物打印技術(shù)[Boland T, et al.Biotechnology journal, 2006, I (9): 910]、美國亞利桑那大學(xué)的三維直寫生物打印技術(shù)[Cooper GM, et al.Tissue Engineering Part
A,2010, 16(5):1749]以及荷蘭烏德勒支大學(xué)醫(yī)學(xué)中心的三維纖維沉積技術(shù)[FedorovichNE, et al.Tissue Engineering Part C, 2011，18 (I): 33]等。國內(nèi)清華大學(xué)器官制造中心(Center of Organ Manufacturing)開發(fā)出熔融擠壓設(shè)備、單(雙)頭噴頭(針頭)低溫沉積成形設(shè)備，并成功制備出了簡單的血管網(wǎng)、肝組織和骨修復(fù)材料等[Wang XH, etal.Trends in Biotechnology, 2007, 25:505 ；ffang XH, et al.Tissue Engineering Part
B,2010,16:189;ffangXH.Artificial organs, 2012，36:591]。
[0004]快速成形技術(shù)`也可用于制備宏觀多孔的結(jié)構(gòu)，這種鏤空結(jié)構(gòu)的制備大大節(jié)約了材料。國內(nèi)中國科技大學(xué)和大連理工大學(xué)利用快速成形三維打印技術(shù)制備了多孔殼體(skin-frame structure),這種殼體為類祐1架的鏤空結(jié)構(gòu)，既節(jié)約了原材料(塑料)，又能保證原始性狀和力學(xué)性能[Wang W，et al.ACM Transactions onGraphics (TOG), 2013, 32 (6): 177] 0意大利比薩大學(xué)的Vozzi G等人利用微注射的方法，制備了六邊形網(wǎng)格，成形結(jié)構(gòu)精確[Vozzi G, et al.Tissue Engineering, 2002, 8 (6): 1089-1098]。上述制備鏤空結(jié)構(gòu)的制備方法尚局限于合成高分子材料領(lǐng)域，在生物和水凝膠體系的應(yīng)用少有提及；未來，鏤空的水凝膠結(jié)構(gòu)的應(yīng)用將提高營養(yǎng)液在結(jié)構(gòu)體中的交換速度。
[0005]微流體技術(shù)(MT, Microfluidics Technology)能在能在微觀尺寸下控制、操作和檢測復(fù)雜的流體，近年來在與微機械、生物工程等領(lǐng)域的交叉中進展迅速，芯片實驗室(Lab on a chip)也應(yīng)運而生。英國拉夫堡大學(xué)Capel AJ等人總結(jié)了五種快速成形技術(shù)在流體化學(xué)反應(yīng)的應(yīng)用，并提出制備小型反應(yīng)器的制備[Capel AJ, et al.Lab on aChip, 2013，13(23):4583]。將快速成形技術(shù)與為流體技術(shù)結(jié)合是解決人造血管化組織的研究熱點。美國賓夕法尼亞大學(xué)的Miller JS等人制備了三維的可溶解糖纖維支架，通入血液模擬剪切力的作用，完成了內(nèi)皮細胞在血管通道的黏附，具有了初步的血管功能[MillerJS, et al.Nature materials, 2012, 11 (9): 768]。但是制備糖纖維支架費時費力，并且精度和幾何復(fù)雜度也受到限制。
[0006]專利(申請?zhí)?01210324600.4)提出了用旋轉(zhuǎn)組合模具制備紡錘狀復(fù)雜器官前體的方法，該方法通過模具的相對轉(zhuǎn)動得到成形體外圍的弧線，通過灌注方法得到成形體的主體，通過模具得到分支通道。但該方法的成形體外部形狀難以精確保證；分支通道的路徑可控性不強，分支通道的多重分支難以保證；成形體的中部未做處理，不易形成毛細血管，該方法的操作穩(wěn)定性和結(jié)構(gòu)復(fù)雜性有待提升。
[0007]通過以上分析，利用再生醫(yī)學(xué)原理來構(gòu)建體外組織器官已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)和工程領(lǐng)域的研究熱點?，F(xiàn)有的快速成形和器官制造技術(shù)并不能制備出帶微血管系統(tǒng)的可與人體動靜脈血管直接連接的血管化組織器官結(jié)構(gòu)。同時，微流體技術(shù)為分支血管和血管化的應(yīng)用提供了很大可行性。這些因素促使我們利用復(fù)合多噴頭快速成形技術(shù)制備具有微流體通道的血管化組織結(jié)構(gòu)，實現(xiàn)高分子溶液、含細胞的水凝膠和含細胞的稀溶液多種材料的復(fù)合成形；分布于主體結(jié)構(gòu)間和分支血管間的溶液有助于營養(yǎng)物質(zhì)交換，毛細血管層模擬了體內(nèi)毛細血管形態(tài)，本發(fā)明為制造含分支血管的器官和組織提供了參考。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的是提供一種具有微流體通道的血管化組織結(jié)構(gòu)及其制備方法，使其更好的模擬體內(nèi)分支血管和毛細血管的形態(tài)，從而有助于營養(yǎng)物質(zhì)的交換和細胞貼附。
