作為雌性不育的治療靶標和診斷標記的無細胞dna的制作方法
【專利摘要】本發明涉及DNA酶治療雌性不育的應用和cfDNA作為雌性不育標記的應用。
【專利說明】作為雌性不育的治療靶標和診斷標記的無細胞DNA
[0001] 本發明涉及雌性不育領域。更精確地，其涉及一種雌性不育的新標記，以及增加有 此需要的雌性患者的孕育能力的新型治療。
[0002] 在最近幾年里，作者已經報道了無法解釋的不育的流行程度高達20%至25%。不 育是指夫妻在嘗試孕育持續至少一整年后仍然不能懷孕。
[0003] 不育的診斷以考慮病史和體檢開始。如果檢查局限于經過一年的嘗試未能懷孕的 任何夫妻中的卵巢功能評價、子宮輸卵管造影片和腹腔鏡檢查，那么大量的不育病例是無 法解釋的。通過增加大量的測定（測量多種激素和細胞因子的水平，檢測與雌性不育相關 的基因中的任意突變的基因檢驗技術）擴大診斷檢測僅僅略微減少"無法解釋的"不育。
[0004] 吸煙、過量咖啡因攝入或飲酒的有害影響是已知的。然而，它們對不育的影響因個 體而大大不同，并且目前還沒有生物學標志能夠定量這種影響。因此，通過目前可用的檢測 并不能精確地評估這些影響。
[0005] 在臨床不育的治療中，輔助性的繁殖技術（ART)具有最高的活產率/治療。ART自 其開始已經在世界范圍內有助于超過一百萬嬰兒的孕育。然而，這些技術的失敗率仍然是 顯著的，并且在一次嘗試失敗后，由于治療的身體、精神和經濟成本，夫妻對于繼續ART或 重復ART治療的決定通常是一個艱難的決定。
[0006] 體外受精（IVF)和精子卵漿內注射技術（ICSI)數據清楚表明，甚至在最成功的程 序中，相對于轉運的胚胎數的低植入率。導致植入問題的缺陷可能比目前所評價的要常見 得多，并且構成另一個無法解釋的不育領域。
[0007] 測定植入因子，如整聯蛋白、LIF、G-CSF或其他生長因子，可能導致對其他不育病 例的理解，并且因此降低被歸類為患有"無法解釋的不育"的患者的百分數，但是，在大部分 病例中，這在關于治療的最初的審慎考慮中并沒有幫助。在法國，關于每次卵母細胞抽取 (oocyte retrieval)的活產，ART 的成功率為 25% -28 % 〇
[0008] 從上文可以看出，似乎雌性不育所涉及的多種參數完全被目前的檢測忽視了。
[0009] 1948年，Mendel和Metais報道了在人血衆中存在循環的無細胞DNA (circulating cell-free DNA)[1]。無細胞循環DNA(cfDNA)已經在寬泛的生理和病理學病癥中進行研 宄，所述病癥包括炎性紊亂、氧化應激和惡性病。其在健康受試者中以〇-l〇〇ng/ml的血液 濃度存在，平均為30ng/ml [2]。假定正常細胞的DNA含量總計為6. 6pg，這些數值代表平均 0 - 15, 000個基因組當量/ml血液，平均為5000個基因組/ml。這種DNA的大部分是雙鏈 的，并且外觀上以核蛋白復合物的形式存在。
[0010] CfDNA在低百分數瓊脂糖凝膠上的電泳已經顯示出0. 18-21kb的DNA片段的尺寸 的變化，在DNA片段的尺寸分布上隨樣品而變化。檢測大的、準基因組（quasi-genome)尺 寸的DNA片段是常見的。
[0011] 盡管與游離DNA釋放到血流中相關的精確機制尚是不確定的，但是其可能來源于 凋亡、壞死和從細胞的主動釋放的組合。
[0012] cfDNA從血流中的清除是快速發生的：胎兒DNA在分娩后以16. 3分鐘的半衰期從 母親血液中消失[3]。已知cfDNA對血漿核酸酶（例如，DNA酶I)敏感，但是腎[4]和肝
