適用于治療血友病的化合物的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及適用于治療凝血疾病的VWF化合物以及組合物。
【專(zhuān)利說(shuō)明】適用于治療血友病的化合物 技術(shù)背景
[0001] 本發(fā)明涉及血友病的治療和/或預(yù)防。
[0002] 背景 經(jīng)靜脈內(nèi)給予凝血因子的蛋白質(zhì)替代療法目前用于治療血友病患者。對(duì)于患者的方便 性和依從性而言，血管外（例如，皮下（s. c.)或皮內(nèi)）給藥優(yōu)于現(xiàn)有的靜脈內(nèi)（i. V.)注射。 血管外給予還具有潛在的安全性?xún)?yōu)勢(shì)，因?yàn)樵S多患者能夠避免靜脈內(nèi)端口手術(shù)以及這類(lèi)導(dǎo) 管插入相關(guān)的感染和凝血風(fēng)險(xiǎn)。
[0003] 在FVIII缺乏的小鼠中經(jīng)皮下給予FVIII，公開(kāi)于Shi等人，Haemophilia, 2012， DOI :10. 1111/j. 1365-2516. 2011. 02735. X。FVIII的生物利用度在此文中據(jù)報(bào)告為低（大 約 1%)。
[0004] 經(jīng)皮下給予FVIII和VWF另外公開(kāi)于W008151817,但未公開(kāi)FVIII劑量和所達(dá)到 的循環(huán)FVIII濃度間的劑量反應(yīng)關(guān)系。在W0815817中，VWF與FVIII的（單位）比率大于 5:1，相當(dāng)于VWF蛋白濃度比FVIII濃度有150-250倍摩爾過(guò)量。然而，從實(shí)踐和經(jīng)濟(jì)上的 觀(guān)點(diǎn)看，這種類(lèi)型的比例并不理想。在W008151817中，進(jìn)一步證明了當(dāng)將FVIII與VWF共 同配制時(shí)，經(jīng)皮下給予FVIII的小鼠的免疫原性明顯降低。
[0005] 在W010062768中，公開(kāi)了 FVIII的聚乙二醇化可以改進(jìn)經(jīng)皮下注射給小鼠的 FVIII的生物利用度，而與VWF共同配制卻沒(méi)有改進(jìn)FVIII的生物利用度。
[0006] 本領(lǐng)域需要這樣的化合物和/或藥物組合物：其適用于經(jīng)血管外給予，以在有或 無(wú)抑制劑時(shí)治療和/或預(yù)防患有凝血疾病例如A型血友病的患者，和/或治療和/或預(yù)防 患有馮維勒布蘭德氏病的患者，因?yàn)檫@樣的給予形式將會(huì)減輕經(jīng)靜脈內(nèi)治療的負(fù)擔(dān)，這兩 者的靜脈內(nèi)治療都同樣涉及到輸注并且也涉及到因植入便攜式導(dǎo)管所致的感染風(fēng)險(xiǎn)。這樣 的化合物和組合物優(yōu)選是安全的（即具有低的免疫原性風(fēng)險(xiǎn)）和/或具有高生物利用度和 /或優(yōu)選是在生產(chǎn)和配制過(guò)程中容易處理的。
[0007] 概述 本發(fā)明涉及包含1200個(gè)或更少氨基酸的重組VWF片段，例如，TIL'結(jié)構(gòu)域或TIL' /E' 結(jié)構(gòu)域（Zhou等人.Blood 2012 ;120(2) :449-458)。本發(fā)明還涉及包含以下的藥物組合 物：⑴本發(fā)明的VWF片段，和（ii) FVIII分子（全長(zhǎng)/截短的B結(jié)構(gòu)域/綴合的）。本 發(fā)明還涉及它們?cè)谥委熝巡≈械挠猛?，例如?jīng)血管外給予。這樣的化合物和組合物當(dāng)經(jīng) 血管外共同給予FVIII時(shí)將優(yōu)選導(dǎo)致相對(duì)高的FVIII生物利用度和/或相對(duì)低的FVIII免 疫原性風(fēng)險(xiǎn)。
[0008] 描述 本發(fā)明的一方面，與具有延長(zhǎng)的體內(nèi)循環(huán)半壽期的FVIII分子共同給予的本發(fā)明的 VWF片段在經(jīng)血管外（例如皮下）給予時(shí)具有令人驚奇的高生物利用度。
[0009] 本發(fā)明的發(fā)明人還驚奇地發(fā)現(xiàn)了以下觀(guān)察結(jié)果：在與類(lèi)似摩爾量的本發(fā)明的VWF 片段血管外共同給予后，可以明顯改善FVIII分子的生物利用度?；蛘?，可通過(guò)血管外共同 給予FVIII分子庫(kù)，以達(dá)到高生物利用度，在所述分子庫(kù)中，大部分所述FVIII分子與本發(fā) 明的VWF片段結(jié)合。有趣的是，全長(zhǎng)VWF對(duì)FVIII的生物利用度沒(méi)有積極影響。優(yōu)選地，VWF 應(yīng)當(dāng)呈VWF片段的形式，其包含TIL'或TIL' /E'結(jié)構(gòu)域。因此，本發(fā)明的化合物和組合物 可在有或無(wú)抑制劑時(shí)用于治療和預(yù)防血友病患者（尤其是A型血友病患者），以及在有抑制 劑時(shí)用于血友病患者的免疫耐受誘導(dǎo)（ITI)。
[0010] 附圖簡(jiǎn)述 圖1 :在有或無(wú)共同給予相對(duì)于N8-GP而言的7. 7倍摩爾劑量的VWF TIL' /E' /D3/A1 時(shí)，在皮下給予10000 U/kg "N8-GP"后，血漿中的FVIII活性。數(shù)據(jù)是在每一時(shí)間點(diǎn)來(lái)自 n=2 FVIII KO小鼠的測(cè)量的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。"N8-GP"是如W02009108806的實(shí)施例1+2 所述而制備的糖-聚乙二醇化FVIII分子。
[0011] 圖2 :在有或無(wú)共同給予相對(duì)于N8-GP而言的7. 7倍摩爾劑量的VWF TIL'/E'/D3/ Al時(shí)，在皮下給予10000 U/kg N8-GP后，血漿中的FVIII抗原。數(shù)據(jù)是在每一時(shí)間點(diǎn)來(lái)自 n=2 FVIII KO小鼠的測(cè)量的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。
[0012] 圖3 :在有或無(wú)共同給予相對(duì)于N8-GP而言的7. 7倍摩爾劑量的VWF TIL' /E' / D3/A1時(shí)，在皮下給予2500 U/kg N8-GP后，血漿中的FVIII活性。數(shù)據(jù)是在每一時(shí)間點(diǎn)來(lái) 自n=2 FVIII KO小鼠的測(cè)量的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。
[0013] 圖4 :在有或無(wú)共同給予相對(duì)于N8-GP而言的7. 7倍摩爾劑量的VWF TIL' /E' / D3/A1時(shí)，在皮下給予2500 U/kg N8-GP后，血漿中的FVIII抗原。數(shù)據(jù)是在每一時(shí)間點(diǎn)來(lái) 自n=2 FVIII KO小鼠的測(cè)量的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。
[0014] 圖5 :在有或無(wú)共同給予相對(duì)于FVIII而言的7. 7倍摩爾劑量的VWF TIL' /E' / D3/A1 時(shí)，在皮下分別給予 5000 或 20000 IU/kg wt FVIII (N8, turoctocog alfa)后，血 漿中的FVIII活性。數(shù)據(jù)是在每一時(shí)間點(diǎn)來(lái)自n=2 FVIII KO小鼠的測(cè)量的平均值和標(biāo)準(zhǔn) 差。"N8"/"turocotog alfa"是如W02009108806的實(shí)施例1中所述而制備的B結(jié)構(gòu)域截 短的FVIII分子。
[0015] 圖6 :在有或無(wú)共同給予相對(duì)于FVIII而言的7. 7倍摩爾劑量的VWF TIL' /E' / D3/A1 時(shí)，在皮下給予 5000 或 20000 IU/kg wt FVIII (N8, turoctocog alfa)后，血漿中 的FVIII抗原。數(shù)據(jù)是在每一時(shí)間點(diǎn)來(lái)自n=2 FVIII KO小鼠的測(cè)量的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。
[0016] 圖7 :在有或無(wú)共同給予相對(duì)于FVIII而言的7. 7倍摩爾劑量的VWF TIL' /E' / D3/A1 時(shí)，在皮下給予 5000 IU/kg FVIII (N8, turoctocog alfa)后，血漿中的 FVIII 抗 原。數(shù)據(jù)是在每一時(shí)間點(diǎn)來(lái)自n=2 FVIII KO小鼠的測(cè)量的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。
[0017] 圖8:在有或無(wú)共同給予相對(duì)于FVIII而言的7. 7倍摩爾劑量的VWF TIL' /E'/ D3/A1 時(shí)，在皮下給予 5000 IU/kg FVIII (N8, turoctocog alfa)后，血漿中的 FVIII 活 性。數(shù)據(jù)是在每一時(shí)間點(diǎn)來(lái)自n=2 FVIII KO小鼠的測(cè)量的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。
[0018] 圖 9 :在 20T 與 FVIII (N8, turoctocog alfa)結(jié)合的 VWF 變體（764-865 SEQ ID NO 5)。上圖面顯示每次滴定后釋放熱量的原始數(shù)據(jù)。下圖面顯示得自積分原始數(shù)據(jù)的 結(jié)合等溫線(xiàn)。數(shù)據(jù)分析表明VWF變體（SEQ ID NO 5)在放熱反應(yīng)中與FVIII結(jié)合，其化學(xué) 計(jì)量學(xué)為 1. 14, Λ H 為-5. 82 kcal/mole，Λ S 為 9. 8 cal/mol/deg 和 Kd 為 0· 33 μΜ。"F8/ N8/turoctocog alfa"是如W02009108806的實(shí)施例1中所公開(kāi)而制備的B結(jié)構(gòu)域截短的 FVIII分子。
[0019] 圖10 :經(jīng)皮下給予的N8-GP在體內(nèi)能有效止血。左圖面顯示在尾巴橫切前24小 時(shí)經(jīng)皮下N8-GP或溶媒治療，或在尾巴橫切前5分鐘經(jīng)靜脈內(nèi)治療的FVIIIKO小鼠中的血 液損失。N8-GP"是如W02009108806的實(shí)施例1+2中所述而制備的糖-聚乙二醇化FVIII 分子。右圖面顯示在來(lái)自小鼠離體全血中的凝血時(shí)間，使用R0TEM。
[0020] 圖 11 :在 25°C，F(xiàn)VIII、TIL，/E，/D3/A1 III、以及 FVIII 和 TIL，/E，/D3/A1 III 的混合物在155 mM NaCl、10 mM乙酸鈣、10 %異丙醇中的SEC-UV (280 nm)色譜圖。
[0021] 圖 12 :在 25°C，F(xiàn)VIII、TIL' /E' /D3 II、以及 FVIII 和 TIL' /E' /D3 II 的混合物 在155 mM NaCl、10 mM乙酸鈣、10%異丙醇中的SEC-UV (280 nm)色譜圖。
