包含抗-dll4抗體的穩定化制劑的制作方法

包含抗-dll4抗體的穩定化制劑的制作方法
【專利摘要】本發明提供包含特異性地結合至人Δ樣配體4(DLL4)的抗體的藥物制劑。除了抗-DLL4抗體以外，這些制劑可含有磷酸鹽緩沖液、有機共溶劑、雙糖以及鹽。本發明的藥物制劑在儲存數個月之后以及在歷經熱脅迫以及其他物理性脅迫之后表現出相當程度的抗體穩定性。
【專利說明】包含抗-DLL4抗體的穩定化制劑
[0001] 本申請于2013年5月31日作為PCT國際專利申請提交，要求2012年5月31日 提交的美國臨時專利申請No 61/653,478的優先權，該申請的公開內容通過引證的方式整 體納入本文。

【技術領域】
[0002] 本發明涉及治療性抗體制劑的領域。更具體而言，本發明涉及包含特異性地結合 至人A樣配體4 (D114)的抗體的藥物制劑領域。
[0003] 序列表
[0004] 依據37C. F. R § L 821 (e)，隨本說明書同時一起提交的是序列表的ST. 25兼容性 計算機可讀文本文件。文本文件的內容通過引用并入本文。序列表的紙本復印本依據37C. F. R § 1. 821 (f)，與ST. 25兼容性計算機可讀取文本文件的內容完全相同，其被納入作為本 說明的一部分且通過引用并入本文。

【背景技術】
[0005] Notch-信號通路是一種用于細胞對細胞溝通的系統，被廣泛的真核生物用于數種 生物學過程，諸如分化、增殖及穩態。A樣（A-Iike)4(D14)或A樣配體4(D114)(下文 中稱作"D114"）是Notch配體A家族的一個成員，其在血管內皮中具有高選擇性的表達 (Shutter et al. (2000)Genes Develop. 14:1313_1318)。0114 是Notch 受體（包括Notchl 及Notch4)的一個配體。人類D114的氨基酸序列顯示于SEQ ID N0:9中。若D114-Notch 信號通路在調節血管生成中扮演重要角色且其反映人類健康與醫學，則發展及開展以D114 為基礎的藥劑是需要的。一個這樣以D114為基礎的藥劑為對D114具有特異性的治療性抗 體。
[0006] 制造可用作為人類治療劑的抗體的方法包括產生嵌合抗體及人源化抗體（參見， 例如 U. S. 6, 949, 245)。參見，例如 WO 94/02602 (Abgenix)及 U. S. 6, 596, 541 (Regeneron Pharmaceuticals)，其描述了產生能夠生產人類抗體的非人類轉基因小鼠的方法。美 國專利第7, 488, 806號、第7, 534, 868號與第7, 919, 593號，以及美國專利申請 US2011-0150905A1公開了針對人類D114的抗體。
[0007] 治療性抗體必須以不僅使抗體適于給藥至患者的方式，還要以在儲存以及后續使 用期間維持其穩定性的方式來制劑。舉例而言，例如，在沒有適當配制的情況下，液體溶液 中的治療性抗體傾向于分解、沉淀、團聚和進行不想要的化學修飾。抗體在液體制劑中的穩 定性不僅取決于制劑中所使用的賦形劑種類，還有賦形劑相對于彼此的數量和比例。此外， 除了穩定性以外，在制備液體抗體制劑時必須納入其他考慮。此等其他考慮的實例包括溶 液的粘度和特定制劑所能包含的抗體濃度，以及制劑的視覺質量或訴求。因此，在配制治療 性抗體時，必須非常小心以獲得這樣的制劑，其保持穩定、含有適當濃度的抗體，以及具有 適當粘度以及其他能夠使制劑方便地給藥至患者的特性。
[0008] 針對D114的抗體是需要適當配制的治療相關大分子的一個實例。盡管已知一些 抗-D114抗體，但本領域中對于含有足夠穩定且適于給藥至患者的抗-D114抗體的新藥物 制劑仍存在有需要。


【發明內容】

[0009] 本發明通過提供含有特異性地結合至人類A樣配體4(D114)的人抗體的藥物制 劑來滿足上述需求。
[0010] 本發明的一個方面提供一種液體藥物制劑，其包含：Q)特異性地結合至D114的 抗體；（ii)緩沖液；（iii)有機共溶劑；以及（iv)熱穩定劑。
[0011] 在一個實施方案中，抗體以約20±3mg/mL至約75±11. 25mg/mL的濃度提供。在 另一個實施方案中，抗體以約25mg/mL±3. 75mg/mL的濃度提供。在另一個實施方案中，抗 體以約50mg/mL±7. 5mg/mL的濃度提供。
[0012] 在一個實施方案中，本發明的示例性抗-D114抗體包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、 LCDRULCDR2及LCDR3結構域，其各自具有氨基酸序列SEQ ID N0:2、3、4、6、7及8(例如 REGN421)。在一個實施方案中，該抗體含有包含在具有氨基酸序列SEQ ID NO: 1的HCVR和 具有氨基酸序列SEQ ID NO: 5的LCVR的⑶R序列中。
[0013] 在一個實施方案中，液體制劑的pH為約pH 5.0至約pH 6.6 ;pH 6. 0±0. 5、pH 6. 0±0. 4、pH 6. 0±0. 3、pH 6. 0±0. 2、pH 6. 0±0. 1、pH 6. 0±0. 05、pH 6. 0±0. 01，或 pH 6.0。在一個特定實施方案中，液體制劑的pH為約pH 6.0±0.5。在一個實施方案中，緩沖 液具有約pH 5. 8至約pH 8. 0 ;或約pH 6. 0至約7. 5的有效緩沖范圍。在一個實施方案中， 緩沖液具有約6. 0至約7. 5的pKa。在一個實施方案中，緩沖液具有6. 0的pKa。在一個實 施方案中，緩沖液具有6.4的pKa。在一個實施方案中，緩沖液具有6.5的pKa。在一個實 施方案中，緩沖液具有7. 2的pKa。
[0014] 在一個實施方案中，緩沖液為磷酸鹽緩沖液。在一個實施方案中，磷酸鹽濃度為 5mM±0. 75mM至50mM±7. 5mM。在一個實施方案中，磷酸鹽濃度為5mM±0. 75mM或約5mM。 在一個實施方案中，磷酸鹽濃度為10mM±l. 5mM或約10mM。在一個實施方案中，磷酸鹽濃度 為15mM±2. 25mM或約15mM。在一個實施方案中，磷酸鹽濃度為20mM±3mM或約20mM。在 一個實施方案中，磷酸鹽濃度為25mM±3. 75mM或約25mM。在一個實施方案中，磷酸鹽濃度 為30mM±4. 5mM或約30mM。在一個實施方案中，磷酸鹽濃度為35mM±5. 25mM或約35mM。在 一個實施方案中，磷酸鹽濃度為40mM±6mM或約40mM。在一個實施方案中，磷酸鹽濃度為 45mM±6. 75mM或約45mM。在一個實施方案中，磷酸鹽濃度為50mM±7. 5mM或約50mM。
[0015] 在一個實施方案中，有機共溶劑為含有聚氧乙烯部分的非離子性聚合物。在一些 實施方案中，有機共溶劑為聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、帕洛沙姆188及聚乙二醇3350 中的任一者或多者。在一個特定實施方案中，有機共溶劑為聚山梨醇酯20。
[0016] 在一個實施方案中，有機共溶劑濃度為約0.005 % ±0.00075 %至約1 % ±0. 15% "重量比體積"或" w/v"，其中，例如0? lg/ml = 10%而0? 01g/ml = 1 %。在一個 實施方案中，有機共溶劑為聚山梨醇酯20,其濃度為0. 2 % ±0. 03% w/v，或約0. 2 % w/v。 在另一個實施方案中，有機共溶劑為聚山梨醇酯20,其濃度為0.01% ±0.0015% w/v或約 0. 01 % w/v〇
[0017] 在一個實施方案中，穩定劑為糖、鹽、氨基酸，或其任一或多者的組合。在一個實施 方案中，糖選自蔗糖、山梨醇、甘露醇、甘油和海藻糖；鹽為氯化鈉；而氨基酸為甘氨酸。在 一個實施方案中，穩定劑包含蔗糖與氯化鈉的組合。
[0018] 在一個實施方案中，鹿糖濃度為約5 %至約40 %, w/v ;且氯化鈉為約50mM至 約250mM。在一個特定實施方案中，制劑包含10% ±1.5 %、約10%，或10%蔗糖；以及 150mM±22. 5mM、約150mM，或150mM氯化鈉。在另一個實施方案中，制劑包含20% ±3%，約 20%或20%鹿糖。