[0009]一種具有微流體通道的血管化組織結(jié)構(gòu)，其特征在于:所述血管化組織結(jié)構(gòu)包括組織結(jié)構(gòu)主體、分支血管、毛細血管層和保護層；所述的分支血管分布于組織結(jié)構(gòu)主體內(nèi)部；所述毛細血管層位于組織結(jié)構(gòu)主體內(nèi)部，將組織結(jié)構(gòu)主體和分支血管分為兩部分，并分別與分支血管構(gòu)成一體；所述保護層位于組織結(jié)構(gòu)主體外部；所述的組織結(jié)構(gòu)主體為逐層堆積的含細胞的天然高分子水凝膠的交叉結(jié)構(gòu)，該交叉結(jié)構(gòu)的網(wǎng)格間和層間分布有能維持細胞生存的稀溶液，該稀溶液含有或不含細胞，并呈微流體狀態(tài)；分支血管管壁為類祐1架或類碳納米管的天然高分子水凝膠結(jié)構(gòu)；分支血管孔道內(nèi)分布有能維持細胞生存的稀溶液，該稀溶液含或不含細胞，呈層流態(tài)；分支血管含至少一個入口和至少一個出口，入口和出口與體內(nèi)血管或生物反應(yīng)器相`連；所述的毛細血管層為含細胞的且能維持細胞生存的稀溶液，該細胞形成毛細血管內(nèi)皮網(wǎng)眼結(jié)構(gòu)，或為不含細胞的合成高分子溶液，經(jīng)萃取有機溶劑后形成多孔結(jié)構(gòu)；所述的保護層為天然或合成高分子。
[0010]上述技術(shù)方案中，所述組織結(jié)構(gòu)主體交叉結(jié)構(gòu)的網(wǎng)格間和層間分布的能維持細胞生存的稀溶液為磷酸鹽緩沖液、細胞培養(yǎng)基、生理鹽水和體液中的至少一種。所述分支血管孔道內(nèi)分布的能維持細胞生存的稀溶液為磷酸鹽緩沖液、細胞培養(yǎng)基、生理鹽水和體液中的至少一種。所述毛細血管層的含細胞的且能維持細胞生存的稀溶液為磷酸鹽緩沖液、細胞培養(yǎng)基、生理鹽水和體液中的至少一種。所述毛細血管層的不含細胞的合成高分子溶液的溶質(zhì)為聚氨酯、聚己內(nèi)酯、聚碳酸酯、聚乙二醇、聚乳酸-羥基乙酸共聚物、聚酯和聚羥基酸酯中至少一種；該合成高分子溶液的溶劑為四乙二醇或1，4- 二氧六環(huán)，合成高分子溶液的質(zhì)量體積濃度為0.1~10%。
[0011]本發(fā)明所述的分支血管孔徑為0.01~5mm。所述毛細血管層層厚為0.01~20mm。所述的保護層的合成高分子為聚氨酯、聚己內(nèi)酯、聚碳酸酯、聚乙二醇、聚乳酸-羥基乙酸共聚物、聚酯和聚羥基酸酯中的至少一種；該合成高分子稀溶液的溶劑為四乙二醇或1，4- 二氧六環(huán)，合成高分子稀溶液的質(zhì)量體積濃度為0.1~30%。所述細胞為成體組織細胞、成體干細胞、胚胎干細胞、誘導(dǎo)多能干細胞的至少一種。
[0012]本發(fā)明提供的一種具有微流體通道的血管化組織結(jié)構(gòu)的制備方法，其特征在于該方法包括如下步驟:
[0013]I)利用計算機設(shè)計所述具有微流體通道的血管化組織結(jié)構(gòu)的三維模型；
[0014]2)采用復(fù)合多噴頭快速成形設(shè)備，成形室溫度控制在40°C~_30°C ;該設(shè)備噴頭組件包括擠壓式噴頭、滴加式噴頭和噴灑式噴頭；將配置好的含細胞的天然高分子水凝膠、含或不含細胞的能維持細胞生存的稀溶液和合成高分子溶液分別裝入不同類型的噴頭組件中；
[0015]3)采用擠壓式噴頭組件打印至少一層天然高分子水凝膠或合成高分子溶液，得到支撐部分；
[0016]4)采用擠壓式噴頭組件打印至少一層所述含細胞的天然高分子水凝膠，得到水凝膠的交叉結(jié)構(gòu)，然后采用滴加式噴頭組件滴加或噴灑式噴頭組件噴灑含或不含細胞的且能維持細胞生存的稀溶液，使該稀溶液分布于交叉結(jié)構(gòu)的網(wǎng)格間和層間，得到組織結(jié)構(gòu)主體；
[0017]5)采用擠壓式噴頭組件打印至少一層所述含細胞的天然高分子水凝膠，得到水凝膠的類桁架或碳納米管結(jié)構(gòu)分支血管壁，再采用滴加式噴頭組件滴加或噴灑式噴頭組件噴灑含或不含細胞的 且能維持細胞生存的稀溶液，使該稀溶液分布于類桁架或類碳納米管孔道內(nèi)，得到分支血管；
