一種用于抑制豬瘟病毒復制的NS5B303shRNA及其制備方法
【專利摘要】一種用于抑制豬瘟病毒復制的NS5B303shRNA，所述包含siRNA序列，shRNA慢病毒表達載體構建，復制缺陷型慢病毒的獲得、慢病毒感染PK-15細胞（豬腎細胞）以及抑制豬瘟病毒復制效果的驗證方法，該序列具有明顯抑制豬瘟病毒在敏感細胞上復制的作用。本發明對豬瘟病毒體內外復制進行RNA干擾的探索，構建靶向豬瘟病毒基因組的特定保守基因區段的慢病毒載體介導的穩定整合的RNA干擾技術，有望構建靶向豬瘟病毒的siRNA的轉基因動物。為shRNA應用于豬瘟病毒的基因功能研究以及豬瘟的防治積累了必要的實驗數據，為動物的抗病育種提供前期準備。
【專利說明】—種用于抑制豬瘟病毒復制的NS5B303shRNA及其制備方法
[0001]本申請是“申請日:2012年6月4日、申請號:201210180327.2、名稱:一種用于抑制豬瘟病毒復制的RNAi及其制備方法”的分案申請。
【技術領域】
[0002]本發明涉及抑制豬瘟病毒復制的方法，具體說是一種用于抑制豬瘟病毒復制的NS5B303shRNA (NS非結構蛋白，shRNA short hairpin RNA短發夾脫氧核糖核酸),本發明還包括NS5B303shRNA的制備方法。
【背景技術】
[0003]豬瘟(Classical swine fever, CSF)是世界范圍內嚴重危害養豬業的傳染病之一。為了區別于非洲豬痕，歐洲人稱其為“古典豬痕(Classical swine fever, CSF) ”。其病原是豬痕病毒(Classical swine fever virus, CSFV)。CSFV是RNA病毒,屬黃病毒科(Flaviridae)、痕病毒屬(Pestivirus)的成員，與同屬的牛病毒性腹?寫病毒(Bovine viraldiarrhea virus, BVDV)和綿羊邊界病病毒(Border disease virus, BDV)在抗原性和結構上關系密切。CSFV是具有囊膜的正鏈RNA (核糖核酸)病毒，具有感染性。CSFV基因組共編碼4種結構蛋白、8種非結構蛋白。結構蛋白編碼區占據病毒基因組5'端的1/3，非結構蛋白編碼區除Νρι.ο編碼序列位于基因組5'端外，其余均位于病毒基因組3'端的2/3。一般認為病毒侵染細胞是通過囊膜蛋白與細胞表面受體相互作用形成Infecosome (感染復合體)后進入宿主細胞。然而對CSFV感染細胞的細節尚不甚明了。而傳統的疫苗免疫等措施不能有效地應對豬瘟的暴 發和流行，RNAi (核糖核酸干擾)現象的發現及其在抗病毒方面的研究進展，為豬瘟的防制研究開辟了一個新的探索領域。
[0004]RNA干擾(RNA interference, RNAi)是通過內、外源雙鏈RNA觸發的，由19_23bp小分子干擾RNA片段(siRNA)誘導的同源性mRNA (信使RNA)的降解，從而使該基因表達沉默(gene silence)的過程。它是廣泛存在于動、植物中的序列特異性轉錄后基因沉默，是生物體在進化過程中，抵御病毒感染及因重復序列和突變引起的基因組不穩定性的保護機制，同時也是一種真核生物體內的基因調控機制。分子生物學研究的早期，人們對基因的了解都是通過基因突變而獲得的。近年來，反向遺傳學技術廣泛應用于基因功能的研究，使人們對基因功能的研究取得了飛躍式的發展，但該技術在基因重組方面耗時費力。在如今的后基因組時代，RNAi技術以其獨特的優勢成為分析基因功能的又一種方法，得到了廣泛的認同。近年來，許多學者以人工誘導RNAi的方式進行了病毒復制的干擾研究，取得了良好進展。例如在抗乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、艾滋病毒(HIV)和脊髓灰質炎病毒(Poliovirus)等病毒病的研究中都發現RNA干擾，對于抑制這類病毒的復制效果極好，可能為這類病毒病的治療創立新的、更有效的途徑。