沉默DNMT基因的雙鏈siRNA分子及其應(yīng)用的制作方法

沉默DNMT基因的雙鏈siRNA分子及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及沉默DNMT基因的雙鏈siRNA分子及其應(yīng)用，更具體地，本發(fā)明針對人腫瘤細(xì)胞DNMT基因的核苷酸序列設(shè)計合成siRNA，所述siRNA轉(zhuǎn)入肝癌細(xì)胞后能明顯促進(jìn)免疫原性相關(guān)蛋白的表達(dá)。
【專利說明】沉默DNMT基因的雙鏈siRNA分子及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及雙鏈siRNA分子及其應(yīng)用，更具體地，本發(fā)明針對人腫瘤細(xì)胞DNMT基因的核苷酸序列設(shè)計合成siRNA，所述siRNA轉(zhuǎn)入肝癌細(xì)胞后能明顯促進(jìn)免疫原性相關(guān)蛋白的表達(dá)。
【背景技術(shù)】
[0002]DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferases, DNMTs)是催化DNA甲基化修飾的酶。具有催化甲基化功能的DNMTs有3種，分別為DNMTl、DNMT3a及DNMT3b [Plass, C.Cancerepigenomics.Human Molecular Genetics, 2002 ;11:2479-2488]。DNA 甲基化是調(diào)控免疫細(xì)胞的分化及功能表達(dá)。甲基化調(diào)節(jié)免疫分子和腫瘤抗原的表達(dá)與腫瘤的免疫原性和免疫反應(yīng)性有明確的關(guān)系，因此，合理的去甲基化是克服免疫耐受和免疫逃逸的有效手段[Teitella, M., et al.DNA methylation in immune system.Clinical immunology, 2003 ；109:2-5]。
[0003]癌/睪丸抗原(cancer / testis antigen, CTA)是一種腫瘤相關(guān)抗原，目前已確定19個CTA家族的基因產(chǎn)物，均具有較強(qiáng)的免疫原性(如CT10(cancer / testislO)，有多個HLA-1 (human leukocyte antigen) I類抗原限制的免疫表位,體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)能夠誘導(dǎo)功能性的淋巴細(xì)胞毒性反應(yīng)，促進(jìn)腫瘤的消退，在HCC患者的肝癌組織中，CTA表達(dá)非常高[Zhao L, et al.Progress and prospects in hepatocellular carcinoma surgery.Ann Chir, 1988 ；52:558-563]，因此針對CTA的抗腫瘤免疫治療符合肝癌及其其他腫瘤病人進(jìn)行免疫的理想選擇[Chen YT., et al.A testicular antigen aberrant lye expressedin human cancers detected by autologous antibody screening.Proc Natl Acard SciUSA, 1997 ；94:1914-1918Korangy F., et al.Spontaneous tumor-specific humoral andcellular immune responses to `NY-ES0-1 in Hepatocellular carcinoma.Clin CancerRes, 2004；10:4332-43410h BK., et al.DNA me thyItransferase expression and DNAmethylation in human hepatocellular carcinoma and their clinicopathologicalcorrelation]。雖然已有報道稱，CTA和HLA基因的表達(dá)均受甲基化調(diào)控，通過抑制DNMT，可促進(jìn)其表達(dá)[Guo ZS., et al.De novo induction of a Cancer / Testis Antigenby5_Aza-2’-Deoxycytidine Augments Adoptive Immunotherapy in a Murine TumorMode.Cancer Res.，2006 ；66:1105-1113]。但是在肝癌細(xì)胞中CTA,HLA是否受甲基化調(diào)控還不太清楚。
