適用于治療血友病的藥物組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及適用于治療血友病的藥物組合物。
【專利說明】適用于治療血友病的藥物組合物 技術(shù)背景
[0001] 本發(fā)明涉及血友病的治療和/或預(yù)防。
[0002] 背景 經(jīng)靜脈內(nèi)給予凝血因子的蛋白質(zhì)替代療法目前用于治療血友病患者。對于患者的方便 性和依從性而言，血管外（例如，皮下（s.c.)或皮內(nèi)）給藥優(yōu)于現(xiàn)有的靜脈內(nèi)（i.V.)注射。 血管外給予還具有潛在的安全性優(yōu)勢，因?yàn)樵S多患者能夠避免靜脈內(nèi)端口手術(shù)以及這類導(dǎo) 管插入相關(guān)的感染和凝血風(fēng)險(xiǎn)。
[0003] 在FVIII缺乏的小鼠中經(jīng)皮下給予FVIII，公開于Shi等人，Haemophilia, 2012， DOI:10. 1111/j. 1365-2516. 2011. 02735.X。FVIII的生物利用度在此文中據(jù)報(bào)告為低（大 約 1%)。
[0004] 經(jīng)皮下給予FVIII和VWF另外公開于W008151817,但未公開FVIII劑量和所達(dá)到 的循環(huán)FVIII濃度間的劑量反應(yīng)關(guān)系。在W0815817中，VWF與FVIII的（單位）比率大于 5:1，相當(dāng)于VWF蛋白濃度比FVIII濃度有150-250倍摩爾過量。然而，從實(shí)踐和經(jīng)濟(jì)上的 觀點(diǎn)看，這種類型的比例并不理想。在W008151817中，進(jìn)一步證明了當(dāng)將FVIII與VWF共 同配制時(shí)，經(jīng)皮下給予FVIII的小鼠的免疫原性明顯降低。
[0005] 在W010062768中，公開了FVIII的聚乙二醇化可以改進(jìn)經(jīng)皮下注射給小鼠的 FVIII的生物利用度，而與VWF共同配制卻沒有改進(jìn)FVIII的生物利用度。
[0006] 本領(lǐng)域需要這樣的化合物和/或藥物組合物：其適用于經(jīng)血管外給予，以在有或 無抑制劑時(shí)治療和/或預(yù)防患有凝血疾病例如A型血友病的患者，和/或治療和/或預(yù)防 患有馮維勒布蘭德氏病的患者，因?yàn)檫@樣的給予形式將會(huì)減輕經(jīng)靜脈內(nèi)治療的負(fù)擔(dān)，這兩 者的靜脈內(nèi)治療都同樣涉及到輸注并且也涉及到因植入便攜式導(dǎo)管所致的感染風(fēng)險(xiǎn)。這樣 的化合物和組合物優(yōu)選是安全的（即具有低的免疫原性風(fēng)險(xiǎn)）和/或具有高生物利用度和 /或優(yōu)選是在生產(chǎn)和配制過程中容易處理的。
[0007] 概述 本發(fā)明涉及包含F(xiàn)VIII分子的藥物組合物在治療血友病中的用途，其中所述FVIII分 子包含長度為100-700個(gè)氨基酸的截短的B結(jié)構(gòu)域，其中所述截短的B結(jié)構(gòu)域的氨基酸序 列源自wtFVIIIB結(jié)構(gòu)域氨基酸序列，和其中所述FVIII分子經(jīng)血管外給予的生物利用度 為至少20%。
[0008] 描述 本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)了以下觀察結(jié)果：與例如具有整個(gè)B結(jié)構(gòu)域完整的FVIII以及沒 有或僅有少數(shù)氨基酸（例如，15-30個(gè)氨基酸）的B結(jié)構(gòu)域截短/缺失的FVIII分子相比， 本發(fā)明的FVIII分子在經(jīng)皮下給予時(shí)具有令人驚奇的高FVIII生物利用度。
[0009] 本發(fā)明的發(fā)明人還驚奇地發(fā)現(xiàn)了以下觀察結(jié)果：當(dāng)與VWF或VWF片段共同給予時(shí) 可以改善本發(fā)明的FVIII分子經(jīng)皮下的生物利用度。優(yōu)選地，VWF應(yīng)當(dāng)呈VWF片段的形式， 其包含TIL'結(jié)構(gòu)域和任選地包含C1099和/或Cl142半胱氨酸的氨基酸取代，以減少多聚 體的形成。
[0010] 附圖簡述 圖1 :在有或無共同給予相對于N8-GP而言的7. 7倍摩爾劑量的VWFTIL' /E' /D3/A1 時(shí)，在皮下給予10000U/kg"N8-GP"后，血漿中的FVIII活性。數(shù)據(jù)是在每一時(shí)間點(diǎn)來自 n=2FVIIIKO小鼠的測量的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。"N8-GP"是如W02009108806的實(shí)施例1+2 所述而制備的糖-聚乙二醇化FVIII分子。