[0018]6)采用滴加式噴頭組件滴加或噴灑式噴頭組件噴灑不含細胞的合成高分子稀溶液，并萃取有機溶劑，或采用滴加式噴頭組件滴加或噴灑式噴頭組件噴灑含細胞的且能使細胞生存的稀溶液，形成毛細血管層；
[0019]7)采用擠壓式噴頭組件打印至少一層或噴灑式噴頭組件噴灑合成高分子溶液于組織結(jié)構(gòu)主體外部，并萃取有機溶劑，得到保護層；
[0020]8)重復(fù)步驟4)、5)和7)，成形過程結(jié)束后移除支撐部分，最終得到所述具有微流體通道的血管化組織結(jié)構(gòu)。
[0021]本發(fā)明所述的制備方法，其特征在于:所述擠壓式噴頭噴嘴內(nèi)徑為10~ΙΟΟΟμπι ;所述滴加式噴頭噴嘴內(nèi)徑為10~100 μ m ;所述噴灑式噴頭噴嘴噴涂范圍為0.01~10cm2。所述組織結(jié)構(gòu)主體、分支血管和支撐部分的天然高分子水凝膠為質(zhì)量體積濃度為0.5~10%的海藻酸鈉、質(zhì)量體積濃度為0.5~10%的膠原、質(zhì)量體積濃度為0.5~10%的基質(zhì)膠、質(zhì)量體積濃度為I~20%的右旋糖、質(zhì)量體積濃度為0.5~5%的纖維蛋白原和質(zhì)量體積濃度為5~30%的明膠中的至少一種。
[0022]本發(fā)明所述的制備方法，其特征在于:所述支撐部分的合成高分子為聚氨酯、聚己內(nèi)酯、聚碳酸酯、聚乙二醇、聚乳酸-羥基乙酸共聚物、聚酯和聚羥基酸酯中的至少一種；合成高分子的溶劑為四乙二醇或1，4-二氧六環(huán)；合成高分子稀溶液的質(zhì)量體積濃度為0.1~40%。
[0023]本發(fā)明所述的制備方法，其特征在于:成形室溫度在-30~4°C時，含細胞的天然高分子水凝膠和能維持細胞生存的稀溶液中需加入凍存劑，凍存劑為體積百分濃度為1%~20%的二甲基亞砜、體積百分濃度為1%~20%的甘油和質(zhì)量體積濃度1%~20%右旋糖中的至少一種；成形后三維結(jié)構(gòu)體在_80°C及其以下的溫度保存，擇時復(fù)蘇。
[0024]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，有以下優(yōu)點及突出性的技術(shù)效果:①本發(fā)明的組織結(jié)構(gòu)主體天然高分子水凝膠交叉結(jié)構(gòu)網(wǎng)格間和層間分布有含或不含細胞且能維持細胞生存的稀溶液，該稀溶液形成微流體狀態(tài)，便于營養(yǎng)物質(zhì)交換；交叉結(jié)構(gòu)的網(wǎng)格間和層間溶液在結(jié)構(gòu)體內(nèi)連通，有助于營養(yǎng)物質(zhì)的交換和細胞貼附。②本發(fā)明的分支血管管壁為類桁架或類碳納米管的天然高分子水凝膠結(jié)構(gòu)，便于營養(yǎng)物質(zhì)交換和細胞貼附；分支血管孔道內(nèi)分布有能維持細胞生存的稀溶液，該稀溶液含或不含細胞，呈層流態(tài)，便于營養(yǎng)物質(zhì)交換；分支血管的入口和出口能與脈動培養(yǎng)系統(tǒng)或體內(nèi)血管鏈接。③本發(fā)明的毛細血管層與分支血管鏈接模擬了體內(nèi)血管的交換區(qū)域，且毛細血管層的毛細血管內(nèi)皮網(wǎng)眼結(jié)構(gòu)或合成高分子多孔結(jié)構(gòu)為模擬了體內(nèi)毛細血管的形態(tài)，便于營養(yǎng)物質(zhì)交換。④本發(fā)明的保護層對組織結(jié)構(gòu)內(nèi)部起著物理、化學(xué)和生物上的保護作用；能夠維持組織結(jié)構(gòu)體的穩(wěn)定。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1為具有微流體通道的血管化組織結(jié)構(gòu)的截面示意圖。
[0026]圖2為未移除支撐部分的具有微流體通道的血管化組織結(jié)構(gòu)截面圖。
[0027]圖3a、圖3b和為圖3c分別為擠壓式噴頭組件、滴加式噴頭組件和噴灑式噴頭組件的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0028]圖4為組織結(jié)構(gòu)主體的交叉結(jié)構(gòu)。
[0029]圖5為含細胞的且能維持細胞生存的稀溶液。
[0030]圖6a、圖6b和圖6c分別為分支血管、分支血管管壁的類碳納米管結(jié)構(gòu)和分支血管管壁的類桁架結(jié)構(gòu)。
[0031]圖7為呈多孔結(jié)構(gòu)的毛細血管層。
[0032]圖中:
[0033]101—組織結(jié)構(gòu)主體；102—分支血管； 103—毛細血管層；
[0034]104—保護層；105—支撐部分；