但是目前關于RNAi仍有很多問題亟待解決，例如:進行RNAi的時間和靶位點；哺乳類動物中的干擾素反應；RNAi作用的確切機制；脫靶效應等。因此，今后的研究仍然集中在RNAi作用機制的探討上，以及如何改進運用RNAi的方法來研究基因的功能。本發明注重干擾靶區的選擇和shRNA的初步篩選，在細胞水平上考察了所選shRNA對靶基因的干擾作用，并借助慢病毒表達系統，篩選表達shRNA的陽性PK-15細胞克隆，在細胞模型水平有助于闡明抑制FMDV復制的關鍵靶基因、病原感染過程及病原中該靶基因的生物學功能，并為轉基因抗病育種打下堅實基礎。
【發明內容】
[0005]本發明要解決的技術問題是克服現有技術難以控制豬瘟的不足，構建靶向豬瘟病毒基因組的特定保守基因區段的慢病毒載體介導穩定整合的RNA干擾技術，本發明還提供該技術的制備方法。
[0006]為解決上述問題，本發明采用了下述技術方案:
[0007]一種用于抑制豬瘟病毒復制的NS5B303shRNA，包含siRNA序列，通過構建NS5B303shRNA (short hairpin RNA即短發夾脫氧核糖核酸)慢病毒表達載體，獲得復制缺陷型慢病毒，用獲得的慢病毒感染PK-15細胞，篩選出具有抑制豬瘟病毒復制的PK-15細胞克隆。
[0008]所述序列SEQ ID NO:1 和 SEQ ID N0:2 即:
[0009]NS5B303:5，— 3，
[0010]SEQ ID NO:1:T CACCGGGAGAAATACAACCACAATCCGAA[0011 ] GATTGTGGTTGTATTTCTCCC
[0012]SEQ ID NO:2:B AAAAGGGAGAAATACAACCACAATCTTCG
[0013]GATTGTGGTTGTATTTCTCCC
[0014]所述NS5B303shRNA表達載體的構建，包括NS5B303shRNA克隆載體的構建和表達載體的構建。
[0015]所述復制缺陷型慢病毒的獲得，包括NS5B303shRNA表達質粒與Packaging Mix(包裝混合物)共同轉染293-FT (人胚腎細胞株)細胞，收獲細胞上清，獲得復制缺陷型慢病毒。
[0016]所述復制缺陷型慢病毒感染PK-15細胞，包括復制缺陷型慢病毒感染PK-15，blasticidin抗性篩選，獲得抑制豬瘟病毒復制的PK-15細胞克隆。
[0017]所述抑制豬瘟病毒復制效果的驗證方法，包括流式細胞術、間接免疫熒光及Real-time RT-PCR、
[0018]本發明還提供了 NS5B303shRNA的制備及驗證方法，包括以下步驟:
[0019]a.設計并合成 NS5B303shRNA 對應的 DNA 序列一ds oligo。
[0020]b.利用T4DNA連接酶將ds oligo克隆進pEN/U6載體。
[0021]c.轉化T0P10感受態細胞，挑選陽性克隆，測序檢驗序列的保真性。
[0022]d.將上述pEN/U6-NS5B303質粒與pDEST載體進行LR重組，獲得表達骨架。
[0023]e.獲得的表達骨架與優化好的Packaging Mix共轉染293-FT細胞，產生復制缺陷型慢病毒粒子。
[0024]f.將產生的復制缺陷型慢病毒粒子感染PK-15細胞，將ds oligo整合到宿主細胞的基因組上。
[0025]g.blasticidin抗性篩選，獲得表達NS5B303shRNA的PK-15細胞陽性克隆；
[0026]h.分別用Real-time RT-PCR (實時定量-反轉錄-聚合酶鏈反應)、間接免疫熒光及流式細胞術驗證抑制效果。