[0004]近來研究已經(jīng)表明，在哺乳動物中小干擾RNA RNA(SiRNA)能通過對生物學(xué)上保守結(jié)構(gòu)的RNA進(jìn)行干擾，從而抑制靶基因表達(dá)。RNA干擾作用(RNAi)技術(shù)被認(rèn)為是一種最有效特異性下調(diào)祀基因表達(dá)的方法之一 [Noor1-Daloii MR., et al.Use of siRNA in knockingdown of dopamine receptors, a possible therapeutic option in neuropsychiatricdisorders.Molecular biology reports2012 ;39:2003-2010]。干擾小 RNA (siRNA)是 RNA干擾作用(RNAi)賴以發(fā)生的重要中間效應(yīng)分子。siRNA是一類長約21~25個核苷酸(nt)的特殊雙鏈RNA (dsRNA)分子，具有特征性結(jié)構(gòu)，即siRNA的序列與所作用的靶mRNA序列具有同源性；siRNA兩條單鏈末端為5’端磷酸和3’端羥基。siRNA可作為一種特殊引物，RNA依賴RNA聚合酶(RdRp)作用下以靶mRNA為模板合成dsRNA，后者可被降解形成新的siRNA。新生的dsRNA反復(fù)合成和降解，不斷產(chǎn)生新的siRNA，從而使靶mRNA漸進(jìn)性減少，呈現(xiàn)基因沉默現(xiàn)象。
[0005]為了探究肝癌細(xì)胞中CTA和HLA基因表達(dá)是否受甲基化的調(diào)控，我們利用siRNA干擾技術(shù)，沉默DNMT基因，檢測CTA和HLA在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)情況，從而為恢復(fù)肝癌細(xì)胞的免疫原性提供新的治療手段。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于公開一種高效的針對DNMT基因的廣譜小分子干擾RNA(siRNA),序列如下:
[0007]siRNAl:
[0008]正義鏈:5’-UCAGGAACGCGCACUGAAAtt-3’ (SEQ ID NO:1)，
[0009]反義鏈:5’-UUUCAGUGCGCGUUCCMGAtt-3’(SEQ ID NO:2)。
[0010]本發(fā)明的另一目的在于公開一種雙鏈siRNA分子組合物，該組合物包括上述siRNAl,還包括siRNA2和/或siRNA3 ;其中siRNA2包括正義鏈和反義鏈，siRNA2正義鏈的序列為:5’-CAGAUGUUCUUCGCUAAUAtt-3’ (SEQ ID NO:3)，siRNA2 反義鏈的序列為:5’-UAUUAGCGAAGAACAU CUGtt-3’(SEQ ID NO:4);其中 siRNA3 包括正義鏈和反義鏈，siRNA3正義鏈的序列為:5’-GAUCAGAGCCGAGAACAAAtt-3’ (SEQ ID NO:5)，siRNA3 反義鏈的序列為:5’-UUUGUUCUCGGCUCUGAUCtt-3’ (SEQ ID NO:6)。
[0011]本發(fā)明提供了雙鏈siRNA或雙鏈siRNA分子組合物在制備降低細(xì)胞DNMT基因表達(dá)試劑中的應(yīng)用，優(yōu)選地，DNMT是DNMT1、DNMT3a或DNMT3b。
[0012]本發(fā)明提供了雙鏈siRNA或雙鏈siRNA分子組合物在制備促進(jìn)細(xì)胞CTA蛋白表達(dá)試劑中的應(yīng)用，優(yōu)選地，CTA蛋白是CT10。
[0013]本發(fā)明提供了雙鏈siRNA或雙鏈siRNA分子組合物在制備促進(jìn)細(xì)胞HLA-1類蛋白表達(dá)試劑中的應(yīng)用，優(yōu)選地，HLA-1類蛋白是HLA-A、HLA-B或HLA-C。
[0014]優(yōu)選地，本發(fā)明使用的細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞。