[0019] 在一個實施方案中，制劑的粘度為約1厘泊至約5厘泊。在一個實施方案中，制劑 的粘度為1. 5厘泊±0. 23厘泊，或約1. 5厘泊或1. 5厘泊。
[0020] 在一個實施方案中，制劑的重量克分子滲透壓濃度（osmolality)接近或在生理 范圍內。在一個實施方案中，制劑具有約300滲透壓毫克分子/kg (mOsm)至約700m0sm的滲 透壓。在一個實施方案中，制劑的重量克分子滲透壓濃度為650m0sm±98m0sm，約650m0sm 或 650m0sm。
[0021] 在一個實施方案中，至少95%的由-80°C下儲存24個月后的液體藥物制劑回收而 來的抗-D114抗體是非團聚且未降解的，如通過尺寸排阻色譜所測定。在一個實施方案中， 至少57%的由-80°C下儲存24個月后的液體藥物制劑回收而來的抗-D114抗體是非堿性 及非酸性形式（亦即，主峰或主要電荷形式或"區2峰"），如通過離子交換色譜所測定。在 一個實施方案中，相對于儲存前的抗體結合活性，在_80°C下儲存24個月后，抗-Dl 14平均 維持其結合活性約65 %至約135%。
[0022] 在一個實施方案中，至少95%的由_30°C下儲存18個月后的液體藥物制劑回收而 來的抗-D114抗體是非團聚且未降解的，如通過尺寸排阻色譜所測定。在一個實施方案中， 至少57%的由-30°C下儲存18個月后的液體藥物制劑回收而來的抗-D114抗體是主要電 荷形式，如通過離子交換色譜所測定。在一個實施方案中，相對于儲存前的抗體結合活性， 在-30°C下儲存18個月后，抗-D114抗體平均維持其結合活性約65%至約135%。
[0023] 在一個實施方案中，至少95%的由-20°C下儲存6個月后的液體藥物制劑回收而 來的抗-D114抗體是非團聚且未降解的，如通過尺寸排阻色譜所測定。在一個實施方案中， 至少60%的由-20°C下儲存6個月后的該液體藥物制劑回收而來的抗-D114抗體是主要電 荷形式，如通過離子交換色譜所測定。在一個實施方案中，相對于儲存前的抗體結合活性， 在-20°C下儲存6個月后，抗-D114抗體平均維持其結合活性約65%至約135%。
[0024] 在一個實施方案中，至少95%的由5°C下儲存6個月后的液體藥物制劑回收而來 的抗-D114抗體是非團聚且未降解的，如通過尺寸排阻色譜所測定。在一個實施方案中，至 少61 %的由5°C下儲存6個月后的液體藥物制劑回收而來的抗-D114抗體是主要電荷形 式，如通過離子交換色譜所測定。在一個實施方案中，相對于儲存前的抗體結合活性，在5°C 下儲存6個月后，抗-D114抗體平均維持其結合活性約65 %至約135%。
[0025] 在一個實施方案中，至少97%的由25°C下熱脅迫（thermal stress)6個月后的 液體藥物制劑回收而來的抗-D114抗體是非團聚且未降解的，如通過尺寸排阻色譜所測 定。在一個實施方案中，至少53 %的由25°C下儲存6個月后的液體藥物制劑回收而來的 抗-Dl 14抗體是主要電荷形式，如通過離子交換色譜所測定。在一個實施方案中，相對于儲 存前的抗體結合活性，于25°C下儲存6個月后，抗-D114抗體平均維持其結合活性約65% 至約135%。
[0026] 在一個實施方案中，至少94%的由45°C下熱脅迫28天后的液體藥物制劑回收而 來的抗-D114抗體是非團聚且未降解的，如通過尺寸排阻色譜所測定。在一個實施方案中， 至少45%的由45°C下熱脅迫28天后的液體藥物制劑回收而來的抗-D114抗體是主要電荷 形式，如通過離子交換色譜所測定。在一個實施方案中，相對于施加熱脅迫條件前的抗體結 合活性，于45°C下熱脅迫28天后，抗-Dl 14抗體平均維持其結合活性約65 %至約135%。
[0027] 在一個實施方案中，至少96%的由37°C下熱脅迫28天后的液體藥物制劑回收而 來的抗-D114抗體是非團聚且未降解的，如通過尺寸排阻色譜所測定。在一個實施方案中， 至少51 %的由37°C下熱脅迫28天后的液體藥物制劑回收而來的抗-D114抗體是主要電荷 形式，如通過離子交換色譜所測定。在一個實施方案中，相對于施加熱脅迫條件前的抗體結 合活性，于37°C下熱脅迫28天后，抗-Dl 14抗體平均維持其結合活性約65 %至約135%。
[0028] 在一個實施方案中，至少97%的由25°C下熱脅迫28天后的液體藥物制劑回收而 來的抗-D114抗體是非團聚且未降解的，如通過尺寸排阻色譜所測定。在一個實施方案中， 至少57%的由25°C下熱脅迫28天后的液體藥物制劑回收而來的抗-D114抗體是主要電荷 形式，如通過離子交換色譜所測定。在一個實施方案中，相對于施加熱脅迫條件前的抗體結 合活性，于25°C下熱脅迫28天后，抗-Dl 14抗體平均維持其結合活性約65 %至約135%。
[0029] 在一個實施方案中，至少98%的由振蕩脅迫（agitation stress)下120分鐘后 的液體藥物制劑回收而來的抗-D114抗體是非團聚且未降解的，如通過尺寸排阻色譜所測 定。在一個實施方案中，至少59%的由振蕩脅迫120分鐘后的液體藥物制劑回收而來的 抗-Dl 14抗體是主要電荷形式，如通過離子交換色譜所測定。在一個實施方案中，相對于施 加振蕩脅迫條件前的抗體結合活性，于振蕩脅迫120分鐘后，抗-D114抗體平均維持其結合 活性約65 %至約135%。
[0030] 在一個實施方案中，至少98%的由八個冷凍/解凍循環后的液體藥物制劑回收而 來的抗-D114抗體是非團聚且未降解的，如通過尺寸排阻色譜所測定。在一個實施方案中， 至少58%的由八個冷凍/解凍循環后的液體藥物制劑回收而來的抗-D114抗體是主要電 荷形式，如通過離子交換色譜所測定。在一個實施方案中，相對于施加冷凍/解凍條件前的 抗體結合活性，于八個冷凍/解凍循環后，抗-D114抗體平均維持其結合活性約65%至約 135%。
[0031] 本發明的另一個方面提供一種液體藥物制劑，其包含：⑴20±3mg/ml至 75±11. 25mg/ml 特異性地結合至人 D114 的人抗體；（ii)5mM±〇. 75mM 至 50mM±7. 5mM 磷酸鹽；005 % ±0. 000075 % 至 I % ±0. 15 % (w/v)聚山梨醇酯 20 ;(iv)5 % ±0. 75 % 至 40 % ±6 % (w/v)蔗糖；以及（v)50mM±7. 5mM 至 250mM±37. 5mM 氯化鈉， pH為約5. 5至約6. 5。此方面的抗-D114抗體含有重鏈可變區（HCVR)以及輕鏈可變 區（LCVR)，以使得HCVR/LCVR組合含有重鏈與輕鏈互補決定區（HCDR1-HCDR2-HCDR3/ 1^0?1-10)1?2-10)1?3)，其分別具有5￡〇10勵：2-3-4/5￡〇10勵：6-7-8的氨基酸序列。在一 個特定實施方案中，抗-D114抗體含有重鏈可變區（HCVR)以及輕鏈可變區（LCVR)，其分別 包括SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :5的氨基酸序列（美國專利第7, 488, 806號、第7, 534, 868 號及第7, 919, 593號，與美國專利申請公開US 2011-0150905的抗體REGN421)。
[0032] 在一個實施方案中，液體制劑含有⑴25mg/mL± 3. 75mg/mL的抗體REGN421 ; (ii)10±l. 5mM 磷酸鹽；2% ±0. 03% (w/v)聚山梨醇酯 20 ;(iv)10% ±1. 5% (w/v)蔗糖；以及（v)150mM±22. 5mM氯化鈉，pH為6. 0±0. 5。在一個實施方案中，制劑于 45°C下28天的熱脅迫后，> 94%的抗體維持天然構型，> 45%的抗體為主要電荷形式，且 > 98%的抗體維持其結合活性。在另一個實施方案中，制劑于37°C下28天的熱脅迫后， > 97%的抗體為天然的，> 59%的抗體為主要電荷形式，且約100%的抗體維持其結合活 性。在一個實施方案中，制劑于25 °C下28天的熱脅迫后，> 97 %的抗體為天然的，> 57 %的 抗體為主要電荷形式，且約100%的抗體維持其結合活性。在一個具體制劑的實施方案中， 制劑于八個冷凍隨后解凍的循環后，> 98%的抗體為天然的，> 59%的抗體為主要電荷形 式，且約100%的抗體維持其結合活性。在本具體制劑的一個實施方案中，于120分鐘振蕩 脅迫后，彡98%的抗體為天然的，彡58%的抗體為主要電荷形式，且至少約98%的抗體維 持其效力。