[0035]301一擠壓式噴頭組件噴嘴；302—擠出的材料；303—滴加式噴頭組件噴嘴；
[0036]304一滴加的材料；305—噴灑式噴嘴；306—噴灑的材料。
【具體實施方式】
[0037]下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明進一步說明。
[0038]圖1為具有微流體通道的血管化組織結(jié)構(gòu)的截面示意圖，所述血管化組織結(jié)構(gòu)包括組織結(jié)構(gòu)主體101、分支血管102、毛細血管層103和保護層104 ;所述的分支血管102分布于組織結(jié)構(gòu)主體101內(nèi)部；所述毛細血管層103位于組織結(jié)構(gòu)主體101內(nèi)部，將組織結(jié)構(gòu)主體101和分支血管102分為兩部分，并分別與分支血管102構(gòu)成一體；所述保護層104位于組織結(jié)構(gòu)主體101外部；所述的組織結(jié)構(gòu)主體101為逐層堆積的含細胞的天然高分子水凝膠的交叉結(jié)構(gòu)，該交叉結(jié)構(gòu)的網(wǎng)格間和層間分布有能維持細胞生存的稀溶液，該稀溶液含有或不含細胞，并呈微流體狀態(tài)，如圖4 ;分支血管102管壁為類祐1架或類碳納米管的天然高分子水凝膠結(jié)構(gòu)，如圖6 ;分支血管102孔道內(nèi)分布有能維持細胞生存的稀溶液，該稀溶液含或不含細胞，呈層流態(tài)；分支血管102含至少一個入口和至少一個出口，入口和出口與體內(nèi)血管或生物反應(yīng)器相連；所述的毛細血管層103為含細胞的且能維持細胞生存的稀溶液，該細胞形成如圖7的毛細血管內(nèi)皮網(wǎng)眼結(jié)構(gòu)，或為不含細胞的合成高分子溶液，經(jīng)萃取有機溶劑后形成多孔結(jié)構(gòu)；所述的保護層104為天然或合成高分子。
[0039]所述組織結(jié)構(gòu)主體交叉結(jié)構(gòu)的網(wǎng)格間和層間分布的能維持細胞生存的稀溶液為磷酸鹽緩沖液、細胞培養(yǎng)基、生理鹽水和體液中的至少一種。所述分支血管孔道內(nèi)分布的能維持細胞生存的稀溶液為磷酸鹽緩沖液、細胞培養(yǎng)基、生理鹽水和體液中的至少一種。所述毛細血管層的含細胞的且能維持細胞生存的稀溶液為磷酸鹽緩沖液、細胞培養(yǎng)基、生理鹽水和體液中的至少一種。所述毛細血管層的不含細胞的合成高分子溶液的溶質(zhì)為聚氨酯、聚己內(nèi)酯、聚碳酸酯、聚乙二醇、聚乳酸-羥基乙酸共聚物、聚酯和聚羥基酸酯中至少一種；該合成高分子溶液的溶劑為四乙二醇或1，4- 二氧六環(huán)，合成高分子溶液的質(zhì)量體積濃度為0.1~10%。所述分支血管孔徑為0.01~5mm。所述毛細血管層層厚為0.01~20mm。所述的保護層的合成高分子為聚氨酯、聚己內(nèi)酯、聚碳酸酯、聚乙二醇、聚乳酸-羥基乙酸共聚物、聚酯和聚羥基酸酯中的至少一種；該合成高分子稀溶液的溶劑為四乙二醇或1，4_ 二氧六環(huán)，合成高分子稀溶液的質(zhì)量體積濃度為0.1~30%。所述細胞為成體組織細胞、成體干細胞、胚胎干細胞、誘導(dǎo)多能干細胞的至少一種。
[0040]圖2為未移除支撐部分的具有微流體通道的血管化組織結(jié)構(gòu)截面圖，成形過程結(jié)束后移除支撐結(jié)構(gòu)。所述支撐部分的合成高分子為聚氨酯、聚己內(nèi)酯、聚碳酸酯、聚乙二醇、聚乳酸-羥基乙酸共聚物、聚酯和聚羥基酸酯中的至少一種；合成高分子的溶劑為四乙二醇或1，4- 二氧六環(huán)；合成高分子稀溶液的質(zhì)量體積濃度為0.1~40%。
[0041]本發(fā)明提供的一種具有微流體通道的血管化組織結(jié)構(gòu)的制備方法，其特征在于該方法包括如下步驟:1)利用計算機設(shè)計所述具有微流體通道的血管化組織結(jié)構(gòu)的三維模型；2)采用復(fù)合多噴頭快速成形設(shè)備，成形室溫度控制在40°C~-30°c;該設(shè)備噴頭組件包括擠壓式噴頭、滴加式噴頭和噴灑式噴頭；將配置好的含細胞的天然高分子水凝膠、含或不含細胞的能維持細胞生存的稀溶液和合成高分子溶液分別裝入不同類型的噴頭組件中；3)采用擠壓式噴頭組件打印 至少一層天然高分子水凝膠或合成高分子溶液，得到支撐部分；