[5]清除機制也參與了 cfDNA的消除。
[0013] 迄今為止，cfDNA的釋放是否具有任何生物學作用還是未知的。培養的細胞已經 表現出向培養基中釋放雙鏈DNA[6]，并且cfDNA可能結合在細胞中[7]。這些發現導致引 入"基因組轉移（genometastasis)"的概念[8]。然而，這種假說有待證明。
[0014] 循環DNA可以從血漿和血清兩者中分離，但是血清中含有約6倍高濃度的循環 DNA。近來，Umetani等表明所述6倍高的血清DNA水平中少于10%是由于被其他來源的污 染所導致的（即，在血清分離期間從白細胞釋放的）[9]。關于高血清水平的原因是未知的， 但是排除在純化步驟期間血漿中DNA的損失[9]。
[0015] 無細胞循環DNA是潛在有用的生物標記。DNA水平和斷裂模式為診斷和預后 目的提供有意義的可能性。近來，Bartoov等記述了用于評估男性受試者的孕育狀態的 方法，所述方法是基于來自所述受試者的流體樣品中的cfDNA的測量（W02008/047364)。 他們還提議了通過向低生育力的男性施用DNA酶來治療男性低生育能力的方法。無細 胞DNA還被提議為用于非侵入性監測惡性和良性增生和炎性病癥（如子宮內膜異位癥 (endometriosis))的生物標志[10]。
[0016] 最近，Czamanski-Cohen等報道在37名進行IVF治療的婦女團體中，與懷孕的婦 女相比，在f3HCg檢測那天，沒懷孕的婦女中的血漿cfDNA濃度在統計學上更高。然而，如 作者所承認，由于其中所包括的所有婦女都處于IVF治療期間，所以該研宄不能確定雌性 不育與cfDNA濃度之間的相關性[11]。
[0017] 如本文所述，本發明人現在已經證明不育婦女中的cfDNA水平在統計學上高于能 生育的婦女。因此，cfDNA水平可以用于不育的診斷和預后。cfDNA水平還可以用于不患有 子宮內膜異位癥的婦女中的不育診斷和預后。可以不經侵入性或痛苦的程序獲得cfDNA的 事實使其特別適合用于診斷女性不育。并且，如下文實驗部分所證明的，導致無細胞DNA水 平降低的治療顯著提高被治療的雌性患者的生育能力。
[0018] 因此，本發明的第一方面是用于體外診斷哺乳動物雌性的不育的方法，所述方法 包括下述步驟：
[0019] (i)確定來自所述雌性的體液樣品中的無細胞DNA的水平，并且
[0020] (ii)將所述水平與預先確定的閾值進行比較，
[0021] 其中高于所述預先確定的閾值的無細胞DNA的水平指示不育。
[0022] 所述方法可以用于診斷人或動物雌性、優選人中的不育。其可以與在研宄夫妻不 育原因時進行的首次檢測一起進行，或者，在所述檢測不能鑒別不育原因的患者中，在這些 檢測之后進行。特別地，其可以用于體外診斷不患有子宮內膜異位癥的雌性中的不育。
[0023] 當然，在前文所述，具有"指示不育"的cfDNA水平的雌性意指所述雌性具有的不 育可能性高于cfDNA低于預先確定的閾值的雌性的不育可能性。
[0024] 在上述方法中，所述體液樣品可以是血漿、血清、血液或卵泡液樣品。