[0033] 在本發明的一個方面中，任一前述方面的液體藥物制劑在容器中提供。在一個實 施方案中，容器為聚碳酸酯小瓶。在另一個實施方案中，容器為玻璃小瓶，其在一些實施方 案中為1型硼硅酸玻璃小瓶，具有涂覆氟碳化物的丁基橡膠瓶塞。在又另一個實施方案中， 容器為袋，諸如靜脈內滴注（IV)袋，其在一些實施方案中是由聚氯乙烯或聚烯烴制成。在 另一個實施方案中，容器為注射裝置，諸如微輸注器或注射器。
[0034] 本發明的一個方面提供一種含有下列的藥物制劑：(a)25mg/mL±3. 75mg/mL的 抗-Ang-2 抗體、（b) 10mM±L 5mM 磷酸鹽，pH 6. 0±0. 5、（c)0. 2% ±0. 03% 聚山梨醇酯 20、 ((1)10%?八±1.5%蔗糖，以及（6)15〇1111±22.51111氯化鈉，其中（&)該抗體含有5￡〇10吣：1的HCVD以及SEQ ID NO :5的LCVD、（b)抗體具有約146kDa、約147kDa或約150kDa的分 子量、（c)約82%至約87%的抗體含巖藻糖基化的寡糖鏈，及（d)抗體的重鏈缺少C端賴 氨酸。
[0035] 在一個實施方案中，提供一種由下列組成的藥物制劑：（a) 25mg/mL±3. 75mg/mL 的抗-Ang-2 抗體、（b)10mM±1.5mM 磷酸鹽，pH 6. 0±0. 5、（c)0. 2% ±0. 03%聚山梨醇酯 20、（(1)10%￥八±1.5%蔗糖，以及（6)15〇1111±22.51111氯化鈉，其中（&)該抗體含有5￡〇10 NO :1 的 HCVD 以及 SEQ ID NO :5 的 LCVD、（b)抗體具有約 146kDa、約 147kDa 或約 150kDa 的 分子量、（c)約82%至約87%的抗體含巖藻糖基化的寡糖鏈，及（d)抗體的重鏈缺少C端 賴氨酸。
[0036] 本發明的一個方面提供一種藥盒，其含有前述方面中任一者的藥物組合物、容器 以及使用說明。在一個實施方案中，容器為預充填注射器。在一個實施方案中，容器為硼硅 酸小瓶，配有涂覆FLUR0TEC的4023/50的橡膠瓶塞。
[0037] 本發明的其他實施方案將透過參閱之后的詳細說明而清楚明了。 具體實施方案
[0038] 在說明本發明前，應了解，本發明不受限于所述的特定方法及實驗條件，因為該等 方法以及條件可能會改變。亦應了解，本文所用術語僅是供說明特定實施方案之用，而不意 欲為限制性的，因為本發明的范圍將僅受到隨附申請專利范圍所囿限。
[0039] 除非另有定義，否則本文所用全部技術與科學術語與本發明所屬領域的本領域技 術人員所理解的意思相同。如本文所用，術語"約"，當提及特定引用的數值或數值范圍時， 表示該數值可相對于引用的數值改變不超過5%。例如，如本文所用，表述"約100"包括95 與 105,以及其間的所有數值（例如 95. 00、95. 01、95. 02、95. 03、95. 04…104. 96、104. 97、 104. 98、104. 99、105. 00)。
[0040] 盡管任何與本文所述方法和材料類似或等效者可用于實施或測試本發明，現將說 明較佳方法與材料。
[0041] 藥物制劑
[0042] 如本文所用，表述"藥物制劑"意指至少一種活性成分（例如小分子、大分子、化 合物等，其能夠在人類或非人類動物體內展現生物效用）以及至少一種非活性成分（其與 活性成分或一或多種其他非活性成分組合時，適于治療性給藥至人類或非人類動物）的組 合。除非另有具體指明，否則本文中使用的術語"制劑"表示"藥物制劑"。本發明提供包含至 少一種治療性多肽的藥物制劑。依據本發明的某些實施方案，該治療性多肽為抗體或其抗 原-結合片段，其特異性地結合至人類A樣配體-4(D114)蛋白。更具體而言，本發明包括 含有下列的藥物制劑：（i)特異性地結合至人類Dl 14的人抗體；（ii)磷酸鹽緩沖液；（iii) 有機共溶劑，其為非離子性表面活性劑；以及（iv)穩定劑，其為碳水化合物或無機鹽，或碳 水化合物與無機鹽的組合。本發明所包括的特定示例性組分與制劑詳述于下文。
[0043] 特異性地結合至D114的抗體
[0044] 本發明藥物制劑可包含特異性地結合至人D114的人抗體或其抗原-結合片段。如 本文所用，術語"D114"表示人A樣配體4,其為Notch的血管特異性配體。D114-Notch信 號通路一般理解為通過阻斷血管分支并促進血管成熟來調控血管生成（D114作為分支的 負向調節劑；在Sainsin and Harris, Trends in Molecular Medicine, Vol. 13(9) :389-39 5, S印.2007中綜述）。拮抗D114-Notch路徑的藥劑已顯示會通過"引起過度但非功能性血 管生成"抑制腫瘤生長速率（參見Sainsin文獻389頁）。D114被VEGF上調節，并被認為 會促進功能性新血管的組織化發展。示例性的人D114氨基酸序列描述于SEQ ID NO :9中。 針對人D114的抗體描述于專利第7, 488, 806號、第7, 534, 868號及第7, 919, 593號中。
[0045] 本文所用的術語〃抗體〃通常欲意指免疫球蛋白分子，其含有4個多肽鏈：通過二 硫鍵相互連結的2個重（H)鏈以及2個輕（L)鏈，及其多聚體（例如IgM);然而，僅由重鏈 所構成的免疫球蛋白分子（亦即缺乏輕鏈）也含括在術語〃抗體〃的定義內。各個重鏈含 有一個重鏈可變區（此處縮寫為HCVR或Vh)以及一個重鏈恒定區。重鏈恒定區含有三個結 構域，CH1、CH2以及CH3。各個輕鏈含有一個輕鏈可變區（此處縮寫為LCVR或VJ以及一個 輕鏈恒定區。輕鏈恒定區含有一個結構域（CLl)。Vh與'區可進一步分為具有超變異性的 區域（稱作互補決定區（CDR))，其與較為保守的區域（命名為骨架區（FR))交替分布。各 個Vh與 '由三個⑶R以及四個FR所構成，以下列順序從氨基端往羧基端排列：FR1、⑶R1、 FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
[0046] 除非另有特別指明，否則術語〃抗體〃，如本文所用，應理解為含括完整抗體分子 以及其抗原-結合片段。抗體中的〃抗原-結合部分〃或〃抗原-結合片段"（或簡稱〃 抗體部分"或"抗體片段"），如本文所用，意指抗體的一或多個片段，其保有特異性地結合 至人D114或其抗原決定位的能力。
[0047] 如本文所用的術語"分離抗體"欲意指基本上不含具有不同抗原特異性的其他抗 體的抗體（例如，一個特異性地結合人D114的分離抗體基本上不含特異性地結合人D114 以外的抗原的抗體），其中要注意的例外為一方面特異性地結合D114,而另一方面結合另 一抗原決定位的雙特異性（或多特異性）抗體。此外，分離抗體可以基本上不含其他細胞 物質或化學物質。
[0048] 術語〃特異性地結合〃或類似術語意指抗體或其抗原-結合片段與抗原形成在生 理條件下相對穩定的復合物。特異性地結合的特征在于解離常數為至少約IXKT6M或更 高。用于測定兩個分子是否特異性地結合的方法為本領域中已知的，且包括例如平衡透析、 表面等離子共振及類似方法。但是，特異性地結合人D114的分離抗體與其他抗原（諸如其 他物種的D114分子（同源物））具有交叉反應性。在本發明的上下文中，結合至人D114以 及一種或多種其他抗原的多特異性（例如雙特異性）抗體被視為"特異性地結合"人D114。
[0049] 可含括在本發明藥物制劑中的示例性抗-人Dl 14抗體述于美國專利第7, 488, 806 號、第7, 534, 868號、第7, 919, 593號及美國專利申請US2011-0150905號中。
