用于治療硬皮病的抗ccl2抗體的制作方法

用于治療硬皮病的抗ccl2抗體的制作方法
【專利摘要】本發明尤其提供特征在于高親和力、效力、組織選擇性和/或表位特異性的經改良抗CCL2抗體，和其尤其用于治療硬皮病和相關纖維化和/或發炎性疾病、病癥和病況的用途。在一些實施例中，本發明提供基于親和力為10-12M或更大的抗CCL2抗體治療硬皮病和相關纖維化和/或發炎性疾病、病癥和病況的方法和組合物。
【專利說明】用于治療硬皮病的抗CCL2抗體
[0001] 相關申請案的奪叉引用
[0002] 本申請案依據35USC§ 119(e)要求2012年5月22日提交的美國臨時專利申請 案第61/650, 149號的權益，所述申請案特此以全文引用的方式并入本文中。
[0003] 序列表
[0004] 本說明書提及2013年5月22日以電子形式作為命名為"2006685-0330_ Sequences_ST25"的ASCII,txt文檔提交的序列表。所述.txt文檔是在2013年5月14日 生成的且大小是2KB。

【技術領域】
[0005] 無

【背景技術】
[0006] 全身性硬化癥（硬皮病）是臨床上異質性結締組織病癥，引起皮膚的硬化和繃緊。 其是特征在于免疫活化、血管損傷和纖維化的自身免疫型疾病。涉及肺、心、腎和胃腸道的 基于主要器官的并發癥可促進死亡率和發病率。發病機制是未知的。
[0007] 與硬皮病最常有關的特征是纖維化（膠原蛋白在皮膚和器官中積聚）。膠原蛋 白的積聚促成病癥的癥狀，包括脫發、皮膚硬化和繃緊、皮膚變色、關節疼痛、手指和關節僵 硬、消化道問題和呼吸并發癥（干咳、呼吸短促、喘息）。硬皮病可歸類成兩個主要子組：局 限性皮膚硬皮病和彌漫性皮膚硬皮病。在局限性皮膚硬皮病中，纖維化主要限制于手、臂和 面部。彌漫性皮膚硬皮病是一種快速進行性病癥，其影響大面積的皮膚并損害一或多個內 臟。患有局限性皮膚硬皮病的患者與患有彌漫性皮膚硬皮病的患者相比具有相對更好的長 期預后。廣泛的全身性硬皮病可損傷心、腎、肺或胃腸道，這可引起死亡。肺纖維化是患有 硬皮病的患者死亡的最常見原因。
[0008] 因此，硬皮病是極度致衰弱的疾病，有著潛在的致命后果。在美國約有50, 000名 患者。女性患者與男性患者的比率是約4:1。當前治療方法僅基于對在整個疾病過程產生 的并發癥的對癥治療和管理（例如皮質類固醇、NSAID和免疫抑制藥物（如甲氨蝶呤和環 磷氮介））。沒有療法展示出會逆轉或停止疾病進展。因此，對于硬皮病的有效療法存在高 度未滿足的醫學需求。


【發明內容】

[0009] 本發明具體是基于經改良抗體或結合蛋白提供用于有效治療硬皮病的經改良方 法和組合物，所述經改良抗體或結合蛋白可以高親和力、效力和/或表位多樣性特異性地 結合于C-C趨化因子配體-2 ("CCL2")，從而實現穩固的生物分布和/或組織特異性。已知 CCL2是硬皮病的經驗證目標。數項研宄已展示，硬皮病成纖維細胞呈現出CCL2mRNA和蛋白 的組成型表達增加。在硬皮病皮膚切片中，CCL2的表達在成纖維細胞、角質細胞和單核細胞 中被檢測到，而其在正常皮膚中是不可檢測的（加林多（Galindo)等人，關節炎與風濕病 (ArthritisRheum. )2001 年6月；44(6) :1382-6 ;迪斯特勒（Distler)等人，關節炎與風濕 病 2001 年 11 月；44 (11) :2665-78 ;利奧伊德（Lioyd)等人，實驗醫學（ExpMed. ) 1997 年 4 月 7 日；185 (7) :1371-80 ;山本（Yamamoto)等人，皮膚病科學雜志（JDermatolSci. )2001 年 6 月；26 (2) :133-9;登頓（Denton)等人；免疫學趨勢（TrendsImmunol. )2005 年 11 月； 26(11):596-602. 2005年9月15日電子出版）。然而，在本發明之前，尚未發展出基于抗 CCL2抗體的針對硬皮病的有效療法。本發明人觀察到，血漿中的高水平CCL2螯合靜脈內注 射的抗CCL2抗體，引起對患病組織中CCL2的低效靶向。為了解決這一問題，本發明人想到 使用具有高親和力的抗CCL2抗體，以足以勝過高水平血清CCL2的量投與，引起對所需患病 組織中CCL2的有效靶向。具體來說，本發明人想到"同類之最的"抗CCL2單克隆抗體，其 特征在于高結合親和力、組織選擇性、表位特異性和/或長半衰期。所述本發明抗體一旦被 體內投與就會引起所需生物分布和生物可用性，使得其結合并阻斷目標組織中的CCL2信 號傳導，除了硬皮病的其它癥狀或特征以外還減少浸潤、炎癥和纖維化。
[0010] 因此，在一個方面中，本發明提供治療硬皮病的方法，其包含向罹患或易患硬皮病 的個體投與有效量的抗CCL2抗體或其片段，使得目標組織中硬皮病的至少一種癥狀或特 征的強度、嚴重度或頻率降低或具有延遲的發作。
[0011] 在一些實施例中，硬皮病的至少一種癥狀或特征是選自內皮細胞損傷、基底膜層 增生、血管周圍單核細胞浸潤、纖維化、內臟器官架構紊亂、血管稀疏、缺氧和其組合。
[0012] 在一些實施例中，目標組織是選自由以下組成的群組：皮膚、血管、肺、心、腎、胃腸 道（包括肝）、肌肉骨胳系統以及其組合。在一些實施例中，目標組織是肺。在一些實施例 中，目標組織是心。
