Pcbp1基因制備放療增敏試劑盒的應用的制作方法

Pcbp1基因制備放療增敏試劑盒的應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了PCBP1基因在制備放療增敏試劑盒中的應用，具體涉及PCBP1基因在制備包括重離子射線在內的電離輻射作為腫瘤放療增敏試劑盒中的應用。其中所述PCBP1基因的核苷酸序列為SEQ ID NO.1，其構建在真核表達質粒中。PCBP1協同重離子束，調控腫瘤轉移和侵襲相關的CD44v6基因表達，抑制了HeLa腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲；顯著下調細胞周期調節蛋白Cyclin D1，促使細胞發生G0／G1期阻滯，增加HeLa細胞中對輻射敏感性；此外，上調促凋亡蛋白Tap73、線粒體凋亡通路MCL表達，下調抑制凋亡DelNp73蛋白，誘發更多HeLa細胞發生凋亡。
【專利說明】PCBP1基因制備放療增敏試劑盒的應用

【技術領域】
[0001] 本發明涉及多聚胞啼陡結合蛋白I (poly C binding proteinl，PCBPl，或 heterogeneous nuclear ribonuclear protein El, hnRNP El 或 a-complex proteinl, a CPI)基因的新用途，具體涉及PCBPl基因在制備放療增敏藥物中的應用。

【背景技術】
[0002] 宮頸癌是我國常見的女性生殖道惡性腫瘤之一。宮頸癌發病率已成為大中城市中 死亡率增長最快的癌癥，且發病年齡表現為逐漸年輕化，已成為嚴重危害我國婦女健康的 疾病之一。
[0003] 放射治療是腫瘤治療的常規手段之一，70%?80%的惡性腫瘤患者在治療過程中 需接受放療。同化療一樣，放療還是重要的姑息治療手段。依據循證醫學的資料嚴格估算， 52%的腫瘤患者在其腫瘤治療過程中會接受至少一次放射治療。常規外照射對各類實體腫 瘤的局控率是不相同的，同一病理類型腫瘤放療的有效率也不一致。臨床上將其主要歸因 于腫瘤細胞的內在放射抵抗性、放射后腫瘤細胞加速再增殖、總體腫瘤負荷和氧合狀態等 因素。如何提高放射治療療效已成為放療領域的一大熱點話題，藥物增敏已有多年的歷史， 但其療效和穩定性方面一直不是很理想。由于分子生物技術的迅猛發展，腫瘤基因放射治 療是近年來發展起來的具有良好前景的抗腫瘤治療新方法。該方法是將放射治療與基因治 療聯合起來應用于腫瘤治療。在對腫瘤實施局部放療的同時誘導治療基因的表達，射線和 基因對腫瘤形成聯合殺傷。基因放射治療具有提商腫瘤治療基因的局部表達量、降低有效 照射劑量、減輕受照部位正常組織的放射損傷等諸多優點。而該方法面臨的難題之一是如 何篩選到輻射敏感相關的靶基因。將放射治療與基因治療相結合，事半功倍，已成為腫瘤治 療研究的重要方向之一。因此開展新的基因的研究是當前惡性腫瘤基因-放射治療的研究 重點之一。
[0004] 近年來，多聚胞啼陡結合蛋白I (poly C binding proteinl, PCBP1,或 heterogeneous nuclear ribonuclear protein El, hnRNP El 或 a-complex proteinl, a CPI)的研究進展為我們這項發明的提出提供了契機。PCBPl功能多樣，在多個水平廣泛 參與了基因的表達調控，調控的靶基因涉及細胞增殖、物質代謝、細胞分化、造血調控、胚胎 發育和病毒復制等多方面，它的異常會引起這些靶基因的表達水平的改變，從而導致如腫 瘤等。目前，國內外科研工作者對RNA結合蛋白，尤其是對PCBPl的研究取得了一些初步的 進展。通過酵母雙雜交系統發現了 8個PCBPl相互作用蛋白，提示這些PCBPl可能參與細 胞周期、白噬、免疫應答等過程[酵母雙雜交系統3篩選人源核不均一核糖核蛋白El的功 能伙伴.中國組織工程研究與臨床康復.2010年第14期]。PCBPl或其保守序列未發生變 化的變異多肽或其活性片段或其活性片段衍生物在制備預防或治療帕金森病藥物中具有 重要的應用[參見，申請號為201210555379. 3的發明專利申請，其發明名稱為"多聚胞嘧啶 結合蛋白1在制備預防及治療帕金森病藥物中的應用"]。