4)采用擠壓式噴頭組件打印至少一層所述含細胞的天然高分子水凝膠，得到水凝膠的交叉結(jié)構(gòu)，然后采用滴加式噴頭組件滴加或噴灑式噴頭組件噴灑含或不含細胞的且能維持細胞生存的稀溶液，使該稀溶液分布于交叉結(jié)構(gòu)的網(wǎng)格間和層間，得到組織結(jié)構(gòu)主體；5)采用擠壓式噴頭組件打印至少一層所述含細胞的天然高分子水凝膠，得到水凝膠的類桁架或碳納米管結(jié)構(gòu)分支血管壁，再采用滴加式噴頭組件滴加或噴灑式噴頭組件噴灑含或不含細胞的且能維持細胞生存的稀溶液，使該稀溶液分布于類桁架或類碳納米管孔道內(nèi)，得到分支血管；6)采用滴加式噴頭組件滴加或噴灑式噴頭組件噴灑不含細胞的合成高分子稀溶液，并萃取有機溶劑，或采用滴加式噴頭組件滴加或噴灑式噴頭組件噴灑含細胞的且能使細胞生存的稀溶液，形成毛細血管層；7)采用擠壓式噴頭組件打印至少一層或噴灑式噴頭組件噴灑合成高分子溶液于組織結(jié)構(gòu)主體外部，并萃取有機溶劑，得到保護層；8)重復(fù)步驟4)、5)和7)，成形過程結(jié)束后移除支撐部分，最終得到所述具有微流體通道的血管化組織結(jié)構(gòu)。上述步驟3)~8)可先后或同步，以實現(xiàn)所述具有微流體通道的血管化組織結(jié)構(gòu)的
[0042]圖3a、圖3b和為圖3c分別為擠壓式噴頭組件301、滴加式噴頭組件303和噴灑式噴頭組件305的結(jié)構(gòu)示意圖。所述擠壓式噴頭噴嘴內(nèi)徑為10~1000 μ m ;所述滴加式噴頭噴嘴內(nèi)徑為10~IOOym ;所述噴灑式噴頭噴嘴噴涂范圍為0.01~10cm2。
[0043]本發(fā)明所述的組織結(jié)構(gòu)主體、分支血管和支撐部分的天然高分子水凝膠為質(zhì)量體積濃度為0.5~10%的海藻酸鈉、質(zhì)量體積濃度為0.5~10%的膠原、質(zhì)量體積濃度為
0.5~10%的基質(zhì)膠、質(zhì)量體積濃度為I~20%的右旋糖、質(zhì)量體積濃度為0.5~5%的纖維蛋白原和質(zhì)量體積濃度為5~30%的明膠中的至少一種。成形室溫度在-30~4°C時，含細胞的天然高分子水凝膠和能維持細胞生存的稀溶液中需加入凍存劑，凍存劑為體積百分濃度為1%~20%的二甲基亞砜、體積百分濃度為1%~20%的甘油和質(zhì)量體積濃度1%~20%右旋糖中的至少一種；成形后三維結(jié)構(gòu)體在_80°C及其以下的溫度保存，擇時復(fù)蘇。
[0044]下面舉出幾個具體的實施例，以進一步理解本發(fā)明。
[0045]實施例1:制備具有微流體通道的血管化肝組織
[0046](I)細胞的提取:提取人體脂肪干細胞(ADSC)和肝細胞(Hep)，培養(yǎng)傳代。
[0047](2)水凝膠的制備:將明膠和海藻酸鈉粉末分別溶于培養(yǎng)液(DMEM，dulbeCC0' smodified eagle medium)中，得到質(zhì)量體積濃度為10%的明膠溶液和質(zhì)量體積濃度為2%的海藻酸鈉溶液，以上述明膠溶液、海藻酸鈉溶液等體積混合得到水凝膠待用。
[0048](3)合成高分子溶液的制備:將可降解聚碳酸酯溶于四乙二醇中得到質(zhì)量體積濃度為2%和質(zhì)量體積濃度為25%的溶液待用。
[0049](4)含細胞的基質(zhì)材料的制備:將肝細胞Ofep)、二甲基亞砜凍存劑和上述水凝膠材料溶液混合，水凝膠溶液的肝細胞OfeP)濃度為I X IO6個/mL，二甲基亞砜凍存劑體積濃度為10%;將脂肪干細胞(`ADSC)、二甲基亞砜凍存劑和DMEM培養(yǎng)液混合，DMEM稀溶液的ADSC濃度為2 X IO5個/mL，二甲基亞砜凍存劑的體積濃度為10%。
[0050](5)成形過程:由計算機控制快速成形設(shè)備的運動，成形室溫度設(shè)置為_20°C，其中一個噴頭組件采用擠壓式噴頭組件打印含Hep的水凝膠，一噴頭組件利用滴加式噴頭組件滴加含ADSC的DMEM稀溶液，形成組織結(jié)構(gòu)主體、分支血管和毛細血管層；一噴頭組件采用擠壓式噴頭組件打印質(zhì)量體積濃度為2%聚碳酸酯，形成保護層；一噴頭組件采用擠壓式噴頭組件打印質(zhì)量體積濃度為25%聚碳酸酯，形成支撐部分；成形結(jié)束后，解凍復(fù)蘇，并利用質(zhì)量體積濃度為5%的CaCl2交聯(lián)海藻酸鈉2min。
[0051](6)后期培養(yǎng):采用脈動反應(yīng)器培養(yǎng)上述成形結(jié)構(gòu)，采用血管化生長因子使得血管種子細胞ADSC內(nèi)皮化，并在毛細血管層實現(xiàn)血管化。
[0052]實施例2:制備具有微流體通道的血管化脂肪組織
[0053](I)細胞的提取:提取人體脂肪干細胞(ADSC)，培養(yǎng)傳代。
[0054](2)水凝膠的制備:將天然高分子材料粉末溶于DMEM培養(yǎng)液，得到質(zhì)量體積濃度為20%的明膠溶液、質(zhì)量體積濃度為1%的纖維蛋白原溶液，以上述明膠溶液、纖維蛋白原溶液等體積混合得到水凝膠材料溶液待用。
[0055](3)合成高分子溶液的制備:將PLGA溶于四乙二醇中得到質(zhì)量體積濃度為2%和15%的溶液待用。