[0013] 在一些實施例中，個體罹患或易患局限性皮膚硬皮病。在一些實施例中，個體罹患 或易患彌漫性皮膚硬皮病。
[0014] 在一些實施例中，抗CCL2抗體或其片段是腸胃外投與的。在一些實施例中，腸胃 外投與是選自靜脈內、皮內、吸入、經皮（表面）、皮下和/或經粘膜投與。在一些實施例中， 腸胃外投與是靜脈內投與。
[0015] 在一些實施例中，抗CCL2抗體或其片段是口服投與的。
[0016] 在一些實施例中，抗CCL2抗體或其片段是兩月一次、每月一次、三周一次、兩周一 次、每周一次、每天一次或以可變的時間間隔投與的。
[0017] 在另一方面中，本發明提供如本文中所述的抗CCL2抗體或其片段的用途，其用于 制造供治療硬皮病用的藥物，其中治療包含向罹患或易患硬皮病的個體投與有效量的抗 CCL2抗體或其片段，使得目標組織中硬皮病的至少一種癥狀或特征的強度、嚴重度或頻率 降低或具有延遲的發作。
[0018] 在一些實施例中，本發明提供抗CCL2抗體或其片段的用途，其用于制造如本文中 所述的供治療硬皮病用的藥物，其中抗CCL2抗體或其片段的特征在于結合親和力強于和/ 或大于KT12M(例如大于 0? 5XKT12M、1(T13M、0. 5XKT13M、1(T14M、0. 5XKT14M或I(T15M)。
[0019] 在一些實施例中，根據本發明的抗CCL2抗體或其片段是選自由以下組成的群組： 完整IgG、F(ab'）2、F(ab) 2、Fab'、Fab、scFvs、雙功能抗體、三功能抗體和四功能抗體。
[0020] 在一些實施例中，抗CCL2抗體或其片段是單克隆抗體，任選地，抗CCL2抗體或其 片段是人類化單克隆抗體，任選地，抗CCL2抗體或其片段是人類抗體。
[0021] 在另一方面中，本發明提供治療硬皮病的方法，其包含向罹患或易患硬皮病的個 體投與抗CCL2抗體或其片段，所述抗CCL2抗體或其片段的結合親和力強于和/或大于 KT12M(例如大于 0? 5XKT12M、1(T13M、0. 5XKT13M、1(T14M、0. 5XKT14M或I(T15M)。
[0022] 在一些實施例中，抗CCL2抗體或其片段以治療有效劑量和一定的投與時間間隔 投與，使得抗CCL2抗體或其片段分布到一或多種選自由以下組成的群組的目標組織：皮 膚、血管、肺、心、腎、胃腸道（包括肝）、肌肉骨胳系統以及其組合。在一些實施例中，抗CCL2 抗體或其片段以治療有效劑量和一定的投與時間間隔投與，使得抗CCL2抗體或其片段分 布到肺和/或心。
[0023] 在一些實施例中，投與時間間隔是選自兩月一次、每月一次、三周一次、兩周一次、 每周一次、每天一次或可變的時間間隔。
[0024] 在另一方面中，本發明提供治療硬皮病的方法，其包含以治療有效劑量和一定的 投與時間間隔向罹患或易患硬皮病的個體投與抗CCL2抗體或其片段，使得抗CCL2抗體或 其片段分布到肺和/或心。在一些實施例中，抗CCL2抗體或其片段進一步分布到皮膚、腎 和/或肝。
[0025] 在另一方面中，本發明提供如以上各種實施例中公開的方法，其中抗CCL2抗體或 其片段是選自由以下組成的群組：完整IgG、F(ab'）2、F(ab)2、Fab'、Fab、scFvs、雙功能抗 體、三功能抗體和四功能抗體。
[0026] 在一些實施例中，抗CCL2抗體或其片段是單克隆抗體。在一些實施例中，抗CCL2 抗體或其片段是人類化單克隆抗體。在一些實施例中，抗CCL2抗體或其片段是人類抗體。
[0027] 本發明尤其提供具有高親和力的抗CCL2抗體。在一些實施例中，本發明提供抗 CCL2抗體或其片段，其結合親和力強于和/或大于KT12M(例如大于0. 5X1(T12M、10_13M、 0? 5X1(T13M、1(T14M、0. 5XKT14M或I(T15M)。
[0028] 在一些實施例中，根據本發明的抗CCL2抗體或其片段是選自由以下組成的群組： 完整IgG、F(ab'）2、F(ab) 2、Fab'、Fab、scFvs、雙功能抗體、三功能抗體和四功能抗體。
[0029] 在一些實施例中，抗CCL2抗體或其片段是單克隆抗體。
[0030] 在一些實施例中，抗CCL2抗體或其片段是人類化單克隆抗體。
[0031] 在一些實施例中，抗CCL2抗體或其片段是人類抗體。
[0032] 在另一方面中，本發明提供如本文中所述用于治療硬皮病的方法的抗CCL2抗 體或其片段，所述方法包含向受試者投與抗CCL2抗體或其片段的步驟，其中抗CCL2抗 體或其片段的特征在于結合親和力強于和/或大于KT12M(例如大于0. 5XKT12M、1(T13M、 0? 5X1(T13M、1(T14M、0. 5XKT14M或I(T15M)。
[0033] 在一些實施例中，根據本發明的抗CCL2抗體或其片段是選自由以下組成的群組： 完整IgG、F(ab'）2、F(ab) 2、Fab'、Fab、scFvs、雙功能抗體、三功能抗體和四功能抗體。
[0034] 在一些實施例中，抗CCL2抗體或其片段是單克隆抗體，任選地，抗CCL2抗體或其 片段是人類化單克隆抗體，任選地，抗CCL2抗體或其片段是人類抗體。