[0015]體外實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的siRNA分子的反義鏈可特異性地與DNMT基因的mRNA結(jié)合，降解mRNA，從而干擾轉(zhuǎn)錄后的翻譯過程，進(jìn)而促進(jìn)DNMT蛋白調(diào)控的CTA和HLA蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)免疫細(xì)胞的毒性反應(yīng)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的消退，達(dá)到治療腫瘤的目的。
[0016]本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明的siRNA分子可以應(yīng)用于制備調(diào)節(jié)細(xì)胞中DNMT基因的藥物中發(fā)揮RNA干擾的作用，增強(qiáng)免疫細(xì)胞的毒性反應(yīng)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞消退，達(dá)到治療腫瘤的目的。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1顯示了化學(xué)合成的siRNA對DNMT基因沉默效果的檢測結(jié)果，其中
[0018]圖1a顯示了利用QPCR檢測siRNA對DNMT基因的沉默效果，
[0019]圖1b顯示了利用免疫印跡檢測siRNA對DNMT基因的沉默效果，[0020]圖2顯示了利用免疫印跡檢測化學(xué)合成的siRNA對CTA基因表達(dá)的影響，
[0021]圖3顯示了化學(xué)合成的siRNA對HLA基因表達(dá)的影響，其中
[0022]圖3a顯示了利用QPCR檢測siRNA對HLA基因表達(dá)的影響，
[0023]圖3b顯示了利用免疫印跡檢測siRNA對HLA基因表達(dá)的影響，
【具體實(shí)施方式】
[0024]下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例。下面通過參考附圖描述的實(shí)施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。
[0025]實(shí)施例1:化學(xué)合成的siRNA對DNMT基因沉默效果的檢測實(shí)驗(yàn)
[0026]1.主要儀器、試劑和材料.[0027]1.1儀器:PCR儀(ABI公司)；實(shí)時定量PCR儀(Bio-Rad);細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo)，凝膠成像儀(Alpha Innothech)等。
[0028]1.2材料和試劑:mRNA提取純化試劑盒(QIAGEN)，脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen), DMEM 培養(yǎng)基(Gibco), Oligo (dT) (Promega), M-MLV(Promega), Tap 酶(Takara)等。
[0029]2.合成 siRNA
[0030]在Genebank 中找到 DNMTl，DNMT3a, DNMT3b 的基因序列(NO:NM-001379, NO:NM-175629, NO:NM_006892)。由上海基凱生物公司設(shè)計及化學(xué)合成，每個基因設(shè)計一對siRNA序列，2.0OD (5nmol) *2只，并有陽性對照β-actin的干擾序列和陰性對照，如下:
[0031]siRNAl:
[0032]正義鏈:5，-UCAGGAACGCGCACUGAAAtt-3’(SEQ ID NO:1)，
[0033]反義鏈:5’-UUUCAGUGCGCGUUCCUGAtt-3’(SEQ ID NO:2)。
[0034]siRNA2:
[0035]正義鏈:5，-CAGAUGUUCUUCGCUAAUAtt-3’(SEQ ID NO:3)，
[0036]反義鏈:5，-UAUUAGCGAAGAACAUCUGtt-3’(SEQ ID NO:4)。
[0037]siRNA3:
[0038]正義鏈:5，-GAUCAGAGCCGAGAACAAAtt-3’(SEQ ID NO:5)，