[0011] 圖2 :在有或無共同給予相對于N8-GP而言的7. 7倍摩爾劑量的VWFTIL'/E'/D3/ Al時(shí)，在皮下給予10000U/kgN8-GP后，血漿中的FVIII抗原。數(shù)據(jù)是在每一時(shí)間點(diǎn)來自 n=2FVIIIKO小鼠的測量的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。
[0012] 圖3 :在有或無共同給予相對于N8-GP而言的7. 7倍摩爾劑量的VWFTIL' /E' / D3/A1時(shí)，在皮下給予2500U/kgN8-GP后，血漿中的FVIII活性。數(shù)據(jù)是在每一時(shí)間點(diǎn)來 自n=2FVIIIKO小鼠的測量的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。
[0013] 圖4 :在有或無共同給予相對于N8-GP而言的7. 7倍摩爾劑量的VWFTIL' /E' / D3/A1時(shí)，在皮下給予2500U/kgN8-GP后，血漿中的FVIII抗原。數(shù)據(jù)是在每一時(shí)間點(diǎn)來 自n=2FVIIIKO小鼠的測量的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。
[0014] 圖5 :在有或無共同給予相對于FVIII而言的7. 7倍摩爾劑量的VWFTIL' /E' / D3/A1 時(shí)，在皮下分別給予 5000 或 20000IU/kgwtFVIII(N8,turoctocogalfa)后，血 漿中的FVIII活性。數(shù)據(jù)是在每一時(shí)間點(diǎn)來自n=2FVIIIKO小鼠的測量的平均值和標(biāo)準(zhǔn) 差。"N8"/"turocotogalfa"是如W02009108806的實(shí)施例1中所述而制備的B結(jié)構(gòu)域截 短的FVIII分子。
[0015] 圖6 :在有或無共同給予相對于FVIII而言的7. 7倍摩爾劑量的VWFTIL' /E' / D3/A1 時(shí)，在皮下給予 5000 或 20000IU/kgwtFVIII(N8,turoctocogalfa)后，血漿中 的FVIII抗原。數(shù)據(jù)是在每一時(shí)間點(diǎn)來自n=2FVIIIKO小鼠的測量的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。
[0016] 圖7 :在有或無共同給予相對于FVIII而言的7. 7倍摩爾劑量的VWFTIL' /E' / D3/A1 時(shí)，在皮下給予 5000IU/kgFVIII(N8,turoctocogalfa)后，血漿中的FVIII抗 原。數(shù)據(jù)是在每一時(shí)間點(diǎn)來自n=2FVIIIKO小鼠的測量的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。
[0017] 圖8:在有或無共同給予相對于FVIII而言的7. 7倍摩爾劑量的VWFTIL' /E'/ D3/A1 時(shí)，在皮下給予 5000IU/kgFVIII(N8,turoctocogalfa)后，血漿中的FVIII活 性。數(shù)據(jù)是在每一時(shí)間點(diǎn)來自n=2FVIIIKO小鼠的測量的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。
[0018] 圖 9 :在 20T與FVIII(N8,turoctocogalfa)結(jié)合的VWF片段（764-865SEQ IDNO5)。上圖面顯示每次滴定后釋放熱量的原始數(shù)據(jù)。下圖面顯示得自積分原始數(shù)據(jù)的 結(jié)合等溫線。數(shù)據(jù)分析表明VWF片段（SEQIDNO5)在放熱反應(yīng)中與FVIII結(jié)合，其化學(xué) 計(jì)量學(xué)為 1. 14,ΛH為-5. 82kcal/mole，ΛS為 9. 8cal/mol/deg和Kd 為 0· 33μΜ。"F8/ N8/turoctocogalfa"是如W02009108806的實(shí)施例1中所公開而制備的B結(jié)構(gòu)域截短的 FVIII分子。
[0019] 圖10 :經(jīng)皮下給予的N8-GP在體內(nèi)能有效止血。左圖面顯示在尾巴橫切前24小 時(shí)經(jīng)皮下N8-GP或溶媒治療，或在尾巴橫切前5分鐘經(jīng)靜脈內(nèi)治療的FVIIIK0小鼠中的血 液損失。N8-GP"是如W02009108806的實(shí)施例1+2中所述而制備的糖-聚乙二醇化FVIII 分子。右圖面顯示在來自小鼠離體全血中的凝血時(shí)間，使用R0TEM。