[0050] 依據本發明的某些實施方案，抗-人D114抗體為含有重鏈可變區（為 IGHV3-33.01亞型）以及輕鏈可變區（為IGKV3-11.01亞型）的人IgGl (參見Barbie and Lefranc, The Human Immunoglobulin Kappa Variable (IGKV) Genes and Joining (IGKJ) Segments,Exp.Clin. Immunogenet. 1998 ；15:171-183 ； 與 Scaviner, D. et al. , Protein Displays of the Human Immunoglobulin Heavy, Kappa and Lambda Variable and Joining Regions, Exp. Clin. Immunogenet.，1999 ; 16:234-240)。本文中出現的種系 IGHV3-33與IGKV3-11序列，以及氨基酸位置分派數與國際免疫遺傳學（MGT)信息系 統一致，如 Lefranc, M.-P.，et al.，IMGT1?，the international ImMunoGeneTics information system'?, Nucl. Acids Res, 37, D1006-D1012 (2009)中所述。
[0051] 在一些實施方案中，抗-人D114抗體在一個或多個骨架區相對于正統重鏈可變區 含有一或多個氨基酸置換，合理預期造成抗體整個露出表面的電荷分布改變，并因此影響 其與周圍溶劑和賦形劑的相互作用。在一些實施方案中，氨基酸置換包含分別在IGHV3-33 的MGT位置54、86及90處絲氨酸被置換為丙氨酸、甲硫氨酸被置換為蘇胺酸，及/或谷氨 酸被置換為谷氨酰胺。
[0052] 在一些實施方案中，抗-人D114抗體在一個或多個⑶R中相對于正統輕鏈可變區 含有一個或多個氨基酸置換，合理預期造成抗體整個露出表面的電荷分布改變，并因此影 響其與溶劑環境的相互作用。在一些實施方案中，氨基酸置換包含在IGKV3-11的MGT位 置106處的組氨酸置換谷氨酰胺。
[0053] 依據本發明的一些實施方案，抗-人D114抗體或其抗原-結合片段包含SEQ ID NO :2 的重鏈互補決定區（HCDR) 1、SEQ ID NO :3 的 HCDR2 及 SEQ ID NO :4 的 HCDR3。在某 些實施方案中，抗-人Dl 14抗體或其抗原-結合片段包含SEQ ID NO :1的HCVD。
[0054] 依據本發明的一些實施方案，抗-人D114抗體或其抗原-結合片段包含SEQ ID NO :6 的輕（K )鏈互補決定區（LCDR) 1、SEQ ID NO :7 的 LCDR2 和 SEQ ID NO :8 的 LCDR3。 在一些實施方案中，抗-人Dl 14抗體或其抗原-結合片段包含SEQ ID NO :5的LCVD。
[0055] 本文實施例中所用非限制性示例性抗體被稱作REGN421，如在US7, 488, 806、 舊 7,534,868、舊 7,919,593 及舊 2011-0150905 中。該抗體包含11〇^/1〇^氨基酸 序列對，其具有 SEQ ID NO: 1/5,及由 SEQ ID NO :2-3-4/SEQ ID NO :6-7-8 所表示的 HCDR1-HCDR2-HCDR3/LCDR1-LCDR2-LCDR3 結構域。
[0056] 本發明藥物制劑中所包含的抗體或其抗原-結合片段的量可隨著制劑所要的 特定特性以及特定環境與要使用制劑的目的而改變。在某些實施方案中，藥物制劑為液 體制劑，其可含有 20mg/mL±3mg/mL 至 75mg/mL± 11. 25mg/mL 抗體；25±3. 75mg/mL 至 70± 10. 5mg/mL 抗體；30±4. 5mg/mL 至 65±9. 75mg/mL 抗體；35±5. 25mg/mL 至 60±9mg/ mL 抗體；40±6mg/mL 至 55±8. 25mg/mL 抗體；45±6. 75mg/mL 至 50±7. 5mg/mL 抗體；25mg/ mL±3. 75mg/mL ;約 25mg/mL ;25mg/mL ;50mg/mL±7. 5mg/mL ;約 50mg/mL ;或 50mg/mL 的特異 性地結合至人D114的抗體或其抗原-結合片段。
[0057] 賦形劑與pH
[0058] 本發明藥物制劑包含一種或多種賦形劑。如本文所用的術語"賦形劑"意指任一 種被添加至制劑以提供所要稠度、粘度或穩定效用的非治療劑。
[0059] 在一些實施方案中，本發明藥物制劑包含至少一種其類型和數量在粗略操作或振 蕩（諸如渦旋）的條件下使人D114抗體穩定的有機共溶劑。在一些實施方案中，"穩定" 表示在粗略操作過程中維持D114抗體的至95%呈其天然狀態（亦即未斷裂或團聚），粗略 操例如為渦旋抗體-有機共溶劑的溶液約60分鐘或約120分鐘。
[0060] 在某些實施方案中，有機共溶劑為非離子性表面活性劑，諸如烷基聚（氧化乙 烯）。可包括在本發明制劑中的具體非離子性表面活性劑包括，例如聚山梨醇酯，諸如聚山 梨醇酯20、聚山梨醇酯28、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯65、聚山梨醇酯80、 聚山梨醇酯81及聚山梨醇酯85 ;帕洛沙姆，諸如帕洛沙姆181、帕洛沙姆188、帕洛沙姆 407 ;或聚乙二醇（PEG)。聚山梨醇酯20也被稱作TWEEN 20、山梨醇單月桂酸酯及聚氧乙烯 脫水山梨醇單月桂酯。帕洛沙姆188也被稱作PLURONIC F68。
[0061] 本發明藥物制劑中所含的非離子性表面活性劑的量可隨制劑所需的特定特 性，以及要使用制劑的特定環境和目的而改變。在某些實施方案中，制劑可含有〇. 01 % ±0. 0015%至1% ±0. 15%的表面活性劑。例如，本發明制劑可含有約0. 0085%;約0. 01%; 約 0. 02% ;約 0. 03% ;約 0. 04% ;約 0. 05% ;約 0. 06% ;約 0. 07% ;約 0. 08% ;約 0. 09% ; 約 0? 1% ;約 0? 11% ;約 0? 12% ;約 0? 13% ;約 0? 14% ;約 0? 15% ;約 0? 16% ;約 0? 17% ; 約 0. 18% ;約 0. 19% ;約 0. 20% ;約 0. 21% ;約 0. 22% ;約 0. 23% ;約 0. 24% ;約 0. 25% ; 約 0. 3% ;約 0. 4% ;約 0. 5% ;約 0. 6% ;約 0. 7% ;約 0. 8% ;約 0. 9%、約 1% ;約 1. 1% ;約 1. 15% :或約1. 2%的聚山梨醇酯20或帕洛沙姆188。
[0062] 本發明的藥物制劑亦可包含一種或多種其類型及數量在熱脅迫條件下穩定人 D114抗體的穩定劑。在一些實施方案中，"穩定"表示當含有抗體及熱穩定劑的溶液在約 45°C下保存最高達約28天時，超過約94%的抗體維持其天然構形。在一些實施方案中，〃 穩定〃表示當含有抗體及熱穩定劑的溶液在約37°C下保存最高達約28天時，超過約96% 的抗體維持其天然構形。如本文所用，"天然"表示通過尺寸排阻法確定的主要抗體形式， 其通常為抗體的完整單體。
[0063] 在某些實施方案中，熱穩定劑為糖或糖醇，選自蔗糖、山梨醇、甘油、海藻糖及甘露 醇或其任何組合，其在制劑中所含的量可隨著特定環境及要使用制劑的目的而改變。在某 些實施方案中，制劑可含有約5 %至約40 %的糖或糖醇；約1 %至約20 %糖或糖醇；約5% 至約15%糖或糖醇；約7. 5%至約12. 5%糖或糖醇；約10%糖或糖醇；約10% ±1. 5%糖 或糖醇；或10%糖或糖醇。例如，本發明藥物制劑可含有4% ±0.6% ;5% ±0.75% ;6% ±0.9% ;7% ±1.05% ;8% ±1.2% ;9% ±1.35% ;10% ±1.5% ;11% ±1.65% ;12% ±1.8% ;13% ±1.95% ;或約14% ±2. 1%糖或糖醇（例如，蔗糖、海藻糖或甘露醇）。 [0064] 本發明的藥物制劑亦可含有緩沖液或緩沖體系，其用于維持穩定的pH并有助于 穩定人D114抗體。在一些實施方案中，〃穩定〃表示當含有抗體及緩沖液的溶液在45°C 下保存最高達約28天時，至少94%抗體呈由尺寸排阻色譜所測定的自然構型。〃天然〃或 〃天然構型〃表示未團聚或降解的抗體級分。這通常是通過測量抗體實體的相對大小的分 析（諸如尺寸排排阻色譜分析）來決定。非團聚及非分解抗體在與天然抗體相同的級分處 洗脫出來，且通常是主要洗脫級分。團聚抗體在表示尺寸大于天然抗體的級分處洗脫出來。 分解抗體在表示尺寸小于天然抗體的級分處洗脫出來。