[0039]反義鏈:5’-UUUGUUCUCGGCUCUGAUCtt-3’(SEQ ID NO:6)。
[0040]β -actin siRNA:
[0041 ]正義鏈:5’ -ACCAGGUGCUACGCUCAGAAAtt-3 ’，
[0042]反義鏈:5’-UCUGACUACUGUGAG⑶CUtt-3，。
[0043]陰性對照(NC-siRNA)
[0044]正義鏈:5’-UUAAGUAGCUUGGCCUUGAtt-3，，
[0045]反義鏈:5’-UCAAGGCCAAGCUACUUAAtt-3 ’。
[0046]3.沉默效率驗(yàn)證
[0047]3.1細(xì)胞培養(yǎng):肝癌細(xì)胞H印G2在含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中，37°C、5 % CO2培
養(yǎng)箱培養(yǎng)。
[0048]3.2細(xì)胞鋪板并轉(zhuǎn)染:將細(xì)胞按IXlO4 /孔接種到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱細(xì)胞培養(yǎng)24小時，在無雙抗含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)染按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑2000(購自于Invitrogen公司)的說明書轉(zhuǎn)染，實(shí)驗(yàn)分為未轉(zhuǎn)染組、陰性對照組和實(shí)驗(yàn)組(80nM)，其中陰性對照組siRNA為通用對照siRNA，即NC-siRNA，與DNMT基因的序列無同源性，濃度為SOnM /孔。同時分別轉(zhuǎn)染。
[0049]3.3RT-PCR檢測DNMT基因mRNA水平:用mRNA提取純化試劑盒(TurboCapturemRNA kit)提取純化細(xì)胞RNA，操作按試劑盒說明書進(jìn)行，用80 μ L無RNA酶水/孔溶解RNA，取 2 μ gRNA加入 0.6 μ LOligo (dT)，無菌DEPC水補(bǔ)充體積至 20 μ L, 70°C變性 IOmin。迅速插入冰冷至少5min ;冰上操作，加入以下試劑:6.Ομ L5*buffer,5.Ομ L2.5μΜ dNTPs,l.0yL RNasin (40U / μ L)和 1.0 μ L M-MLV，混勻后，短暫離心，37°C 孵育 lh，70°C 15min 中止反應(yīng)，用基因特異性引物檢測樣本中DNMT mRNA表達(dá)水平，同時擴(kuò)增看家基因β-actin作為內(nèi)參對照(引物序列如表1所示)。每個反應(yīng)做3個平行。建立如下25yL反應(yīng)體系:1“14莫板。0嫩，0.54 1^ Tap E，各I μ L5’正反向引物(0.5 μ M)，2.5 μ L10*反應(yīng)緩沖液，
2.5μ L dNTP(0.2mM)，用無RNA酶水補(bǔ)足體系至25yL。反應(yīng)條件:95°C預(yù)變性lOmin，94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸45s，循環(huán)36次，充分延伸72°C IOmin0同等體積的各PCR樣品進(jìn)行瓊脂糖膠電泳(膠濃度:1% )。其中DNMT基因的
[0050]結(jié)果分析--從RT-PCR電泳結(jié)果來看:經(jīng)過RNA干擾的H印G2細(xì)胞，在相應(yīng)的組內(nèi)，均有所降低，未處理組和模擬對照組的DNMT變化無明顯差異，數(shù)據(jù)未顯示。
[0051]3.4熒光實(shí)時定量PCR(QPCR)檢測DNMT基因mRNA水平:用基因特異性引物檢測樣本中DNMT mRNA表達(dá)水平(引物序列如表1所示)，同時擴(kuò)增看家基因β -actin作為內(nèi)參對照。每個反應(yīng)做3個平行。建立如下25 μ L反應(yīng)體系:1.0 μ L模板eDNA，各I μ L5’正反向引物(0.5yM)，1.0yL20XEver Green 1,0.5μ L Hotstar TapE(5U / μ L)，用無RNA酶水補(bǔ)足體系至25 μ L。反應(yīng)條件:40°C反轉(zhuǎn)錄30min，95°C預(yù)變性5min，94°C變性20s，60°C退火45s，72。。延伸45s，循環(huán)40次，充分延伸72°C IOmin0