[0035] 在另一方面中，本發明提供含有本文中所述的抗CCL2抗體的各種組合物和試劑 盒。
[0036] 本發明的其它特征、目標和優點將在隨后的【具體實施方式】、圖式和權利要求書顯 而易知。然而，應理解，【具體實施方式】、圖式和權利要求書在指示本發明的實施例時僅以說 明方式給出且無限制性。在本發明的范圍內的各種變化和修改對于所屬領域的技術人員將 變得顯而易見。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0037] 圖式是僅出于說明的目的而非限制。
[0038] 圖1示出了描繪經修改的羅德南皮膚分數的示例性圖式。指示了身體上評估皮膚 纖維化的位置。
[0039] 圖2描繪了繪制在平衡之后CCL2的血清和組織濃度的示例性圖式。
[0040] 圖3示出了描繪血漿和患病組織中CCL2靶向的示例性圖式。
[0041] 定義
[0042] 為了使本發明更易于理解，首先對某些術語進行定義。以下術語和其它術語的其 它定義闡述在整個說明書中。
[0043] 親和力：如本領域中已知，"親和力"是具體配體結合于（例如非共價締合于）其 搭配物的緊密性和/或其從其搭配物解離的速率或頻率的量度。如本領域中已知，多種技 術中的任一者均可用于測定親和力。在許多實施例中，親和力代表特異性結合的量度。 [0044] 親和力成熟的（或親和力成熟的抗體）：如本文中所用，其是指在其一或多個CDR 中具有一或多個變化的抗體，所述一或多個變化引起抗體與不具有那些變化的親本抗體相 比對抗原的親和力提高。在一些實施例中，親和力成熟的抗體對目標抗原將具有納摩爾 或甚至皮摩爾的親和力。親和力成熟的抗體可通過所屬領域中已知的多種程序中的任一 者產生。馬克斯（Marks)等人生物技術（BioTechnology) 10:779-783(1992)描述通SVh 和'域改組產生的親和力成熟。CDR和/或框架殘基的隨機誘變由以下各者描述：巴巴 斯（Barbas)等人美國國家科學院院刊（ProcNat.Acad.Sci,USA)91:3809-3813(1994); 希爾（Schier)等人基因（Gene) 169:147-155 (1995);耶爾頓（Yelton)等人免疫 學雜志（J.Immunol. ) 155:1994-2004(1995);杰克遜（Jackson)等人，免疫學雜 志154 (7) : 3310-9 (1995);以及霍金斯（Hawkins)等人，分子生物學雜志（J.Mol. Biol.)226:889-896(1992)。
[0045] 抗體：如本文中所用，術語"抗體"是指由一或多個實質上由免疫球蛋白基因或免 疫球蛋白基因片段編碼的多肽組成的多肽。所識別的免疫球蛋白基因包括K、X、a、y、 S、e和y恒定區基因以及無數免疫球蛋白可變區基因。輕鏈通常歸類為K或X。重鏈 通常歸類為y、y、a、S或e，其又分別定義免疫球蛋白類別IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。 典型免疫球蛋白（抗體）結構單元已知包含四聚體。每一四聚體由兩對相同的多肽鏈組成， 每一對具有一個"輕"鏈（約25kD)和一個"重"鏈（約50-70kD)。每一鏈的N端界定具有約 100到110個或更多個主要負責抗原識別的氨基酸的可變區。術語"可變輕鏈"（VJ和"可 變重鏈"(VH)分別是指這些輕鏈和重鏈。抗體對具體抗原可具有特異性。抗體或其抗原可為 分析物或結合搭配物。抗體作為完整免疫球蛋白或作為通過使用各種肽酶消化而產生的多 個明確表征的片段存在。因此，舉例來說，胃蛋白酶在鉸鏈區中的二硫鍵下方消化抗體以產 生F(ab) ' 2 (-種自身為由雙硫鍵連接到輕鏈的Fab的二聚體）。可在溫和條件下 還原F(ab)'2以破壞鉸鏈區中的雙硫鍵聯進而將（Fab'）2二聚體轉化成Fab'單體。Fab'單 體基本上是具有部分鉸鏈區的Fab(參見基礎免疫學（FundamentalImmunology)，W.E.保 羅（W.E.Paul)編，紐約的瑞文出版社（RavenPress，N.Y. )(1993)，關于其它抗體片段的 較詳細描述）。雖然各種抗體片段根據完整抗體的消化定義，但所屬領域的技術人員將理 解所述Fab'片段可以化學方式或使用重組DNA方法從頭合成。因此，如本文中所用的術語 "抗體"還包括通過修飾全抗體產生的抗體片段或通過使用重組DNA方法從頭合成的抗體 片段。在一些實施例中，抗體是單鏈抗體，如單鏈Fv(scFv)抗體，其中可變重鏈和可變輕鏈 (直接或通過肽連接子）連接在一起以形成連續多肽。單鏈Fv( "scFv"）多肽是共價連接 的VH: 雜二聚體，其可從包括直接連接或由肽編碼連接子連接的V#PVJl碼序列的核 酸表達。（參見例如休斯頓（Huston)等人（1988)美國國家科學院院刊，85:5879-5883,其 全部內容以引用的方式并入本文中。）多種結構存在用于將來自抗體V區的天然聚集但化 學上間隔開的輕鏈和重鏈多肽鏈轉化成scFv分子，所述scFv分子將折疊成實質上類似于 抗原結合位點結構的三維結構。參見例如美國專利第5, 091，513號和第5, 132, 405號和第 4, 956, 778 號。