[0065] 在一些實施方案中，〃穩定〃表示當含有抗體及緩沖液的溶液在45°C下級分約28 天時，至少45%的抗體呈其由陽離子交換色譜所測定的主要電荷形式。〃主要電荷〃或〃 主要電荷形式"表示從離子交換樹脂洗脫出來的主峰中的抗體級分，其通常一側為更"堿 性〃峰而另一側為更〃酸性〃峰。
[0066] 本發明藥物制劑可具有約5. 5至約6. 5的pH。例如，本發明制劑具有約5. 5 ;約 5. 6 ;約 5. 7 ;約 5. 8 ;約 5. 9 ;約 6. 0 ;約 6. 1 ;約 6. 2 ;約 6. 3 ;約 6. 4 ;或約 6. 5 的 pH。在一 些實施方案中，pH 為 6. 0±0. 5 ;6. 0±0. 4 ;6. 0±0. 3 ;6. 0±0. 2 ;6. 0±0. 1 ;約 6. 0 ;或 6. 0。 [0067] 在一些實施方案中，緩沖液或緩沖體系包含至少一種其緩沖范圍完全或部分與pH 5. 5-7. 4重疊的緩沖液，諸如，例如具有可用緩沖范圍pH 4. 8至pH 8. 8的緩沖液。在一個實 施方案中，緩沖液具有約7. 21的pKa。在某些實施方案中，緩沖液包括磷酸鹽緩沖液。在一 些實施方案中，磷酸鹽以 5mM±〇. 75mM 至 15mM±2. 25mM ;6mM±〇. 9mM 至 14mM±2. ImM ; 7mM±1.05mM 至 13mM±1.95mM;8mM±1.2mM 至 12mM±1.8mM;9mM±1.35mM 至 llmM±l. 65mM ;10mM±l. 5mM ;或約IOmM的濃度存在。在一些實施方案中，緩沖體系包含 10mM±L 5mM，pH 為 6. 0±0. 5 的磷酸鹽。
[0068] 示例性制劑
[0069] 依據本發明的一個方面，液體制劑具有低粘度（即少于10厘泊或約1. 5厘泊）且 重量克分子滲透壓濃度介于600至700m0sm或約650m0sm)，且含有：（i) 25mg/mL±3. 75mg/ mL,或50mg/mL±7.5mg/mL特異性地結合至人D114的人抗體（例如REGN421) ;(ii)緩沖體 系，在約pH 6. 0±0. 5下緩沖；（iii)包含糖及鹽的熱穩定劑，其作為；以及（iv)有機共溶 劑。
[0070] 依據一個實施方案，藥物制劑包含：⑴20±3mg/mL至60±9mg/mL特異性地結合 至人D114的人IgGl抗體，且其含有經置換的IGHV3-33型重鏈可變區及經置換的IGKV3-11 型輕鏈可變區；（ii)磷酸鹽緩沖液，其在pH 6. 0±0. 5緩沖；（iii)蔗糖與氯化鈉；及（iv) 非離子清潔劑，諸如聚山梨醇酯。
[0071] 依據一個實施方案，藥物制劑包含：（i)25mg/mL±3.75mg/mL特異性地結合至 人 D114 的人 IgGl 抗體，且其具有 SEQ ID NO :2 的 HCDR1、SEQ ID NO :3 的 HCDR2、SEQ ID NO :4 的 HCDR3、SEQ ID NO :6 的 LCDR1、SEQ ID NO :7 的 LCDR2 及 SEQ ID NO :8 的 LCDR3 ; (ii)10mM±1.5mM 磷酸鹽，pH 6.0±0.5 ;(iii)10% ±1.5%蔗糖；（iv)150mM±22.5mM 氯化鈉；以及（v)0. 2% ±0. 03%聚山梨醇酯20。
[0072] 依據一個實施方案，藥物制劑包含：（i)50mg/mL±7. 5mg/mL特異性地結合至人 D114 的人 IgGl 抗體，且其具有 SEQ ID N0:2 的 HCDR1、SEQ ID N0:3 的 HCDR2、SEQ ID NO :4 的 HCDR3、SEQ ID NO :6 的 LCDR1、SEQ ID NO :7 的 LCDR2 及 SEQ ID NO :8 的 LCDR3 ; (ii)10mM±1.5mM 磷酸鹽，pH 6.0±0.5 ;(iii)10% ±1.5%蔗糖；（iv)150mM±22.5mM 氯化鈉；以及（v)0. 2% ±0.03%聚山梨醇酯20。
[0073] 依據一個實施方案，藥物制劑包含：（i)25mg/mL±3.75mg/mL特異性地結合至 人D114的人IgGl抗體，且其具有SEQ ID NO: 1的重鏈可變域，與SEQ ID NO :5的輕鏈 可變域，濃度為；出）1〇11^±1.511^磷酸鹽，？116.0±0.5;出1)10%±1.5%蔗糖 ；(iv)150mM±22.5mM 氯化鈉；以及（v)0.2% ±0.03% 聚山梨醇酯 20。
[0074] 依據一個實施方案，藥物制劑包含：⑴50mg/mL±7.5mg/mL特異性地結合至人 D114的人IgGl抗體，且其具有SEQ ID NO :1的重鏈可變域，與SEQ ID NO :5的輕鏈可變域； (ii)10mM±1.5mM 磷酸鹽，pH 6.0±0.5 ;(iii)10% ±1.5%蔗糖；（iv)150mM±22.5mM 氯化鈉；以及（v)0. 2% ±0.03%聚山梨醇酯20。
[0075] 本發明所含括的藥物制劑的其他非限制性實例在本文他處說明，包括下文所示實 施例。
[0076] 藥物制劑的穩定性與粘度
[0077] 本發明藥物制劑通常表現出高度穩定性。如本文所用的術語"穩定"在提及藥物 制劑時，表示藥物制劑中的抗體在儲存于特定條件下之后保有可接受程度的化學結構或生 物功能。制劑可以是穩定的，盡管其中所含抗體在儲存特定時間總數之后并未維持其100% 化學結構或生物功能。在某些情況下，在儲存特定時間總數之后維持至少約 96%、97%、98%或99%的抗體結構或功能被認為是〃穩定"。
[0078] 穩定性尤其可于特定溫度下儲存特定時間總數之后通過測定制劑中剩余的天然 抗體百分率來決定。天然抗體的百分率尤其可以通過尺寸排阻色譜（例如尺寸排阻高效液 相色譜[SE-HPLC])來測定，天然表示非團聚者及非分解者。"可接受程度的穩定性"，當這 個詞組用于本文中時，表示至少90%的天然形式抗體可于特定溫度下儲存特定時間總數之 后在制劑中檢測到。在某些實施方案中，至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、 97%、98%、99(%或100(%的天然形式抗體可于特定溫度下儲存特定時間總數之后在制劑中 檢測到。在其后測量穩定性的特定時間總數可為至少14天、至少28天、至少1個月、至少 2個月、至少3個月、至少4個月、至少5個月、至少6個月、至少7個月、至少8個月、至少9 個月、至少10個月、至少11個月、至少12個月、至少18個月、至少24個月或更久。當評估 穩定性時，藥物制劑儲存的特定溫度可為下列的任一溫度：約_80°C至約45°C，例如儲存于 約-80°C下、約-30°C下、約-20°C下、約(TC下、約4°C -8°C下、約5°C下。熱脅迫包括，例如 維持制劑在約25°C下、約35°C下、約37°C下或約45°C下歷時約14天或約28天。
[0079] 例如，若在儲存于5°C下6個月之后，通過SE-HPLC檢測到至少90%、91%、92%、 93%、94%、95%、96%、97%、98%、98.5%、99%或99.5%天然抗體，則藥物制劑可被視為 是穩定的。若在儲存于25°C下6個月之后，通過SE-HPLC檢測到至少97%、97. 5%、98%、 98. 5%、99%或99. 5%天然抗體，則藥物制劑亦可被視為是穩定的。若在儲存于37°C下28 天之后，通過 SE-HPLC 檢測到至少 96%、96. 5%、97%、97. 5%、98%、98. 5%、99%或 99. 5% 天然抗體，則藥物制劑亦可被視為是穩定的。若在儲存于45°C下28天之后，通過SE-HPLC 檢測到至少94 %、95 %、96 %、97 %、98 %或99 %天然抗體，則藥物制劑亦可被視為是穩定 的。若在儲存于_20°C下6個月之后，通過SE-HPLC檢測到超過約98. 5%、99%或99. 5%天 然抗體，則藥物制劑亦可被視為是穩定的。若在儲存于-30°C下18個月之后，通過SE-HPLC 檢測到至少99%或99. 5%天然抗體，則藥物制劑亦可被視為是穩定的。在儲存于-80°C下 6個月之后，通過SE-HPLC檢測到至少99 %或99. 5 %天然抗體，則藥物制劑亦可被視為是穩 定的。