[0052]結(jié)果分析:以β-actin內(nèi)參，用實(shí)時定量PCR2_""et法確定DNMT mRNA表達(dá)量，并作出柱狀圖，結(jié)果見圖la。如圖所示，縱坐標(biāo)表示DNMT相對于β-actin的mRNA表達(dá)水平；橫坐標(biāo)表示3個處理實(shí)驗(yàn)組，其中“模擬轉(zhuǎn)染組”表示轉(zhuǎn)染濃度80nM NC-siRNA的陰性對照，其他兩組為siRNAl轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)組，“siRNAl”表示單獨(dú)轉(zhuǎn)染一種DNMT干擾RNA實(shí)驗(yàn)組，“siRNAl+2+3”表示共轉(zhuǎn)染三種DNMT干擾RNA實(shí)驗(yàn)組，結(jié)果顯示本發(fā)明的siRNA對DNMT基因的沉默效果明顯。
[0053]3.5免疫印跡(western blot)檢測DNMT基因蛋白表達(dá)水平:按照3.2的方法轉(zhuǎn)染細(xì)胞后72小時，用細(xì)胞裂解液(150mM氯化鈉+1 % NP-40 (去垢劑)+0.1 % SDS (去垢劑)+2yg/ ml Aprotinin(蛋白酶抑制劑)(使用前加入)+2μ g / ml Leupeptin(蛋白酶抑制劑)(使用前加入)或ImM PMSF(蛋白酶抑制劑)+1.5mM EDTA(蛋白酶抑制劑 )+ImMNaVanadate (磷酸脂酶抑制劑))收集細(xì)胞，用BCA蛋白檢測試劑盒進(jìn)行蛋白濃度的測定，各實(shí)驗(yàn)組取50 μ g蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，分別加入DNMTl抗體、DNMT3a抗體、DNMT3b抗體進(jìn)行檢測，以管家蛋白Tubulin為內(nèi)參，觀察DNMT蛋白的表達(dá)情況。
[0054]結(jié)果分析:使用western blot的方法檢測各實(shí)驗(yàn)組DNMT的表達(dá)水平，DNMTl為一 190kDa的雙帶，與抗體說明書的描述一致，在有DNMTl干擾的組中均有明顯降低，尤其在DNMTl+3a+3b組中降低的幅度更明顯；在模擬轉(zhuǎn)染組中則無降低。DNMT3a和DNMT3b的表達(dá)情況與DNMTl類似，在有DNMT干擾的組中，無相應(yīng)的條帶，說明本發(fā)明設(shè)計的DNMT干擾RNA能明顯的降低DNMT蛋白的表達(dá)水平，三種DNMT干擾RNA混合效果更明顯(圖1b)。
[0055]實(shí)施例2 =DNMT基因沉默對CTA基因表達(dá)的影響
[0056]1.RT-PCR檢測CTA基因轉(zhuǎn)錄水平的變化
[0057]1.1主要儀器、試劑和耗材同實(shí)施例1
[0058]1.2RT-PCR實(shí)驗(yàn)步驟同實(shí)施例1 (相應(yīng)的引物序列見表1)
[0059]結(jié)果分析:在H印G2細(xì)胞中，使用脂質(zhì)體SiNRA干擾DNMT基因后，可見CTlO和SSXl兩個基因在SiRNAl組和混合干擾組(siRNAl+2+3)中有不同程度的再表達(dá)，在為未處理組和模擬轉(zhuǎn)染組則無相應(yīng)條帶(數(shù)據(jù)未顯示)。MAGE-1和MAGE-3在各組中均無明顯變化。NY-ES0-1也無明顯變化，其余三種CTA、CTpll、SCPl和SSX4未檢測到表達(dá)(數(shù)據(jù)未顯示)O
[0060]1.3熒光實(shí)時定量PCR(QPCR)實(shí)驗(yàn)步驟同實(shí)施例1 (相應(yīng)的引物序列見表1)
[0061]結(jié)果分析:QPCR檢測顯示，MAGEl無明顯變化。CTlO和SSXl的再表達(dá)趨勢明顯(數(shù)據(jù)未顯示)。
[0062]2.Western blot檢測CTA基因蛋白表達(dá)水平的變化
[0063]Westernblot的步驟同實(shí)施例1，利用抗體為CTA蛋白中的CTlO蛋白抗體。
[0064]結(jié)果分析:CT10蛋白的表達(dá)和RT-PCR的結(jié)果一致，在siRNAl組有明顯的再表達(dá)，在混合干擾組(siRNAl+2+3)表達(dá)的效果更明顯(圖2)。