[0025] 如下文的實驗部分所示，測量94名可育婦女和96名不育婦女的血漿中的cfDNA 濃度。在這一團體中，在可育婦女中，平均cfDNA血漿濃度約為50ng/ μ 1，并且在不育婦女 中約為109ng/ μ 1。因此，當上述方法涉及人類雌性并且當所述體液樣品是血漿樣品時，所 述閾值可以在這兩個值之間選擇，并且優選約50至約IOOng/μ 1。當然，熟練的技術人員能 夠通過在更大的患者團體上進一步研宄這一參數而提煉并且修改這些數值。通過測量來自 更大量的患者的樣品中的cfDNA水平，本領域技術人員還將確定關于cfDNA水平的值的量 表，其具有相應的不育可能性。在更大的團體（包括同類的婦女亞組（取決于她們的年齡 和/或行為參數，如她們是否吸煙，和/或身體參數，如體重、HbAlc等））中的測量也可以 導致確定反應不同狀況的不同閾值。在這種情形中，本領域技術人員將通過關于其他相關 參數解釋她的cfDNA水平來確定婦女的不育可能性。
[0026] 如已經提及的，所述方法可以通過測量不同于血漿樣品的體液樣品中的cfDNA水 平來進行。當然，對于每種體液，測量必須在包括可育和不育雌性的顯著的雌性團體中進 行，以確定相關的閾值。
[0027] 如果目的是鑒別所有或幾乎所有可能是不育的雌性，則選擇所述閾值使其與可育 雌性的平均值接近。在這一情形中，可育雌性也可能被診斷為可能是不育的（假陽性）。相 反，如果目的是僅鑒別具有最高的不育可能性的那些，則選擇所述閾值使其與不育雌性的 平均值接近。
[0028] 在一個具體的實施方案中，通過測量來自所述婦女的血漿樣品中的cfDNA水平來 實施本發明所述的方法，用于體外診斷婦女的不育，并且，高于60ng/ μ 1的血漿cfDNA水平 指示不育。
[0029] 在另一個實施方案中，通過測量來自所述婦女的血漿樣品中的cfDNA水平來實施 本發明所述的方法，用于體外診斷婦女的不育，并且，高于70ng/ μ 1的血漿cfDNA水平指示 不育。
[0030] 在另一個實施方案中，通過測量來自所述婦女的血漿樣品中的CfDNA水平來實施 本發明所述的方法，用于體外診斷婦女的不育，并且，高于80ng/ μ 1的血漿cfDNA水平指示 不育，其中高于所述預先確定的閾值的無細胞DNA水平指示不育。
[0031] 在另一個實施方案中，通過測量來自所述婦女的血漿樣品中的cfDNA水平來實施 本發明所述的方法，用于體外診斷婦女的不育，并且，高于90ng/ μ 1的血漿cfDNA水平指示 不育，其中高于所述預先確定的閾值的無細胞DNA水平指示不育。
[0032] 在另一個實施方案中，通過測量來自所述婦女的血漿樣品中的cfDNA水平來實施 本發明所述的方法，用于體外診斷婦女的不育，并且，高于IOOng/μ 1的血漿cfDNA水平指 示不育。
[0033] 按照另一方面，本發明涉及用于實施上述方法的試劑盒。具體地，本發明涉及包含 用于測量生物樣品中的cfDNA水平的反應物以及特異性用于測量生物樣品中的至少一種 其他生理學參數的反應物的試劑盒，其中所述生理學參數選自由以下組成的組：抗米勒管 激素（anti-milllerian hormone) (AMH)的水平、端粒末端轉移酶活性和高半胱氨酸濃度。
[0034] 生物樣品中的cfDNA水平可以通過本領域已知的任意技術來測量，諸如，但不限 于，任意的核酸染色，如，例如，嵌入劑。可以用來測量cfDNA水平并且包含在本發明所述的 試劑盒中的DNA嵌入劑的非限制性實例包括小檗堿，溴乙啶，原黃素，道諾霉素，多柔比星， 沙立度胺，Sybr? Green, Sybr? Gold 和 Pico Green?。
