一種抗豬2型圓環病毒病的重組蛋白亞單位疫苗的制作方法
【專利摘要】本發明提供了一種抗豬2型圓環病毒病的重組亞單位疫苗，該疫苗是具有較高免疫原性的鼠傷寒沙門菌鞭毛蛋白（flagellin）和豬2型圓環病毒Cap蛋白的融合蛋白。本發明通過將人工編碼的Flagellin-ORF2、Flagellin-ΔORF2基因融合克隆進pFastBac表達載體，同ORF2、ΔORF2重組克隆（pFastBac載體）一起轉染Sf9細胞，利用桿狀病毒系統表達四個融合蛋白，并通過間接免疫熒光（IFA）和Western-blot進行鑒定。通過上述系統獲得重組桿狀病毒的周期短，且表達的flagellin+Cap融合蛋白具有較高的免疫保護力。
【專利說明】—種抗豬2型圓環病毒病的重組蛋白亞單位疫苗
【技術領域】
[0001]本發明涉及免疫學領域，具體涉及一種抗豬2型圓環病毒病的亞單位疫苗。
【背景技術】
[0002]豬圓環病毒于1974年首次在豬腎細胞系PK15細胞中發現，并被認為具非致病性。1991年在加拿大豬群中發現稱之為斷奶仔豬多系統衰竭綜合征(Postweaningmultisystemic wasting syndrome,PMWS)的病,發現其主要是由一種致病性豬圓環病毒引起，被國際分類學會劃分為PCV2，而非致病性的豬圓環病毒劃分為PCVl。PCV2屬圓環病毒科圓環病毒屬，其基因組由一環狀單鏈DNA組成，是迄今發現的最小的一種動物病毒。PCV2含有2個主要閱讀框ORFl和0RF2，其中ORFl負責編碼與病毒復制相關的蛋白(Rep)，而0RF2編碼病毒的結構蛋白Cap蛋白。PCV2感染可引起斷奶仔豬多系統衰竭綜合征(PMWS)、豬呼吸疾病綜合征(PRDC)、豬皮膚和腎病綜合征(PDNS)等多種疾病(總稱為豬圓環病毒病，PCVD)。研究表明，該病毒在豬的淋巴系統增殖，可引起免疫細胞凋亡，造成免疫抑制，導致機體抵抗力下降，誘發多種病毒和細菌的混合感染和繼發感染，給養豬業造成巨大的經濟損失，已引起世界各地廣泛重視。
[0003]目前防控豬2型圓環病毒病的主要方法是接種疫苗，生產中使用的疫苗主要是PCV2全病毒滅活疫苗、PCV1-PCV2嵌合病毒滅活疫苗以及桿狀病毒表達PCV2基因工程疫苗。這些疫苗對防制豬2型圓環病毒病有一定的效果，但該病仍然嚴重發生和流行，說明僅能產生體液免疫應答能力 的滅活疫苗和常規的基因工程亞單位疫苗不能很好地控制豬圓環病毒病。豬2型圓環病毒導致B淋巴細胞和T淋巴細胞的減少甚至缺失而引起免疫抑制，因此僅能產生體液免疫應答的滅活疫苗和亞單位疫苗不能產生理想的免疫效果，研究表明，目前使用的商品疫苗均不能刺激機體產生細胞免疫應答導致防控PCV2感染的效果不理想，因此如何開發出能同時激活體液和細胞免疫應答是PCV2疫苗研究的方向。病原感染宿主引起致病是通過病原與宿主相互作用表現出來的，TLR受體在強毒力病原致病或減毒疫苗產生免疫應答方面起重要作用。鞭毛蛋白，是一種TLR5配體，能顯著增強抗原的免疫原性與保護性。研究表明，將西尼羅病毒囊膜蛋白與鞭毛蛋白融合制成疫苗免疫能產生抗病毒攻擊的中和抗體與保護性抗體，而單獨的亞單位抗原免疫不能產生合適的保護性抗體應答。為此，PCV2的免疫原性蛋白0RF2基因與鞭毛蛋白基因連接，并于桿狀病毒中表達，開發出良好免疫效力的新型亞單位疫苗，用于豬圓環病毒病的有效防控具有重要意義。
【發明內容】
[0004]為了解決上述問題，本發明的一個目的是提供一種高免疫原性且沒有安全隱患的抗豬2型圓環病毒病的亞單位疫苗，所述的高免疫原性的亞單位疫苗保護性抗原是鼠傷寒沙門菌鞭毛蛋白(flagellin)和豬2型圓環病毒Cap蛋白的融合蛋白。
[0005]本發明的另一個目的是提供上述鼠傷寒沙門菌鞭毛蛋白(flagellin)和豬2型圓環病毒Cap蛋白的融合蛋白的制備方法。[0006]為了實現本發明的目的，本發明采用如下技術方案:
[0007]本發明首先提供了一種融合蛋白，其為豬2型圓環病毒Cap蛋白與消除毒力的鼠傷寒沙門菌鞭毛蛋白的融合蛋白。該融合蛋白的氨基酸序列見SEQ ID N0.2所示，編碼上述flagellin+Cap融合蛋白的基因，其核苷酸序列見SEQ ID N0.1，該基因用FlagelIin_0RF2表不。
[0008]此外，考慮到密碼子的簡并性，例如可在其編碼區，在不改變氨基酸序列的條件下，或在其非編碼區在不影響蛋白表達的條件下，對編碼上述蛋白的基因序列進行修改。因此，本發明還包含對編碼上述蛋白的基因序列進行的替換、添加和/或缺失一個或多個核苷酸，具有與上述編碼基因具有相同功能的核苷酸序列。本發明還包括基于所述基因的正義序列或反義序列，包括含有所述核苷酸序列的克隆載體或表達載體、含有所述載體的宿主細胞等等。