[0065]上述結(jié)果表明，siRNAl組`促進(jìn)了 CTA分子中的CTlO蛋白和SSXl的表達(dá)，混合干擾組(siRNAl+2+3)效果更明顯。
[0066]實(shí)施例3 =DNMT基因沉默對HLA基因表達(dá)的影響
[0067]1.RT-PCR檢測HLA基因轉(zhuǎn)錄水平的變化
[0068]1.1主要儀器、試劑和耗材同實(shí)施例1
[0069]1.2RT-PCR實(shí)驗(yàn)步驟同實(shí)施例1 (相應(yīng)的引物序列見表1)
[0070]結(jié)果分析:在H印G2細(xì)胞中，使用脂質(zhì)體siNRA干擾DNMT基因后，可見HLA-1類分子中的HLA-A、HLA-B、HLA-C基因在siRNAl組和混合干擾組(siRNAl+2+3)中有不同程度的再表達(dá)，HLA-1I類分子和CIITA基因均無條帶，數(shù)據(jù)未顯示。
[0071]1.3熒光實(shí)時定量PCR(QPCR)實(shí)驗(yàn)步驟同實(shí)施例1 (相應(yīng)的引物序列見表1)
[0072]結(jié)果分析:以模擬轉(zhuǎn)染組三種HLA-1類分子的相對表達(dá)為I。在siRNAl組和混合干擾組(siRNAl+2+3)中，HLA-A的相對表達(dá)度分別為5和8 ；HLA-B的相對表達(dá)度分別為
2.5和6 ；HLA-C的相對表達(dá)度分別為30和45 (圖3a)。
[0073]2.Western blot檢測HLA基因蛋白表達(dá)水平的變化
[0074]Western blot的步驟同實(shí)施例1，利用抗體為HLA-1類蛋白抗體。
[0075]結(jié)果分析=HLA-1類蛋白的表達(dá)和RT-PCR的結(jié)果一致，在siRNAl組有明顯的再表達(dá)，在混合干擾組(siRNAl+2+3)再表達(dá)的效果更明顯(圖3b)。
[0076]上述結(jié)果表明，siRNAl組促進(jìn)了 HLA-1類分子表達(dá)，混合干擾組(siRNAl+2+3)效果更明顯。
[0077]實(shí)施例4 =CTA和HLA的啟動子甲基化狀態(tài)的檢測
[0078]1.儀器:PCR 儀(ABI 公司)，凝膠成像儀(Alpha Innothech)[0079]2.材料和試劑:DNA提取試劑盒(QIAGEN)，純化柱(Promega)，Tap酶(Takara)等。
[0080]3.實(shí)驗(yàn)步驟
[0081]3.1DNA提取:利用DNA提取試劑盒(QIAGEN)按照說明書上的步驟提取細(xì)胞總DNA。
[0082]3.2DNA修飾:取1-10 μ gDNA,溶解于18 μ L無菌水中，95°C水浴變性20min，冰浴；加入3M氫氧化鈉2 μ L (混勻，脈沖離心)，42°C水浴變性20min，配制5M亞硫酸氫鈉處理液(每份樣品0.5ml,以配制4mI為例):取1.9g亞硫酸氫鈉加入2.5ml無菌水中，加入2M氫氧化鈉0.7ml，加入IM對苯二酚(IlOmg / ml) 0.5ml，50°C水浴，反復(fù)倒置直至完全溶解；向上述20 μ L DNA變性液加入新鮮配制的5Μ亞硫酸氫鈉處理液380 μ L (混勻，脈沖離心)；加入200 μ L石蠟油以防蒸發(fā)，50°C水浴12-16h ；
[0083]3.3DNA純化除鹽:安裝DNA純化柱，標(biāo)記；將上述處理的樣本加入純化柱(Promega)內(nèi)，真空抽吸；加入80%異丙醇洗漆二次；12000rpm離心,去除殘留液體；將0嫩洗脫到50 μ L無菌水中(801:7欠，801:溫浴51^11，離心)；加入3Μ氫氧化鈉lyL，37°C水浴15min ;加入5M醋酸銨166 μ L ;加入2.5倍體積的無水乙醇，_70°C沉淀0.5_lh ； 1000Orpm離心20min，棄上清；70%乙醇200 μ L洗沉淀，離心20min，棄上清；將DNA溶解于30-50 μ LTE緩沖液中，-20°C保存。
[0084]3.4甲基化PCR反應(yīng)