[0035] 抗米勒管激素（AMH)還稱為MIS (米勒管抑制物質）。由于AMH由卵泡直接產生， 所以AMH水平與卵巢中囊狀卵泡的數量相關。已經證明，與具有較高水平的婦女相比，具有 較低AMH的婦女具有較低的囊狀卵泡計數并且產生較低數量的卵母細胞。認為血液AMH水 平反映剩余的卵子供應-或"卵巢儲庫"的大小。AMH可以通過免疫測定如ELISA進行測 量。因此，本發明所述的試劑盒可以包含抗-AMH抗體。
[0036] 端粒末端轉移酶是一種修復DNA降解的酶。然而，如果其以不足的濃度存在，則其 可以是無效的。除此之外，當以過高的濃度存在時，端粒末端轉移酶產生凋亡因子。因此， 端粒末端轉移酶還參與生育并且影響早期胚胎發育。其水平可以通過免疫測定進行測量， 并且因此，本發明所述的試劑盒可以包含特異性識別端粒末端轉移酶的抗體。
[0037] 高半胱氨酸是氨基酸半胱氨酸的一種非蛋白同系物，區別在于額外的亞甲基 (-CH2-)基團。其是氧化應激的標記，并且因此，可以提供關于個體的生育能力狀況的信 息。高半胱氨酸水平可以通過酶測定來測量：結合的或二聚體化的高半胱氨酸（氧化形式） 被還原成游離的高半胱氨酸，然后其在胱硫醚β-合酶（CBS)的催化下與絲氨酸反應形成 L-胱硫醚。胱硫醚又通過胱硫醚β-裂合酶（CBL)分解而形成高半胱氨酸、丙酮酸酯和氨。 然后，丙酮酸酯被乳酸脫氫酶（LDH)和作為輔酶的NADH轉化為乳酸酯。NADH轉化為NAD的 速率與高半胱氨酸的濃度成正比（ΔΑ340ηπι)。
[0038] 按照一個具體的實施方案，本發明所述的試劑盒包含至少一種DNA嵌入試劑和特 異性識別AMH的抗體。
[0039] 如下文的實驗所述，已經進行了幾次治療（包括幾次IVF)而未成功的不育婦女用 脫氧核糖核酸酶進行治療。在用脫氧核糖核酸酶僅進行一輪治療之后，然后ART治療，這些 患者中超過50%懷孕。因此，本發明還涉及脫氧核糖核酸酶，其用于治療雌性不育，尤其是 當所述不育與高于在可育婦女中統計學上觀察到的無細胞DNA水平的無細胞DNA水平相關 時。
[0040] 脫氧核糖核酸酶（DNA酶）是一種催化DNA骨架中的磷酸二酯鍵水解裂解的酶。因 此，脫氧核糖核酸酶是一種核酸酶。各種各樣的脫氧核糖核酸酶是已知的，它們的不同在于 它們的底物特異性、化學機制和生物學功能。
[0041] -些DNA酶僅切割在DNA分子末端的殘基（脫氧核糖核酸外切酶，一種外切核酸 酶）。其他切割鏈的任何位置（脫氧核糖核酸內切酶，核糖核酸酶的子集）。一些對于其所 切割的DNA序列是非常序列特異性的，如限制性酶，而另一些完全是無差別的。一些僅切割 雙鏈DNA，另一些特異性針對單鏈分子，還有一些對二者都起作用。
[0042] 脫氧核糖核酸酶I優先在鄰近嘧啶核苷酸的磷酸二酯鍵處切割DNA，產生在3'位 置具有游離的羥基的5' 5' -磷酸-封端的多核苷酸，平均起來產生四核苷酸。其作用在單 鏈DNA、dsDNA和染色質上。
[0043] 脫氧核糖核酸酶II (酸性DNA酶）水解天然和變性的DNA中的脫氧核糖核苷酸 鍵，產生具有3'-磷酸的產物。如名稱所暗示的，其在酸性pH下更有效率。存在一些已知 的DNA酶II，包括a DNA酶II (通常僅稱為DNA酶II)和DNA酶II β (還稱為DLAD或DNA 酶II樣酸性DNA酶）。
[0044] 盡管任何類型的DNA酶都可以用于本發明，但是優選DNA酶I。重組人DNA酶I 已經在臨床上使用。可以使用霧化器讓囊性纖維化（cystic fibrosis)患者吸入DNA酶。 由于在黏液中積聚的白血球分解并且釋放DNA，所述釋放的DNA增加了黏液的'厚度'，因此 DNA酶有幫助。DNA酶分解DNA，并且所述黏液更容易從肺中清除。