[0009]本發明還進一步提供所述flagellin+Cap融合蛋白的制備方法,其包括以下步驟:
[0010]人工合成編碼所述融合蛋白的基因，連接到pFastBac-HA質粒，得到重組載體pFastBacHA-flagellin+0RF2，轉化E.coli DHlOBac感受態細胞，然后利用其含有細菌Tn7轉座系統，將該基因轉座至桿狀病毒穿梭載體bacmid中，得到重組質粒Bacmid-f IagelIin+0RF2，將其轉染昆蟲Sf9細胞，獲得重組桿狀病毒，并以昆蟲Sf9細胞為寄主細胞培養病毒，采用N1-NAT親和層析法純化帶有His標簽的目的蛋白。
[0011]本發明提供的flagellin+Cap融合蛋白中的鼠傷寒沙門菌鞭毛蛋白(flagellin)作為TLR5的識別受體，可誘導產生天然免疫應答。鞭毛蛋白還可以通過自身激發先天性免疫系統產生應答，以啟動增強特異性免疫系統對其他與鞭毛蛋白相連接的抗原產生特異性的應答，發揮較強的免疫佐劑作用，而且可以在粘膜表面誘導以Th2型免疫反應并且伴有IgA的分泌。本發明提供的融合蛋白中的Cap蛋白是0RF2閱讀框編碼的PCV2結構蛋白。此蛋白具有良好的免疫原性，是PCV2的保護性抗原，其誘導的中和抗體能保護宿主不受PCV2的感染。可見，本發明提供的融合蛋白，鞭毛蛋白作為佐劑增強了 Cap蛋白的免疫應答，具有更好的保護作用。另外，本發明研究意外發現，刪除核定位信號的Cap蛋白(A0RF2)比原蛋白具有更強的免疫原性，然而將flagellin+Cap融合表達與將flagellin+Λ 0RF2融合表達相比，前者卻表現出更佳的免疫保護力。
[0012]本發明是通過真核表達系統中Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統將鼠傷寒沙門氏菌鞭毛蛋白與豬2型圓環病毒Cap蛋白進行融合表達，表達融合蛋白的周期短，其表達產物具有與天然產物相似的理化和生物學特性，能對蛋白質進行正確的翻譯后加工修飾，表達穩定，而且表達產量高，且該融合蛋白具有良好的免疫原性，對實驗動物進行強毒攻擊后有較好的免疫保護力。本發明的鞭毛蛋白是經過改造后的鞭毛蛋白，其中去掉了鞭毛蛋白毒力的部分，消除了鞭毛蛋白毒力的影響，因此通過本發明提供的表達系統能獲得沒有毒副作用的且具有免疫學活性的表達產物，對抗豬2型圓病毒新型疫苗的開發具有重要的意義。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0013]圖1是目的基因擴增結果，其中I~3分別是A0RF2，Flagellin-Δ 0RF2,FlagelIin-0RF2 的擴增條帶；M 是 DL2000Marker。[0014]圖2是目的基因擴增到DH5a鑒定結果，其中1、2是pFastBac-Λ 0RF2，3、4 是 pFastBac-Flagellin-Δ 0RF2, 5 是 pFastBac-Flagellin_0RF2 基因條帶；M 是DL2000Markero
[0015]圖3是陽性重組質粒轉化到DHlOBac感受態細胞后，提取質粒PCR鑒定結果，其中，1 ~6 分別是 Λ 0RF2、Flagellin-Λ 0RF2、Flagellin-0RF2、pFastBac-Λ 0RF2、pFastBac-Flagellin-Δ0RF2 和 pFastBac-Flagellin_0RF2 ;M 是 DL2000Marker。
[0016]圖4是重組桿狀病毒轉染Sf9細胞結果，其中，(I)是轉染后Sf9細胞，(2)是Bacmid空載體，(3)正常Sf9細胞。
[0017]圖5是轉染Sf9細胞沉淀進行Western-blot結果，其中，I~3分別是Bac-flagellin-0RF2, Bac-f Iagellin- Δ 0RF2 和 Bac_A0RF2 ;M 是 7_175KDmarker。
[0018]圖6是IFA檢測重組質粒轉染Sf9細胞結果，其中I~5分別是Bac-Λ 0RF2轉染Sf9 細胞、Bac-Flagellin- Δ 0RF2 轉染 Sf9 細胞、Bac-FlagelIin_0RF2 轉染細胞、Bacmid 空質粒對照和正常Sf9細胞IFA檢測結果。
[0019]圖7是SDS鑒定蛋白純化結果，其中，I~4分別是Bac-A0RF2、Bac_0RF2、Bac-f Iagellin- Δ 0RF2 和 Bac-f lagelIin_0RF2 組純化條帶；M 是 7-175KDmarker。
[0020]圖8是Western-blot鑒定純化蛋白結果，I~4分別是Bac-Λ 0RF2，Bac_0RF2，Bac-f Iagellin- Δ 0RF2, Bac-f lagel I in_0RF2 組純化條帶；M 是 7-175KD marker。