[0056](4)含細胞的材料的制備:將脂肪干細胞(ADSC)、甘油凍存劑和上述水凝膠材料溶液混合，水凝膠溶液的ADSC濃度為5 X IO6個/mL，甘油凍存劑的體積濃度為10% ;將脂肪干細胞(ADSC)、甘油凍存劑和培養(yǎng)液混合，DMEM稀溶液的ADSC濃度為I X IO5個/mL，甘油凍存劑的體積濃度為10%。[0057](5)成形過程:由計算機控制快速成形設(shè)備的運動，成形室溫度設(shè)置為_30°C，其中一個噴頭組件采用擠壓式噴頭組件打印含ADSC的水凝膠，得到組織結(jié)構(gòu)主體；一噴頭組件利用噴灑式噴頭組件噴灑質(zhì)量體積濃度為2%的PLGA，并萃取形成毛細血管層；一組噴頭采用擠壓式噴頭組件打印質(zhì)量體積濃度為15%的PLGA，形成保護層；一組噴頭利用利用花灑式噴頭組件噴灑含ADSC的DMEM于組織結(jié)構(gòu)主體間；成形結(jié)束后，解凍復(fù)蘇，利用濃度為1000U的凝血酶溶液將纖維蛋白原聚合2min。
[0058](6)后期培養(yǎng):采用體內(nèi)培養(yǎng)，將整體結(jié)構(gòu)連接體內(nèi)血管系統(tǒng)；使得部分ADSC轉(zhuǎn)化為脂肪細胞，部分ADSC貼附與分支血管內(nèi)壁，并在模擬毛細血管部位形成毛細血管的結(jié)構(gòu)，實現(xiàn)血管化的穩(wěn)定。 [0059]實施例3:制備具有微流體通道的血管化肺氣管組織
[0060](I)細胞的提取:提取人體脂肪干細胞(ADSC)和肺細胞(Pne)，培養(yǎng)傳代。
[0061 ] (2)水凝膠的制備:將明膠材料粉末溶于DMEM培養(yǎng)液，得到質(zhì)量體積濃度為15%的明膠溶液。
[0062](3)合成高分子溶液的制備:將不可降解PU溶于四乙二醇中得到質(zhì)量體積濃度為5%的合成高分子溶液。
[0063](4)含細胞的基質(zhì)材料的制備:將肺細胞(Pne)和上述明膠粘溶液混合，得到濃度為I X IO6個/mL的含Pne水凝膠；將脂肪干細胞(ADSC)和培養(yǎng)液混合，得到ADSC濃度為
IX IO6個/mL的DMEM懸浮稀溶液。
[0064](5)成形過程:由計算機控制快速成形設(shè)備的運動，成形室溫度設(shè)置為0°C，其中一個噴頭組件采用擠壓式噴頭組件控制含Pne的明膠的三維堆積，使支撐部分和組織結(jié)構(gòu)主體成形；一噴頭組件利用噴灑式噴頭組件噴灑含ADSC的DMEM稀溶液于組織結(jié)構(gòu)主體網(wǎng)格間；一噴頭組件利用噴灑式噴頭組件噴灑質(zhì)量體積濃度為5%的PU，形成毛細血管層；成形結(jié)束后，不需要解凍復(fù)蘇，不需交聯(lián)明膠，直接用DMEM培養(yǎng)液萃取有機溶劑四乙二醇可。
[0065](5)后期培養(yǎng):采用體外靜態(tài)培養(yǎng)上述成形結(jié)構(gòu)，采用血管細胞生長因子等使得ADSC轉(zhuǎn)化為血管細胞結(jié)構(gòu)，實現(xiàn)血管化的穩(wěn)定。
[0066]實施例4:制備具有微流體通道的血管化胰島組織
[0067](I)細胞的提取:提取人體內(nèi)皮細胞(EC)和胰島細胞(β細胞)，培養(yǎng)傳代。
[0068](2)水凝膠的制備:將明膠粉末溶于DMEM培養(yǎng)液，得到質(zhì)量體積濃度為10%和20%的明膠溶液；將膠原溶于醋酸溶液，得到質(zhì)量體積濃度為0.01%的膠原溶液，調(diào)節(jié)PH值至6.8。
[0069](3)合成高分子溶液的制備:將PLGA溶于四乙二醇中得到體積濃度為5%的溶液。
[0070](4)含細胞的基質(zhì)材料的制備:將胰島細胞(β細胞)和上述明膠溶液混合，得到β細胞濃度為I X IO6個/mL的水凝膠；將內(nèi)皮細胞(EC)和DMEM培養(yǎng)液混合，得到濃度為
IX IO7個/mL的內(nèi)皮細胞溶液。
[0071](5)成形過程:成形室溫度設(shè)置為5°C，其中擠壓式噴頭控制β細胞的質(zhì)量體積濃度為20%水凝膠的主體部分三維堆積，另一擠壓式噴頭組件打印10%水凝膠，形成支撐部分和組織結(jié)構(gòu)主體，滴加式噴頭組件滴加含EC的DMEM稀溶液，使溶液分布于組織結(jié)構(gòu)主體和分支血管內(nèi)；噴灑式噴頭組件噴灑質(zhì)量濃度為5%的PLGA，并萃取，得到毛細血管層；成形結(jié)束后，用DMEM培養(yǎng)液萃取PLGA中的四乙二醇。[0072](6)后期培養(yǎng):采用體外靜態(tài)培養(yǎng)上述成形結(jié)構(gòu)，在組織結(jié)構(gòu)主體、分支血管和毛細血管層形成內(nèi)皮化結(jié)構(gòu)。
[0073]實施例5:制備具有微流體通道的血管化心肌組織
[0074](I)細胞的提取:提取人體脂肪干細胞(ADSC)、內(nèi)皮細胞(EC)和心肌細胞(CMC)，