[0045] 本發明還涉及用于治療雌性不育的方法。在具體的實施方案中，本發明涉及用于 治療不患有子宮內膜異位癥的雌性中的雌性不育的方法。在另一個具體的實施方案中，本 發明涉及用于治療表現出比在可育雌性中統計學觀察到的無細胞DNA水平高的無細胞DNA 水平的雌性中的雌性不育的方法。在任一實施方案中，本發明所述的方法包括向雌性施用 足以使其無細胞DNA水平降至與在可育雌性中觀察到水平相似的水平的量的脫氧核糖核 酸酶。在前文所述，"無細胞DNA水平"應該理解為在任意相關的體液中的無細胞DNA的濃 度，所述任意相關的體液諸如血漿、血清、血液或卵泡液。在下文中，（與可育雌性相比）具 有高水平的cfDNA的不育雌性被指定為"需要"本文公開的治療。本發明對于治療婦女中 的不育癥是特別有利的。
[0046] 在本發明中，可以有利地使用重組的人DNA酶，特別是用于治療婦女。當然，當治 療另一種物種的雌性時，優選來自該物種的重組DNA酶。如已經提及的，可以使用任意DNA 酶來實施本發明，但是優選DNA酶I。
[0047] 當進行本發明時，可以使用任意的施用途徑，條件是其能夠遞送足夠量的DNA酶， 以獲得循環無細胞DNA的減少。例如，所述DNA酶可以通過靜脈內或肌內途徑施用。
[0048] 對于不育癥的治療，DNA酶以足以獲得血液中和/或卵泡液中無細胞DNA水平降 低的量施用。例如，在至少2天期間，優選至少3天或4天或更多天期間，每天可以向不育 雌性中施用最少2500UI的DNA酶I。當然，由于個體間的差異，可以觀察到不同的反應，并 且可以因此修改劑量方案，以使施用的劑量足以獲得無細胞DNA水平的降低，其必須變得 與在可育患者中觀察到的水平相似。可以追蹤cfDNA水平，以檢驗其降低并且避免不必要 的治療。
[0049] 已經觀察到，在cfDNA水平降低后和治療終止后，cfDNA水平沒有迅速增加至達到 其之前的值。在至少幾天期間，cfDNA水平大致保持穩定。因此，在黃體后期期間，可以有 利地將DNA酶施用給需要其的不育雌性中。
[0050] 按照下文實驗部分舉例說明的本發明的一個具體的實施方案，在7天的黃體后期 期間，向需要其的不育雌性每天兩次施用2500UI的DNA酶I。
[0051] 當然，上述治療不育的方法可以與ART聯合，如下文實驗中所述。
[0052] 通過下述附圖和實施例進一步舉例說明本發明。
[0053] 附圖標記
[0054] 圖1 :在73名可育和88名不育男性和在94名可育和96名不育婦女的血漿中的 平均cfDNA濃度。
[0055] 圖2 :在來自37名婦女的血漿（黑色框）和卵泡液（灰色框）中的CfDNA濃度。 該組中懷孕的那些婦女在血漿和/或卵泡液中的平均cfDNA水平低于該組所有婦女（包括 懷孕的那些和沒有懷孕的那些）的平均值。 實施例
[0056] 實施例1 :患者、材料和方法
[0057] 精液樣品
[0058] 在3-6天的節欲后通過手淫收集年齡小于50歲的可育和不育男性的精液樣品。按 照世界衛生組織指南進行精子計數和運動性、活力和形態分析。該研宄中總共包括161名 男性：73名可育的男性和88名不育的男性。
[0059] 來自女性的血漿和卵泡液樣品
[0060] 在年齡小于37歲的94名可育（AMH>2ng/ml)和96名不育婦女中測量血漿中的無 細胞DNA (cfDNA)的量。進行基因組研宄來驗證該cfDNA的來源，特別是在不育婦女中的來 源。
