一種針對宮頸癌具有免疫原性的蛋白及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種針對宮頸癌具有免疫原性的蛋白及其應用，本發明的針對宮頸癌具有免疫原性的蛋白，為含有人乳頭瘤病毒16亞型E7原癌蛋白(HPV16E7)的蛋白，本發明還進一步公開了一種重組減毒單核細胞增生性李斯特細菌，所述重組減毒單核細胞增生性李斯特細菌的基因組中整合有密碼子優化的HPV16E7的編碼基因。本發明的融合蛋白或其編碼基因或重組減毒單核細胞增生性李斯特細菌可用于制備宮頸癌疫苗。
【專利說明】一種針對宮頸癌具有免疫原性的蛋白及其應用
【技術領域】[0001]本發明屬于基因工程【技術領域】，尤其涉及一種針對宮頸癌具有免疫原性的融合蛋白及其應用。
【背景技術】
[0002]宮頸癌居于全球女性癌癥發病率的第二位，是重要的公共健康問題。全球每年新發宮頸癌病例約50萬，有27.3萬人死于宮頸癌，其中約85%死亡病例發生在發展中國家，中國每年新增宮頸癌病例約有13.5萬，占全球新發病例的1/3，因此中國也是宮頸癌高發國之一。當前，人乳頭瘤病毒(HPV)已被證實是引起宮頸癌的主要病原，至少在99%宮頸癌患者組織內檢測到HPV DNA。
[0003]依據HPV的致癌危險性，分類為低危型和高危型。高度致癌危險的病毒主要包括HPV16、18、26、31、33、35、45、51、52、56、66等亞型，通常在高度鱗狀上皮內病變(CIN2~3)中發現。其中HPV16、18可在絕大多數宮頸癌中發現，并且50%以上的宮頸癌患者由HPV16引起。2008年6月，歷時5年的《中國婦女人乳頭瘤病毒感染和宮頸癌流行病學調查》結果顯示，HPV16和HPV18是導致中國婦女患子宮頸癌的最主要類型。
[0004]E7蛋白可以抑制Rb (retinoblastoma gene)的抑癌功能,從而以多種方式擾亂正常細胞周期，引起細胞周期的失控，導致細胞的過度增殖，細胞轉化及惡變。E7是維持細胞轉化和惡性癌變所必需的，因此E7常作為HPV血清學診斷抗原和宮頸癌治療性疫苗研究的革巴抗原。
[0005]單核細胞增生性李斯特菌(Lm)是一種宿主譜廣泛的兼性胞內菌。Lm被巨噬細胞和其它吞噬細胞吞噬后，既能存在于吞噬體內，又能定居在細胞胞漿中，使Lm運送的外源抗原可以同時進入MHC I類和MHC II類抗原提呈途徑，從而誘導強烈的⑶4+T細胞和⑶8+T細胞免疫應答。這種獨特的胞內生活史，使單增李斯特菌成為研究宿主和細菌相互作用及宿主免疫應答的模式細菌，尤其誘導強烈的CD8+T細胞免疫應答，其作為傳染性疾病和腫瘤疾病疫苗載體具有廣闊應用前景。
【發明內容】
[0006]本發明的目的在于克服現有技術中的缺陷，提供一種具有宮頸癌免疫原性的融合蛋白及其應用。
[0007]本發明一方面提供了一種密碼子優化的HPV16E7蛋白。
[0008]所述密碼子優化的HPV16E7蛋白的氨基酸序列如SEQID.1所示:編碼HPV16E7蛋白的基因序列為李斯特菌密碼子偏好的基因序列，如SEQ ID.6所示。
[0009]本發明還公開了一種含有所述HPV16E7蛋白的融合蛋白
[0010]進一步的，所述融合蛋白為單核細胞增生性李斯特菌溶血素蛋白LLO與密碼子優化的HPV16E7的融合蛋白。
[0011]所述單核細胞增生性李斯特菌溶血素蛋白LLO的氨基酸序列如SEQ ID.2所示:[0012]所述融合蛋白中，密碼子優化的HPV16E7蛋白插入于前述單核細胞增生性李斯特菌溶血素蛋白LLO的第37位和第38位氨基酸殘基之間，其氨基酸序列如SEQ ID.3所示。
[0013]所述融合蛋白針對宮頸癌具有較強的免疫原性。
[0014]本發明第二方面提供了一種多核苷酸，其編碼所述融合蛋白。
[0015]本發明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。
[0016]本發明第三方面提供了一種載體，其含有所述多核苷酸。