培養(yǎng)傳代。
[0075](2)水凝膠的制備:將明膠粉末溶于DMEM培養(yǎng)液，得到質(zhì)量體積濃度為10%的明膠溶液。
[0076](3)合成高分子溶液的制備:將可降解PCL溶于四乙二醇中得到質(zhì)量體積濃度為1%的溶液待用。
[0077](4)含細胞的基質(zhì)材料的制備:將心肌細胞(CMC)和上述明膠材料混合，得到CMC濃度為I X105f/mL的水凝膠；將脂肪干細胞(ADSC)、內(nèi)皮細胞(EC)和培養(yǎng)液(DMEM)混合，得到ADSC和EC濃度均為I X IO6個/mL的DMEM溶液。
[0078](5)成形過程:
[0079]由計算機控制快速成形設(shè)備的運動，一個噴頭組件采用擠壓式噴頭組件控制含CMC的明膠的三維堆積，使支撐部分和組織結(jié)構(gòu)主體成形；一噴頭組件利用噴灑式噴頭組件噴灑含ADSC和 EC的DMEM稀溶液于組織結(jié)構(gòu)主體網(wǎng)格間和層間；一噴頭組件利用噴灑式噴頭組件噴灑質(zhì)量體積濃度為5%的PCL，形成毛細血管層；成形結(jié)束后，不需要解凍復(fù)蘇，不需交聯(lián)明膠，直接用DMEM培養(yǎng)液萃取有機溶劑四乙二醇可。
[0080](6)后期培養(yǎng):采用外脈動反應(yīng)器培養(yǎng)上述成形結(jié)構(gòu)，采用血管化生長因子使得血管種子細胞ADSC內(nèi)皮化，并在模擬毛細血管部位形成毛細血管的結(jié)構(gòu)，實現(xiàn)血管化的穩(wěn)定。
【權(quán)利要求】
1.一種具有微流體通道的血管化組織結(jié)構(gòu)，其特征在于:所述血管化組織結(jié)構(gòu)包括組織結(jié)構(gòu)主體(101)、分支血管(102)、毛細血管層(103)和保護層(104);所述的分支血管(102)分布于組織結(jié)構(gòu)主體(101)內(nèi)部；所述毛細血管層(103)位于組織結(jié)構(gòu)主體(101)內(nèi)部，將組織結(jié)構(gòu)主體(101)和分支血管(102)分為兩部分，并分別與分支血管(102)構(gòu)成一體；所述保護層(104)位于組織結(jié)構(gòu)主體(101)外部；所述的組織結(jié)構(gòu)主體(101)為逐層堆積的含細胞的天然高分子水凝膠的交叉結(jié)構(gòu)，該交叉結(jié)構(gòu)的網(wǎng)格間和層間分布有能維持細胞生存的稀溶液，該稀溶液含有或不含細胞，并呈微流體狀態(tài)；分支血管(102)管壁為類祐1架或類碳納米管的天然高分子水凝膠結(jié)構(gòu)；分支血管(102)孔道內(nèi)分布有能維持細胞生存的稀溶液，該稀溶液含或不含細胞，呈層流態(tài)；分支血管(102)含至少一個入口和至少一個出口，入口和出口與體內(nèi)血管或生物反應(yīng)器相連；所述的毛細血管層(103)為含細胞的且能維持細胞生存的稀溶液，該細胞形成毛細血管內(nèi)皮網(wǎng)眼結(jié)構(gòu)，或為不含細胞的合成高分子溶液，經(jīng)萃取有機溶劑后形成多孔結(jié)構(gòu)；所述的保護層(104)為天然或合成高分子。
2.如權(quán)利要求1所述的一種具有微流體通道的血管化組織結(jié)構(gòu)，其特征在于:所述組織結(jié)構(gòu)主體交叉結(jié)構(gòu)的網(wǎng)格間和層間分布的能維持細胞生存的稀溶液為磷酸鹽緩沖液、細胞培養(yǎng)基、生理鹽水和體液中的至少一種。
3.如權(quán)利要求1所述的一種具有微流體通道的血管化組織結(jié)構(gòu)，其特征在于:所述分支血管孔道內(nèi)分布的能維持細胞生存的稀溶液為磷酸鹽緩沖液、細胞培養(yǎng)基、生理鹽水和體液中的至少一種。
4.如權(quán)利要求1所述的一種具有微流體通道的血管化組織結(jié)構(gòu)，其特征在于:所述毛細血管層的含細胞的且能維持細胞生存的稀溶液為磷酸鹽緩沖液、細胞培養(yǎng)基、生理鹽水和體液中的至少一種。
5.如權(quán)利要求1所述的一種具有微流體通道的血管化組織結(jié)構(gòu)，其特征在于:所述毛細血管層的不含細胞的合成高分子溶液的溶質(zhì)為聚氨酯、聚己內(nèi)酯、聚碳酸酯、聚乙二醇、聚乳酸-羥基乙酸共聚物、聚酯和聚羥基酸酯中至少一種；該合成高分子溶液的溶劑為四乙二醇或1，4- 二氧六環(huán)，合成高分`子溶液的質(zhì)量體積濃度為0.1~10%。
6.如權(quán)利要求1所述的一種具有微流體通道的血管化組織結(jié)構(gòu)，其特征在于:所述分支血管孔徑為0.01~5mm。
7.如權(quán)利要求1所述的一種具有微流體通道的血管化組織結(jié)構(gòu)，其特征在于:所述毛細血管層層厚為0.01~20mm。