[0022] 定義 本文使用的術(shù)語(yǔ)"治這"指任何有需要的人或其他脊椎動(dòng)物受試者的醫(yī)學(xué)治療。預(yù)期 所述受試者已經(jīng)歷醫(yī)生或獸醫(yī)進(jìn)行的身體檢查，醫(yī)生或獸醫(yī)已給出試驗(yàn)性或明確的診斷， 表明使用所述特定治療對(duì)治療所述人或其他脊椎動(dòng)物的疾病有益。根據(jù)受試者健康狀況， 所述治療的時(shí)機(jī)和目的可因個(gè)體的不同而異。因此，所述治療可以是預(yù)防性的、緩和性的、 對(duì)癥的和/或治愈性的。
[0023] 給藥方式:本發(fā)明的化合物和藥物組合物可經(jīng)胃腸外給予，例如，經(jīng)靜脈內(nèi)或血管 外（例如，皮內(nèi)、肌內(nèi)、皮下等）給予。本發(fā)明的化合物和藥物組合物可以是預(yù)防性和/或 治療性地給予和/或按需要給予。根據(jù)本發(fā)明，血管外給予本發(fā)明的化合物/藥物組合物 具有若干優(yōu)勢(shì)。血管外給予對(duì)所有患者的可能益處、尤其是對(duì)兒童和小嬰兒的特定益處是， 更容易、簡(jiǎn)單，更少疼痛，更少麻煩和并發(fā)癥（并因此可能帶來(lái)較好的依從性）。
[0024] 聯(lián)合治療/共同給予：可以以許多不同方式完成兩種或更多種活件化合物(例如， FVIII和具有與FVIII結(jié)合能力的本發(fā)明的VWF/VWF片段）的聯(lián)合給予。在一個(gè)實(shí)施方案 中，兩種活性化合物可以在單個(gè)組合物中一起給予。在另一個(gè)實(shí)施方案中，兩種活性化合物 可以在單獨(dú)組合物中給予，作為聯(lián)合治療的組成部分。例如，第一種化合物可以在第二種 化合物之前、之后或同時(shí)給予。在FVIII和VWF片段作為兩種單獨(dú)的藥物組合物經(jīng)血管外 (例如，皮下）給予的情況下，它們優(yōu)選地是靠近地給予，以便得益于這兩種類(lèi)型的化合物 同時(shí)給予時(shí)所獲得的改進(jìn)的生物利用度（即注射部位應(yīng)當(dāng)間隔不超過(guò)5 cm、優(yōu)選地不超過(guò) 4 cm、優(yōu)選地不超過(guò)3 cm、優(yōu)選地不超過(guò)2 cm和最優(yōu)選地不超過(guò)I cm)。兩種化合物還應(yīng) 當(dāng)優(yōu)選地在大約1小時(shí)內(nèi)、優(yōu)選大約30分鐘內(nèi)、優(yōu)選大約15分鐘內(nèi)、和最優(yōu)選地大約5分 鐘內(nèi)注射。
[0025] 因子VIII :因子VIII (FVIII)是主要由肝細(xì)胞產(chǎn)生的大的復(fù)雜糖蛋白。人 FVIII包含2351個(gè)氨基酸，包括信號(hào)肽，并包含若干個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域，如通過(guò)同源性所 限定。有3個(gè)A-結(jié)構(gòu)域、1個(gè)唯一的B-結(jié)構(gòu)域和2個(gè)C-結(jié)構(gòu)域。結(jié)構(gòu)域順序可列為 NH2-A1-A2-B-A3-C1-C2-C00H。通過(guò)二價(jià)金屬離子結(jié)合將鏈連接在一起。A1-A2-B鏈命名為 重鏈（HC)，而A3-C1-C2命名為輕鏈（LC)。Al (al區(qū)）和A2 (a2區(qū)）的小的酸性區(qū)C-末 端和A3結(jié)構(gòu)域的N-末端（a3區(qū)）在其與其它凝血蛋白質(zhì)的相互作用中起到重要作用，所 述其它凝血蛋白質(zhì)包括凝血酶和馮維勒布蘭德因子（von Willebrandt Factor) (VWF)， FVIII的載體蛋白。
[0026] 內(nèi)源VIII分子以具有不同尺寸的B-結(jié)構(gòu)域的分子庫(kù)（最短的具有在位置740的 C-末端，即在A2-a2的C-末端，并因此不含B結(jié)構(gòu)域）在體內(nèi)循環(huán)。這些具有不同長(zhǎng)度的 B結(jié)構(gòu)域的FVIII分子都具有全部促凝血活性。一旦用凝血酶活化，在位置372的Al-al的 C-末端、在位置740的A2-a2的C-末端、和在位置1689的介于a3和A3之間切割FVIII， 后一切割釋放a3區(qū)，同時(shí)失去對(duì)VWF的親和力?；罨腇VIII分子稱(chēng)為FVIIIa?；罨试S FVIIIa與磷脂表面樣活化的血小板和活化的因子IX (FIXa)相互作用，即形成tenase復(fù)合 物，允許有效活化因子X(jué) (FX)。
[0027] 術(shù)語(yǔ)"因子VIII (a) "和"FVIII (a) "包括FVIII和FVIIIa兩者。同樣，術(shù)語(yǔ)"因子 VIII"和"FVIII"可包括FVIII和FVIIIa兩者。本文使用的"因子VIII"或"FVIII"是指 作為內(nèi)在凝血途徑的成員并對(duì)血液凝固必需的人血漿糖蛋白。"野生型（wt)/天然FVIII" 是源自如SEQ ID NO :1 (氨基酸1-2332)所示的全長(zhǎng)序列的人FVIII分子。"FVIII (a)"包 括可以在個(gè)體之間存在并出現(xiàn)的FVIII (a)的天然等位變體。FVIII (a)可以是血漿衍生的 或經(jīng)重組產(chǎn)生的，使用眾所周知的生產(chǎn)和純化方法。糖基化、酪氨酸硫酸化和其它翻譯后修 飾的程度和位置可以隨所選擇的宿主細(xì)胞及其生長(zhǎng)環(huán)境的不同而變。
[0028] 本發(fā)明的藥物組合物可包含這樣的天然的或B結(jié)構(gòu)域-截短的FVIII分子：其中 剩余結(jié)構(gòu)域接近相當(dāng)于如SEQ ID NO :3的氨基酸編號(hào)1-740和1649-2332所示的序列。在 這類(lèi)分子中，以及在包含全長(zhǎng)B結(jié)構(gòu)域氨基酸序列的FVIII中，可以引入突變。可將氨基酸 修飾例如取代、插入和缺失引入分子中，以便修飾FVIII與多種其他組分的結(jié)合能力，所述 多種其他組分例如低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白（LRP)和相關(guān)受體、多種其他受體、其他凝 血因子、細(xì)胞表面、糖基化位點(diǎn)的引入和/或取消等。不取消FVIII活性的其它突變也可在 本文的FVIII分子中提供。
[0029] 本文的FVIII分子（分子/變體/衍生物/類(lèi)似物/綴合物）在凝血級(jí)聯(lián)中能夠 起作用，其方式在功能上類(lèi)似于或等同于wt/內(nèi)源FVIII，導(dǎo)致FXa的形成（經(jīng)由與活化血 小板上的FIXa相互作用）和支持血凝塊的形成。可使用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)，在體外評(píng) 價(jià)FVIII活性。凝血分析、FX活化測(cè)定法（通常稱(chēng)為顯色測(cè)定法）、凝血酶產(chǎn)生測(cè)定法和全 血血栓-彈性成像是這類(lèi)體外技術(shù)的實(shí)例。本發(fā)明的FVIII分子具有的FVIII活性是天然 人FVIII的至少大約10%、至少大約20%、至少大約30%、至少大約40%、至少大約50%、至少大 約60%、至少大約70%、至少大約80%、至少大約90%、100%或甚至超過(guò)100%。
[0030] 將內(nèi)源全長(zhǎng)FVIII合成為單鏈前體分子。在分泌之前，將前體切割為重鏈和輕鏈。 可從兩種不同的策略產(chǎn)生重組B結(jié)構(gòu)域缺失或截短的FVIII。將無(wú) B-結(jié)構(gòu)域的重鏈和輕鏈 單獨(dú)合成為兩條不同的多肽鏈（兩條鏈策略），或?qū)-結(jié)構(gòu)域缺失或截短的FVIII合成為 單一前體多肽鏈（單條鏈策略），其以與全長(zhǎng)FVIII前體相同的方式被切割為重鏈和輕鏈。
[0031] 在經(jīng)單條鏈策略產(chǎn)生的B結(jié)構(gòu)域缺失或截短的FVIII前體多肽中，通常通過(guò)接頭 分開(kāi)重鏈和輕鏈部分。為了使在B結(jié)構(gòu)域缺失的FVIII中導(dǎo)入免疫原性表位的風(fēng)險(xiǎn)最小化， 接頭的序列優(yōu)選來(lái)源于FVIII B結(jié)構(gòu)域。在全長(zhǎng)FVIII的B結(jié)構(gòu)域中，氨基酸1644-1648 組成該識(shí)別位點(diǎn)。在B結(jié)構(gòu)域缺失的FVIII活化時(shí)導(dǎo)致接頭移除的凝血酶切割位點(diǎn)位于重 鏈中。因此，接頭的尺寸和氨基酸序列不太可能影響通過(guò)凝血酶活化將其從殘余FVIII分 子中移除。B結(jié)構(gòu)域的缺失/截短對(duì)于產(chǎn)生FVIII是有利的。然而，可在接頭中包含部分B 結(jié)構(gòu)域而不降低生產(chǎn)能力。B結(jié)構(gòu)域?qū)ιa(chǎn)能力的負(fù)面效應(yīng)不能歸因于B結(jié)構(gòu)域的任何特 定尺寸或序列。
[0032] SEQ ID NO :1 :wt人FVIII (Ser750殘基以黑體和下劃線(xiàn)顯示） ATRRYYLGAVELSffDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSVVYKKTLFVEFTDHLFNIAKPRPPWMGLL GPTIQAEVYDTVVITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLKENGPMAS DPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMQDRDAASAR AffPKMHTVNGYVNRSLPGLIGCHRKSVYffHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQASLEISPITFLTAQTLLMDL GQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPK TWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKTREAIQHESGILGPLLYGEV ⑶TLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTVTVEDGPTKSDPRCLTRYYS SFVNMERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQRFLPNPAGVQLEDPEFQAS NIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYEDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLff ILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNTCDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSQNSRHPSTRQKQFNATTIPEND IEKTDPWFAHRTPMPKIQNVSSSDLLMLLRQSPTPHGLSLSDLQEAKYETFSDDPSPGAIDSNNSLSEMTHFRPQLH HSGDMVFTPESGLQLRLNEKLGTTAATELKKLDFKVSSTSNNLISTIPSDNLAAGTDNTSSLGPPSMPVHYDSQLDT