[0080] 穩定性尤其可通過測定抗體在離子交換期間相對于總合并峰面積移至抗體主要 級分（〃主要電荷部分）的百分率來測量，其中穩定性與呈主要電荷形式的抗體級分呈正 t匕。盡管不希望受到理論所囿限，抗體的去酰胺化可使得抗體變為更加帶負電并因而相對 于非去醜胺化抗體更為酸性（參見，例如Robinson, N.，Protein Deamidation, PNAS, April 16, 2002, 99 (8) : 5283-5288)。"可接受程度的穩定性"，當這個詞組用于本文中時，表示于 特定溫度下儲存特定時間總數之后在制劑中檢測到至少53%抗體呈主要電荷形式。在一 些實施方案中，可接受程度的穩定性表示于特定溫度下儲存特定時間總數，或在熱、冷凍/ 解凍或振蕩脅迫下至少約 53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、65%、 70 %、75 %、80 %、85 %、90 %、95 %或99 %抗體可檢測到呈主要電荷形式。其后測量穩定性 的特定時間總數可為至少2周、至少28天、至少1個月、至少2個月、至少3個月、至少4 個月、至少5個月、至少6個月、至少7個月、至少8個月、至少9個月、至少10個月、至少 11個月、至少12個月、至少18個月、至少24個月或更久。當評估穩定性時，儲存藥物制劑 的溫度可為約_80°C至約45°C的任一溫度，例如儲存于約-80°C下、約-30°C下、約-20°C 下、約(TC下、約4°C -8°C下、約5°C下、約25°C下、約37°C下或約45°C下。例如，若在儲存 于-80°C、_30°C或_20°C下3個月之后，不少于約57%、58%、59%、60%或61 %抗體呈主要 電荷形式，則藥物制劑可被視為是穩定的。若在儲存于5°C下6個月之后，不少于約59%、 59. 1 %,59. 2 %,59. 3 %,59. 4 %,59. 5 %,59. 6 %,59. 7 %,59. 8 %,59. 9 %,60 %,60. 1 %, 60. 2%、60. 3%、60. 4%、60. 5%、60. 6%、60. 7%、60. 8%、60. 9%、61%或 61. 1%抗體呈主 要電荷形式，則藥物制劑亦可被視為是穩定的。若在儲存于25°C下6個月后，不少于約53% 抗體呈主要電荷形式，則藥物制劑亦可被視為是穩定的。若在儲存于37°C下28天之后，不 少于約50%、50.5(%、51(%或51.5(%抗體呈主要電荷形式，則藥物制劑亦可被視為是穩定 的。若在儲存于45°C下28天之后，檢測到不少于約45%、45. 1%、45. 2%、45. 3%、45. 4%、 45. 5%、45. 6%、45. 7%、45. 8%、45. 9%或50%抗體呈主要電荷形式，則藥物制劑亦可被視 為是穩定的。
[0081] 測量抗體對其目標的結合親和力亦可用于評估穩定性。例如，若在儲存于例 如-80°〇、-301：、-201：、51：、251：、371：、451：等溫度下特定時間總數（例如14天至24個 月）之后，則制劑中所含抗-D114抗體維持該抗體儲存前的至少50%到至高約150%效力 (作為結合親和力測量），本發明制劑可被視為是穩定的。結合親和力可通過，例如ELISA或 等離子共振來測定。生物活性可通過D114活性分析（諸如，例如使表達D114的細胞與包 含抗D114抗體的制劑接觸）來測定。抗體至該細胞的結合可直接通過諸如，例如FACS分 析來測定。或者，DllVNotch信號通路的下游活性可在抗體存在時測量，并且與抗體不存 在時D114/Notch信號通路的活性相比較。在一些實施方案中，D114對細胞來說是內生性 的。在其他實施方案中，D114在細胞中異位（異源）地表達。
[0082] 用于評估制劑中的抗體穩定性的其他方法在下面所示實例中證實。
[0083] 容器及給藥方法
[0084] 本發明藥物制劑可包含在任何適于儲存或給藥藥品及其他治療性組合物的容器 中。例如，藥物制劑可包含在密封且滅菌的具有預定體積的塑料或玻璃容器中，例如小瓶、 安瓿、注射器、藥匣、瓶或IV袋中。不同類型的小瓶可用于容納本發明制劑，包括，例如透明 與不透明（例如琥珀色）玻璃或塑料小瓶。同樣地，任何類型的注射器可用于容納或給藥 本發明的藥物制劑。
[0085] 本發明藥物制劑可包含在〃標準鎢〃注射器或〃低鎢〃注射器中。如本領域技 術人員可以理解的，制造玻璃注射器的方法通常涉及使用熱鎢桿用來刺穿玻璃，從而由其 產生一個液體可被抽出并排出注射器的孔洞。此方法使微量鎢沉積在注射器的內表面上。 之后的洗滌與其他加工步驟可用于降低鎢在注射器中的數量。如本文所用，術語"標準鎢 〃表示注射器含有超過或等于500ppb (十億分之一份）的鎢。術語〃低鎢〃表示注射器含 有少于500ppb的鎢。例如，依據本發明，低鎢注射器可含有少于約490、480、470、460、450、 440、430、420、410、390、350、300、250、200、150、100、90、80、70、60、50、40、30、20、10 或更低 ppb的鶴。
[0086] 注射器中所使用的橡膠柱塞，以及用于密封小瓶開口的橡膠瓶塞可被涂層以防止 注射器或小瓶的醫藥內容物被污染，或維持其穩定性。因此，依據某些實施方案，本發明藥 物制劑可包含在具有涂覆柱塞注射器內，或在用涂覆橡膠瓶塞密封的小瓶內。例如，柱塞或 瓶蓋可涂覆有氟碳化物膜。適用于與含有本發明藥物制劑的小瓶及注射器一起使用的經涂 覆柱塞或瓶蓋的實例述于，例如美國專利第4, 997, 423號；第5, 908, 686號；第6, 286, 699 號；第6, 645, 635號及第7, 226, 554號。可用于本發明上下文的特定不例性經涂覆橡膠瓶 塞與柱塞可在商業上以商標名〃 FluroTec? 〃由West Pharmaceutical Services, Inc. (Li〇nville，PA)取得。FluroTec?是一種用于使藥品盡可能不附著于橡膠表面或防止藥 品附著于橡膠表面的氟碳化物涂層。
[0087] 依據本發明的某些實施方案，藥物制劑可包含于具有經氟碳化物涂覆的柱塞的低 鎢注射器內。
[0088] 藥物制劑可以通過非經腸途徑給藥至患者，諸如注射（例如皮下、靜脈 內、肌肉內、腹膜內等），或經皮、黏膜、鼻、肺或口服給藥。許多可重復使用筆型 或自動注射遞送裝置可用于皮下遞送本發明的藥物制劑。實例包括，但不限于 AUTOPEN?(Owen Mumford, Inc. , Woodstock, UK) > DISETRONIC? pen (Disetronic Medical Systems, Bergdorf, Switzerland), HUMAL0G MIX75/25? pen, HUMAL0G? pen, HUMALIN 70/30? pen(Eli Lilly and Co. ,Indianapolis, IN)、N0V0PEN? I、II 與 III(Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark)、N0V0PEN JUNIOR? (Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark)、 BD? pen(Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)、0PTIPEN?、0PTIPEN PRO?、0PTIPEN STARLET? 及 0PTICLIK?(sanofi-aventis，Frankfurt, Germany)。具有皮下遞送本發 明的藥物組合物的拋棄式筆型或自動注射遞送裝置的實例包括，但不限于S0L0STAR? pen (sanofi-aventis)、FLEXPEN?(Novo Nordisk)以及 KWIKPEN?(Eli Lilly)、SURECLICK? Autoinjector(Amgen, Thousand Oaks, CA) > PENLET?(Haselmeier, Stuttgart, Germany)> EPIPEN (Dey, L. P.)與 HUMIRA? Pen (Abbott Labs, Abbott Park, IL)。