8.如權(quán)利要求1所述的一種具有微流體通道的血管化組織結(jié)構(gòu)，其特征在于:所述的保護層的合成高分子為聚氨酯、聚己內(nèi)酯、聚碳酸酯、聚乙二醇、聚乳酸-羥基乙酸共聚物、聚酯和聚羥基酸酯中的至少一種；該合成高分子稀溶液的溶劑為四乙二醇或1，4_ 二氧六環(huán)，合成高分子稀溶液的質(zhì)量體積濃度為0.1~30%。
9.如權(quán)利要求1所述的一種具有微流體通道的血管化組織結(jié)構(gòu)，其特征在于:所述細胞為成體組織細胞、成體干細胞、胚胎干細胞、誘導(dǎo)多能干細胞的至少一種。
10.一種如權(quán)利要求1所述具有微流體通道的血管化組織結(jié)構(gòu)的制備方法，其特征在于該方法包括如下步驟: 1)利用計算機設(shè)計所述具有微流體通道的血管化組織結(jié)構(gòu)的三維模型； 2)采用復(fù)合多噴頭快速成形設(shè)備，成形室溫度控制在40°C~-30°C;該設(shè)備噴頭組件包括擠壓式噴頭(301)、滴加式噴頭(303)和噴灑式噴頭(305);將配置好的含細胞的天然高分子水凝膠、含或不含細胞的能維持細胞生存的稀溶液和合成高分子溶液分別裝入不同類型的噴頭組件中； 3)采用擠壓式噴頭組件打印至少一層天然高分子水凝膠或合成高分子溶液，得到支撐部分； 4)采用擠壓式噴頭組件打印至少一層所述含細胞的天然高分子水凝膠，得到水凝膠的交叉結(jié)構(gòu)，然后采用滴加式噴頭組件滴加或噴灑式噴頭組件噴灑含或不含細胞的且能維持細胞生存的稀溶液，使該稀溶液分布于交叉結(jié)構(gòu)的網(wǎng)格間和層間，得到組織結(jié)構(gòu)主體； 5)采用擠壓式噴頭組件打印至少一層所述含細胞的天然高分子水凝膠，得到水凝膠的類桁架或碳納米管結(jié)構(gòu)分支血管壁，再采用滴加式噴頭組件滴加或噴灑式噴頭組件噴灑含或不含細胞的且能維持細胞生存的稀溶液，使該稀溶液分布于類桁架或類碳納米管孔道內(nèi)，得到分支血管； 6)采用滴加式噴頭組件滴加或噴灑式噴頭組件噴灑不含細胞的合成高分子稀溶液，并萃取有機溶劑，或采用滴加式噴頭組件滴加或噴灑式噴頭組件噴灑含細胞的且能使細胞生存的稀溶液，形成毛細血管層； 7)采用擠壓式噴頭組件打印至少一層或噴灑式噴頭組件噴灑合成高分子溶液于組織結(jié)構(gòu)主體外部，并萃取有機溶劑，得到保護層； 8)重復(fù)步驟4)、5)和7)，成形過程結(jié)束后移除支撐部分，最終得到所述具有微流體通道的血管化組織結(jié)構(gòu) 。
11.如權(quán)利要求10所述的具有微流體通道的血管化組織結(jié)構(gòu)的制備方法，其特征在于:所述擠壓式噴頭噴嘴內(nèi)徑為10~1000 μ m ;所述滴加式噴頭噴嘴內(nèi)徑為10~IOOym ;所述噴灑式噴頭噴嘴噴涂范圍為0.01~10cm2。
12.如權(quán)利要求10所述的一種具有微流體通道的血管化組織結(jié)構(gòu)的制備方法，其特征在于:所述組織結(jié)構(gòu)主體、分支血管和支撐部分的天然高分子水凝膠為質(zhì)量體積濃度為0.5~10%的海藻酸鈉、質(zhì)量體積濃度為0.5~10%的膠原、質(zhì)量體積濃度為0.5~10%的基質(zhì)膠、質(zhì)量體積濃度為I~20%的右旋糖、質(zhì)量體積濃度為0.5~5%的纖維蛋白原和質(zhì)量體積濃度為5~30%的明膠中的至少一種。
13.如權(quán)利要求10所述的一種具有微流體通道的血管化組織結(jié)構(gòu)的制備方法，其特征在于:所述支撐部分的合成高分子為聚氨酯、聚己內(nèi)酯、聚碳酸酯、聚乙二醇、聚乳酸-羥基乙酸共聚物、聚酯和聚羥基酸酯中的至少一種；合成高分子的溶劑為四乙二醇或1，4_ 二氧六環(huán)；合成高分子稀溶液的質(zhì)量體積濃度為0.1~40%。
14.如權(quán)利要求10所述的一種具有微流體通道的血管化組織結(jié)構(gòu)的制備方法，其特征在于:成形室溫度在-30~4°C時，含細胞的天然高分子水凝膠和能維持細胞生存的稀溶液中需加入凍存劑，凍存劑為體積百分濃度為1%~20%的二甲基亞砜、體積百分濃度為1%~20%的甘油和質(zhì)量體積濃度1%~20%右旋糖中的至少一種；成形后三維結(jié)構(gòu)體在_80°C及其以下的溫度保存，擇時復(fù)蘇。
【文檔編號】A61L27/44GK103767804SQ201410026170
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2014年1月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月20日
【發(fā)明者】王小紅, 許雨帆 申請人:清華大學(xué)