TLFGKKSSPLTESGGPLSLSEENNDSKLLESGLMNSQESSWGKNVSSTESGRLFKGKRAHGPALLTKDNALFKVSIS LLKTNKTSNNSATNRKTHIDGPSLLIENSPSVWQNILESDTEFKKVTPLIHDRMLMDKNATALRLNHMSNKTTSSKN MEMVQQKKEGPIPPDAQNPDMSFFKMLFLPESARWIQRTHGKNSLNSGQGPSPKQLVSLGPEKSVEGQNFLSEKNKV VVGKGEFTKDVGLKEMVFPSSRNLFLTNLDNLHENNTHNQEKKIQEEIEKKETLIQENVVLPQIHTVTGTKNFMKNL FLLSTRQNVEGSYDGAYAPVLQDFRSLNDSTNRTKKHTAHFSKKGEEENLEGLGNQTKQIVEKYACTTRISPNTSQQ NFVTQRSKRALKQFRLPLEETELEKRIIVDDTSTQWSKNMKHLTPSTLTQIDYNEKEKGAITQSPLSDCLTRSHSIP QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLTRVLFQDNSSHLPAASYRKKDSGVQESSHFLQGAKKNNLSLAILTLEMTCDQRE VGSLGTSATNSVTYKKVENTVLPKPDLPKTSGKVELLPKVHIYQKDLFPTETSNGSPGHLDLVEGSLLQGTEGAIKff NEANRPGKVPFLRVATESSAKTPSKLLDPLAWDNHYGTQIPKEEWKSQEKSPEKTAFKKKDTILSLNACESNHAIAA INEGQNKPEIEVTWAKQGRTERLCSQNPPVLKRHQREITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPR SFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKVVFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAE VEDNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDL EKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHA INGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWR VECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSINAWSTKEPFSWIKVD LLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRL HPTHYSIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNPKE WLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPVVNSLDPPLLTRY LRlHPQSffVHQIALRMEVLGCEAQDLY FVIII的B結(jié)構(gòu)域跨越SEQ ID NO :1的氨基酸741-1648。B-結(jié)構(gòu)域在若干不同位點(diǎn) 上被切割，在循環(huán)的血漿FVIII分子中產(chǎn)生大的異質(zhì)性。高度糖基化的B-結(jié)構(gòu)域的確切功 能未知。所知道的是B結(jié)構(gòu)域在凝血級(jí)聯(lián)中對(duì)FVIII活性是非必要的。因此經(jīng)常以B結(jié)構(gòu) 域缺失/截短的變體形式產(chǎn)生重組FVIII。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，由編碼包含具有以 下序列的21個(gè)氨基酸殘基L (接頭）序列的FVIII分子的表達(dá)載體產(chǎn)生FVIII分子：SEQ ID NO 2:SFSQNSRHPSQNPPVLKRHQR (0-聚糖連接到下劃線(xiàn)的S)。或者，優(yōu)選的B結(jié)構(gòu)域接 頭序列可以缺乏SEQ ID NO 2所示的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，例如SEQ ID NO 2中的C-末 端R。優(yōu)選的FVIII分子是B結(jié)構(gòu)域缺失/截短的變體，其包含連接到SEQ ID NO 1中所示 的Ser 750殘基的0-聚糖，任選經(jīng)由該0-聚糖綴合到聚合物（半壽期延長(zhǎng)）部分上。
[0033] 本發(fā)明的發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)了以下觀(guān)察結(jié)果：與例如具有整個(gè)B結(jié)構(gòu)域完整的 FVIII以及沒(méi)有或僅有少數(shù)氨基酸（例如，15-30個(gè)氨基酸）完整的FVIII分子相比，本發(fā)明 的具有以下長(zhǎng)度的B結(jié)構(gòu)域的B結(jié)構(gòu)域缺失FVIII分子當(dāng)經(jīng)血管外（例如皮下）給予時(shí)，具 有驚人高的生物利用度：大約100至大約400個(gè)氨基酸（（優(yōu)選150-650、更優(yōu)選150-600、 更優(yōu)選150-550、更優(yōu)選150-500、更優(yōu)選150-450、更優(yōu)選150-400、更優(yōu)選150-350、更優(yōu) 選200-700、更優(yōu)選200-600、更優(yōu)選200-500、更優(yōu)選200-400、更優(yōu)選200-300、和最優(yōu)選大 約200-250)。這樣的分子可以包含或可以不包含SEQ ID NO 1的Sei750殘基。因此提供 了在皮下/皮內(nèi)給予后具有改善的生物利用度的FVIII的簡(jiǎn)單而安全的生產(chǎn)方式。通過(guò)將 所述變體與半壽期延長(zhǎng)部分綴合/融合可延長(zhǎng)具有100至大約400個(gè)氨基酸的B結(jié)構(gòu)域的 FVIII的體內(nèi)循環(huán)半壽期是似乎合理的。包含226個(gè)氨基酸的B結(jié)構(gòu)域的FVIII分子的實(shí) 例見(jiàn) SEQ ID NO 3 : SEQ ID NO 3 : (226個(gè)氨基酸的B結(jié)構(gòu)域變體）： atrryylgavelswdymqsdlgelpvdarfpprvpksfpfntsvvykktIfveftdhlfniakprppwmgll gptiqaevydtvvitlknmashpvsIhavgvsywkasegaeyddqtsqrekeddkvfpggshtyvwqvlkengpmas dpicltysylshvdlvkdlnsgligallvcregslakektqtlhkfilIfavfdegkswhsetknslmqdrdaasara wpkmhtvngyvnrslpgligchrksvywhvigmgttpevhsifleghtflvrnhrqaslei spitfltaqtllmdlg qfllfchisshqhdgmeayvkvdscpeepqlrmknneeaedydddltdsemdvvrfdddnspsfiqirsvakkhpktw vhyiaaeeedwdyaplvlapddrsyksqylnngpqrigrkykkvrfmaytdetfktreaiqhesgiIgpIIygevgd tlliifknqasrpyniyphgitdvrplysrrlpkgvkhlkdfpilpgeifkykwtvtvedgptksdprcltryyssf vnmerdlasgligpllicykesvdqrgnqimsdkrnvilfsvfdenrswylteniqrflpnpagvqledpefqasni mhsingyvfdslqlsvclhevaywyilsigaqtdflsvffsgytfkhkmvyedtltlfpfsgetvfmsmenpglwiI gchnsdfrnrgmtallkvsscdkntgdyyedsyedisayIlsknnaieprsfsqnsrhpstrqkqfnattipendie ktdpwfahrtpmpkiqnvsssdlImllrqsptphglslsdlqeakyetfsddpspgaidsnnslsemthfrpqlhhs gdmvftpesglqlrlneklgttaatelkkldfkvsstsnnlistipsdnlaagtdntsslgppsmpvhydsqldttl fgkksspltesggplsiseenndskllesglmnsqesswgknvshhhhhhsqnppvlkrhqreitrttlqsdqeeid yddtisvemkkedfdiydedenqsprsfqkktrhyfiaaverlwdygmsssphvlrnraqsgsvpqfkkvvfqeftdg sftqplyrgeInehIgllgpyiraevednimvtfrnqasrpysfysslisyeedqrqgaeprknfvkpnetktyfwk vqhhmaptkdefdckawayfsdvdlekdvhsgligpllvchtntlnpahgrqvtvqefalfftifdetkswyftenm erncrapcniqmedptfkenyrfhaingyimdtlpglvmaqdqrirwyIlsmgsnenihsihfsghvftvrkkeeyk malynlypgvfetvemlpskagiwrvecligehlhagmstIflvysnkcqtplgmasghirdfqitasgqygqwapk larlhysgsinawstkepfswikvdllapmiihgiktqgarqkfsslyisqfiimysldgkkwqtyrgnstgtlmvff gnvdssgikhnifnppiiaryirlhpthysirstIrmelmgcdlnscsmplgmeskaisdaqitassyftnmfatws pskarlhlqgrsnawrpqvnnpkewlqvdfqktmkvtgvttqgvksIltsmyvkeflisssqdghqwtlffqngkvk vfqgnqdsftpvvnsIdppIItrylrihpqswvhqialrmevlgceaqdly 馮維勒布3德因子（VffF)是渉及到Ih血的一種血液糠蛋白。在最常見(jiàn)的遺傳性出血障 礙馮維勒布蘭德氏病中該因子缺乏或有缺陷。VWF是存在于血漿中的大的多聚體糖蛋白， 在內(nèi)皮、巨核細(xì)胞和內(nèi)皮下結(jié)締組織中組成型地產(chǎn)生?；綱WF單體是2050個(gè)氨基酸的蛋 白。每個(gè)單體含有具有特定功能的許多特定結(jié)構(gòu)域，包括與FVIII結(jié)合的TIL'或TIL' /E' 結(jié)構(gòu)域（Zhou等人.Blood 2012 ;120 (2) :449-458)。FVIII與VWF結(jié)合，同時(shí)在循環(huán)中失 活并通過(guò)凝血酶作用從VWF中釋放。不與VWF結(jié)合的FVIII (a)被快速清除和/或降解。本 文證明了，全長(zhǎng)VWF沒(méi)有顯著增加血管外共同給予的FVIII的生物利用度的能力，盡管它具 有固有的FVIII保護(hù)作用。