[0046] 大約：如本文中所用，術語"大約"或"約"在應用于所關注的一或多個值時是指與 所述參考值類似的值。在某些實施例中，除非另行說明或另外從上下文顯而易見，否則術 語"大約"或"約"是指落入所述參考值的任一方向（大于或小于）25%、20%、19%、18%、 17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或 更低內的一系列值（除了其中所述數目將超過100%的可能值）。
[0047] 結合劑：如本文中所用，術語"結合劑"包括結合抗原或目標蛋白或肽的任何天然 存在、合成或基因工程改造的藥劑，如蛋白質。"結合劑"也稱為"結合蛋白"。結合劑可來 源于天然存在的抗體或以合成方式經工程改造。結合蛋白或結合劑可類似于抗體通過結合 于特定抗原以形成復合物并引發生物反應（例如激動或拮抗具體生物活性）來起作用。結 合劑或結合蛋白可包括經分離片段、由抗體的重鏈和輕鏈的可變區組成的"Fv"片段、其中 輕鏈和重鏈可變區由肽連接子連接的重組單鏈多肽分子（"scFv蛋白"）和由模擬高變區 的氨基酸殘基組成的最小識別單位。如本文中所用的術語結合劑還可包括通過修飾全抗 體產生的抗體片段或通過使用重組DNA方法從頭合成的抗體片段。在一些實施例中，抗體 是單鏈抗體，如單鏈Fv(scFv)抗體，其中可變重鏈和可變輕鏈（直接或通過肽連接子）連 接在一起以形成連續多肽。單鏈Fv( "scFv"）多肽是共價連接的VH: =Vlj雜二聚體，其可從 包括直接連接或由肽編碼連接子連接的VjPVJl碼序列的核酸表達。（參見例如休斯頓 (Huston)等人（1988)美國國家科學院院刊，85:5879-5883,其全部內容以引用的方式并入 本文中。）多種結構存在用于將來自抗體V區的天然聚集但化學上間隔開的輕鏈和重鏈多 肽鏈轉化成scFv分子，所述scFv分子將折疊成實質上類似于抗原結合位點結構的三維結 構。參見例如美國專利第5, 091，513號和第5, 132, 405號和第4, 956, 778號。在一些實施 例中，如本文中所用的術語結合劑還可包括抗體。參見抗體的定義。
[0048] CDR:如本文中所用，其是指抗體可變區內的互補決定區。在重鏈和輕鏈的每一可 變區中有三個⑶R，對于每一可變區，其被指定為⑶R1、⑶R2和⑶R3。"⑶R的組"或"⑶R 組"是指在能夠結合抗原的單一可變區中存在的三個或六個CDR群組或能夠結合抗原的同 源重鏈和輕鏈可變區的CDR。CDR的界限已取決于系統以不同方式定義，在所述系統中數種 是所屬領域中已知的（例如卡巴特（Kabat)、科西亞（Chothia)等）。
[0049] 化合物和藥劑：術語"化合物"和"藥劑"在本文中可互換使用。其是指任何天然 存在或非天然存在（即合成或重組）的分子，如生物大分子（例如核酸、多肽或蛋白質）、有 機或無機分子、或由生物物質（如細菌、植物、真菌或動物（尤其是哺乳動物，包括人類）細 胞或組織）制成的提取物。化合物可為單一分子或至少兩種分子的混合物或復合物。
[0050] 對照：如本文中所用，術語"對照"具有其作為結果與之相比的標準的本領域理解 的含義。通常，對照用于通過隔離變量以便得出關于所述變量的結論來加強實驗的完整性。 在一些實施例中，對照是與測試反應或分析同時執行以提供比較物的反應或分析。在一個 實驗中，施用"測試"（即，所測試的變量）。在第二實驗中，"對照"，不施用所測試的變量。 在一些實施例中，對照是歷史對照（即先前執行的測試或分析，或先前已知的量或結果）。 在一些實施例中，對照是或包含印刷或以其它方式保存的記錄。對照可為陽性對照或陰性 對照。
[0051] 給藥方案："給藥方案"（或"治療方案"）在所述術語在本文中使用時是通常間隔 開時間段向受試者個別投與的一組單位劑量（通常是一個以上）。在一些實施例中，給定治 療劑具有推薦的給藥方案，其可能涉及一或多個劑量。在一些實施例中，給藥方案包含多個 劑量，其中的每一者彼此間隔開相同長度的時間段；在一些實施例中，給藥方案包含多個劑 量以及間隔開個別劑量的至少兩個不同時間段。
[0052] 診斷：如本文中所用，術語"診斷"是指旨在判定個體是否罹患疾病（disease或 ailment)的過程。在本發明的情形下，"硬皮病的診斷"是指旨在以下各項中的一者或多者 的過程：判定個體是否罹患硬皮病，鑒別硬皮病亞型（即彌漫性或局限性皮膚硬皮病）以及 確定疾病的嚴重度。
[0053] 有效量：如本文中所用，術語"有效量"是指足以滿足預期目的的化合物或藥劑的 量。在本發明的情形下，目的可為例如：調節硬皮病的病因或癥狀；和/或延緩或預防硬皮 病的發作；和/或減緩或終止硬皮病癥狀的進展、加重或惡化；和/或緩解與硬皮病有關的 一或多個癥狀；和/或為硬皮病癥狀帶來改善，和/或治愈硬皮病。