[0021]圖9是ELISA檢測免疫后小鼠血清內抗體水平圖，其中(I)免疫劑量為2 μ g的小鼠血清內抗體水平，(2)免疫劑量為10 μ g的小鼠血清內抗體水平。
[0022]圖10是ELISA檢測攻毒后小鼠血清內抗體水平圖，其中(I)免疫劑量)免疫劑量為2μ g的小鼠攻毒后血清內抗體水平，(2)免疫劑量為10 μ g的小鼠攻毒后血清內抗體水平。
[0023]圖11是小鼠血清內中和抗體水平。
[0024]圖12是免疫組和對照組小鼠攻毒后，肝臟與腎臟免疫組織化學觀察圖，其中，(A):空白對照肝組織，(B):Bac-flagellin-0RF2免疫攻擊組小鼠肝組織，(C):Bac-0RF2免疫攻擊組小鼠肝組織，(D):空白對照攻擊組小鼠肝組織，(E):空白對照腎組織，(F):Bac-f lagel I in-0RF2免疫攻擊組小鼠腎組織，(G):Bac-0RF2免疫攻擊組小鼠腎組織，(H):空白對照攻擊組小鼠腎組織。
【具體實施方式】
[0025]以下實施例用于對本發明的進一步說明，但不應該理解為對本發明的限制。在不背離本發明精神和實質的前提下，對本發明所做的修飾或者替換，均屬于本發明的范疇。
[0026]實施例1豬2型圓環病毒Cap蛋白與鼠傷寒沙門菌鞭毛蛋白在昆蟲Sf9細胞中的融合表達
[0027]1.1構建重組載體
[0028]1.1.1 A0RF2、Flagellin-0RF2 和 Flagellin-A0RF2 基因的 PCR 擴增:
[0029]人工合成的A0RF2基因，其是刪除核定位信號的編碼Cap蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0.9所示；人工合成的FlagelIin-0RF2基因核酸序列見SEQ ID N0.1 ；Flagellin-Λ 0RF2基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.10所示。[0030]A0RF2基因的上下游引物，分別是:
[0031]上游引物(Pl):CCCTCGAGGAATGGCATCTTCAACACCCG
[0032]下游引物(P2):CCCAAGCTTGGAGGGTTAAGTGGGGGGTCTTTAA ；
[0033]FlagelIin-0RF2 和 Flagellin-Λ 0RF2 的上下游引物分別是:
[0034]上游引物(Ρ3):CCCTCGAGGATGACGTATCCAAGGAGGCG
[0035]下游引物(Ρ4): CCTCGAGGATGGCACAAGTAATCAACAC
[0036]其中Ρ1、Ρ3、Ρ4包含XhoI酶切位點，見下劃線，Ρ2包含HindIII酶切位點，見下劃線，通過對PCR反應條件和試劑優化后建立20 μ I的反應體系，見表1:
[0037]表1:PCR反應具體物質的量
[0038]
【權利要求】
1.一種融合蛋白，其為豬2型圓環病毒Cap蛋白與鼠傷寒沙丨I囷鞭毛蛋白的融合蛋白。
2.根據權利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQID N0.2所示。
3.編碼權利要求1所述融合蛋白的基因。
4.根據權利要求3所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID N0.1所示。
5.—種表達載體,其含有權利要求3或4所述的基因。
6.—種細胞系,其含有權利要求5所述的表達載體。
7.一種抗豬2型圓環病毒病的重組亞單位疫苗，其特征在于，其保護性抗原是權利要求I所述的融合蛋白。
8.制備權利要求1所述融合蛋白的方法，其包括以下步驟:人工合成編碼權利要求1所述蛋白的基因，連接到pFastBac-HA質粒，得到重組載體pFastBacHA-flagellin+0RF2,轉化E.coli DHlOBac感受態細胞，然后利用其含有細菌Tn7轉座系統，將該基因轉座至桿狀病毒穿梭載體bacmid中，得到重組質粒Bacmid-f lagellin+0RF2,將其轉染昆蟲Sf9細胞，獲得重組桿狀病毒，并以昆蟲Sf9細胞為寄主細胞培養病毒，采用N1-NAT親和層析法純化帶有His標簽的目的蛋白。`
【文檔編號】A61K39/12GK103739717SQ201410018219
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2014年1月15日 優先權日:2014年1月15日
【發明者】劉爵, 張春燕, 韋莉, 王菁, 朱珊珊, 全榮, 閻旭, 李子璇 申請人:北京市農林科學院