[0020] 圖 11 :在 25°C，F(xiàn)VIII、TIL，/E，/D3/A1III、以及FVIII和TIL，/E，/D3/A1III 的混合物在155mMNaCl、10mM乙酸鈣、10 %異丙醇中的SEC-UV(280nm)色譜圖。
[0021] 圖 12 :在 25°C，F(xiàn)VIII、TIL' /E' /D3II、以及FVIII和TIL' /E' /D3II的混合物 在155mMNaCl、10mM乙酸鈣、10%異丙醇中的SEC-UV(280nm)色譜圖。
[0022] 定義 本文使用的術(shù)語"治這"指任何有需要的人或其他脊椎動(dòng)物受試者的醫(yī)學(xué)治療。預(yù)期 所述受試者已經(jīng)歷醫(yī)生或獸醫(yī)進(jìn)行的身體檢查，醫(yī)生或獸醫(yī)已給出試驗(yàn)性或明確的診斷， 表明使用所述特定治療對治療所述人或其他脊椎動(dòng)物的疾病有益。根據(jù)受試者健康狀況， 所述治療的時(shí)機(jī)和目的可因個(gè)體的不同而異。因此，所述治療可以是預(yù)防性的、緩和性的、 對癥的和/或治愈性的。
[0023]給藥方式:本發(fā)明的化合物和藥物組合物可經(jīng)胃腸外給予，例如，經(jīng)靜脈內(nèi)或血管 外（例如，皮內(nèi)、肌內(nèi)、皮下等）給予。本發(fā)明的化合物和藥物組合物可以是預(yù)防性和/或 治療性地給予和/或按需要給予。根據(jù)本發(fā)明，血管外給予本發(fā)明的化合物/藥物組合物 具有若干優(yōu)勢。血管外給予對所有患者的可能益處、尤其是對兒童和小嬰兒的特定益處是， 更容易、簡單，更少疼痛，更少麻煩和并發(fā)癥（并因此可能帶來較好的依從性）。有可能避免 導(dǎo)管手術(shù)并且有可能使用更方便的藥盒和裝置，用于使用血管外給藥途徑來給予產(chǎn)品。
[0024]聯(lián)合治療/共同給予：可以以許多不同方式完成兩種或更多種活件化合物(例如， 本發(fā)明的FVIII分子和具有與FVIII結(jié)合能力的VWF(例如，VWF片段））的聯(lián)合給予。在 一個(gè)實(shí)施方案中，兩種活性化合物可以在單個(gè)組合物中一起給予。在另一個(gè)實(shí)施方案中，兩 種活性化合物可以在單獨(dú)組合物中給予，作為聯(lián)合治療的組成部分。例如，第一種化合物可 以在第二種化合物之前、之后或同時(shí)給予。在FVIII和VWF作為兩種單獨(dú)的藥物組合物經(jīng) 血管外（例如，皮下）給予的情況下，它們優(yōu)選地是靠近地給予，以便得益于這兩種類型的 化合物同時(shí)給予時(shí)所獲得的改進(jìn)的生物利用度（即注射部位應(yīng)當(dāng)間隔不超過5cm、優(yōu)選地 不超過4cm、優(yōu)選地不超過3cm、優(yōu)選地不超過2cm和最優(yōu)選地不超過Icm)。兩種化合 物還應(yīng)當(dāng)優(yōu)選地在大約1小時(shí)內(nèi)、優(yōu)選大約30分鐘內(nèi)、優(yōu)選大約15分鐘內(nèi)、和最優(yōu)選地大 約5分鐘內(nèi)注射。
[0025]因子VIII:因子VIII(FVIII)是主要由肝細(xì)胞產(chǎn)生的大的復(fù)雜糖蛋白。人 FVIII的序列編碼2351個(gè)氨基酸，包括信號(hào)肽，并包含若干個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域，如通過同源性 所限定。有3個(gè)A-結(jié)構(gòu)域、1個(gè)唯一的B-結(jié)構(gòu)域和2個(gè)C-結(jié)構(gòu)域。結(jié)構(gòu)域順序可列為 NH2-A1-A2-B-A3-C1-C2-C00H。通過二價(jià)金屬離子結(jié)合將鏈連接在一起。A1-A2-B鏈命名為 重鏈（HC)，而A3-C1-C2命名為輕鏈（LC)。Al(al區(qū)）和A2 (a2區(qū)）的小的酸性區(qū)C-末 端和A3結(jié)構(gòu)域的N-末端（a3區(qū)）在其與其它凝血蛋白質(zhì)的相互作用中起到重要作用，所 述其它凝血蛋白質(zhì)包括凝血酶和馮維勒布蘭德因子（vonWillebrandtFactor) (VWF)， FVIII的載體蛋白。