[0054] 框架或框架區：如本文中所用，其是指減去CDR的可變區的序列。因為CDR序列 可通過不同系統測定，所以同樣地框架序列經歷相對應地不同解讀。六個CDR將重鏈和輕 鏈上的框架區劃分成各鏈上的四個子區（FR1、FR2、FR3和FR4)，其中CDRl位于FRl與FR2 之間，⑶R2位于FR2與FR3之間，并且⑶R3位于FR3與FR4之間。在不將具體子區指定為 FRl、FR2、FR3或FR4的情況下，如通過其它提及的框架區代表單個天然存在免疫球蛋白鏈 的可變區內的組合的FR。如本文中所用，FR代表四個子區中的一者，FRl例如代表最接近 于可變區的氨基末端并且相對于CDRl的5'的第一框架區，并且FRs代表構成框架區的子 區中的兩者或更多者。
[0055] 人類抗體：如本文中所用，其打算包括具有從人類免疫球蛋白序列生成（或裝配） 的可變區和恒定區的抗體。在一些實施例中，抗體（或抗體組分）可視為"人類"，盡管其 氨基酸序列例如在一或多個CDR并且尤其是CDR3中包括不由人類生殖系免疫球蛋白序列 (例如包括序列變異體，例如可能（原先）已通過體外隨機或定點誘變或通過體內體細胞突 變引入的序列變異體）編碼的殘基或元件。
[0056] 人類化：如本領域中已知，術語"人類化"常用于指氨基酸序列包括來自在非人類 物種（例如小鼠）中產生的參考抗體的VjPVl區序列而且在那些序列中包括打算使其更 "人類樣"（即，與人類生殖系可變序列更類似）的相對于參考抗體的修飾的抗體（或抗體組 分）。在一些實施例中，"人類化"抗體（或抗體組分）是免疫特異性地結合到所關注抗原 的抗體，并且其具有具備實質上如人類抗體的氨基酸序列般的氨基酸序列的框架（FR)區 以及具備實質上如非人類抗體的氨基酸序列般的氨基酸序列的互補決定區（CDR)。人類化 抗體包含實質上所有的至少一個并且通常是兩個可變域（Fab、Fab' 4(&13'）2、？&13(：、？0，其 中所有或實質上所有的CDR區對應于非人類免疫球蛋白（即供體免疫球蛋白）的CDR區， 并且所有或實質上所有框架區是人類免疫球蛋白共同序列的框架區。在一些實施例中，人 類化抗體還包含免疫球蛋白恒定區（Fe)的至少一部分，通常是人類免疫球蛋白恒定區的 至少一部分。在一些實施例中，人類化抗體含有輕鏈以及至少重鏈可變域兩者。抗體還可 包括重鏈恒定區的CH1、鉸鏈、CH2、CH3以及任選地CH4區。在一些實施例中，人類化抗體僅含 有人類化'區。在一些實施例中，人類化抗體僅含有人類化VHg。在一些某些實施例中， 人類化抗體含有人類化％和Vl區。
[0057] 提高、增大或減小：如本文中所用，術語"提高"、"增大"或"減小"或語法上的等效 說法指示相對于基線測量值的值，所述基線測量值如在相同個體中在開始本文中所述的治 療之前的測量值或在一個對照個體（或多個對照個體）中在不存在本文中所述的治療的情 況下的測量值。"對照個體"是與所治療的個體罹患相同類型和大致相同嚴重度的硬皮病的 個體，其與所治療的個體年齡大致相同（從而確保所治療的個體與對照個體的疾病階段是 可比的）。
[0058] 試劑盒：如本文中所用，術語"試劑盒"是指用于傳遞物質的任何傳遞系統。所述 傳遞系統可包括允許從一個地點到另一個地點儲存、運輸或傳遞各種診斷性或治療性試劑 (例如在適當容器中的寡核苷酸、酶等）和/或支持物質（例如緩沖液，用于執行分析的書 面說明書等）的系統。舉例來說，試劑盒包括一或多個含有相關反應試劑和/或支持物質 的外殼（例如盒子）。術語"分部式試劑盒"是指包含兩個或更多個分開的容器的傳遞系 統，所述容器各自含有全部試劑盒組分的亞部分。可一起或分開地將所述容器傳遞給預期 的接受者。舉例來說，第一個容器可含有用于分析的酶，而第二個容器含有寡核苷酸。術 語"分部式試劑盒"打算涵蓋含有在聯邦食品、藥品和化妝品法案（FederalFood，Drug，and CosmeticAct)的條款520(e)的管制之下的分析物特異性試劑（AnalyteSpecific Reagents，ASR's)的試劑盒，但并不局限于此。事實上，在術語"分部式試劑盒"中包括任何 包含兩個或更多個分開的容器的傳遞系統，所述容器各自含有全部試劑盒組分的亞部分。 相反地，"組合式試劑盒"是指在單個容器中（例如在容納每一所需組分的單個盒子中）含 有所有組分的傳遞系統。術語"試劑盒"包括分部式和組合式試劑盒兩者。
[0059] 正常：如本文中所用，術語"正常"在用于修飾術語"個體"或"受試者"時是指并 未患有具體疾病或病況并且也不是所述疾病或病況的攜帶者的個體或個體群組。術語"正 常"在本文中也用于形容從正常或野生型個體或受試者中分離的生物樣本或樣品，例如"正 常生物樣品"。
[0060] 核酸：如本文中所用的術語"核酸"是指寡核苷酸、核苷酸或多核苷酸以及其片段 或部分，并且是指可為單鏈或雙鏈的基因組或合成起點的DNA或RNA，并且代表正義或反義 鏈。
[0061] 核酸分子：術語"核酸分子"和"多核苷酸"在本文中可互換使用。其是指呈單鏈 或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，并且除非另行說明，否則其涵蓋可以 與天然存在的核苷酸類似的方式起作用的已知的天然核苷酸類似物。所述術語涵蓋具有合 成主鏈的核酸樣結構以及擴增產物。
[0062] 蛋白質：一般來說，"蛋白質"是多肽（即，由肽鍵彼此連接的至少兩個氨基酸的 串）。蛋白質可包括除氨基酸之外的部分（例如可為糖蛋白）和/或可以其它方式加工或 修飾。所屬領域的技術人員將理解"蛋白質"可為如由細胞產生的完整多肽鏈（具有或不 具有信號序列），或可為其功能性部分。一般技術者將進一步理解蛋白質有時可包括例如由 一或多個二硫鍵連接或通過其它方式締合的一個以上多肽鏈。