[0085]3.4.1引物設(shè)計=HLA-1類分子的甲基化引物序列參照Nie等[Nie Y.，et al.DNAhypermethylation is a mechanism for loss of expression of HLA CTAss I genes inhuman esophageal squamous cell carcinomas.Carcinogenesis,2001 ;22:1615-1623]的文獻(xiàn)的引物和反應(yīng)體系。MAGE引物序列參考Honda等[HondaT.，et al.Demethylationof MAGE promotors during gastric cancer progression.British Journal ofcancer, 2004 ；90:838-843]文獻(xiàn)。CTlO 的甲基化引物自行設(shè)計，從 www.genecards.0rg 網(wǎng)站下載CTlO基因的第一外顯子前1000bp序列以及第一外顯子本身共計1190bp ;進(jìn)入www.methprimer.com,,復(fù)制這段序列,選擇MSP引物，即在線輸出5對甲基化和非甲基化引物。選擇第一對甲基化和非甲基化引物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)(引物序列見表2所示)。
[0086]3.4.2配制反應(yīng)體系
[0087]向200yL PCR管中加 入以下成分，并混勻。
[0088]
【權(quán)利要求】
1.一種雙鏈SiRNA分子，其特征在于，具有下述核苷酸序列的正義鏈和反義鏈組成:
正義鏈:5’-UCAGGAACGCGCACUGAAAtt-3’ (SEQ ID NO:1),
反義鏈:5’ -UUUCAGUGCGCGUUCCUGAtt-3’ (SEQ ID NO:2)。
2.一種雙鏈SiRNA分子組合物，其特征在于，所述的組合物包含權(quán)利要求1所述的SiRNA0
3.權(quán)利要求2所述的siRNA分子組合物，其特征在于，所述的siRNA分子組合物還包括siRNA2和/或siRNA3 ;其中所述的siRNA2包括正義鏈和反義鏈，siRNA2正義鏈的序列為:5’ -CAGAUGUUCUUCGCUAAUAtt-3’ (SEQ ID NO:3)，siRNA2 反義鏈的序列為:5’ -UAUUAGCGAAGAACAUCUGtt-3’ (SEQ ID NO:4);其中所述的 siRNA3 包括正義鏈和反義鏈，siRNA3 正義鏈的序列為:5’ -GAUCAGAGCCGAGAACAAAtt-3’ (SEQ ID NO:5)，siRNA3 反義鏈的序列為:5’-UUUGUUCUCGGCUCUGAUCtt-3’ (SEQ ID NO:6)。
4.權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)所述的雙鏈siRNA或雙鏈siRNA分子組合物在制備降低細(xì)胞DNMT基因表達(dá)試劑中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)所述的雙鏈siRNA或雙鏈siRNA分子組合物在制備促進(jìn)細(xì)胞CTA蛋白表達(dá)試劑中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)所述的雙鏈siRNA或雙鏈siRNA分子組合物在制備促進(jìn)細(xì)胞HLA-1類蛋白表達(dá)試劑中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求4中所 述的應(yīng)用，其特征在于，所述DNMT是DNMTl、DNMT3a或DNMT3b。
8.權(quán)利要求5中所述的應(yīng)用，其特征在于，所述CTA蛋白是CT10。
9.權(quán)利要求6中所述的應(yīng)用，其特征在于，所述HLA-1類蛋白是HLA-A、HLA-B或HLA-C。
10.權(quán)利要求2至5中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞，其特征在于，所述細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞。
【文檔編號】A61K48/00GK103757021SQ201410021188
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年1月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月17日
【發(fā)明者】肖文華, 董偉偉 申請人:肖文華