[0034] 因此全長(zhǎng)VWF分子是非常復(fù)雜的蛋白質(zhì)。前原VWF (pr印ro VWF)由2813個(gè)氨基 酸殘基（SEQ ID NO 22)組成。在分泌期間，氨基酸殘基1-22的信號(hào)肽和氨基酸殘基23-763 的前肽被切割，得到2050個(gè)氨基酸殘基的成熟VWF。因此氨基酸編號(hào)通常是根據(jù)前原VWF， 因此氨基酸S764是成熟分子中的第一個(gè)氨基酸。認(rèn)為成熟分子含有12個(gè)Asn-連接的和 10個(gè)Thr/Ser連接的寡糖側(cè)鏈。此外該分子可以形成二聚體、三聚體等，多聚體分子量至多 達(dá)幾百萬(wàn)道爾頓。在人體中已發(fā)現(xiàn)不同的等位VWF變體，因此可以理解，本發(fā)明的VWF片段 可以源自這些天然發(fā)生的變體的任一個(gè)。
[0035] 對(duì)于VWF的藥物組合物而言，全長(zhǎng)分子的糖基化異質(zhì)性，以及多聚體形成性能，使 得構(gòu)建表達(dá)系統(tǒng)和下游純化過(guò)程頗具挑戰(zhàn)性。
[0036] 對(duì)VWF中的組織和結(jié)構(gòu)域邊界的理解尚未完成。僅僅所謂A結(jié)構(gòu)域被良好表征并 測(cè)定了它們的晶體結(jié)構(gòu)。VWF內(nèi)的二硫化物的化學(xué)安排是有限的。然而，近期對(duì)VWF中的結(jié) 構(gòu)域與其它蛋白中的結(jié)構(gòu)域的同源性的研究表明可以形成若干二硫鍵。Zhou等人.Blood 2012 ; 120，449-458所述的VWF的結(jié)構(gòu)域定義用于本文中。
[0037] 本發(fā)明涉及VWF片段，其優(yōu)選比全長(zhǎng)分子更容易產(chǎn)生。本文的VWF片段還更優(yōu)選地 具有增加經(jīng)皮下共同給予的FVIII的生物利用度的能力。本發(fā)明的VWF片段包含TIL'結(jié)構(gòu) 域/亞結(jié)構(gòu)域（跨越SEQ ID NO 22的氨基酸764-778)或TIL'結(jié)構(gòu)域/亞結(jié)構(gòu)域（跨越 SEQ ID NO 22 的氨基酸 764-828 或 SEQ ID NO 22 的氨基酸 764-829)或 TIL'/E'結(jié)構(gòu)域 / 亞結(jié)構(gòu)域（跨越SEQ ID NO 22的氨基酸764-865)的至少15個(gè)N-末端氨基酸并且尺寸小 于1500個(gè)氨基酸、優(yōu)選小于1400個(gè)氨基酸、優(yōu)選小于1300個(gè)氨基酸、優(yōu)選小于1200個(gè)氨 基酸、優(yōu)選小于1100個(gè)氨基酸、優(yōu)選小于1000個(gè)氨基酸、優(yōu)選小于900個(gè)氨基酸、優(yōu)選小于 800個(gè)氨基酸、優(yōu)選小于700個(gè)氨基酸、優(yōu)選小于600個(gè)氨基酸、優(yōu)選小于500個(gè)氨基酸、優(yōu) 選小于400個(gè)氨基酸、優(yōu)選小于300個(gè)氨基酸、優(yōu)選小于275個(gè)氨基酸、優(yōu)選小于250個(gè)氨基 酸、優(yōu)選小于225個(gè)氨基酸、優(yōu)選小于200個(gè)氨基酸、優(yōu)選小于175個(gè)氨基酸、優(yōu)選小于150 個(gè)氨基酸、優(yōu)選小于125個(gè)氨基酸、優(yōu)選小于100個(gè)氨基酸、優(yōu)選小于95個(gè)氨基酸、優(yōu)選小 于90個(gè)氨基酸、優(yōu)選小于85個(gè)氨基酸、或優(yōu)選小于80個(gè)氨基酸、或優(yōu)選小于75個(gè)氨基酸、 或優(yōu)選小于70個(gè)氨基酸、或優(yōu)選小于65個(gè)氨基酸、或優(yōu)選小于60個(gè)氨基酸、或優(yōu)選小于55 個(gè)氨基酸、或優(yōu)選小于50個(gè)氨基酸、或優(yōu)選小于45個(gè)氨基酸、或優(yōu)選小于40個(gè)氨基酸、或 優(yōu)選小于35個(gè)氨基酸、或優(yōu)選小于30個(gè)氨基酸、或優(yōu)選小于25個(gè)氨基酸、或優(yōu)選小于20個(gè) 氨基酸、或優(yōu)選小于15個(gè)氨基酸。本發(fā)明的VWF片段優(yōu)選地包含TIL' /E' /D3結(jié)構(gòu)域（其 中D3分為亞結(jié)構(gòu)域VWD3-C8-3-TIL-3-E3)，其跨越SEQ ID NO 22的氨基酸764-1250或氨 基酸764-1261或氨基酸764-1268。本發(fā)明的VWF片段優(yōu)選地包含TIL'、TIL'或TIL' /E' 結(jié)構(gòu)域（SEQ ID NO 22的氨基酸764-778、764-828或氨基酸764-865)的至少15個(gè)N-末 端氨基酸。本發(fā)明的VWF片段還可以含有較少潛在抗原性區(qū)。本發(fā)明的VWF片段二聚體的 分子量可以自然是單體片段的大約兩倍（本發(fā)明的二聚體因此可包含至多大約2400個(gè)氨 基酸，如果單體尺寸是1200個(gè)氨基酸的話(huà)）。
[0038] 優(yōu)選地，本發(fā)明的VWF片段包含至少氨基酸764-828 (SEQ ID NO 4)，或至少氨 基酸764-865 (SEQ ID NO 5)，或至少氨基酸764-1035 (SEQ ID NO 6)，或至少氨基酸 764-1041 (SEQ ID NO 7)，或至少氨基酸 764-1045 (SEQ ID NO 8)，或至少氨基酸 764-1128 (SEQ ID NO 9)，或至少氨基酸 7M-Il98 (SEQ ID no 10)，或至少氨基酸 764-125〇 (SEQ ID NO 11)，或至少氨基酸 764-1261 (SEQ ID NO 14)，或至少氨基酸 764-1268 (SEQ ID NO 22)。
[0039] 在一個(gè)實(shí)施方案中，在本發(fā)明的VWF片段中的C1099和/或Cl 142半胱氨酸可以突 變。這些半胱氨酸殘基據(jù)信負(fù)責(zé)VWF蛋白的寡聚化/二聚化。具有這兩個(gè)半胱氨酸的VWF 片段可以形成二聚體和同型寡聚物。這兩個(gè)半胱氨酸的修飾可以導(dǎo)致產(chǎn)生由單體VWF片段 組成的產(chǎn)物，而一個(gè)或另一個(gè)的缺失可以導(dǎo)致二聚體VWF片段或可能導(dǎo)致寡聚物VWF片段。 以上兩種情況都可導(dǎo)致比全長(zhǎng)蛋白更簡(jiǎn)單的產(chǎn)物純化過(guò)程。
[0040] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，C1099和C1142半胱氨酸兩者都保持完整，其可以導(dǎo)致優(yōu)選 的二聚體VWF片段。包括C1099和Cl 142半胱氨酸的天然序列可具有安全性?xún)?yōu)勢(shì)。
[0041] 驚奇的是，與FVIII和全長(zhǎng)VWF分子的共同配制相比，本發(fā)明的FVIII和VWF片段 的共同配制顯示了改進(jìn)的生物利用度。本發(fā)明的共同配制顯示了經(jīng)皮下注射的因子VIII 的增加的生物利用度。本發(fā)明的VWF片段包含D'結(jié)構(gòu)域（跨越SEQ ID NO :22的氨基酸 764-865/866)，其被認(rèn)為是主要的FVIII結(jié)合部位，其中FVIII可以通過(guò)靜電偶極-偶極樣 相互作用?？吭贒'。本發(fā)明的VWF片段優(yōu)選地包含D'結(jié)構(gòu)域和/或D3-結(jié)構(gòu)域（D3結(jié)構(gòu) 域跨越SEQ ID NO: 15的氨基酸865/866-1250/1261/1268)。根據(jù)本文的發(fā)現(xiàn)，可能D'和 D'D3結(jié)構(gòu)域兩者都具有與FVIII結(jié)合的能力。本發(fā)明的VWF片段沒(méi)有任何明顯程度地（即 優(yōu)選小于5%、更優(yōu)選小于4%、優(yōu)選小于3%、優(yōu)選小于2%、更優(yōu)選小于1%)形成多聚體（即具 有超過(guò)兩個(gè)單元，例如寡聚物），因?yàn)槎嗑垠w裝配所必需的半胱氨酸（C1099和C1142)不存 在或已經(jīng)突變/取代。本發(fā)明的一些VWF片段在任何明顯程度上不再形成二聚體，尤其是 其中C1099和/或Cl 142半胱氨酸不存在的那些。
[0042] 然而，在某些情況下，形成二聚體的VWF片段也可用于本發(fā)明，TIL' /E' /D3/A1二 聚體例如已經(jīng)證明具有比單體更高的FVIII親和力。VWF片段二聚體還可以是相對(duì)同質(zhì)的 產(chǎn)物，其可被相對(duì)容易地生產(chǎn)。
[0043] 本發(fā)明的VWF片段的一個(gè)優(yōu)勢(shì)就是在工業(yè)規(guī)模上更容易生產(chǎn)作為相對(duì)同質(zhì)產(chǎn)物 的所述化合物，因?yàn)榈统潭鹊亩嗑刍鸵驗(yàn)橐韵率聦?shí)：與全長(zhǎng)VWF相比，所述化合物是具有 較少的翻譯后修飾的較小的化合物。這意味著更容易達(dá)到高表達(dá)水平和/或因分子更簡(jiǎn)單 而導(dǎo)致純化方法將會(huì)更簡(jiǎn)單。另外，與在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中的生產(chǎn)相比，在簡(jiǎn)單生物體例如 酵母中的重組肽和蛋白質(zhì)的產(chǎn)生是更快和更便宜的生產(chǎn)方法，本發(fā)明的某些VWF片段可以 在酵母中生產(chǎn)。
[0044] 本發(fā)明的VWF片段可以呈單鏈VWF片段的形式（例如，跨越SEQ ID NO 22的氨基 酸764-1459的完整TIL' /E' /D3/A1區(qū)）或呈多組來(lái)自VWF的連續(xù)氨基酸融合在一起并因 此缺失中間片段的形式（例如，跨越SEQ ID NO 22的氨基酸764-828+764-865的TIL'和 TIL'/E'結(jié)構(gòu)域的"融合物")。另一實(shí)例可以是SEQ ID NO 22的氨基酸764-828+1127-1197。 本發(fā)明的VWF片段或者還可以呈重復(fù)序列的形式?？蓪⑼椿虍愒?間隔基（spacer) "序列 引入融合的VWF片段/序列之間（例如，TIL'/E'結(jié)構(gòu)域的多重融合物，例如TIL'/E'TIL'/ E' TIL' /E'）。本發(fā)明的VWF片段還可以在VWF衍生的序列中包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸交替 (alternation)(例如，取代、缺失、添加）。
[0045] 可以通過(guò)將FVIII與至少一個(gè)半壽期延長(zhǎng)部分綴合而進(jìn)一步改進(jìn)經(jīng)血管外共同 給予FVIII和本發(fā)明的VWF片段時(shí)的FVIII的生物利用度。因此，包含TIL'和/或TIL'/ E'結(jié)構(gòu)域的VWF片段和與至少一個(gè)半壽期延長(zhǎng)部分綴合的FVIII分子的血管外共同給予與 相對(duì)高的FVIII生物利用度有關(guān)。
[0046] 本發(fā)明的VWF片段的實(shí)例（使用來(lái)自Zhou等人的結(jié)構(gòu)域注釋?zhuān)┤缫韵耂EQ ID NO 4-21 中所示。TIL' /E' /VWD3 I、TIL' /E' /VWD3 II 和 TIL' /E' /VWD3 III 表示 3 種形式 (不同長(zhǎng)度）的TIL' /E' /VWD3。