[0027]CSFV的抗原性呈多樣性而且比較復雜，具有不同的血清變種。另外CSFV基因組為單股正鏈RNA，相當于mRNA，為單順反子結構。基因組RNA沒有單一準確的核酸序列，呈現類群分布，這種特性使得CSFV在變異及適應性方面具有很大的靈活性，即便是面對RNAi，病毒仍能夠通過RNA中堿基的刪除或突變進行逃逸。所以RNAi技術運用于抗病毒研究首先就要解決病毒高度遺傳變異帶來的逃逸這一關鍵問題。解決上述問題的辦法之一就是設計的shRNA靶向病毒基因組的高度保守區域。干擾靶序列的保守性越高，抑制CSFV的潛力就越大。
[0028]NS5B是CSFV的非結構蛋白，由728個氨基酸組成，分子量82kDa，N端為Ser3181，C端為Val3898，為呈堿性親 水性蛋白。因氨基酸序列中含有RNA聚合酶的典型活性基序(Gly-Asp-Asp)，是病毒RNA復制酶。通過對上述非結構蛋白的分析發現，NS5B基因序列高度保守。
[0029]鑒于此，本發明針對豬瘟病毒基因組中高度保守的NS5B區域作為靶序列。
[0030]按照shRNA序列選擇的一般原則，利用Invitrogen公司的BLOCK-1t? RNAiDesigner在線設計程序初步篩選一些shRNA序列，同時對干擾靶位序列進行了同源性分析。當前較為常用的5種制備siRNAs的方法是體外轉錄法、直接化學合成法、長片段dsRNAs經RNase III類(如Dicer)降解、PCR制備的siRNA表達框在細胞中表達、siRNA質粒表達載體或病毒載體在細胞內表達siRNAs五種。前三種涉及到RNA操作，對實驗室的要求較高。利用表達載體在細胞內表達siRNA不僅可以避開RNA操作，而且可以長效、穩定的產生RNAi效應。常用siRNA表達載體的啟動子屬于RNA聚合酶III(p0l III)，主要有鼠源的U6啟動子、人源的U6啟動子和人Hl啟動子3種。各種siRNA表達載體轉錄出的產物是可折疊形成的shRNA，然后在細胞中被Dicer酶切割成siRNA，進而啟動RNAi介導基因沉默。
[0031]使用siRNA表達載體需要合成2條編碼shRNA序列的DNA單鏈，經退火后插入對應載體的pol III啟動子下游。本發明使用的PEN/U6是含有人源U6啟動子的shRNA表達載體，它是由Pol III啟動子、卡那霉素抗性基因和大腸桿菌復制子等組成。利用已經線性化載體的粘性末端的堿基特性，將合成的一對帶有4個堿基的突出端的50-mer的寡核苷酸退火并連接到上述PEN/U6載體。這種部分具有回文結構的DNA序列在RNA pol III啟動子的作用下可以在哺乳動物細胞內轉錄出眾多的shRNA，從而啟動RNA干擾過程。
[0032]對豬瘟病毒體內外復制進行RNA干擾的探索，構建靶向豬瘟病毒基因組的特定保守基因區段的慢病毒載體介導的穩定整合的RNA干擾技術，有望構建靶向豬瘟病毒的siRNA的轉基因動物。為RNAi應用于豬瘟病毒的基因功能研究以及豬瘟的防治積累了必要的實驗數據，為動物的抗病育種提供前期準備。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0033]圖1為pENU6/303_shRNA重組質粒測序結果示意圖
[0034]圖2為pLenti6EX/303_shRNA表達質粒測序結果示意圖
[0035]圖3為real-time RT-PCR驗證NS5B303shRNA對豬瘟脾臟病毒復制的抑制效果
[0036]圖4為間接免疫熒光驗證NS5B303shRNA對豬瘟全血病毒復制的抑制效果
[0037]圖5為real-time RT-PCR驗證NS5B303shRNA對豬瘟全血病毒復制的抑制效果[0038]圖6為流式細胞術驗證NS5B303shRNA對豬瘟病毒復制的抑制效果【具體實施方式】
[0039]下面結合實施例對本發明進行進一步詳細敘述
[0040]實施例1
[0041]1、表達 NS5B303shRNA 的 ds oligo 的生成