在慢性粒細胞白血病急性發作 期BCR / ABL融合基因的表達增高，導致PCBPl蛋白水平升高。而PCBPl能夠抑制該基因 的表達，最終抑制細胞分化，導致腫瘤的發生。PCBPl可參與STAT3介導的對NF-κ B活化通 路的抑制作用，有利于細胞處于抗凋亡狀態[核不均一核糖核蛋白（hnRNPs)與腫瘤關系的 研究進展.廣州醫學院學報.2007年第35期]。在人肝癌細胞中，PCBPl調控細胞表面粘 連分子CD44基因的選擇性剪接[PCBP1調控人肝癌細胞CD44選擇性剪接參與的腫瘤細胞 的侵襲.FEBSLett. 2012年第586期，第10卷，頁碼：431-438]。Cancer Cell上發表文章， PCBPl調控腫瘤相關基因的表達[PCBP1抑制和腫瘤侵襲相關的PRL-3蛋白磷酸化.Cancer Cell. 2010年第18期，第1卷，頁碼：52-62]。這些研究的發現給大家提供了治療腫瘤疾病 的新線索。通過調節這些能夠與腫瘤相關基因的mRNA3或者5非編碼區相結合的PCBPl蛋 白，抑止或者上調腫瘤相關基因的表達水平而達到阻礙腫瘤疾病的發生與發展的目的。那 么PCBPl是否是一個新的腫瘤增敏的靶標？這方面的研究目前國內外尚無報道。本研究率 先展開直接將PCBPl在人的宮頸癌細胞HeLa中過表達，研究該基因在輻射增敏中的作用， 從而可望提高宮頸癌病人的生存率。因此，本發明提供了 PCBPl基因制備放療增敏藥物的 潛在應用價值。


【發明內容】

[0005] 本發明目的是提供PCBPl (poly C binding proteinl，多聚胞啼陡結合蛋白1)基 因的新功能，即PCBPl基因在制備放療增敏試劑盒中的應用。
[0006] 為達到上述目的，本發明采用的技術方案是=PCBPl基因在制備放療增敏試劑盒 中的應用。具體地，脂質體介導的真核表達質粒PCDNA3-PCBP1在制備放療增敏試劑盒中的 應用。
[0007] 本發明同時要求保護一種放療增敏試劑盒，所述放療增敏試劑盒的活性成分包括 攜帶PCBPl基因的真核表達質粒。在一個優選的實施方案中，所述攜帶PCBPl基因的真核 表達質粒為脂質體介導的真核表達質粒PCDNA3-PCBP1。
[0008] 本發明還提供了一種應用脂質體介導的真核表達質粒pcDNA3-PCBP 1增強腫 瘤細胞對放療敏感性的方法。所述方法包括：放療前將脂質體介導的真核表達質粒 pcDNA3-PCBPl導入腫瘤細胞，使PCBPl基因在腫瘤細胞中表達，然后進行放療。
[0009] 上述技術方案中，真核表達質粒pcDNA3_PCBPl的制備方法為現有技術，可以參見 文獻：張林、侯艷紅、王孟薇、吳本儼、李楠.中華腫瘤防治雜志.2008 (16)。
[0010] 其中所述的PCBPl基因來源于人，基因文庫中的標號為NM006196。其基因序列為：
[0011] atggatgccggtgtgactgaaagtggactaaatgtgactctcaccattcggcttcttatgcacggaaag gaagtaggaagcatcattgggaagaaaggggagtcggttaagaggatccgcgaggagagtggcgcgcggatcaacat ctcggaggggaattgtccggagagaatcatcactctgaccggccccaccaatgccatctttaaggctttcgctatga teatcgacaagctggaggaagatatcaacagctccatgaccaacagtaccgcggccagcaggcccccggtcaccctg aggctggtggtgccggccacccagtgcggctccctgattgggaaaggcgggtgtaagatcaaagagatccgcgagag tacgggggcgcaggtccaggtggcgggggatatgctgcccaactccaccgagcgggccatcaccatcgctggcgtgc cgcagtctgtcaccgagtgtgtcaagcagatttgcctggtcatgctggagacgctctcccagtctccgcaagggaga gtcatgaccattccgtaccagcccatgccggccagctccccagtcatctgcgcgggcggccaagatc ggtgcagc gac gctgc