[0047] SEQ ID NO 4 :氨基酸 764-828 (TIL，）： SLSCRPPMVKLVCPADNLRAEGLECTKTCQNYDLECMSMGCVSGCLCPPGMVRHENRCVALERCP SEQ ID NO 5 :氨基酸 764-865 (TIL，/E'）： SLSCRPPMVKLVCPADNLRAEGLECTKTCQNYDLECMSMGCVSGCLCPPGMVRHENRCVALERCPCFHQGKEY APGETVKIGCNTCVCQDRKWNCTDHVCDA SEQ ID NO 6 :氨基酸 764-1035 (TIL，/E' /VWD3 I): SLSCRPPMVKLVCPADNLRAEGLECTKTCQNYDLECMSMGCVSGCLCPPGMVRHENRCVALERCPCFHQGKE YAPGETVKIGCNTCVCQDRKWNCTDHVCDATCSTIGMAHYLTFDGLKYLFPGECQYVLVQDYCGSNPGTFRILVGNK GCSHPSVKCKKRVTILVEGGEIELFDGEVNVKRPMKDETHFEVVESGRYIILLLGKALSVVffDRHLSISVVLKQTYQ EKVCGLCGNFDGIQNNDLTSSNLQVEEDPVDFGNSWKVSSQCADTR SEQ ID NO 7 :氨基酸 764-1041 (TIL，/E' /VWD3 II): SLSCRPPMVKLVCPADNLRAEGLECTKTCQNYDLECMSMGCVSGCLCPPGMVRHENRCVALERCPCFHQGKE YAPGETVKIGCNTCVCQDRKWNCTDHVCDATCSTIGMAHYLTFDGLKYLFPGECQYVLVQDYCGSNPGTFRILVGNK GCSHP SVKCKKRVTILVEGGEIELFDGEVNVKRPMKDETHFEVVESGRY11LLLGKALSVVffDRHLSISVVLKQTYQ EKVCGLCGNFDGIQNNDLTSSNLQVEEDPVDFGNSWKVSSQCADTRKVPLDS SEQ ID NO 8 :氨基酸 764-1045 (TIL，/E，/VWD3 III): SLSCRPPMVKLVCPADNLRAEGLECTKTCQNYDLECMSMGCVSGCLCPPGMVRHENRCVALERCPCFHQGKE YAPGETVKIGCNTCVCQDRKWNCTDHVCDATCSTIGMAHYLTFDGLKYLFPGECQYVLVQDYCGSNPGTFRILVGNK GCSHPSVKCKKRVTILVEGGEIELFDGEVNVKRPMKDETHFEVVESGRYIILLLGKALSVVffDRHLSISVVLKQTYQ EKVCGLCGNFDGIQNNDLTSSNLQVEEDPVDFGNSWKVSSQCADTRKVPLDSSPAT SEQIDN0 9:氨基酸 764-1128 (TIL'/E'/VWD3/C8-3)-半胱氨酸 1099 用黑體標(biāo)明。 該半胱氨酸可以被另一氨基酸例如Ser取代： SLSCRPPMVKLVCPADNLRAEGLECTKTCQNYDLECMSMGCVSGCLCPPGMVRHENRCVALERCPCFHQGKE YAPGETVKIGCNTCVCQDRKWNCTDHVCDATCSTIGMAHYLTFDGLKYLFPGECQYVLVQDYCGSNPGTFRILVGNK GCSHPSVKCKKRVTILVEGGEIELFDGEVNVKRPMKDETHFEVVESGRYIILLLGKALSVVffDRHLSISVVLKQTYQ EKVCGLCGNFDGIQNNDLTSSNLQVEEDPVDFGNSWKVSSQCADTRKVPLDSSPATCHNNIMKQTMVDSSCRILTSD VFQDCNKLVDPEPYLDVCIYDTCSCESI⑶CACFCDTIAAYAHVCAQHGKVVTWRTATLCPQ SEQ ID NO 10:氨基酸 764-1198 (TIL'/E'/VWD3/C8-3/TIL-3)-半胱氨酸 1099 和 1142用黑體標(biāo)明。這兩個(gè)半胱氨酸中的一個(gè)或兩個(gè)可以被另一氨基酸例如Ser取代： SLSCRPPMVKLVCPADNLRAEGLECTKTCQNYDLECMSMGCVSGCLCPPGMVRHENRCVALERCPCFHQGKE YAPGETVKIGCNTCVCQDRKWNCTDHVCDATCSTIGMAHYLTFDGLKYLFPGECQYVLVQDYCGSNPGTFRILVGNK GCSHP SVKCKKRVTILVEGGEIELFDGEVNVKRPMKDETHFEVVESGRY11LLLGKALSVVffDRHLSISVVLKQTYQ EKVCGLCGNFDGIQNNDLTSSNLQVEEDPVDFGNSWKVSSQCADTRKVPLDSSPATCHNNIMKQTMVDSSCRILTSD VFQDCNKLVDPEPYLDVCIYDTCSCESI⑶CACFCDTIAAYAHVCAQHGKVVTWRTATLCPQSCEERNLRENGYECE WRYNSCAPACQVTCQHPEPLACPVQCVEGCHAHCPPGKILDELLQTCVDPEDCPV SEQ ID NO 11:氨基酸 764-1250 (TIL，/E'/D3 I)-半胱氨酸 1099 和 1142 用黑體標(biāo) 明。這兩個(gè)半胱氨酸中的一個(gè)或兩個(gè)可以被另一氨基酸例如Ser取代： SLSCRPPMVKLVCPADNLRAEGLECTKTCQNYDLECMSMGCVSGCLCPPGMVRHENRCVALERCPCFHQGKE YAPGETVKIGCNTCVCQDRKWNCTDHVCDATCSTIGMAHYLTFDGLKYLFPGECQYVLVQDYCGSNPGTFRILVGNK GCSHPSVKCKKRVTILVEGGEIELFDGEVNVKRPMKDETHFEVVESGRYIILLLGKALSVVffDRHLSISVVLKQTYQ EKVCGLCGNFDGIQNNDLTSSNLQVEEDPVDFGNSWKVSSQCADTRKVPLDSSPATCHNNIMKQTMVDSSCRILTSD VFQDCNKLVDPEPYLDVCIYDTCSCESI⑶CACFCDTIAAYAHVCAQHGKVVTWRTATLCPQSCEERNLRENGYECE WRYNSCAPACQVTCQHPEPLACPVQCVEGCHAHCPPGKILDELLQTCVDPEDCPVCEVAGRRFASGKKVTLNPSDPE HCQICHCDVVNLTCEACQEPGGLVVPPTDA SEQ ID NO 12:氨基酸864-1250 (D3 I)-半胱氨酸1099和1142用黑體標(biāo)明。這兩個(gè) 半胱氨酸中的一個(gè)或兩個(gè)可以被另一氨基酸例如Ser取代： ATCSTIGMAHYLTFDGLKYLFPGECQYVLVQDYCGSNPGTFRILVGNKGCSHPSVKCKKRVTILVEGGEIEL FDGEVNVKRPMKDETHFEVVESGRYIILLLGKALSVVWDRHLSISVVLKQTYQEKVCGLCGNFDGIQNNDLTSSNLQ VEEDPVDFGNSWKVSSQCADTRKVPLDSSPATCHNNIMKQTMVDSSCRILTSDVFQDCNKLVDPEPYLDVCIYDTCS CESI⑶CACFCDTIAAYAHVCAQHGKVVTWRTATLCPQSCEERNLRENGYECEWRYNSCAPACQVTCQHPEPLACPV QCVEGCHAHCPPGKILDELLQTCVDPEDCPVCEVAGRRFASGKKVTLNPSDPEHCQICHCDVVNLTCEACQEPGGL VVPPTDA SEQ ID NO 13:氨基酸864-1268 (D3 II)-半胱氨酸1099和1142用黑體標(biāo)明。這兩 個(gè)半胱氨酸中的一個(gè)或兩個(gè)可以被另一氨基酸例如Ser取代： ATCSTIGMAHYLTFDGLKYLFPGECQYVLVQDYCGSNPGTFRILVGNKGCSHPSVKCKKRVTILVEGGEIEL FDGEVNVKRPMKDETHFEVVESGRYIILLLGKALSVVWDRHLSISVVLKQTYQEKVCGLCGNFDGIQNNDLTSSNLQ VEEDPVDFGNSWKVSSQCADTRKVPLDSSPATCHNNIMKQTMVDSSCRILTSDVFQDCNKLVDPEPYLDVCIYDTCS CESI⑶CACFCDTIAAYAHVCAQHGKVVTWRTATLCPQSCEERNLRENGYECEWRYNSCAPACQVTCQHPEPLACPV QCVEGCHAHCPPGKILDELLQTCVDPEDCPVCEVAGRRFASGKKVTLNPSDPEHCQICHCDVVNLTCEACQEPGGLV VPPTDAPVSPTTLYVEDISEPPLHD SEQ ID NO 14:氨基酸 764-1261 (TIL，/E'/D3 II)-半胱氨酸 1099 和 1142 用黑體標(biāo) 明。這兩個(gè)半胱氨酸中的一個(gè)或兩個(gè)可以被另一氨基酸例如Ser取代： SLSCRPPMVKLVCPADNLRAEGLECTKTCQNYDLECMSMGCVSGCLCPPGMVRHENRCVALERCPCFHQGKE YAPGETVKIGCNTCVCQDRKWNCTDHVCDATCSTIGMAHYLTFDGLKYLFPGECQYVLVQDYCGSNPGTFRILVGNK GCSHPSVKCKKRVTILVEGGEIELFDGEVNVKRPMKDETHFEVVESGRYIILLLGKALSVVffDRHLSISVVLKQTYQ EKVCGLCGNFDGIQNNDLTSSNLQVEEDPVDFGNSWKVSSQCADTRKVPLDSSPATCHNNIMKQTMVDSSCRILTSD VFQDCNKLVDPEPYLDVCIYDTCSCESI⑶CACFCDTIAAYAHVCAQHGKVVTWRTATLCPQSCEERNLRENGYECE WRYNSCAPACQVTCQHPEPLACPVQCVEGCHAHCPPGKILDELLQTCVDPEDCPVCEVAGRRFASGKKVTLNPSDPE HCQICHCDVVNLTCEACQEPGGLVVPPTDAPVSPTTLYVED SEQ ID NO 15:氨基酸 764-1264 (TIL，/E'/D3 III)-半胱氨酸 1099 和 1142 用黑體 標(biāo)明。這兩個(gè)半胱氨酸中的一個(gè)或兩個(gè)可以被另一氨基酸例如Ser取代： SLSCRPPMVKLVCPADNLRAEGLECTKTCQNYDLECMSMGCVSGCLCPPGMVRHENRCVALERCPCFHQGKE YAPGETVKIGCNTCVCQDRKWNCTDHVCDATCSTIGMAHYLTFDGLKYLFPGECQYVLVQDYCGSNPGTFRILVGNK GCSHPSVKCKKRVTILVEGGEIELFDGEVNVKRPMKDETHFEVVESGRYIILLLGKALSVVffDRHLSISVVLKQTYQ EKVCGLCGNFDGIQNNDLTSSNLQVEEDPVDFGNSWKVSSQCADTRKVPLDSSPATCHNNIMKQTMVDSSCRILTSD VFQDCNKLVDPEPYLDVCIYDTCSCESI⑶CACFCDTIAAYAHVCAQHGKVVTWRTATLCPQSCEERNLRENGYECE WRYNSCAPACQVTCQHPEPLACPVQCVEGCHAHCPPGKILDELLQTCVDPEDCPVCEVAGRRFASGKKVTLNPSDPE HCQICHCDVVNLTCEACQEPGGLVVPPTDAPVSPTTLYVEDISEP SEQ ID NO 16:氨基酸 764-1268 (TIL，/E'/D3 IV)-半胱氨酸 1099 和 1142 用黑體 標(biāo)明。