[0017]本領域的技術人員熟知的方法能用于構建所述載體。這些方法包括重組DNA技術、DNA合成技術等。可將編碼所述融合蛋白的DNA有效連接到載體中的多克隆位點上，以指導mRNA合成進而表達蛋白，或者用于同源重組。
[0018]較佳的，所述載體為原核載體或穿梭質粒，如原核載體PMD-20T、穿梭質粒pKSV7
坐寸ο
[0019]本發明第四方面提供了一種宿主細胞，其被所述載體所轉化。
[0020]宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有:大腸桿菌，鏈霉菌屬；鼠傷寒沙門菌、李斯特細菌；真菌細胞如酵母；植物細胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細胞；CH0，COs.293細胞、或Bowes黑素瘤細胞的動物細胞等。
[0021]其中，特別優選單核細胞增生性李斯特細菌(Listeria monocytogenes,以下簡寫為 LM),如 yzuLM4 等。
[0022]本發明第五方面提供了一種重組減毒單核細胞增生性李斯特細菌，所述重組減毒單核細胞增生性李斯特細菌的基因組中，整合有密碼子優化的HPV16E7基因，所述重組減毒單核細胞增生性李斯特細菌能融合表達單核細胞增生性李斯特菌溶血素蛋白LLO與HPV16E7融合蛋白。
[0023]進一步的，所述編碼HPV16E7蛋白的基因重組整合于野生型單核細胞增生李斯特菌基因組DNA中hly基因的111位與154位堿基之間。
[0024]進一步的，相比野生型單核細胞增生李斯特菌，本發明將野生型單核細胞增生李斯特菌hly基因的第112-153位堿基替換為HPV16E7基因SEQ ID.6。亦即，本發明的重組減毒單核細胞增生李斯特菌中，野生型的hly編碼基因被替換成了序列為3的融合蛋白的編碼基因。
[0025]本發明第六方面公開了所述重組減毒單核細胞增生性李斯特細菌的構建方法，包括下列步驟:
[0026]I)從公司合成密碼子優化的HPV16E7蛋白編碼基因片段；從單核細胞增生李斯特菌株中擴增出待插入位點的上游同源臂片段hlya和下游同源臂片段hlyb ；
[0027]2)將步驟I)獲得的密碼子優化的HPV16E7編碼基因及上下游同源臂片段拼接成hIya-HPV16E7-hIyb融合片段并連接入穿梭質粒獲得重組穿梭質粒；
[0028]3)將步驟2)獲得的重組穿梭質粒轉化單核細胞增生性李斯特細菌，經過抗性和溫度雙壓力篩選，再通過無抗性傳代得到無抗性基因的重組減毒單核細胞增生性李斯特細菌。
[0029]進一步的，步驟I)中，擴增獲得的上游同源臂片段hlya的序列為SEQ ID.4:[0030]下游同源臂片段hlyb的序列為SEQ ID.5:HPV16E7基因為SEQ ID.6:
[0031]進一步的，步驟I)和3)中所述單核細胞增生李斯特菌株為單核細胞增生李斯特菌株 yzuLM4。
[0032]進一步的，步驟2)可采用重疊衍生PCR技術(SOEing PCR)拼接各片段，再利用酶切位點將拼接片段插入穿梭載體中。
[0033]進一步的,步驟2)中，穿梭質粒可為pKSV7。拼接成的hlya-E7_hlyb融合片段的序列為SEQ ID.7。
[0034]本發明第六方面，提供了所述的融合蛋白或其編碼基因或所述重組減毒單核細胞增生性李斯特細菌在制備宮頸癌疾病疫苗上的用途。
[0035]進一步的,所述重組細菌疫苗為針對宮頸癌疾病的治療性疫苗。
[0036]本發明第七方面，提供了一種疫苗，包括所述融合蛋白或所述重組減毒單核細胞增生性李斯特細菌。
[0037]所述疫苗中還可進一步包括佐劑。
[0038]本發明利用單核細胞增生李斯特菌能在細胞吞噬體內存活，同時也能從細胞吞噬體中“逃逸”出來,進入細胞質繁殖,誘發機體產生強烈的CD8+T細胞免疫應答的特性。利用同源重組技術，將外源融合蛋白基因定點插入到載體生物基因組中。由此提供的融合表達HPV16E7抗原的疫苗能有效提高宿主對宮頸癌疾病的免疫保護效應，為宮頸癌疫苗提供了新的思路。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0039]圖1 是 pKSV7-hlya-E7-hlyb 的 Xba I 與 Kpn I 雙酶切及 PCR 電泳圖；