[0061] 當獲得樣品時，還在相對應的不育婦女的卵泡液樣品中進行cfDNA定量。該研宄 中總共包括37份卵泡液樣品。
[0062] 卵巢刺激和卵泡液提取
[0063] 大部分患者利用使用重組 FSH (Gonal F? (Merck laboratory)或 Pliregon? (Schering Plough laboratory))或HMG(Menopur? :Ferring laboratory)的長期激動 劑方法或拮抗劑方法刺激而進行ART。在激素和超聲圖像控制后，在卵母細胞抽取前36小 時，按照公知技術，用重組或尿HCG促排卵。分離并離心兩個或三個主要的卵泡液，之后儲 存。然后，使用如在血漿/血清中相同的方法評估cfDNA含量。
[0064] CfDNA分離和PCR擴增
[0065] 使用高純度 PCR 模板制備試劑盒（High Pure PCR template preparation kit， Roche)按照供應商的推薦分離血漿cfDNA。通過使用ddH20將洗脫緩沖液稀釋至20%溶 液，并且在70°C預熱。樣品以16, OOOg離心5分鐘，避開細胞碎片，將400 μ 1血漿轉移至 2ml Eppendorf管中。將400 μ 1結合緩沖液和40 μ 1重構的蛋白酶K與所述樣品混合。短 暫渦旋后，將管在70°C溫育10分鐘。溫育后，將200 μ 1 100%的異丙醇與樣品混合，隨后 轉移至高純度PCR模板制備試劑盒中提供的高純度濾器收集管的上部儲器中。柱在室溫以 8, OOOg離心1分鐘。將流過液和收集管棄掉，并且將濾器與新的收集管組合。重復該上樣 步驟，直到全部樣品已經上樣到所述濾器上。將500 μ 1抑制劑去除緩沖液添加到所述上部 儲器中，并且在室溫以8, OOOg離心1分鐘。棄去流過液和收集管，并且將濾器與新的收集管 組合。通過向上部儲器中加入500 μ 1洗滌緩沖液并且在室溫離心1分鐘將管洗滌兩次。通 過以最大速度（約13, 000g)離心10秒而甩干柱，并且將柱轉移到新的I. 5-ml Effendorf 管中，并且在溫箱中在70°C溫熱5分鐘。將100 μ 1預熱的20%洗脫緩沖液小心地添加到 濾器中。將所述管和濾器放置在70°C的溫箱中，并且低速（約400rpm)搖動5分鐘。通過 以8, OOOg離心5分鐘從柱上洗脫DNA樣品，然后保存在4°C備用或者冷凍在_70°C用于長 期保存。
[0066] PCR 擴增
[0067] 用于擴增JmJC2和DXS1285基因座的主混合液在15 μ 1反應體積中包含200mM的 每種dNTP，lXTaq聚合酶緩沖液，2μM每種引物組，1.5mMMgC12和0,5UBiotaq TMDNA聚合 酶（Bioline)。用于擴增JmJC2 (Y染色體的標記）和DXS1285 (X染色體的標記）的引物的 序列分別為：
[0068] 5,-GAGTATGCGACCAGT-3，（SEQ ID No:l)，
[0069] 5' -TGGCACACCATGGGA-3'（SEQ ID No:2)和
[0070] 5,-CGTGCTTAGGCTTAATCCC-3'（SEQ ID No:3)，
[0071] 5'-GAACTGACTGTAGAGAAGG-3'（SEQ ID No:4)，在 60°C 退火。
[0072] CfDNA 定量