這兩個(gè)半胱氨酸中的一個(gè)或兩個(gè)可以被另一氨基酸例如Ser取代： SLSCRPPMVKLVCPADNLRAEGLECTKTCQNYDLECMSMGCVSGCLCPPGMVRHENRCVALERCPCFHQGKE YAPGETVKIGCNTCVCQDRKWNCTDHVCDATCSTIGMAHYLTFDGLKYLFPGECQYVLVQDYCGSNPGTFRILVGNK GCSHPSVKCKKRVTILVEGGEIELFDGEVNVKRPMKDETHFEVVESGRYIILLLGKALSVVffDRHLSISVVLKQTYQ EKVCGLCGNFDGIQNNDLTSSNLQVEEDPVDFGNSWKVSSQCADTRKVPLDSSPATCHNNIMKQTMVDSSCRILTSD VFQDCNKLVDPEPYLDVCIYDTCSCESI⑶CACFCDTIAAYAHVCAQHGKVVTWRTATLCPQSCEERNLRENGYECE WRYNSCAPACQVTCQHPEPLACPVQCVEGCHAHCPPGKILDELLQTCVDPEDCPVCEVAGRRFASGKKVTLNPSDPE HCQICHCDVVNLTCEACQEPGGLVVPPTDAPVSPTTLYVEDISEPPLHD SEQ ID NO 17:氨基酸 764-1459 (TIL，/E'/D3/A1 I)-半胱氨酸 1099 和 1142 用黑 體標(biāo)明。這兩個(gè)半胱氨酸中的一個(gè)或兩個(gè)可以被另一氨基酸例如Ser取代： SLSCRPPMVKLVCPADNLRAEGLECTKTCQNYDLECMSMGCVSGCLCPPGMVRHENRCVALERCPCFHQGKE YAPGETVKIGCNTCVCQDRKWNCTDHVCDATCSTIGMAHYLTFDGLKYLFPGECQYVLVQDYCGSNPGTFRILVGNK GCSHPSVKCKKRVTILVEGGEIELFDGEVNVKRPMKDETHFEVVESGRYIILLLGKALSVVffDRHLSISVVLKQTYQ EKVCGLCGNFDGIQNNDLTSSNLQVEEDPVDFGNSWKVSSQCADTRKVPLDSSPATCHNNIMKQTMVDSSCRILTSD VFQDCNKLVDPEPYLDVCIYDTCSCESI⑶CACFCDTIAAYAHVCAQHGKVVTWRTATLCPQSCEERNLRENGYECE WRYNSCAPACQVTCQHPEPLACPVQCVEGCHAHCPPGKILDELLQTCVDPEDCPVCEVAGRRFASGKKVTLNPSDPE HCQICHCDVVNLTCEACQEPGGLVVPPTDAPVSPTTLYVEDISEPPLHDFYCSRLLDLVFLLDGSSRLSEAEFEVLK AFVVDMMERLRISQKffVRVAVVEYHDGSHAYIGLKDRKRPSELRRIASQVKYAGSQVASTSEVLKYTLFQIFSKIDR PEASRITLLLMASQEPQRMSRNFVRYVQGLKKKKVIVIPVGIGPHANLKQIRLIEKQAPENKAFVLSSVDELEQQRD EI VSYLCD SEQIDN0 18:氨基酸 764-1463 (TILVE'/D3/AlII)-半胱氨酸 1099 和1142用黑 體標(biāo)明。這兩個(gè)半胱氨酸中的一個(gè)或兩個(gè)可以被另一氨基酸例如Ser取代： SLSCRPPMVKLVCPADNLRAEGLECTKTCQNYDLECMSMGCVSGCLCPPGMVRHENRCVALERCPCFHQGKE YAPGETVKIGCNTCVCQDRKWNCTDHVCDATCSTIGMAHYLTFDGLKYLFPGECQYVLVQDYCGSNPGTFRILVGNK GCSHPSVKCKKRVTILVEGGEIELFDGEVNVKRPMKDETHFEVVESGRYIILLLGKALSVVffDRHLSISVVLKQTYQ EKVCGLCGNFDGIQNNDLTSSNLQVEEDPVDFGNSWKVSSQCADTRKVPLDSSPATCHNNIMKQTMVDSSCRILTSD VFQDCNKLVDPEPYLDVCIYDTCSCESI⑶CACFCDTIAAYAHVCAQHGKVVTWRTATLCPQSCEERNLRENGYECE WRYNSCAPACQVTCQHPEPLACPVQCVEGCHAHCPPGKILDELLQTCVDPEDCPVCEVAGRRFASGKKVTLNPSDPE HCQICHCDVVNLTCEACQEPGGLVVPPTDAPVSPTTLYVEDISEPPLHDFYCSRLLDLVFLLDGSSRLSEAEFEVLK AFVVDMMERLRISQKffVRVAVVEYHDGSHAYIGLKDRKRPSELRRIASQVKYAGSQVASTSEVLKYTLFQIFSKIDR PEASRITLLLMASQEPQRMSRNFVRYVQGLKKKKVIVIPVGIGPHANLKQIRLIEKQAPENKAFVLSSVDELEQQRD EI VSYLCDLAPE SEQ ID NO 19:氨基酸 764-1464 (TIL，/E'/D3/A1 III)-半胱氨酸 1099 和 1142 用 黑體標(biāo)明。這兩個(gè)半胱氨酸中的一個(gè)或兩個(gè)可以被另一氨基酸例如Ser取代： SLSCRPPMVKLVCPADNLRAEGLECTKTCQNYDLECMSMGCVSGCLCPPGMVRHENRCVALERCPCFHQGKE YAPGETVKIGCNTCVCQDRKWNCTDHVCDATCSTIGMAHYLTFDGLKYLFPGECQYVLVQDYCGSNPGTFRILVGNK GCSHPSVKCKKRVTILVEGGEIELFDGEVNVKRPMKDETHFEVVESGRYIILLLGKALSVVWDRHLSISVVLKQTYQ EKVCGLCGNFDGIQNNDLTSSNLQVEEDPVDFGNSWKVSSQCADTRKVPLDSSPATCHNNIMKQTMVDSSCRILTSD VFQDCNKLVDPEPYLDVCIYDTCSCESI⑶CACFCDTIAAYAHVCAQHGKVVTWRTATLCPQSCEERNLRENGYECE WRYNSCAPACQVTCQHPEPLACPVQCVEGCHAHCPPGKILDELLQTCVDPEDCPVCEVAGRRFASGKKVTLNPSDPE HCQICHCDVVNLTCEACQEPGGLVVPPTDAPVSPTTLYVEDISEPPLHDFYCSRLLDLVFLLDGSSRLSEAEFEVLK AFVVDMMERLRISQKWVRVAVVEYHDGSHAYIGLKDRKRPSELRRIASQVKYAGSQVASTSEVLKYTLFQIFSKIDR PEASRITLLLMASQEPQRMSRNFVRYVQGLKKKKVIVIPVGIGPHANLKQIRLIEKQAPENKAFVLSSVDELEQQRD EI VSYLCDLAPEA SEQ ID NO 20:氨基酸 764-1683 (TIL'/E'/D3/A1/A2)-半胱氨酸 1099 和 1142 用黑 體標(biāo)明。這兩個(gè)半胱氨酸中的一個(gè)或兩個(gè)可以被另一氨基酸例如Ser取代： SLSCRPPMVKLVCPADNLRAEGLECTKTCQNYDLECMSMGCVSGCLCPPGMVRHENRCVALERCPCFHQGKE YAPGETVKIGCNTCVCQDRKWNCTDHVCDATCSTIGMAHYLTFDGLKYLFPGECQYVLVQDYCGSNPGTFRILVGNK GCSHPSVKCKKRVTILVEGGEIELFDGEVNVKRPMKDETHFEVVESGRYIILLLGKALSVVffDRHLSISVVLKQTY QEKVCGLCGNFDGIQNNDLTSSNLQVEEDPVDFGNSWKVSSQCADTRKVPLDSSPATCHNNIMKQTMVDSSCRILT SDVFQDCNKLVDPEPYLDVCIYDTCSCESI⑶CACFCDTIAAYAHVCAQHGKVVTWRTATLCPQSCEERNLRENGYE CEWRYNSCAPACQVTCQHPEPLACPVQCVEGCHAHCPPGKILDELLQTCVDPEDCPVCEVAGRRFASGKKVTLNPS DPEHCQICHCDVVNLTCEACQEPGGLVVPPTDAPVSPTTLYVEDISEPPLHDFYCSRLLDLVFLLDGSSRLSEAEF EVLKAFVVDMMERLRISQKWVRVAVVEYHDGSHAYIGLKDRKRPSELRRIASQVKYAGSQVASTSEVLKYTLFQIF SKIDRPEASRITLLLMASQEPQRMSRNFVRYVQGLKKKKVIVIPVGIGPHANLKQIRLIEKQAPENKAFVLSSVDE LEQQRDEIVSYLCDLAPEAPPPTLPPDMAQVTVGPGLLGVSTLGPKRNSMVLDVAFVLEGSDKIGEADFNRSKEFM EEVIQRMDVGQD SIHVTVLQYSYMVTVEYPFSEAQSK⑶ILQRVREIRYQGGNRTNTGLALRYLSDHSFLVSQ⑶R EQAPNLVYMVTGNPASDEIKRLP⑶IQWPIGVGPNANVQELERIGWPNAPILIQDFETLPREAPDLVLQRCCSGE GLQIPTLSPA SEQ ID NO 21:氨基酸 764-1873 (TIL'/E'/D3/A1/A2/A3)-半胱氨酸 1099 和 1142 用黑體標(biāo)明。這兩個(gè)半胱氨酸中的一個(gè)或兩個(gè)可以被另一氨基酸例如Ser取代： SLSCRPPMVKLVCPADNLRAEGLECTKTCQNYDLECMSMGCVSGCLCPPGMVRHENRCVALERCPCFHQGKE YAPGETVKIGCNTCVCQDRKWNCTDHVCDATCSTIGMAHYLTFDGLKYLFPGECQYVLVQDYCGSNPGTFRILVGNK GCSHPSVKCKKRVTILVEGGEIELFDGEVNVKRPMKDETHFEVVESGRYIILLLGKALSVVffDRHLSISVVLKQTYQ EKVCGLCGNFDGIQNNDLTSSNLQVEEDPVDFGNSWKVSSQCADTRKVPLDSSPATCHNNIMKQTMVDSSCRILTSD VFQDCNKLVDPEPYLDVCIYDTCSCESI⑶CACFCDTIAAYAHVCAQHGKVVTWRTATLCPQSCEERNLRENGYECE WRYNSCAPACQVTCQHPEPLACPVQCVEGCHAHCPPGKILDELLQTCVDPEDCPVCEVAGRRFASGKKVTLNPSDPE HCQICHCDVVNLTCEACQEPGGLVVPPTDAPVSPTTLYVEDISEPPLHDFYCSRLLDLVFLLDGSSRLSEAEFEVLK AFVVDMMERLRISQKWVRVAVVEYHDGSHAYIGLKDRKRPSELRRIASQVKYAGSQVASTSEVLKYTLFQIFSKIDR PEASRITLLLMASQEPQRMSRNFVRYVQGLKKKKVIVIPVGIGPHANLKQIRLIEKQAPENKAFVLSSVDELEQQRD EIVSYLCDLAPEAPPPTLPPDMAQVTVGPGLLGVSTLGPKRNSMVLDVAFVLEGSDKIGEADFNRSKEFMEEVIQRM DVGQDSIHVTVLQYSYMVTVEYPFSEAQSKGDILQRVREIRYQGGNRTNTGLALRYLSDHSFLVSQGDREQAPNLVY MVTGNPASDEIKRLP⑶IQVVPIGVGPNANVQELERIGWPNAPILIQDFETLPREAPDLVLQRCCSGEGLQIPTLSP APDCSQPLDVILLLDGSSSFPASYFDEMKSFAKAFISKANIGPRLTQVSVLQYGSITTIDVPWNVVPEKAHLLSLVD VMQREGGPSQIGDALGFAVRYLTSEMHGARPGAS KAWILVTDVSVDSVDAAADAARSNRVTVFPIGI⑶RYDAAQ LRILAGPAGDSNVVKLQRIEDLPTMVTLGNSFLHKLCS SEQ ID NO 22:根據(jù) UniProtKB/Swiss-Prot 