[0063] 樣品：如本文中所用，術語"樣品"涵蓋從生物來源獲得的任何樣品。術語"生物樣 品"和"樣品"可互換使用。生物樣品可（借助于非限制性實例）包括皮膚組織、肝組織、腎 組織、肺組織、腦脊髓液、（CSF)、血液、羊水、血清、尿液、糞便、表皮樣品、皮膚樣品、頰部抹 拭、精子、羊膜液、經培養細胞、骨髓樣品和/或絨毛膜絨毛。任何生物樣品的細胞培養物也 可用作生物樣品。生物樣品還可為例如從任何器官或組織獲得的樣品（包括活檢或尸檢樣 本），可包含細胞（不論是原代細胞還是經培養細胞）、由任何細胞、組織或器官調節的培養 基、組織培養物。在一些實施例中，適于本發明的生物樣品是已經加工從而釋放或以其它方 式使核酸可供用于如本文中所述的檢測的樣品。也可使用固定或冷凍組織。
[0064] 受試者：如本文中所用，術語"受試者"是指人類或任何非人類動物（例如小鼠、大 鼠、兔、狗、貓、牛、豬、綿羊、馬或靈長類動物）。人類包括出生前和出生后形式。在許多實施 例中，受試者是人類。受試者可為患者，其是指呈現給醫療服務提供者以便診斷或治療疾病 的人類。術語"受試者"在本文中與"個體"或"患者"可互換使用。受試者可罹患或易患疾 病或病癥但可能呈現或可能不呈現所述疾病或病癥的癥狀。
[0065] 罹患："罹患"疾病、病癥和/或病況（例如硬皮病）的個體已診斷有所述疾病、病 癥和/或病況或展示所述疾病、病癥和/或病況的一或多種癥狀。
[0066] 易患："易患"疾病、病癥和/或病況的個體尚未診斷有所述疾病、病癥和/或病況 和/或可能不展現所述疾病、病癥和/或病況的癥狀。在一些實施例中，易患疾病、病癥和/ 或病況（例如硬皮病）的個體的特征可在于以下中的一或多者：（1)與所述疾病、病癥和/ 或病況發展有關的基因突變；（2)與所述疾病、病癥和/或病況發展有關的基因多態性；（3) 增加和/或減少與所述疾病、病癥和/或病況有關的蛋白的表達和/或活性；(4)與所述疾 病、病癥和/或病況發展有關的習慣和/或生活方式；（5)所述疾病、病癥和/或病況的家 族病史；(6)對某些細菌或病毒的反應；（7)暴露于某些化學物質。在一些實施例中，易患疾 病、病癥和/或病況的個體將發展所述疾病、病癥和/或病況。在一些實施例中，易患疾病、 病癥和/或病況的個體將不發展所述疾病、病癥和/或病況。
[0067] 治療：如本文中所用，術語"治療（treatment)"（還有"治療（treat)"或"治療 (treating)"）是指治療性蛋白的任何投與（例如抗CCL2單克隆抗體或其抗原結合片段的 投與）部分或完全地將具體疾病、病癥和/或病況（例如硬皮病、纖維化或炎癥）的一或多 種癥狀或特征緩解、改善、減輕、抑制、延緩發作、降低嚴重度和/或降低發病率。所述治療 可為對并未展現相關疾病、病癥和/或病況的征象的受試者的治療和/或對僅展現疾病、病 癥和/或病況的早期征象的受試者的治療。可替代地或另外，所述治療可為對展現相關疾 病、病癥和/或病況的一或多種確立征象的受試者的治療。

【具體實施方式】
[0068] 本發明尤其提供特征在于高親和力、效力、組織選擇性和/或表位特異性的經改 良抗CCL2抗體，和其尤其用于治療硬皮病和相關纖維化和/或發炎性疾病、病癥和病況的 用途。在一些實施例中，本發明提供基于親和力為KT12M或更大的抗CCL2抗體治療硬皮病 和相關纖維化和/或發炎性疾病、病癥和病況的方法和組合物。
[0069] 本發明在某種程度上基于由本發明人觀察到的獨到見解，S卩，高親和力抗CCL2 抗體尤其在以高劑量投與時允許不管血漿中的高水平CCL2而有效抑制受影響組織中的 CCL2。本發明的實施例包括親和力為KT12M或更大的抗CCL2抗體。所述高親和力的抗體 是尤其有利的。由于硬皮病患者血漿中CCL2的循環水平較高，故所投與的任何抗CCL2抗 體的較大部分很可能被循環CCL2所螯合。在不希望受理論束縛的情況下，高親和力抗CCL2 抗體除了中和循環CCL2之外還可有效中和受影響組織中的CCL2,這部分歸因于其有效地 競爭離開受體CCR2 (其對CCL2的結合親和力為60pM)的能力。因此，高親和力抗CCL2抗 體（例如結合親和力強于60pM的抗CCL2抗體）可有效螯合患病組織中的CCL2,防止CCL2 與其受體CCR2之間的結合。因此，患病組織中可能需要較少量的高親和力抗CCL2抗體來 實現所需治療作用。
[0070] 本發明的各種方面詳細地描述于以下章節中。章節的使用不意欲限制本發明。每 一章節可應用于本發明的任何方面。在本申請案中，除非另外說明，否則"或"的使用意指 "和/或"。
[0071] 硬皮病
[0072] 硬皮病或全身性硬化癥通常被視為慢性全身性自身免疫疾病，其特征尤其在于纖 維化或硬化、血管變化和自身抗體。在不希望受理論束縛的情況下，據認為硬皮病是由強化 擴增環中截留的活動過度的自身免疫反應引起的。舉例來說，硬皮病的組織學特征在于單 核細胞的炎性浸潤，其又活化周圍成纖維細胞中的膠原蛋白合成并與膠原蛋白合成增加有 關。具體來說，活化的巨噬細胞產生TGF-0和TOGF，其活化受影響區域中的成纖維細胞以 產生較高量的膠原蛋白。