gggctacccccatgccacccatgacctggagggaccacctctagatgcctactcgattcaaggaca acacaccatttctccgctcgatctggccaagctgaaccaggtggcaagacaacagtctcactttgccatgatgcac ggcgggaccggattcgccggaattgactccagctctccagaggtgaaaggctattgggcaagtttggatgcatcta ctcaaaccacccatgaactcaccattccaaataacttaattggctgcagtaatcgggcgccaaggcgccaacatta atgagatccgccagatgtccggggcccagatcaaaattgccaacccagtggaaggctcctctggtaggcaggtta ctatcactggctctgctgccagtattagtctggcccagtatctaatcaatgccaggctttcctctgagaagggca tggggtgcagctag(SEQ ID Ν0·1)〇
[0012] 上述技術方案中，所述腫瘤細胞包括但不限于宮頸癌細胞。
[0013] 本發明還提供一種增強腫瘤細胞對放療的敏感性的方法。所述方法包括：在放療 之前，向所述腫瘤細胞轉染包含PCBPl的真核表達載體；待PCBPl在轉染的腫瘤細胞中表達 后，對所述腫瘤細胞施加放療。
[0014] 在一個優選的實施方案中，本發明所述的"放療"是指重離子輻照療法。并且，所 述腫瘤細胞包括但不限于宮頸癌細胞。
[0015] 由于上述技術方案的運用，本發明與現有技術相比具有下列優點：
[0016] (I)PCBPl協同重離子束，調控腫瘤轉移和侵襲相關的-⑶44ν6基因表達，抑制了 HeLa腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲。
[0017] (2)PCBPl協同重離子束，顯著下調細胞周期調節蛋白Cyclin D1，促使細胞發生 GO / Gl期阻滯，增加 HeLa細胞中對輻射的敏感性。
[0018] (3)PCBPl協同重離子束，上調促凋亡蛋白Tap73、線粒體凋亡通路MCL的表達，下 調抑制凋亡DelNp73的蛋白，誘發了更多的HeLa細胞發生凋亡。
[0019] 本發明所述PCDNA3-PCBP1轉染聯合放療對人宮頸癌HeLa細胞誘導凋亡的作用高 于單一放療組，呈現明顯放療增敏協同效應。因此，本發明從腫瘤細胞增殖、遷移、侵襲、周 期阻滯和凋亡的多個層面上提供了 PCBPl基因制備放療增敏試劑盒的潛在應用價值。
[0020] 綜上所述，本發明提供下述技術方案：
[0021] I. PCBPl基因在制備放療增敏試劑盒中的應用。
[0022] 2.根據第1項所述的應用，其中所述PCBPl基因構建在真核表達質粒中，其中所述 PCBPl基因的核苷酸序列為SEQ ID NO. 1。
[0023] 3.根據第2項所述的應用，其中所述PCBPl基因構建在pcDNA3質粒中。
[0024] 4.根據第1項所述的應用，其中所述試劑盒用于治療宮頸癌。
[0025] 5.根據第1項所述的應用，其中所述放療為重離子輻照治療。
[0026] 6. -種放療增敏試劑盒，其中所述放療增敏試劑盒的活性成分包括攜帶PCBPl基 因的真核表達質粒。
[0027] 7.根據第6項所述的放療增敏試劑盒，其中所述PCBPl基因的核苷酸序列為SEQ ID NO. 1。
[0028] 8.根據第6項所述的放療增敏試劑盒，其中所述攜帶PCBPl基因的真核表達質粒 為脂質體介導的真核表達質粒PCDNA3-PCBP1。
[0029] 9.根據第6項所述的放療增敏試劑盒，所述試劑盒用于治療宮頸癌。
[0030] 10.根據第6項所述的放療增敏試劑盒，其中所述放療是重離子輻照療法。
[0031] 11. 一種增強腫瘤細胞對放療的敏感性的方法，所述方法包括：在放療之前，向所 述腫瘤細胞轉染包含PCBPl的真核表達載體；待PCBPl在轉染的腫瘤細胞中表達后，對所述 腫瘤細胞施加放療。
[0032] 12.根據第11項所述的方法，其中所述包含PCBPl的真核表達載體為包含PCBPl 的pcDNA3載體，其中所述PCBPl墓因的核苷酸序列為SEQ ID NO. 1。