[0073] 血液樣品收集在含有EDTA的真空血液收集管（vacutainer tube)中。將其離心 (3, 400rpm，15分鐘），進行血漿分離。在cfDNA定量之前，將血漿和卵泡液樣品以3, 400g離 心20分鐘。樣品必須是透明的，沒有紅血球。實際上在有色樣品中cfDNA定量可能改變。 將標準DNA溶液在166 μ 1中稀釋至20, 50, 100和500ng/ml，以繪制標準曲線。將166 μ 1 IN HCLO4 (高氯酸）和664 μ 1二苯胺添加到每個166 μ 1的血漿或卵泡液上清樣品中。將 樣品在37°C溫育20小時，然后以15, OOOg離心10分鐘。將300 μ 1上清液轉移至96-孔板 中，并且在分光光度計（Tecan，Genios)中在600nm進行測量。
[0074] DNA酶治療
[0075] 在獲得其書面知情同意書后招募患者。
[0076] 在上一周期的黃體后期中，10名選出的具有非常高的cfDNA水平OlOOng/微升） 的婦女用一安瓿的脫氧核糖核酸酶α (阿法鏈道丨酶⑧（:Pulinozyine?))2,5mg(2500IU) 治療，通過肌內途徑施用，每天兩次，持續七天。
[0077] 阿法鏈道酶? (脫氧核糖核酸酶α)吸入溶液是無菌、澄清、無色、高度純化的重 組人脫氧核糖核酸酶I (rhDNA酶）的溶液，所述重組人脫氧核糖核酸酶I選擇性切割DNA。
[0078] 阿法鏈道酶⑧通常通過吸入由壓縮空氣驅動的霧化系統產生的氣霧劑霧氣進行 施用。但是，在吸入后，rhDNA酶的系統水平非常低（最大15%)，因此，決定定購其相同的 用于頂注射的產品，以增加 DNA酶濃度，假定這樣的事實：在阿法鏈道酶的毒性學研宄中沒 有副作用，甚至提供過靜脈內途徑也沒有副作用。
[0079] 統計學
[0080] 利用雙向t-檢驗來評價可育與不育個體之間的cfDNA水平的差異。利用Spearman 相關性雙側檢驗計算相關性系數。當P〈〇. 05時認為統計學差異是顯著的。
[0081] 實施例2 :cfDNA和男件不育癥
[0082] 該第一初級研宄的目的是驗證男性不育癥與高水平的cfDNA之間的相關性的概 念，假定這樣的事實：DNA斷裂可能參與增加的cfDNA。
[0083] 為了評價cfDNA的完整性，在分離的cfDNA樣品上進行PCR。用從男性和婦女的血 漿中分離的cfDNA擴增X染色體標記。用從男性血漿而不是從雌性血漿分離的cfDNA擴增 Y染色體標記。
[0084] 與各自的可育對照相比，在來自不育個體的血衆樣品中檢測到更高水平的cfDNA。 已經在73名可育（60. 7ng/μ 1 ±46. 9)和88名不育男性（83. 3ng/μ 1 ±64. 8)中測量血漿 中的 cfDNA 的量，ρ = 8. 7e-3 (圖 1)。
[0085] 實施例3 :在來自婦女的血漿中的cfDNA
[0086] 如在男性中一樣，與各自的可育對照相比，在來自不育婦女的血漿樣品中檢測到 更高水平的cfDNA。然而，在婦女中的可育與不育個體間的差異大于在男性中的可育與不育 個體間的差異。
[0087] 事實上，證明在94名可育婦女的血漿中的cfDNA量（49. 2ng/μ 1 ±58. 0)是96名 不育婦女中的量（l〇9.4ng/yl±88. 1)的兩倍低，ρ = 1.02e_7(圖1)。
[0088] 實施例4 :在37名不育婦女的血漿vs卵泡液中的CfDNA的量
[0089] 將血漿中的cfDNA濃度與卵泡液中的濃度進行比較。在血漿cfDNA濃度與卵泡液 之間發現統計學顯著的正相關性（r = 0. 43, p = 6. 4eT3)(圖3)。在初級研宄中，與未懷孕 的婦女相比，懷孕的婦女在卵泡液和血清中具有較少的cfDNA(數據未顯示）。