[0040]Μ: λ -14Marker
[0041]L:DL2000Marker
[0042]I:PCR 結果
[0043]2:pKSV7-E7_hly 雙酶切結果。
[0044]圖2是重組細菌的鑒定結果；
[0045]1:DL2000Marker
[0046]2:LM4Ahly:: E7-1PCR 產物。
[0047]圖3是蛋白水平檢測目的基因的表達
[0048]M:預染 marker
[0049]123:Lm4 Ahly:: E7-1 的分泌蛋白
[0050]4:LM4的分泌蛋白。
[0051]圖4是分泌融合蛋白LL0-HPV16E7的溶血活性檢驗
[0052]PBS = PBS 對照組
[0053]LM4:單核細胞增生李斯特菌yzuLM4組
[0054]Lm4 Δ hly::E7_1:重組減毒菌組。
[0055]圖5是重組菌對C57BL/6小鼠誘導產生的細胞因子的結果。
[0056]PBS:陰性對照組
[0057]rLm4:重組減毒菌 LM4Ahly:: E7-1 組。[0058]圖6是二次免疫后小鼠腫瘤大小。
[0059]PBS:陰性對照組
[0060]實驗組:LM4Λ hly:: E7-1 組
[0061]LM4 組。
【具體實施方式】
[0062]本發明實施例采用了下列技術方案:
[0063]首先，從公司合 成密碼子優化的HPV16E7基因序列，從單核細胞增生李斯特菌株yzuLM4中擴增出hly上游片段和下游片段，經膠回收后得到的hIya-HPV16E7_hIyb融合片段與PMD-20T (TaKaRa公司)載體連接，轉化至大腸桿菌DH5a感受態細胞中，經PCR與雙酶切驗證正確的陽性克隆送至南京金斯瑞公司并測序；將測序正確的陽性克隆進行提取質粒，進而雙酶切，回收目的片段，再與穿梭載體PKSV7連接，轉化至大腸桿菌DH5 α感受態細胞中，經PCR與雙酶切驗證正確，將陽性質粒電轉化至yzuLM4感受態細胞，通過抗性和溫度雙壓力篩選，再通過無抗性傳代得到無抗性基因的同源重組單核細胞增生李斯特菌。該菌為一種重組減毒菌LM4Ahly:: E7_l。該菌可在正常生活情況下表達E7-LL0蛋白。
[0064]構建重組減毒菌具體方法主要包括下列步驟:
[0065]1.用PCR技術擴增出目的基因E7以及hly基因待插入位點的上下游同源片段hlya、hlyb。所用到的引物如下:
[0066]
【權利要求】
1.一種針對宮頸癌具有免疫原性的蛋白，為在減毒重組李斯特菌中分泌表達的HPV16E7的蛋白。
2.一種編碼權利要求1所述蛋白的基因，其特征在于，為李斯特菌密碼子偏好的基因序列，其序列如SEQ ID.6所示。
3.一種融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白為單核細胞增生性李斯特菌溶血素蛋白LLO與HPV16E7的融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID.3所示。
4.一種重組減毒單核細胞增生性李斯特細菌，其特征在于該重組減毒單核細胞增生性李斯特細菌的基因組中，整合有HPV16E7的基因，所述重組減毒單核細胞增生性李斯特細菌能融合表達單核細胞增生性李斯特菌溶血素蛋白LLO與HPV16E7的融合蛋白。
5.如權利要求4所述重組減毒單核細胞增生性李斯特細菌，其特征在于，編碼HPV16E7的基因重組整合于野生型單 核細胞增生李斯特菌基因組DNA中hly基因的111位與154位堿基之間。
6.一種疫苗，包括權利要求3所述融合蛋白或權利要求4或5所述重組減毒單核細胞增生性李斯特細菌。
【文檔編號】A61K39/02GK103739682SQ201410017908
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2014年1月15日 優先權日:2014年1月15日
【發明者】焦新安, 殷月蘭, 段斐斐, 潘志明, 陳祥, 孫林, 黃金林 申請人:揚州大學