[0033] 13.根據第11項所述的方法，其中所述放療為重離子輻照療法。
[0034] 14.根據第11項所述的方法，其中所述腫瘤細胞為宮頸癌細胞。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0035] 從下面結合附圖的詳細描述中，本發明的上述特征和優點將更明顯，其中：
[0036] 圖1是PCBPl細胞模型的建立。PCBPl在人宮頸癌HeLa細胞中調控抑制凋亡蛋白 DeltaNp73的表達。NC表示無重離子輻照，且有空載體導入；siPCBPl表示PCBPl基因表達 受到干擾，降低表達；overEpl表示PCBPl超表達；overEp2表示PCBPl超表達。與對照組比 較：*，Ρ〈0· 05。**，Ρ〈0· 01 ;***，Ρ〈0· 001。
[0037] 圖2是PCBPl協同重離子輻射抑制人宮頸癌HeLa細胞的增殖。A圖顯示通過結晶 紫染色方法觀察PCBPl協同重離子輻射對人宮頸癌HeLa細胞增殖的影響。B圖顯示通過羅 氏細胞增殖試劑盒分析PCBPl協同重離子輻射對人宮頸癌HeLa細胞增殖的影響。A圖中， NC表示無重離子輻照，且有空載體導入；NC+IR表示4Gy重離子照射劑量，且有空載體導入； over Exp表示有PCBPl基因的超表達；IR+over Exp表示4Gy的重離子照射，且有PCBPl基 因的超表達。B圖中以吸光值為縱坐標，處理為橫坐標。NC表示無重離子輻照；NC+Control 表示無重離子福照，且有空載體導入；4Gy表示重離子照射劑量；4Gy+over Exp表示4Gy的 重離子照射，且有PCBPl基因的超表達。
[0038] 圖3是PCBPl協同重離子輻射降低了人宮頸癌HeLa細胞侵襲、周期阻滯以及凋亡 基因的表達。NC表示無重離子輻照，且有空載體導入；siPCBPl表示PCBPl基因表達受到干 擾，降低表達；overEpl表示PCBPl超表達；overEp2表示PCBPl超表達。與對照組比較：*， Ρ〈0·05〇 #，Ρ〈0·01;***，Ρ〈0·001〇
[0039] 圖4是PCBPl協同重離子抑制腫瘤細胞的遷移。NC表示無重離子輻照，且有空載 體導入；over Exp表示有PCBPl基因的超表達。
[0040] 圖5是PCBPl協同重離子輻射降低了人宮頸癌HeLa細胞侵襲力。NC表示無重離 子福照，且有空載體導入；IR表示4Gy的重離子照射,且有空載體的導入；IR+over Exp表示 4Gy的重離子照射，且有PCBPl基因的超表達。
[0041] 圖6是激光共聚焦顯微鏡觀察PCBPl協同重離子輻射促進凋亡蛋白Tap73的表達 (IOOx)。藍色熒光為DAPI復染的細胞核；紅色熒光為PCBPl的熒光染色；綠色熒光為Tap73 的免疫染色。
[0042] 圖7是激光共聚焦顯微鏡觀察PCBPl協同重離子輻射降低了抑制凋亡蛋白 DeltaNp73的表達。藍色熒光為DAPI復染的細胞核；紅色熒光為DeltaNp73的熒光染色。

【具體實施方式】
[0043] 下面參照具體的實施例進一步描述本發明，但是本領域技術人員應該理解，本發 明并不限于這些具體的實施例。
[0044] 實施例I. PCBPl協同重離子射線對人宮頸癌HeLa腫瘤的輻射增效作用
[0045] 1.實驗材料
[0046] 人宮頸癌HeLa細胞最初購白中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心（目 錄號：TCHul87)，之后在本實驗室中培養和保存；D-MEM培養基干粉、小牛血清、胰酶粉末購 白Gibco公司；碘化丙啶（PI)購白江蘇碧云天生物技術研究所；二甲基亞砜（DMSO)、瓊脂 糖和Tween-20購白上海高科技生物工程有限公司；抗PCBP1、Tap73、和DeltaNp73等抗體 購白美國SantaCruzs生物技術公司。Lipofectamine?2000轉染試劑購白美國Invitrogen 公司。分別用重離子輻照細胞實驗材料。用中國科學院蘭州近代物理研究所的高能12C重 離子束作為射線來源。
[0047] 2.實驗方法
[0048] 2. 1細胞培養和轉染