[0026] 內(nèi)源VIII分子以具有不同尺寸的B-結(jié)構(gòu)域的分子庫（最短的具有在位置740的 C-末端，即在A2-a2的C-末端，并因此不含B結(jié)構(gòu)域）在體內(nèi)循環(huán)。這些具有不同長度的 B結(jié)構(gòu)域的FVIII分子都具有全部促凝血活性。一旦用凝血酶活化，在位置372的Al-al的 C-末端、在位置740的A2-a2的C-末端、和在位置1689的介于a3和A3之間切割FVIII， 后一切割釋放a3區(qū)，同時(shí)失去對VWF的親和力?；罨腇VIII分子稱為FVIIIa?；罨试S FVIIIa與磷脂表面樣活化的血小板和活化的因子IX(FIXa)相互作用，即形成tenase復(fù)合 物，允許有效活化因子X(FX)。
[0027] 術(shù)語"因子VIII(a) "和"FVIII(a) "包括FVIII和FVIIIa兩者。同樣，術(shù)語"因子 VIII"和"FVIII"可包括FVIII和FVIIIa兩者。本文使用的"因子VIII"或"FVIII"是指 作為內(nèi)在凝血途徑的成員并對血液凝固必需的人血漿糖蛋白。"野生型（wt)/天然FVIII" 是源自如SEQIDNO:1 (氨基酸1-2332)所示的全長序列的人FVIII分子。"FVIII(a)"包 括可以在個(gè)體之間存在并出現(xiàn)的FVIII(a)的天然等位變體。本發(fā)明的FVIII分子優(yōu)選是 經(jīng)重組產(chǎn)生的，使用眾所周知的生產(chǎn)和純化方法。糖基化、酪氨酸硫酸化和其它翻譯后修飾 的程度和位置可以隨所選擇的宿主細(xì)胞及其生長環(huán)境的不同而變。
[0028] 本發(fā)明的藥物組合物可包含這樣的B結(jié)構(gòu)域-截短的FVIII分子：其中剩余結(jié)構(gòu) 域接近相當(dāng)于如SEQIDNO:3的氨基酸編號(hào)1-740和1649-2332所示的序列。在這類分子 中，可以引入突變?？蓪被嵝揎椑缛〈?、插入和缺失引入分子中，以便修飾FVIII與 多種其他組分的結(jié)合能力，所述多種其他組分例如低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白（LRP)和相 關(guān)受體、多種其他受體、其他凝血因子、細(xì)胞表面、糖基化位點(diǎn)的引入和/或取消等。不取消 FVIII活性的其它突變也可在本文的FVIII分子中提供。
[0029] 本發(fā)明的FVIII分子（分子/變體/衍生物/類似物/綴合物）在凝血級聯(lián)中能 夠起作用，其方式在功能上類似于或等同于wt/內(nèi)源FVIII，導(dǎo)致FXa的形成（經(jīng)由與活化 血小板上的FIXa相互作用）和支持血凝塊的形成?？墒褂帽绢I(lǐng)域眾所周知的技術(shù)，在體外 評價(jià)FVIII活性。凝血分析、FX活化測定法（通常稱為顯色測定法）、凝血酶產(chǎn)生測定法和 全血血栓-彈性成像是這類體外技術(shù)的實(shí)例。本發(fā)明的FVIII分子具有的FVIII活性是天 然人FVIII的至少大約10%、至少大約20%、至少大約30%、至少大約40%、至少大約50%、至少 大約60%、至少大約70%、至少大約80%、至少大約90%、100%或甚至超過100%。
[0030] 將內(nèi)源全長FVIII合成為單鏈前體分子。在分泌之前，將前體切割為重鏈和輕鏈。 可從兩種不同的策略產(chǎn)生重組B結(jié)構(gòu)域缺失或截短的FVIII。將無B-結(jié)構(gòu)域的重鏈和輕鏈 單獨(dú)合成為兩條不同的多肽鏈（兩條鏈策略），或?qū)-結(jié)構(gòu)域缺失或截短的FVIII合成為 單一前體多肽鏈（單條鏈策略），其以與全長FVIII前體相同的方式被切割為重鏈和輕鏈。
[0031] 在經(jīng)單條鏈策略產(chǎn)生的B結(jié)構(gòu)域缺失或截短的FVIII前體多肽中，通常通過接頭 分開重鏈和輕鏈部分。為了使在本發(fā)明的B結(jié)構(gòu)域缺失/截短的FVIII中導(dǎo)入免疫原性表 位的風(fēng)險(xiǎn)最小化，接頭的序列優(yōu)選來源于FVIIIB結(jié)構(gòu)域。在全長FVIII的B結(jié)構(gòu)域中，氨 基酸1644-1648組成該識(shí)別位點(diǎn)。在B結(jié)構(gòu)域缺失的FVIII活化時(shí)導(dǎo)致接頭移除的凝血酶 切割位點(diǎn)位于重鏈中。因此，接頭的尺寸和氨基酸序列不太可能影響通過凝血酶活化將其 從殘余FVIII分子中移除。B結(jié)構(gòu)域的缺失/截短對于產(chǎn)生FVIII是有利的。然而，可在接 頭中包含部分B結(jié)構(gòu)域而不降低生產(chǎn)能力。B結(jié)構(gòu)域?qū)ιa(chǎn)能力的負(fù)面效應(yīng)不能歸因于B 結(jié)構(gòu)域的任何特定尺寸或序列。