[0089] 在本文中亦預期使用微輸注器（microinfusor)遞送本發明的藥物制劑。如本 文所用，術語〃微輸注器〃表示被設計成在一段長時間內（例如約1〇、15、20、25、30或 更多分鐘）緩慢地給藥大量（例如多達約2. 5mL或更多）治療性制劑的皮下遞送裝置。 參見，例如 U.S. 6, 629, 949 ;US 6, 659, 982 以及 Meehan et al.，J. Controlled Release 46:107-116(1996)。微輸注器尤其可用于遞送大劑量高濃度的治療性蛋白（例如，約100、 125、150、175、200或更多mg/mL)或黏性溶液。
[0090] 在一個實施方案中，藥物制劑是經IV滴注給藥，使得制劑稀釋于含有生理學上可 接受溶液中的IV袋中。在一個實施方案中，藥物組合物是位于靜脈內輸注袋內的復合無菌 制劑，使得單劑量藥品稀釋至100mL、250mL(或適于靜脈內滴注遞送的其他可行量）的生理 緩沖液（例如0.9%鹽水）中。在一些實施方案中，輸注袋是由聚氯乙烯（例如VIAFLEX， Baxter, Deerfield, Illinois)制成。在一些實施方案中，輸注袋是由聚烯烴（EXCEL IV Bags. Braun Medical Inc.，Bethlechem, Pennsylvania)制成。
[0091] 藥物制劑的治療用途
[0092] 本發明的藥物制劑尤其可用于治療、預防或改善與D114活性有關的任何疾病或 病癥，包括由D114或Notch信號通路所介導的疾病或病癥。可通過給藥本發明藥物制劑而 治療或預防的示例性、非限制性疾病與病癥包括各種涉及血管生成的疾病，而血管生成為 新血管形成的生物過程。異常的血管生成與數種疾病病況有關，包括（例如）增生性視網 膜病變、類風濕性關節炎與牛皮癬。另外，已證實血管生成對于腫瘤生長與維持至關重要。
[0093] 實施例
[0094] 提出下列實施例以向本領域技術人員提供對于如何制造與使用本發明方法和組 合物的完整的公開和描述，且不意欲限制發明人所認為的其發明的范圍。已盡力確保所用 數字的正確性（例如數量、溫度等），但應考慮一些實驗誤差與偏差。除非另有指明，否則份 數為以摩爾計的份數，分子量為平均分子量，濃度百分比表示以克計的溶質質量除以以毫 升計的溶液體積成以100% (例如，10%蔗糖表示〇. 1克蔗糖/毫升溶液），溫度為攝氏度， 而壓力為大氣壓或近乎大氣壓。
[0095] 初始制劑開發活動涉及篩選抗-D114抗體的液體與凍干制劑中的有機共溶劑、熱 穩定劑和緩沖液，以鑒別與蛋白質相容且增強其穩定性、同時維持相近的生理滲透度與低 粘度的供靜脈內和皮下注射用的賦形劑。還檢驗了緩沖條件以測定最高蛋白質穩定性的最 佳pH。
[0096] 實施例1 :示例性抗-Dl 14制劑
[0097] 制劑開發活動包括篩選抗-D114抗體的液體制劑中的緩沖液、有機共溶劑與熱穩 定劑，以鑒別會增強蛋白質穩定性的賦形劑。亦檢驗緩沖條件以決定獲得最高的蛋白質 穩定性的最佳pH。由這些研究所產生的結果用于開發穩定的適合臨床使用的液體制劑。 抗D114(例如REGN421)被配制成25±3. 75mg/ml或50±7. 5mg/ml。在一個實施方案中， 抗-D114抗體被配制于10±1. 5mM磷酸鹽（pH 6. 0±0. 5)、0. 2% ±0. 03%聚山梨醇酯20、 10% ±1.5%蔗糖，及150mM±22. 5mM氯化鈉中。磷酸二氫鹽與磷酸氫二鹽組合的磷酸鹽 緩沖液是因為其在對于抗-Dl 14穩定性最佳的pH下的緩沖能力和低團聚率而選定。觀察 到抗-D114抗體REGN421具有最佳穩定性與最低團聚率，并且在pH 6. 0下形成帶電荷變 體。選定聚山梨醇酯20作為振蕩穩定劑，其在抗體振蕩或以其他方式操作時降低團聚及沉 淀率。蔗糖--觀察到其會降低抗體在溶液中的團聚率--被選擇作為熱穩定劑的一個組 分。氯化鈉--觀察到其會減少抗體在溶液中形成帶電物質--被選擇作為熱穩定劑的另 一個組分。
[0098] 實施例2 :脅迫穩定性研究方法學
[0099] 在開發研究中使用光密度（405nm)與反相高效液相色譜（RP-HPLC)以評估配制的 抗-D114抗體的物理穩定性。物理穩定性定義為抗體在溶液中的可溶形式的回收率。喪失 抗體可能是因為沉淀或吸附。可以通過目測觀察或在405nm下的光密度（OD)測量（濁度測 量）來檢測顆粒是否存在，其中OD增加表示濁度因為形成顆粒而增加。通過目測或通過OD 測量所存在的顆粒表示樣品無法維持穩定性。通過RP-HPLC或通過UV分光光度法在280nm 下測量抗-D114抗體的回收率。相比于使用限定濃度的抗體所產生的標準曲線，由洗脫抗 體峰的面積來測定各測試樣品的濃度。
[0100] 尺寸排阻HPLC(SE-HPLC)用來評估抗-D114抗體的純度并提供在分子大小上與 本發明的抗-D114抗體有所不同的抗體團聚物、片段或雜質相對數量的測量法。經純化 抗-D114抗體通常作為小的團聚物峰和大的天然二聚體峰，接著小的低分子量峰被洗脫 出。這個方法采用高分辨率硅基尺寸排阻柱及磷酸鹽-氯化鈉緩沖液。記錄在215nm下的 吸光度并積分供純度測定之用。抗-D114抗體依據SE-HPLC的純度規定必須是主峰面積 > 90. 0%總峰面積。關于高分子量峰面積與低分子量峰面積的總峰面積百分率報導于表格 中。
[0101] 通過陽離子交換色譜使用Dionex的弱陽離子交換管柱（PROPAC? WCX-10,4x 250mm)在一段窄的鹽梯度中于pH 6. 0的磷酸鹽緩沖液（40mM至120mM NaCl，44分鐘內， 以ImL/分）中進行陽離子交換色譜來分析抗體的帶電荷變體。紀錄在215nm下的吸光度 并積分以評估電荷不均勻性。通過將峰分成三個主要電荷群組以對抗-D114抗體的色譜圖 進行積分：酸性、主要與堿性。首先洗脫出來的峰群組已被命名為酸性形式（這是通過分析 暴露于高pH與溫度的物質所決定）。色譜圖中的主峰已稱為主峰、主峰形式或主要帶電荷 變體。峰的最后一個群組稱為堿性物質。這些命名基于柱內保留的延時，因為高水平的正 電荷。抗體測試樣品的峰型態被拿來與參考標準品的峰型態進行比較，且報導酸性、主要與 堿性形式的峰面積百分率。
[0102] 使用結合分析評估抗-D114抗體的活性或效力。使用特異性及敏感性ELISA測量 抗體阻斷生物素化-hD114-hFc結合至Notchl的能力。ELISA測量由生物素-hD114-hFc和 抗-D114抗體的混合物組成的溶液中未結合的生物素化hD114-hFc。混合物被添加至經人 Notchl涂覆的微量滴定盤。以不同量的抗體滴定固定量的生物素-hD114-hFc ;洗去抗體： 生物-hD114-hFc復合物。使用結合至辣根過氧化酶（HRP)的鏈霉親和素檢測仍結合至盤 的生物素-hD114-hFc的量。比較分析樣品與參考標準品以決定相對效力。HRP比色物質用 于檢測，并且測量了 0D450nm。將0D450nm值相對于抗體在溶液中的濃度作圖，使用非線性 回歸分析確定IC5(I。IC5tl定義為阻斷生物素-hDLL4-hFc對hNotchl-hFc涂覆盤的最大結合 的50%所需的抗體濃度，且這些值反映抗體對hDLL4的阻斷效力。通過比較參考標準品樣 品在相同盤上操作來決定效力并表示為參考標準品IC5tl值的百分率。
[0103] 實施例3 :緩沖液與pH
[0104] 考慮pH與緩沖液類型對于抗-D114穩定性的影響。當使用IOmM磷酸鹽緩沖液 或IOmM組氨酸緩沖液配制時，REGN421抗體（"REGN421"）最為穩定。已選定磷酸鹽作為 配制用緩沖液，因為考慮到在以液態儲存期間組氨酸有氧化的潛在風險。當所有賦形劑與 REGN421抗體加在一起時，磷酸二氫鹽與磷酸氫二鹽的混合物產生pH為6. 0。