[0073] T細胞似乎也通過活化巨噬細胞和炎性前纖維發生細胞因子的直接釋放而在疾病 過程中起一定作用。除了膠原蛋白之外，活化的成纖維細胞似乎分泌會將其它炎性細胞募 集到受影響區域的因子，所述炎性細胞釋放細胞因子，所述細胞因子進一步募集細胞因子 釋放炎性細胞，由此引起未經調節的炎癥和組織纖維化。
[0074] 通常，單核細胞/巨噬細胞和T細胞在硬皮病患者的循環和組織中的數目和活化 均增加。組織積聚既是微血管損傷的原因也是其作用，微血管損傷是硬皮病發病機制中的 早期事件之一。微血管損傷的特征在于內皮細胞損傷、基底膜層增生、外周血液單核細胞在 血管壁中的偶發性滯留以及初始血管周圍單核細胞浸潤。隨著發炎級聯反應惡化，纖維化、 內臟器官架構紊亂、血管稀疏以及因此產生的缺氧占主導地位。所有這些因素和單核細胞 的持續募集促成纖維化的維持。
[0075] 在一些實施例中，硬皮病也被視為結締組織疾病，其特征通常在于胞外基質蛋白 在皮膚和內臟中的過度積聚、血管損傷以及免疫異常。
[0076] 所述疾病的許多臨床表現被認為涉及血管重構的誤調節。硬皮病的最早癥狀之一 是微血管損傷。這種微血管損傷被認為引起內皮細胞活化增加。認為活化的內皮細胞會表 達粘附分子，引起毛細管滲透性改變，允許炎性細胞通過內皮迀移并滯留在血管壁中。免疫 活化被認為促進內皮活化維持，這引起內皮細胞的分解。認為這一過程會促進在硬皮病患 者中通常觀察到的血管彈性損失和變窄。此外，認為微血管損傷促成單核細胞在真皮中的 血管周圍浸潤，這被認為會促進成纖維細胞活化和許多硬皮病的相關標志性癥狀。隨著纖 維化增加，滲透性降低。因此，抗體滲透患病組織變得更困難。因此，抗CCL2抗體的親和力 對于保持抗體局部化來說變得尤其重要。
[0077] 所述疾病的許多臨床表現被大體上認為涉及成纖維細胞的誤調節。成纖維細胞的 主要功能是通過連續分泌胞外基質前體來維持結締組織的結構完整性。成纖維細胞為許多 組織提供結構框架（基質），在創傷愈合中起到重要作用并且是動物中最常見的結締組織 細胞。成纖維細胞在形態上是異質的，取決于其位置和活性具有多樣的外觀。
[0078] 硬皮病有兩種主要形式：局限性全身性硬化癥/硬皮病和彌漫性全身性硬化癥/ 硬皮病。在局限性皮膚硬皮病中，皮膚的纖維化大體上限制于接近肘部的區域。局限性皮 膚硬皮病患者通常經歷血管損害。皮膚和器官纖維化在局限性硬皮病患者中通常進展緩 慢。彌漫性硬皮病患者通常經歷與在局限性硬皮病中相比進展更快速的皮膚和器官的纖維 化和/或廣泛的炎癥和/或與在局限性硬皮病中可見相比更嚴重的內部器官涉及。
[0079] 通常認為間質肺疾病（其引起肺纖維化）是硬皮病相關死亡的主要原因（盧德維 卡-布拉德萊A. (Ludwicka-Bradley，A.)等人硬皮病間質肺疾病中的凝血和自身免疫性 (Coagulationandautoimmunityinsclerodermainterstitiallungdisease)?關節炎 與風濕病論文集（SeminArthritisRheum) ,41 (2) ,212-22, 2011)。引起硬皮病相關死亡的 其它并發癥包括（但不限于）癌癥、心力衰竭、肺高血壓、腎衰竭和吸收障礙或其任何組合。
[0080] 硬皮病最常通過檢查皮膚癥狀來診斷。診斷的測試包括（但不限于）目視和/或 手動檢查皮膚、血壓測試、胸X射線、肺CT、超聲心動圖、尿分析、皮膚活檢和血液測試（包括 抗核抗體測試、抗拓撲異構酶抗體測試、抗著絲粒抗體測試、抗U3抗體測試、抗RNA抗體測 試、其它類型的抗體測試、紅細胞沉降速率以及類風濕因子）。
[0081] 抗CCL2 抗體
[0082] 本發明提供基于投與抗CCL2抗體（具體來說是高親和力抗CCL2抗體）來治療硬 皮病和相關纖維化和/或發炎性疾病、病癥和病況的方法和組合物。
[0083] CCL2
[0084] CCL2是由多種細胞類型產生的趨化因子。其也稱為單核趨化蛋白-I(MCP-I)。 已知CCL2是免疫系統許多細胞類型的強力引誘劑，包括（但不限于）單核細胞、CD4和 ⑶8記憶T淋巴細胞和NK細胞（卡魯利M. (Carulli，M.)等人CCL2血清水平可在全身性 硬化癥中用于風險分層或監測治療反應嗎？（CanCCL2serumlevelsbeusedinrisk stratificationortomonitortreatmentresponseinsystemicsclerosis?)風濕 病年鑒（AnnRheumDis)，67, 105-109, 2008，山本T. (Yamamoto,T.)硬皮病-病理生理學 (Scleroderma-Pathophysiology) ?歐洲皮膚病學雜志（EurJDermatol) ,19 (I) ,14-24)。 CCL2已展示出促進白細胞跨內皮單層迀移，表明在促進單核細胞的血管周圍浸潤中的作用 (同上）。CCL2也已展示出在體外大鼠成纖維細胞中促進成纖維細胞活化并上調I型膠原 蛋白mRNA表達。在硬皮病患者以及硬皮病動物模型中已展示出CCL2水平升高（同上）。 確切地說，在硬皮病皮膚中已展示CCL2表達水平增加，并且在硬皮病成纖維細胞中已展示 CCL2RNA和蛋白質增加（同上）。