[0090] 實施例5 :DNA酶治療對血漿cfDNA濃度和牛育能力的影晌
[0091] 迄今為止，對10名已經超過四年不育和/或具有沒有任何解釋的幾次IVF/ICSI 失敗的病史的患者，在前一周期的黃體后期治療七天，緊接著排卵誘導治療，其在下一周期 的第二天開始并且使用重組或尿FSH與GnRH激動劑或拮抗劑。所有的患者獲得裂開的胚 芽，并且在第3天每名患者移植一個或幾個胚胎。
[0092] 對于每名患者，在DNA酶I治療之前和之后立即收集血液樣品，以定量血漿中的 cfDNA。
[0093] 這些患者中的六名在僅一次這樣的治療后懷孕，生下七個孩子（一流產，4個單胎 和1個三胞胎）。與治療的患者相關的數據顯示在下表1和2中：
[0094] 表1 :所包括的患者的年齡和不育病史
【權利要求】
1. DNA酶，其用于治療雌性不育。
2. 權利要求1的DNA酶，其用于治療與統計學上高于可育雌性中的無細胞DNA水平的 無細胞DNA水平相關的雌性不育。
3. 權利要求1或權利要求2的DNA酶，其用于治療雌性不育，其中所述雌性不具有子宮 內膜異位癥。
4. 權利要求1-3中任一項的DNA酶，其用于治療雌性不育，其中所述DNA酶是重組DNA 酶。
5. 權利要求1-4中任一項的DNA酶，其用于治療雌性不育，其中所述DNA酶是DNA酶 Io
6. 權利要求1-5中任一項的DNA酶，其用于治療雌性不育，其中所述DNA酶通過靜脈內 或肌內途徑施用。
7. 權利要求1-6中任一項的DNA酶，其用于治療雌性不育，其中所述DNA酶在黃體后期 期間施用給不育雌性。
8. 權利要求1-7中任一項的DNA酶，其用于治療人類雌性不育。
9. 權利要求1-8中任一項的DNA酶，其用于治療人類雌性不育，其中在至少4天期間， 每天給不育的婦女施用至少2500Π的DNA酶I。
10. 權利要求1-9中任一項的DNA酶，其用于治療人類雌性不育，其中在黃體后期的7 天期間，向不育的婦女每天兩次施用2500Π的DNA酶I。
11. 一種用于體外診斷哺乳動物雌性不育的方法，所述方法包括下述步驟： (i) 確定來自所述雌性的體液樣品中的無細胞DNA的水平，和 (ii) 將所述水平與預先確定的閾值進行比較， 其中高于所述預先確定的閾值的無細胞DNA水平指示不育。
12. 權利要求11的方法，其中所述雌性不具有子宮內膜異位癥。
13. 權利要求11或權利要求12的方法，其中所述體液樣品是血漿、血清、血液或卵泡液 的樣品。
14. 權利要求11-13中任一項的方法，其中所述雌性是人類。
15. 權利要求14的方法，其中所述體液樣品是血漿樣品，并且所述預先確定的閾值包 括在 50ng/ μ 1 與 IOOng/ μ 1 之間。
16. -種用于實施權利要求11-15中任一項所述的方法的試劑盒，其包括特異性用于 測量生物樣品中無細胞DNA水平的反應物和特異性用于測量生物樣品中至少一種其他生 理學參數的反應物，其中所述生理學參數選自由以下組成的組：抗米勒管激素（AMH)的水 平，端粒末端轉移酶活性和高半胱氨酸濃度。
17. 根據權利要求16所述的試劑盒，其包含至少一種DNA嵌入劑和特異性識別AMH的 抗體。
【文檔編號】A61P15/08GK104519906SQ201380041011
【公開日】2015年4月15日 申請日期:2013年8月1日 優先權日:2012年8月3日
【發明者】安德烈·哈祖特 申請人:輝凌公司