[0105] 對在升高溫度下培育的經緩沖的REGN421的分析揭示，主要蛋白質降解路徑為形 成團聚物、切割產物及帶電荷變體。因此，為評估pH與緩沖液對REGN421穩定性的影響，在 45°C下在pH值范圍5. 0至8. 0的多種緩沖液中培育REGN421測試樣品，以鑒別會增加蛋白 質熱穩定性的條件（表1)。當蛋白質在pH 6. 0下配制時，REGN421具有最大穩定性，如通 過SE-HPLC和陽離子交換-高效液相色譜（CEX-HPLC)分析所測定。較之于在pH 6.0下配 制在琥珀酸鹽或檸檬酸鹽緩沖液中，在pH 6. 0的磷酸鹽或組氨酸緩沖液中配制REGN421產 生較高的蛋白質穩定性。選定磷酸鹽用于REGN421制，因為考慮到在液態中長期儲存期間 組氨酸有氧化的潛在風險。
[0106] 為獲得顯示在表1中的結果，在45°C下測試0. 3mL 25mg/mL REGN421的IOmM測試 緩沖液（含有〇. 2%聚山梨醇酯20)--其在具有經FluroTec?涂覆的4432/50 丁基橡膠 瓶塞的2mL 1型硼硅酸玻璃小瓶中--歷時28天。濁度被報導為比較于起始材料的OD4tl5變化。起始材料結果為所有14種制劑的起始材料的平均結果。OD =光密度；RP-HPLC =反 相高效液相色譜；
[0107] SE-HPLC =尺寸排阻高效液相色譜；CEX-HPLC =陽離子交換高效液相色譜。
[0108] 表1 :在45°C下培育28天，緩沖液與pH對于REGN421穩定性的影響
[0109]

【權利要求】
1. 一種藥物制劑，其包含：⑴特異性地結合至人類A樣配體4(D114)的抗體；（ii)pH 為6. 0±0. 5的緩沖液；（iii)有機共溶劑；以及（iv)兩種熱穩定劑。
2. 如權利要求1所述的藥物制劑，其中該抗體包含SEQ ID N0:2的HCDR1、SEQ ID NO: 3 的 HCDR2、SEQ ID NO :4 的 HCDR3、SEQ ID NO :6 的 LCDR1、SEQ ID NO :7 的 LCDR2 及 SEQ ID NO :8 的 LCDR3。
3. 如權利要求1或2所述的藥物制劑，其中該抗體包含SEQ ID NO :1的HCVD，以及SEQ ID NO :5 的 LCVD。
4. 如權利要求1至3中任一項所述的藥物制劑，其中 (a) 該抗體具有約150kDa的分子量；以及 (b) 約82%至約87%的所述抗體是巖藻糖基化的。
5. 如權利要求1至4中任一項所述的藥物制劑，其中所述抗體的濃度為25mg/ mL±3. 75mg/mL〇
6. 如權利要求1至5中任一項所述的藥物制劑，其中該緩沖液為磷酸鹽。
7. 如權利要求6所述的藥物制劑，其中所述磷酸鹽濃度為10mM±l. 5mM。
8. 如權利要求1至7中任一項所述的藥物制劑，其中所述有機共溶劑為聚山梨醇酯 20 〇
9. 如權利要求8所述的藥物制劑，其中所述聚山梨醇酯20濃度為0. 2% w/v±0. 03%。
10. 如權利要求1至9中任一項所述的藥物制劑，其中該穩定劑由蔗糖和氯化鈉組成。
11. 如權利要求10所述的藥物制劑，其中所述蔗糖的濃度為10% ±1.5% (w/v)，所述 氯化鈉濃度為150mM±22. 5mM。
12. 如權利要求1至11中任一項所述的藥物制劑，其包含25mg/mL±3. 75mg/mL抗體、 10mM±l. 5mM 磷酸鹽，pH 6. 0±0. 5、0. 2% w/v±0. 03%聚山梨醇酯 20、10% w/v±l. 5% 蔗糖，及150mM±22. 5mM氯化鈉。
13. 如權利要求1至12中任一項所述的藥物制劑，其中至少94%的所述抗體在45°C下 儲存28天后具有天然構形。
14. 如權利要求1至13中任一項所述的藥物制劑，其中至少45%的所述抗體在45°C下 儲存28天后為抗體的主要電荷形式。
15. 如權利要求1至14中任一項所述的藥物制劑，其中至少97%的所述抗體在25°C下 儲存28天后具有天然構形。
16. 如權利要求1至15中任一項所述的藥物制劑，其中至少57%的所述抗體在25°C下 儲存28天后為抗體的主要電荷形式。
17. 如權利要求1至16中任一項所述的藥物制劑，其中至少97%的所述抗體在37°C下 儲存28天后具有天然構形。
18. 如權利要求1至17中任一項所述的藥物制劑，其中至少51 %的所述抗體在37°C下 儲存28天后為抗體的主要電荷形式。
19. 如權利要求1至18中任一項所述的藥物制劑，其中至少98%的所述抗體在5°C下 儲存6個月后具有天然構形。
20. 如權利要求1至19中任一項所述的藥物制劑，其中至少61 %的所述抗體在5°C下 儲存6個月后為抗體的主要電荷形式。
21. 如權利要求1至20中任一項所述的藥物制劑，其中在5°C下儲存6個月后抗體的 相對效力百分率為儲存前抗體效力的至少100 %。
22. 如權利要求1至21中任一項所述的藥物制劑，其中至少99%的抗體在-80°C下儲 存6個月后具有天然構形。
23. 如權利要求1至22中任一項所述的藥物制劑，其中至少57%的抗體在-80°C下儲 存6個月后為抗體的主要電荷形式。
24. 如權利要求1至23中任一項所述的藥物制劑，其中在-80°C下儲存6個月后抗體 的相對效力百分率為儲存前抗體效力的至少100%。
25. 如權利要求1至24中任一項所述的藥物制劑，其中至少99%的抗體在-30°C下儲 存6個月后具有天然構形。
26. 如權利要求1至25項任一項所述的藥物制劑，其中至少57%的抗體在-30°C下儲 存6個月后為抗體的主要電荷變體。
27. 如權利要求1至26中任一項所述的藥物制劑，其中在-30°C下儲存6個月后抗體 的相對效力百分率為儲存前抗體效力的至少65 %。
28. 如權利要求1至27中任一項所述的藥物制劑，其中至少98%的抗體在-20°C下儲 存6個月后具有天然構形。
29. 如權利要求1至28中任一項所述的藥物制劑，其中至少60%的抗體在-20°C下儲 存6個月后為抗體的主要電荷變體。
30. 如權利要求1至29中任一項所述的藥物制劑，其中在-20°C下儲存6個月后抗體 的相對效力百分率為儲存前抗體效力的至少100%。
31. 一種藥物制劑，其含有（a) 25mg/mL±3. 75mg/mL 的抗-D114抗體、（b) 10mM± 1. 5mM 磷酸鹽，pH 6.0±0.3、（c)0.2% ±0.03%聚山梨醇酯 20、（d)150mM±22.5mM 氯化鈉，及 (d) 10% ±1.5%蔗糖，其中： (a) 該抗體含有 SEQ ID NO :1 的 HCVD 以及 SEQ ID NO :5 的 LCVD ; (b) 該抗體具有約150kDa的分子量；及 (c) 約82%至約87%的抗體是巖藻糖基化的。
32. 如權利要求31所述的藥物制劑，其由在水中的下列所組成：（a)25mg/mL±3. 75mg/ 1^的抗體、〇3)1〇1111±311^磷酸鹽，？116.0±0.5、（(3)0.2%±0.03%聚山梨醇酯20、 ((1)15〇1111±22.51111氯化鈉，及（6)10%±1.5%蔗糖。
33. 如權利要求1至32中任一項所述的藥物組合物，其中該組成物包含在一容器中。
34. 如權利要求33所述的藥物組合物，其中該容器為小瓶。
35. 如權利要求34所述的藥物組合物，其中該小瓶為玻璃。
36. 如權利要求33所述的藥物組合物，其中該容器為靜脈滴注袋。
37. 如權利要求36所述的藥物組合物，其中該袋由聚氯乙烯制成。
38. 如權利要求36所述的藥物組合物，其中該袋是由聚烯烴制成。
39. 藥盒，其包含如權利要求1至32中任一項所述的藥物組合物、容器以及使用說明。
40. 如權利要求39所述的藥盒，其中該容器為玻璃小瓶，配有涂覆FLUR0TEC的 4023/50的橡膠瓶塞。
【文檔編號】A61K39/395GK104349791SQ201380028578
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2013年5月31日 優先權日:2012年5月31日
【發明者】S·沃爾什, D·迪克斯 申請人:里珍納龍藥品有限公司