[0032]SEQIDNO:1:wt人FVIII(Ser750 殘基以黑體顯示） ATRRYYLGAVELSffDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSVVYKKTLFVEFTDHLFNIAKPRPPWMGLL GPTIQAEVYDTVVITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLKENGPMAS DPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMQDRDAASAR AWPKMHTVNGYVNRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQASLEISPITFLTAQTLLMDL GQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPK TWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKTREAIQHESGILGPLLYGEV ⑶TLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTVTVEDGPTKSDPRCLTRYYS SFVNMERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQRFLPNPAGVQLEDPEFQAS NIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYEDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLW ILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNIODYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSQNSRHP§_TRQKQFNATTIPEND IEKTDPWFAHRTPMPKIQNVSSSDLLMLLRQSPTPHGLSLSDLQEAKYETFSDDPSPGAIDSNNSLSEMTHFRPQLH HSGDMVFTPESGLQLRLNEKLGTTAATELKKLDFKVSSTSNNLISTIPSDNLAAGTDNTSSLGPPSMPVHYDSQLDT TLFGKKSSPLTESGGPLSLSEENNDSKLLESGLMNSQESSWGKNVSSTESGRLFKGKRAHGPALLTKDNALFKVSIS LLKTNKTSNNSATNRKTHIDGPSLLIENSPSVWQNILESDTEFKKVTPLIHDRMLMDKNATALRLNHMSNKTTSSKN MEMVQQKKEGPIPPDAQNPDMSFFKMLFLPESARWIQRTHGKNSLNSGQGPSPKQLVSLGPEKSVEGQNFLSEKNKV VVGKGEFTKDVGLKEMVFPSSRNLFLTNLDNLHENNTHNQEKKIQEEIEKKETLIQENVVLPQIHTVTGTKNFMKNL FLLSTRQNVEGSYDGAYAPVLQDFRSLNDSTNRTKKHTAHFSKKGEEENLEGLGNQTKQIVEKYACTTRISPNTSQQ NFVTQRSKRALKQFRLPLEETELEKRIIVDDTSTQWSKNMKHLTPSTLTQIDYNEKEKGAITQSPLSDCLTRSHSIP QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLTRVLFQDNSSHLPAASYRKKDSGVQESSHFLQGAKKNNLSLAILTLEMTGDQRE VGSLGTSATNSVTYKKVENTVLPKPDLPKTSGKVELLPKVHIYQKDLFPTETSNGSPGHLDLVEGSLLQGTEGAIKff NEANRPGKVPFLRVATESSAKTPSKLLDPLAWDNHYGTQIPKEEWKSQEKSPEKTAFKKKDTILSLNACESNHAIAA INEGQNKPEIEVTffAKQGRTERLCSQNPPVLKRHQREITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPR SFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKVVFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAE VEDNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDL EKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHA INGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWR VECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSINAWSTKEPFSWIKVD LLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRL HPTHYSIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNPKE WLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPVVNSLDPPLLTRY LRlHPQSffVHQIALRMEVLGCEAQDLY FVIII的B結(jié)構(gòu)域跨越SEQIDNO:1的氨基酸741-1648。B-結(jié)構(gòu)域在若干不同位點(diǎn)上 被切割，在循環(huán)的血漿FVIII分子中產(chǎn)生大的異質(zhì)性。高度糖基化的B-結(jié)構(gòu)域的確切功能 未知。所知道的是B結(jié)構(gòu)域在凝血級聯(lián)中對FVIII活性是非必要的。因此經(jīng)常以B結(jié)構(gòu)域 缺失/截短的變體形式產(chǎn)生重組FVIII。例如，可由表達(dá)載體產(chǎn)生FVIII分子，所述載體編碼 具有以下序列的21個(gè)氨基酸殘基L(接頭）序列：SEQIDNO2:SFSQNSRHPSQNPPVLKRHQR (0-聚糖連接到下劃線的S)。優(yōu)選的本發(fā)明的FVIII分子是B結(jié)構(gòu)域缺失/截短的變體， 其包含連接到SEQIDNO1中的Ser750殘基的0-聚糖，任選經(jīng)由該0-聚糖綴合到聚合 物（半壽期延長）部分上。
[0033]本發(fā)明的發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)了以下觀察結(jié)果：與例如具有整個(gè)B結(jié)構(gòu)域完整的FVIII以及沒有或僅有少數(shù)氨基酸（例如，15-30個(gè)氨基酸）完整的FVIII分子相比，本發(fā) 明的具有以下長度的B結(jié)構(gòu)域的B結(jié)構(gòu)域缺失/截短的FVIII分子當(dāng)經(jīng)血管外（例如皮 下）給予時(shí)，具有驚人高的生物利用度：大約100至大約700個(gè)氨基酸（（優(yōu)選150-650、 更優(yōu)選150-600、更優(yōu)選150-550、更優(yōu)選150-500、更優(yōu)選150-450、更優(yōu)選150-400、更 優(yōu)選150-350、更優(yōu)選200-700、更優(yōu)選200-600、更優(yōu)選200-500、更優(yōu)選200-400、更優(yōu) 選200-300、和最優(yōu)選大約200-250)。這樣的分子可以包含或可以不包含SEQIDNO1的 Ser750殘基。因此提供了在皮下/皮內(nèi)給予后具有改善的生物利用度的FVIII的簡單而安 全的生產(chǎn)方式。通過將所述分子與半壽期延長部分綴合/融合可延長本發(fā)明的FVIII分子 的體內(nèi)循環(huán)半壽期是似乎合理的。本發(fā)明的包含226個(gè)氨基酸的B結(jié)構(gòu)域的FVIII分子的 實(shí)例見SEQIDNO3 : SEQIDNO3 : (226個(gè)氨基酸的B結(jié)構(gòu)域分子）： ATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSVVYKKTLFVEFTDHLFNIAKPRPPWMGLL GPTIQAEVYDTVVITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLKENGPMAS DPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMQDRDAASAR AWPKMHTVNGYVNRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQASLEISPITFLTAQTLLMDL GQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPK TWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKTREAIQHESGILGPLLYGEV ⑶TLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTVTVEDGPTKSDPRCLTRYYS SFVNMERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQRFLPNPAGVQLEDPEFQAS NIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYEDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLW ILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNIODYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSQNSRHPSTRQKQFNATTIPEND IEKTDPWFAHRTPMPKIQNVSSSDLLMLLRQSPTPHGLSLSDLQEAKYETFSDDPSPGAIDSNNSLSEMTHFRPQLH HSGDMVFTPESGLQLRLNEKLGTTAATELKKLDFKVSSTSNNLISTIPSDNLAAGTDNTSSLGPPSMPVHYDSQLDT TLFGKKSSPLTESGGPLSLSEENNDSKLLESGLMNSQESSWGKNVSHHHHHHSQNPPVLKRHQREITRTTLQSDQEE IDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKVVFQEF TDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAEVEDNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTY FWKVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFT ENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKE EYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQW APKLARLHYSGSINAffSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKKWQTYRGNSTGTL MVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMF ATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQffTLFFQN GKVKVFQGNQDSFTPVVNSLDPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALRMEVLGCEAQDLY 表a:本發(fā)明的FVIII分子的B結(jié)構(gòu)域的實(shí)例。His-標(biāo)簽是任選的并在化合物純化/ 分離后可被移除。
【權(quán)利要求】
1. 包含F(xiàn)VIII分子的藥物組合物在治療血友病中的用途，其中所述FVIII分子包含長 度為100-400個(gè)氨基酸的截短的B結(jié)構(gòu)域，其中所述截短的B結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列源自wt FVIII B結(jié)構(gòu)域氨基酸序列，和其中所述FVIII分子經(jīng)皮下給予的生物利用度為至少10%。
2. 權(quán)利要求1的FVIII分子，其中所述B結(jié)構(gòu)域包含連接到SEQ ID NO 1中的Ser 750 氨基酸殘基的〇-聚糖。
3. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的FVIII分子，其中所述FVIII分子的氨基酸序列如SEQ ID NO 3所示。
4. 權(quán)利要求1的FVIII分子，其中所述FVIII B結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列選自：氨基酸 741-857 + 1637-1648;氨基酸 741-914 + 1637-1648;氨基酸 741-954 + 1637-1648;氨基 酸 741-965 + 1637-1648;氨基酸 741-965 + 1637-1648;氨基酸 741-1003 + 1637-1648; 氨基酸 741-1003 + 1637-1648;氨基酸 741-1020 + 1637-1648;氨基酸 741-1079 + 1637-1648;氨基酸 