[0085] 人類CCL2是含有76個氨基酸殘基的8. 6kDa蛋白，其氨基酸序列展示在表1中。 其由多種細胞類型（尤其包括單核細胞、血管內皮細胞、平滑肌細胞、某些上皮細胞）表達 并且結合其受體CCR2。CCL2屬于CC趨化因子家族，其含有鄰近的兩個半胱氨酸殘基（鄰 近半胱氨酸殘基在表1中帶下劃線）。
[0086] 表 1
[0087]

【權利要求】
1. 一種治療硬皮病的方法，其包含 向罹患或易患硬皮病的個體投與有效量的抗CCL2抗體或其片段，使得目標組織中硬 皮病的至少一種癥狀或特征的強度、嚴重度或頻率降低或具有延遲的發作。
2. 根據權利要求1所述的方法，其中所述硬皮病的至少一種癥狀或特征是選自內皮細 胞損傷、基底膜層增生、血管周圍單核細胞浸潤、纖維化、內臟器官架構紊亂、血管稀疏、缺 氧以及其組合。
3. 根據權利要求1或2所述的方法，其中所述目標組織是選自由以下組成的群組：皮 膚、血管、肺、心、腎、胃腸道（包括肝）、肌肉骨胳系統以及其組合。
4. 根據前述權利要求中任一權利要求所述的方法，其中所述目標組織是肺。
5. 根據權利要求1到3中任一權利要求所述的方法，其中所述目標組織是心。
6. 根據前述權利要求中任一權利要求所述的方法，其中所述個體罹患或易患局限性皮 膚硬皮病。
7. 根據前述權利要求中任一權利要求所述的方法，其中所述個體罹患或易患彌漫性皮 膚硬皮病。
8. 根據前述權利要求中任一權利要求所述的方法，其中所述抗CCL2抗體或其片段是 腸胃外投與的。
9. 根據權利要求8所述的方法，其中所述腸胃外投與是選自靜脈內、皮內、吸入、經皮 (表面）、皮下和/或經粘膜投與。
10. 根據權利要求9所述的方法，其中所述腸胃外投與是靜脈內投與。
11. 根據權利要求1到7中任一權利要求所述的方法，其中所述抗CCL2抗體或其片段 是口服投與的。
12. 根據前述權利要求中任一權利要求所述的方法，其中所述抗CCL2抗體或其片段 是兩月一次、每月一次、三周一次、兩周一次、每周一次、每天一次或以可變的時間間隔投與 的。
13. -種治療硬皮病的方法，其包含 向罹患或易患硬皮病的個體投與結合親和力大于1(T12M的抗CCL2抗體或其片段。
14. 根據權利要求13所述的方法，其中所述抗CCL2抗體或其片段以治療有效劑量和一 定的投與時間間隔投與，使得所述抗CCL2抗體或其片段分布到一或多種選自由以下組成 的群組的目標組織：皮膚、血管、肺、心、腎、胃腸道（包括肝）、肌肉骨胳系統以及其組合。
15. 根據權利要求13所述的方法，其中所述抗CCL2抗體或其片段以治療有效劑量和一 定的投與時間間隔投與，使得所述抗CCL2抗體或其片段分布到肺和/或心。
16. 根據權利要求15所述的方法，其中所述投與時間間隔是選自兩月一次、每月一次、 三周一次、兩周一次、每周一次、每天一次或可變的時間間隔。
17. -種治療硬皮病的方法，其包含 以治療有效劑量和一定的投與時間間隔向罹患或易患硬皮病的個體投與抗CCL2抗體 或其片段，使得所述抗CCL2抗體或其片段分布到肺和/或心。
18. 根據權利要求17所述的方法，其中所述抗CCL2抗體或其片段進一步分布到皮膚、 腎和/或肝。
19. 根據前述權利要求中任一權利要求所述的方法，其中所述抗CCL2抗體或其片段是 選自由以下組成的群組：完整IgG、F(ab'）2、F(ab)2、Fab'、Fab、scFvs、雙功能抗體、三功能 抗體和四功能抗體。
20. 根據權利要求19所述的方法，其中所述抗CCL2抗體或其片段是單克隆抗體。
21. 根據權利要求20所述的方法，其中所述抗CCL2抗體或其片段是人類化單克隆抗 體。
22. 根據權利要求20所述的方法，其中所述抗CCL2抗體或其片段是人類抗體。
23. -種抗CCL2抗體或其片段，其具有大于10 _12M的結合親和力。
24. 根據權利要求23所述的抗CCL2抗體，其中所述抗CCL2抗體或其片段具有大于 1(T13M的結合親和力。
25. 根據權利要求23或24所述的抗CCL2抗體，其中所述抗CCL2抗體或其片段是選自 由以下組成的群組：完整IgG、F(ab'）2、F(ab)2、Fab'、Fab、scFvs、雙功能抗體、三功能抗體 和四功能抗體。
26. 根據權利要求23到25中任一權利要求所述的抗CCL2抗體，其中所述抗CCL2抗體 或其片段是單克隆抗體。
27. 根據權利要求26所述的抗CCL2抗體，其中所述抗CCL2抗體或其片段是人類化單 克隆抗體。
28. 根據權利要求26所述的抗CCL2抗體，其中所述抗CCL2抗體或其片段是人類抗體。
29. -種試劑盒，其包含根據權利要求23到28中任一權利要求所述的抗CCL2抗體或 其片段。
【文檔編號】A61K39/395GK104487091SQ201380038785
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2013年5月22日 優先權日:2012年5月22日
【發明者】P·G·V·馬丁尼, M·納塔拉詹, P·A·J·哈斯利特, A·B·西摩 申請人:夏爾人類遺傳性治療公司