[0049] 按照常規重組質粒構建方法構建重組真核表達質粒pcDNA3_PCBPl，構建方法可 參見文獻：張林、侯艷紅、王孟薇、吳本儼、李楠.中華腫瘤防治雜志.2008 (16)。插入片段 PCBPl的核苷酸序列為SEQ ID NO. 1所示。
[0050] HeLa細胞培養于含10%小牛血清，谷氨酸胺及100萬U / L青霉素和鏈霉素的 D-MEM培養基。細胞置于5% C02,37°C培養箱內培養，每2-3天傳代1次，取對數生長期細 胞用于實驗。
[0051] 轉染前一天，將細胞用胰酶消化、計數，以合適的密度接種6孔板，置于CO2培養箱 中培養過夜，使轉染當日細胞融合度為70%?90%。在鋪板和轉染期間避免使用抗生素。 轉染溶液配制：按照質粒：Lipofectamine2000用量比為Iyg /孔：2. 5μ1/孔。2yg/ 孔 DNA 加入 100 μ 1 / 孔 D-MEM 混勻，室溫靜置 5min，備用；5 μ 1 / 孔 Lipofectamine2000 加入100 μ 1 /孔基礎D-MEM混勻，室溫靜置5min，備用；將稀釋的DNA同稀釋的脂質體試 劑混合，在室溫保溫30min后，加入800 μ 1 /孔基礎D-MEM備用。用PBS及無抗生素的基 礎DMEM洗滌細胞，每孔加入Iml轉染混合液，5% C02, 37°C培養5h。5h后，棄去含轉染試劑 的培養液，加入新鮮的完全培養基，繼續培養后，72h內完成實驗即為瞬時轉染。轉染后通過 熒光定量PCR進行轉染鑒定。
[0052] 2. 2輻照處理
[0053] 12C6+離子束照射在蘭州重離子加速器研究裝置（HIRFL，中國科學院近代物理研究 所）的深層腫瘤治療終端上進行。坪區照射，能量為250MeV，劑量吸收率為IGy / min，照 射劑量為4Gy(空氣電離室檢測劑量）。對數生長期的細胞用于輻照。轉染實驗24h后進行 重離子輻照，輻照48h收樣。
[0054] 2. 3RNA提取、逆轉錄及熒光定量PCR
[0055] 首先按RNA抽提操作手冊（大連寶生物工程公司）的方法提取對照和處理樣品 RNA，提取的RNA經瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性，通過紫外分光光度計測定260nm與280nm 吸光度值而計算RNA的純度與濃度。然后通過寶生物的反轉錄試劑盒合成cDNA。PCR反應 體系如下：SYBR Pre mix ExTaqTMlOy 1，Forward Primer (10 μ mol / 1)0. 4 μ 1，Reverse ?1^1^1(1(^111〇1/1)0.4 4 1，。0嫩模板2.(^1，蒸餾水加至2(^1。采用祀〇-1^(1105實 時定量PCR儀進行應，反應條件為：95°C變性30s，60°C退火30s，95°C延伸5s，共40個循環。
[0056] 表1熒光定量PCR引物
[0057]

【權利要求】
1. PCBP1基因在制備放療增敏試劑盒中的應用。
2. 根據權利要求1所述的應用，其中所述PCBP1基因構建在真核表達質粒中，其中所述 PCBP1基因的核苷酸序列為SEQ ID NO. 1。
3. 根據權利要求2所述的應用，其中所述PCBP1基因構建在pcDNA3質粒中。
4. 根據權利要求1所述的應用，其中所述試劑盒用于治療宮頸癌。
5. 根據權利要求1所述的應用，其中所述放療為重離子輻照療法。
6. -種放療增敏試劑盒，其中所述放療增敏試劑盒的活性成分包括攜帶PCBP1基因的 真核表達質粒。
7. 根據權利要求6所述的放療增敏試劑盒，其中所述PCBP1基因的核苷酸序列為SEQ ID NO. 1。
8. 根據權利要求6所述的放療增敏試劑盒，其中所述攜帶PCBP1基因的真核表達質粒 為脂質體介導的真核表達質粒PCDNA3-PCBP1。
9. 根據權利要求6所述的放療增敏試劑盒，所述試劑盒用于治療宮頸癌。
10. 根據權利要求6所述的放療增敏試劑盒，其中所述放療為重離子輻照療法。
【文檔編號】A61K48/00GK104338150SQ201410005151
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2014年1月6日 優先權日:2014年1月6日
【發明者】狄翠霞, 張紅, 周鑫, 孫超, 司婧, 甘露, 劉圓圓 申請人:中國科學院近代物理研究所