741-1206 + 1637-1648;氨基酸 741-1261 + 1637-1648;氨基酸 741-1309 + 1637-1648;氨基酸 741-914 + 1637-1648;氨基酸 741-954 + 1637-1648; 氨基酸 741-968 + 1637-1648;氨基酸 741-1003 + 1637-1648;氨基酸 741-1018 + 1637-1648;氨基酸 741-1070 + 1637-1648;氨基酸 741-1230 + 1637-1648;氨基酸 741-1301 + 1637-1648 ;氨基酸 741-965 + 1637-1648 ;氨基酸 741-965 + 1637-1648 ;氨 基酸 741-965 + 1637-1648;和氨基酸 741-965 + 1637-1648。
5. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的FVIII分子，其中至少一個(gè)半壽期延長部分與所述FVIII 分子共價(jià)連接。
6. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的FVIII分子，其中至少一個(gè)水溶性聚合物與B結(jié)構(gòu)域中存 在的聚糖共價(jià)連接。
7. 權(quán)利要求5-6中任一項(xiàng)的的FVIII分子，其中所述水溶性聚合物選自：PEG和多糖。
8. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述組合物進(jìn)一步包含VWF或VWF片 段。
9. 權(quán)利要求8的藥物組合物，其中所述VWF片段包含至多1200個(gè)氨基酸，和其中所述 VWF片段包含TIL'結(jié)構(gòu)域。
10. 權(quán)利要求8-9中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述VWF片段不含1099和/或C1142 半胱氨酸。
11. 權(quán)利要求8-10中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中小于5%的所述VWF片段呈寡聚物和 /或多聚體形式。
12. 權(quán)利要求8-10中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述VWF片段是二聚體。
13. 權(quán)利要求8-12中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述VWF片段的氨基酸序列選自：SEQ ID NO 4,SEQ ID NO 5,SEQ ID NO 6,SEQ ID NO 7,SEQ ID NO 8,SEQ ID NO 9,SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 12、SEQ ID NO 13、SEQ ID NO 14、SEQ ID NO 15、SEQ ID NO 16、SEQ ID NO 17、SEQ ID NO 18、SEQ ID NO 19、SEQ ID NO 20 和 SEQ ID NO 21。
14. 權(quán)利要求8-13中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中FVIII和VWF的比例為1:1。
15. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的藥物制劑，其中FVIII濃度為至少500 IU/ml。
16. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的藥物制劑，其中與VWF片段結(jié)合的FVIII的量占所述制 齊[J中的FVIII總量的至少70%。
17. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的藥物組合物在經(jīng)皮下給予用于治療血友病中的用途。
18. 權(quán)利要求17的藥物組合物在經(jīng)血管外給予用于治療馮維勒布蘭德氏病中的用 途。
【文檔編號(hào)】A61K38/37GK104411323SQ201380033402
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2013年3月13日 優(yōu)先權(quán)日:2012年4月24日
【發(fā)明者】G.博特, D.M.卡普特, F.羅德, J.哈亞寧, K.羅伊普斯托夫, L.蒂姆, M.佩特森, M.克賈科, O.維斯特奧森, P.里斯拜諾拜, J.J.漢森 申請人:諾和諾德A/S（股份有限公司）