[0042]借助美國Invitrogen公司網上在線設計軟件(BLOCK-1T? RNAi Designer),確定針對pEN/U6載體要求的具體shRNA片段303對應的DNA插入序列，送與寶生物工程(大連)有限公司合成并退火生成ds oligo。插入序列如下:
[0043]NS5B303:5，— 3，
[0044]SEQ ID NO:1:T CACCGGGAGAAATACAACCACAATCCGAA
[0045]GATTGTGGTTGTATTTCTCCC
[0046]SEQ ID NO:2:B AAAAGGGAGAAATACAACCACAATCTTCG
[0047]GATTGTGGTTGTATTTCTCCC
[0048]2、ds oligo 與 pEN/U6 載體連接，構建 pEN/U6_shRNA
[0049]2.1雙鏈寡核苷酸(ds oligo)的生成
[0050](I)在0.2ml的PCR擴增管中建立下列體系:
【權利要求】
1.一種用于抑制豬瘟病毒復制的NS5B303shRNA，其特征在于包含siRNA序列、通過構建NS5B303shRNA慢病毒表達載體，獲得復制缺陷型慢病毒，用所述慢病毒感染PK-15細胞，篩選表達NS5B303shRNA的PK-15細胞克隆并驗證其對CSFV的抑制效果； 所述具有抑制效果的NS5B303shRNA序列SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 2, BP:
NS5B303: 5’— 3’
SEQ ID NO:1:T CACCGGGAGAAATACAACCACAATCCGAA
GATTGTGGTTGTATTTCTCCC
SEQ ID N0:2:B AAAAGGGAGAAATACAACCACAATCTTCG
GATTGTGGTTGTATTTCTCCC。
2.根據權利要求1所述的一種用于抑制豬瘟病毒復制的NS5B303shRNA，其特征在于所述NS5B303shRNA表達載體的構建，包括NS5B303shRNA克隆載體的構建和表達載體的構建。
3.根據權利要求1所述的一種用于抑制豬瘟病毒復制的NS5B303shRNA，其特征在于所述完整假病毒的獲得是將NS5B303shRNA表達質粒與Packaging Mix共同轉染293-FT細胞，收獲細胞上清，獲得具有感染性的慢病毒。
4.根據權利要求1所述的一種用于抑制豬瘟病毒復制的NS5B303shRNA，其特征在于所述用收獲復制缺陷型慢病毒感染PK-15細胞，采用滅瘟素blasticidin抗性篩選，獲得表達NS5B303shRNA的PK-15陽性細胞克隆。
5.一種如權利要求1`所述NS5B303shRNA的制備方法，包括以下步驟: a.設計并合成NS5B303shRNA對應的DNA序列一dsoligo ； b.利用T4DNA連接酶將ds oligo克隆進pEN/U6載體； c.轉化TOP10感受態細胞，挑選陽性克隆，測序檢驗序列的保真性； d.將上述pEN/U6-NS5B303質粒與pDEST載體進行LR重組，獲得表達骨架； e.獲得的表達骨架與PackagingMix共轉染293-FT細胞，產生復制缺陷型慢病毒粒子; f.將產生的復制缺陷型慢病毒粒子感染PK-15細胞； g.blasticidin抗性篩選，獲得表達NS5B303shRNA的PK-15細胞陽性克隆； h.分別用Real-timeRT-PCR、間接免疫熒光及流式細胞術驗證抑制效果。
【文檔編號】A61P31/14GK103695431SQ201410001384
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2012年6月4日 優先權日:2012年6月4日
【發明者】劉湘濤, 陳妍, 田宏, 吳錦艷, 尚佑軍, 尹雙輝, 王光祥, 靳野, 張克山, 楊順利, 劉永杰 申請人:中國農業科學院蘭州獸醫研究所