數(shù)據(jù)庫(kù)的野生型人 VWF (登錄 P04275) -位置1099和1142的半胱氨酸殘基用黑體標(biāo)明： MIPARFAGVLLALALILPGTLCAEGTRGRSSTARCSLFGSDFVNTFDGSMYSFAGYCSYLLAGGCQKRSFSI I⑶FQNGKRVSLSVYLGEFFDIHLFVNGTVTQ⑶QRVSMPYASKGLYLETEAGYYKLSGEAYGFVARIDGSGNFQVL LSDRYFNKTCGLCGNFNIFAEDDFMTQEGTLTSDPYDFANSWALSSGEQWCERASPPSSSCNISSGEMQKGLWEQCQ LLKSTSVFARCHPLVDPEPFVALCEKTLCECAGGLECACPALLEYARTCAQEGMVLYGWTDHSACSPVCPAGMEYRQ CVSPCARTCQSLHINEMCQERCVDGCSCPEGQLLDEGLCVESTECPCVHSGKRYPPGTSLSRDCNTCICRNSQWICS NEECPGECLVTGQSHFKSFDNRYFTFSGICQYLLARDCQDHSFSIVIETVQCADDRDAVCTRSVTVRLPGLHNSLVK LKHGAGVAMDGQDVQLPLLKGDLRIQHTVTASVRLSYGEDLQMDWDGRGRLLVKLSPVYAGKTCGLCGNYNGNQGDD FLTPSGLAEPRVEDFGNAWKLHGDCQDLQKQHSDPCALNPRMTRFSEEACAVLTSPTFEACHRAVSPLPYLRNCRYD VCSCSDGRECLCGALASYAAACAGRGVRVAWREPGRCELNCPKGQVYLQCGTPCNLTCRSLSYPDEECNEACLEGCF CPPGLYMDERGDCVPKAQCPCYYDGEIFQPEDIFSDHHTMCYCEDGFMHCTMSGVPGSLLPDAVLSSPLSHRSKRSL SCRPPMVKLVCPADNLRAEGLECTKTCQNYDLECMSMGCVSGCLCPPGMVRHENRCVALERCPCFHQGKEYAPGETV KIGCNTCVCQDRKWNCTDHVCDATCSTIGMAHYLTFDGLKYLFPGECQYVLVQDYCGSNPGTFRILVGNKGCSHPSV KCKKRVTILVEGGEIELFDGEVNVKRPMKDETHFEVVESGRYIILLLGKALSVVffDRHLSISVVLKQTYQEKVCGLC GNFDGIQNNDLTSSNLQVEEDPVDFGNSWKVSSQCADTRKVPLDSSPATCHNNIMKQTMVDSSCRILTSDVFQDCNK LVDPEPYLDVCIYDTCSCESI⑶CACFCDTIAAYAHVCAQHGKVVTWRTATLCPQSCEERNLRENGYECEWRYNSCA PACQVTCQHPEPLACPVQCVEGCHAHCPPGKILDELLQTCVDPEDCPVCEVAGRRFASGKKVTLNPSDPEHCQICHC DVVNLTCEACQEPGGLVVPPTDAPVSPTTLYVEDISEPPLHDFYCSRLLDLVFLLDGSSRLSEAEFEVLKAFVVDMM ERLRISQKWVRVAVVEYHDGSHAYIGLKDRKRPSELRRIASQVKYAGSQVASTSEVLKYTLFQIFSKIDRPEASRIT LLLMASQEPQRMSRNFVRYVQGLKKKKVIVIPVGIGPHANLKQIRLIEKQAPENKAFVLSSVDELEQQRDEIVSYLC DLAPEAPPPTLPPDMAQVTVGPGLLGVSTLGPKRNSMVLDVAFVLEGSDKIGEADFNRSKEFMEEVIQRMDVGQDSI HVTVLQYSYMVTVEYPFSEAQSKGDILQRVREIRYQGGNRTNTGLALRYLSDHSFLVSQGDREQAPNLVYMVTGNPA SDEIKRLP⑶IQVVPIGVGPNANVQELERIGWPNAPILIQDFETLPREAPDLVLQRCCSGEGLQIPTLSPAPDCSQP LDVILLLDGSSSFPASYFDEMKSFAKAFISKANIGPRLTQVSVLQYGSITTIDVPWNVVPEKAHLLSLVDVMQREGG PSQIGDALGFAVRYLTSEMHGARPGASKAVVILVTDVSVDSVDAAADAARSNRVTVFPIGI⑶RYDAAQLRILAGPA GDSNVVKLQRIEDLPTMVTLGNSFLHKLCSGFVRICMDEDGNEKRP⑶VWTLPDQCHTVTCQPDGQTLLKSHRVNCD RGLRPSCPNSQSPVKVEETCGCRWTCPCVCTGSSTRHIVTFDGQNFKLTGSCSYVLFQNKEQDLEVILHNGACSPGA RQGCMKSIEVKHSALSVELHSDMEVTVNGRLVSVPYVGGNMEVNVYGAIMHEVRFNHLGHIFTFTPQNNEFQLQLSP KTFASKTYGLCGICDENGANDFMLRDGTVTTDWKTLVQEWTVQRPGQTCQPILEEQCLVPDSSHCQVLLLPLFAECH KVLAPATFYAICQQDSCHQEQVCEVIASYAHLCRTNGVCVDWRTPDFCAMSCPPSLVYNHCEHGCPRHCDGNVSSCG DHPSEGCFCPPDKVMLEGSCVPEEACTQCIGEDGVQHQFLEAWVPDHQPCQICTCLSGRKVNCTTQPCPTAKAPTCG LCEVARLRQNADQCCPEYECVCDPVSCDLPPVPHCERGLQPTLTNPGECRPNFTCACRKEECKRVSPPSCPPHRLPT LRKTQCCDEYECACNCVNSTVSCPLGYLASTATNDCGCTTTTCLPDKVCVHRSTIYPVGQFWEEGCDVCTCTDMEDA VMGLRVAQCSQKPCEDSCRSGFTYVLHEGECCGRCLPSACEVVTGSPRGDSQSSWKSVGSQWASPENPCLINECVRV KEEVFIQQRNVSCPQLEVPVCPSGFQLSCKTSACCPSCRCERMEACMLNGTVIGPGKTVMIDVCTTCRCMVQVGVIS GFKLECRKTTCNPCPLGYKEENNTGECCGRCLPTACTIQLRGGQMTLKRDETLQDGCDTHFCKVNERGEYFWEKRV TGCPPFDEHKCLAEGGKMKIPGTCCDTCEEPECNDITARLQYVKVGSCKSEVEVDIHYCQGKCASKAMYSIDINDV QDQCSCCSPTRTEPMQVALHCTNGSVVYHEVLNAMECKCSPRKCSK FVIII分子/奪體/衍牛物/類(lèi)似物：本用的術(shù)語(yǔ)" FVIII "意圖指具有FVIII活性 的任何FVIII分子，包括wt FVIII、B結(jié)構(gòu)域缺失/截短的FVIII分子、表現(xiàn)出與wt FVIII 基本相同的或改進(jìn)的生物活性的FVIII變體和FVIII相關(guān)多肽，其中已經(jīng)通過(guò)例如以下方 式對(duì)母肽的一個(gè)或多個(gè)氨基酸進(jìn)行了化學(xué)修飾：蛋白：蛋白融合、烷基化、聚乙二醇化、HES 化、PAS化、PSA化、?；Ⅴバ纬苫蝓０沸纬傻龋ňY合到半壽期延長(zhǎng)部分）。
[0048] 半壽其月延長(zhǎng)部分/延長(zhǎng)基（protractive group):術(shù)語(yǔ)"半壽其月延長(zhǎng)部分"在本文 中理解為是指經(jīng)由例如-SH、-OH、-C00H、-C0NH2、-NH2或一個(gè)或多個(gè)N-和/或0-聚糖結(jié) 構(gòu)與FVIII共價(jià)連接的一個(gè)或多個(gè)化學(xué)基團(tuán)，例如親水聚合物，例如PEG和/或多糖，所述 基團(tuán)當(dāng)與這些蛋白綴合時(shí)可以增加體內(nèi)循環(huán)半壽期。適合與本發(fā)明的FVIII綴合的延長(zhǎng)基 /半壽期延長(zhǎng)部分的實(shí)例包括：生物相容性的脂肪酸及其衍生物、羥基烷基淀粉（HAS)例如 羥基乙基淀粉（HES)、聚乙二醇（PEG)、聚（Glyx-Sery)n (HAP)、透明質(zhì)酸（HA)、Ifeparosan 聚合物（HEP)、基于磷酸膽堿的聚合物（PC聚合物）、FleXimerS、葡聚糖、聚唾液酸（PSA) 等）、Fc結(jié)構(gòu)域、Fc受體、轉(zhuǎn)鐵蛋白、白蛋白、彈性蛋白樣肽、XTEN聚合物、白蛋白結(jié)合肽、CTP 肽及其任意組合。一般而言，與無(wú)半壽期延長(zhǎng)部分的FVIII相比，F(xiàn)VIII與一個(gè)或多個(gè)半壽 期延長(zhǎng)部分（例如，親水性聚合物）的綴合當(dāng)與本發(fā)明的VWF片段經(jīng)皮下/皮內(nèi)共同給予 時(shí)通常具有更好的生物利用度。
[0049] 本發(fā)明的聚乙二醇化FVIII分子可具有連接到FVIII蛋白包括任何氨基酸殘基或 碳水化合物部分的任何部分上的一個(gè)或多個(gè)聚乙二醇（PEG)分子。可以使用化學(xué)和/或酶 促方法將PEG或其它聚合物基團(tuán)(半壽期延長(zhǎng)部分)與FVIII上的聚糖綴合。酶促綴合過(guò)程 的實(shí)例描述于例如W003031464。聚糖可以是天然發(fā)生的，或者可使用本領(lǐng)域眾所周知的方 法，通過(guò)例如插入N-連接的和/或0-連接的聚糖而將聚糖插入。本發(fā)明的"半胱氨酸-聚 乙二醇化FVIII"具有綴合到FVIII中存在的半胱氨酸的巰基上的一個(gè)或多個(gè)PEG分子。本 發(fā)明的"半胱氨酸-?；腇VIII"具有綴合到FVIII中的半胱氨酸的巰基上的一個(gè)或多 個(gè)疏水性半壽期延長(zhǎng)部分（例如，脂肪酸），可通過(guò)遺傳工程引入該半胱氨酸殘基或者該半 胱氨酸可以是天然氨基酸序列的一部分。還有可能將半壽期延長(zhǎng)部分與其它氨基酸殘基連 接。
[0050] 融合蛋白：本發(fā)明的融合蛋白是通過(guò)將兩個(gè)或更多個(gè)最初編碼FVIII和融合配偶 體的DNA序列的框內(nèi)連接而產(chǎn)生的蛋白。該融合蛋白DNA序列的翻譯將產(chǎn)生具有來(lái)源于各 最初蛋白或肽的功能性質(zhì)的單一蛋白序列。編碼融合蛋白的DNA序列可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)生物學(xué)方 法（例如重疊 PCR或DNA連接）經(jīng)人工產(chǎn)生，并進(jìn)行裝配，不包括最初5'-端DNA序列的終 止密碼子而保留3'端DNA序列的終止密碼子。可將所得融合蛋白DNA序列插入到合適的 表達(dá)載體中，所述載體支持異源融合蛋白在標(biāo)準(zhǔn)宿主生物體中的表達(dá)。
[0051] 融合蛋白可含有將限定融合蛋白的蛋白或肽部分分隔開(kāi)的接頭或間隔基肽序列。 接頭或間隔基肽序列可促進(jìn)單個(gè)蛋白或肽部分的正確折疊并且使得單個(gè)蛋白或肽部分保 留其各自的功能性更加成為可能?？稍诮M成完整融合蛋白DNA序列的單個(gè)DNA片段的框內(nèi) 裝配期間即在重疊 PCR或DNA連接期間將接頭或間隔基肽序列插入到融合蛋白DNA序列。 包含F(xiàn)VIII和融合配偶體的融合蛋白的實(shí)例參見(jiàn)W02011101284。
[0052] Fc融合蛋白：術(shù)語(yǔ)"Fc融合蛋白"在本文中是指包含與源自任何抗體同種型的Fc 結(jié)構(gòu)域融合的FVIII。由于IgG抗體的相對(duì)長(zhǎng)的循環(huán)半壽期，通常將優(yōu)選IgG Fc結(jié)構(gòu)域。 此外，為了調(diào)節(jié)某些效應(yīng)子功能（例如補(bǔ)體結(jié)合和/或與某些Fc受體結(jié)合），可修飾Fc結(jié) 構(gòu)域。FVIII與具有與FcRn受體結(jié)合的能力的Fc結(jié)構(gòu)域的融合，通常將導(dǎo)致延長(zhǎng)的體內(nèi) 循環(huán)半壽期。IgG Fc結(jié)構(gòu)域中的位置234、235和237的突變通常將導(dǎo)致與Fe γ RI受體 (亦可為Fe γ RIIa和Fe γ RIII受體）的結(jié)合降低。這些突變不改變與FcRn受體的結(jié)合， FcRn受體通過(guò)內(nèi)吞再循環(huán)途徑促進(jìn)長(zhǎng)的循環(huán)體內(nèi)半壽期。優(yōu)選地，本發(fā)明融合蛋白的修飾 的IgG Fc結(jié)構(gòu)域包含一種或多種下述突變，所述突變將分別導(dǎo)致與某些Fc受體的親和力 降低（L234A、L235E和G237A)和Clq介導(dǎo)的補(bǔ)體結(jié)合降低（A330S和P331S)?；蛘撸現(xiàn)c結(jié) 構(gòu)域可以是IgG4 Fc結(jié)構(gòu)域，優(yōu)選地包含S241P/S228P突變。
[0053] (FVIII的）牛物利用度：術(shù)語(yǔ)"牛物利用度"描述了在血管外給予后吸收到血液 中的化合物百分率，計(jì)算為經(jīng)血管外給予化合物后濃度時(shí)間曲線(xiàn)下面積。這是根據(jù)相對(duì)于 經(jīng)靜脈內(nèi)給予后濃度曲線(xiàn)下面積除以同樣的FVIII化合物的劑量，經(jīng)皮下給予后FVIII濃 度曲線(xiàn)下面積除以劑量而計(jì)算。按照本發(fā)明，F(xiàn)VIII分子的生物利用度（經(jīng)皮下/皮內(nèi)共 同給予FVIII和本發(fā)明的VWF片段）為至少3%、優(yōu)選地至少5%、優(yōu)選地至少6%、優(yōu)選地至少 7%、優(yōu)選地至少8%、優(yōu)選地至少9%、優(yōu)選地至少10%、優(yōu)選地至少11%、優(yōu)選地至少12%、優(yōu)選 地至少13%、優(yōu)選地至少14%、優(yōu)選地至少15%、優(yōu)選地至少16%、優(yōu)選地至少17%、優(yōu)選地至少 18%、優(yōu)選地至少19%、優(yōu)選地至少20%、優(yōu)選地至少21%、優(yōu)選地至少22%、優(yōu)選地至少23%、優(yōu) 選地至少24%、優(yōu)選地至少25%、優(yōu)選地至少26%、優(yōu)選地至少27%、優(yōu)選地至少28%、優(yōu)選地 至少29%、優(yōu)選地至少30%、優(yōu)選地至少31%、優(yōu)選地至少32%、優(yōu)選地至少33%、優(yōu)選地至少 34%、優(yōu)選地至少35%、優(yōu)選地至少36%、優(yōu)選地至少37%、優(yōu)選地至少38%、優(yōu)選地至少39%、 優(yōu)選地至少40%、優(yōu)選地至少41%、優(yōu)選地至少42%、優(yōu)選地至少43%、優(yōu)選地至少44%、優(yōu)選 地至少45%、優(yōu)選地至少46%、優(yōu)選地至少47%、優(yōu)選地至少48%、優(yōu)選地至少49%、優(yōu)選地至 少50%、優(yōu)選地至少55%、優(yōu)選地至少60%、優(yōu)選地至少65%、優(yōu)選地至少70%、和最優(yōu)選地至少 75%。生物利用度可以如本文所述地測(cè)定。優(yōu)選地，本發(fā)明制劑的FVIII生物利用度（FVIII 抗原和/或活性）將會(huì)足夠高，以在正?；钚詶l件下發(fā)揮預(yù)防作用，當(dāng)所述制劑經(jīng)血管外 (例如，皮下或皮內(nèi)）給予例如每天1次或2次或每周1、2或3次時(shí)。優(yōu)選地，F(xiàn)VIII劑量 可比得上經(jīng)靜脈內(nèi)給予FVIII所用的劑量，優(yōu)選是后者的2倍，更優(yōu)選3倍、更優(yōu)選4倍、更 優(yōu)選大約10倍、更優(yōu)選大約15倍、更優(yōu)選大約20倍、和最優(yōu)選大約25倍。對(duì)于劑量的確 定，可以考慮安全性和成本上的考慮。
[0054] FVIII對(duì)本發(fā)明VWF片段的飽和:FVIII對(duì)VWF片段的飽和/與VWF結(jié)合或復(fù)合的 FVIII的相對(duì)量/與VWF結(jié)合的FVIII的量除以FVIII的總量。該計(jì)算是基于FVIII與所 述蛋白之間結(jié)合的KD值。對(duì)于FVIII與VWF片段的結(jié)合，所測(cè)KI值用作KD。
[0055] 以下（二次）方程式可用于根據(jù)總濃度[A]t [B]t計(jì)算FVIII (A)與另一蛋白 (B)結(jié)合的濃度。
【權(quán)利要求】
1. 包含至多1200個(gè)氨基酸的VWF片段，其中所述VWF片段包含TIL'結(jié)構(gòu)域。
2. 權(quán)利要求1的VWF片段，其中所述片段包含TIL'和E'結(jié)構(gòu)域。
3. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的VWF片段，其中所述VWF片段包含1099和/或1142半胱 氨酸中的一個(gè)或兩個(gè)氨基酸取代。
4. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的VWF片段，其中小于5%的所述VWF片段呈寡聚物和/或多 聚體的形式。
5. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的VWF片段，其中所述VWF片段是二聚體的一部分。
6. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的VWF片段，其中所述VWF片段是單體。
7. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的VWF片段，其中所述片段包含選自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO 4.SEQ ID NO 5.SEQ ID NO 6.SEQ ID NO 7.SEQ ID NO 8.SEQ ID NO 9.SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 12、SEQ ID NO 13、SEQ ID NO 14、SEQ ID NO 15、SEQ ID NO 16、SEQ ID NO 17、SEQ ID NO 18、SEQ ID NO 19、SEQ ID NO 20 和 SEQ ID NO 21。
8. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的VWF片段，其中所述片段包含SEQ ID NO 9,其中1099半 胱氨酸殘基被另一氨基酸取代。
9. 權(quán)利要求8的VWF片段，其中1099半胱氨酸殘基被絲氨酸取代。
10. 權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的VWF片段，其中所述片段包含選自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO 10,SEQ ID NO 1USEQ ID NO 12,SEQ ID NO 13,SEQ ID NO 14,SEQ ID NO 15,SEQ ID NO 16、SEQ ID NO 17、SEQ ID NO 18、SEQ ID NO 19、SEQ ID NO 20 和 SEQ ID NO 21， 其中1099和1142半胱氨酸殘基被另一氨基酸取代。
11. 權(quán)利要求10的VWF片段，其中1099和1142半胱氨酸殘基被絲氨酸取代。
12. 藥物組合物，包括：⑴權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)的VWF片段；和（ii) FVIII分子。
13. 權(quán)利要求12的藥物組合物，其中所述FVIII分子包含長(zhǎng)度為5-700個(gè)氨基酸的截 短的B結(jié)構(gòu)域。
14. 權(quán)利要求12-13中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中FVIII是B結(jié)構(gòu)域截短的變體，其中 所述截短的B結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列源自SEQ ID NO 1所示的wt FVIII B結(jié)構(gòu)域氨基酸序 列。
15. 權(quán)利要求14的藥物組合物，其中所述B結(jié)構(gòu)域包含與SEQ ID NO 1的Ser 750氨 基酸殘基連接的〇-聚糖。
16. 權(quán)利要求12-15中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述FVIII分子與至少一個(gè)半壽期延 長(zhǎng)部分綴合。
17. 權(quán)利要求12-16中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中至少一個(gè)半壽期延長(zhǎng)部分與FVIII B 結(jié)構(gòu)域中存在的〇-聚糖共價(jià)連接。
18. 權(quán)利要求12-17中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述FVIII分子在皮下給予后的生物 利用度為至少5%。
19. 權(quán)利要求12-18中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中FVIII和VWF的摩爾比為1:1。
20. 權(quán)利要求12-19中任一項(xiàng)的藥物制劑，其中FVIII的濃度為至少500 IU/ml。
21. 權(quán)利要求12-20中任一項(xiàng)的藥物制劑，其中FVIII與VWF片段結(jié)合的量占所述制劑 中的FVIII總量的至少70%。
22. 用于治療血友病的權(quán)利要求12-21中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述藥物組合物 用于經(jīng)皮下給予。
23. 藥物組合物，其中所述組合物包含VWF片段，其中所述VWF片段的氨基酸序列選自： SEQ ID NO 4、SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 12、SEQ ID NO 13、SEQ ID NO 14、SEQ ID NO 15、SEQ ID NO 16、SEQ ID NO 17、SEQ ID NO 18、SEQ ID NO 19、SEQ ID NO 20 和 SEQ ID NO 21。
24. 經(jīng)靜脈內(nèi)或皮下給予用于治療馮維勒布蘭德氏病的權(quán)利要求23的藥物組合物。
【文檔編號(hào)】A61K38/37GK104411716SQ201380033560
【公開(kāi)日】2015年3月11日 申請(qǐng)日期:2013年3月13日 優(yōu)先權(quán)日:2012年4月24日
【發(fā)明者】G.博特, D.M.卡普特, F.羅德, J.哈亞寧, K.羅伊普斯托夫, L.蒂姆, M.佩特森, M.克賈科, O.維斯特奧森, J.J.漢森 申請(qǐng)人:諾和諾德A/S（股份有限公司）