用于治療腫瘤的方法

用于治療腫瘤的方法
【專利摘要】本發明提供藉由給藥IL-2融合蛋白和一種或多種治療劑而治療腫瘤(例如，膀胱癌)的方法，其中所述IL-2融合蛋白不需要以所述腫瘤為目標。
【專利說明】用于治療腫瘤的方法
[0001] 聯邦政府贊助的研宄下進行的發明的權利聲明
[0002] 此成果是由以下美國國家衛生研宄院的補助款（補助款編號：CA097550)所支持。 政府對本發明具有一定權利。

【背景技術】
[0003] 在美國，膀胱癌（本文中亦稱為尿道上皮細胞癌）為男性中第四最常見的 癌癥類型和女性中第九最常見癌癥，而且每年估計有70, 500個新案例（52, 760位男 性和17, 770女性）和14, 680位死亡（10, 410位男人和4, 270位女人）（Jemal, A. et al·，CA Cancer J Clin, 60:277-300, 2010)。局部疾病通常是使用免疫療法（Bacillus Calmette-Guerin)、連接至膀胱鏡的電灼裝置或藉由囊腫切除術治療。晚期疾病通常是 以化學療法或化學療法與輻射的組合而治療。對于以傳統的單一藥劑化學療法治療的 轉移性肌肉-侵入性膀胱癌患者而言，存活中位數為大約7至8個月（Raghavan，D. et al·，N Engl J Med, 322:1129-1138, 1990)。在將包含甲氨蝶呤（methotrexate)、長春花 喊（vinblastine)、多柔比星（doxorubicin)以及順鉬（cisplatin)(MVAC)以及吉西他 濱（gemcitabine)和順鉑（GC)的組合細胞毒性療方導入轉移性膀胱癌的處理，存活中 位數已幾乎增加兩倍至超過13個月，而且3年存活率為大約20 %至25% (Loehrer, P. J. et al.,J Clin Oncol, 10:1066-1073, 1992 ；von der MaasejH.et al.,J Clin Oncol，18:3068-3077, 2000)。然而，彼等案例中因癌癥而最終發生死亡者超過90%，而且在 過去20年沒有核準晚期/轉移性膀胱癌的新藥物。在目前的治療選擇的有限功效的情況 下，需要額外的治療方針。


【發明內容】

[0004] 如下述，本發明的特征為治療癌癥的方法。于優選的具體實施例中，本發明的特征 為對有癌癥的受試者給藥有效量的IL-2融合蛋白與一種或多種治療劑的組合，以治療所 述癌癥。
[0005] 于一個態樣中，本發明通常的特征為一種改善受試者的癌癥的方法，其涉及對有 需要的受試者給藥有效量的IL-2融合蛋白與一種或多種治療劑，藉此改善所述癌癥。
[0006] 于另一個態樣中，本發明的特征為一種減少受試者中的腫瘤負擔的方法，其涉及 對有需要的受試者給藥有效量的IL-2融合蛋白和治療劑，藉此減少所述腫瘤的體積。
[0007] 于又另一個態樣中，本發明的特征為一種治療受試者的化學抗性癌癥的方法，其 涉及對有需要的受試者給藥有效量的IL-2融合蛋白和治療劑，藉此治療所述化學抗性癌 癥。
[0008] 于進一步的態樣中，本發明的特征為一種在受試者中誘發針對癌癥的耐久性免疫 記憶反應的方法，其涉及對有需要的受試者給藥有效量的IL-2融合蛋白和治療劑，藉此誘 發所述針對癌癥的耐久性免疫記憶反應。
[0009] 于又另一個態樣中，本發明的特征為一種增加具有癌癥的受試者的存活的方法， 其涉及對有需要的受試者給藥有效量的IL-2融合蛋白和治療劑，藉此增加所述受試者的 存活。
[0010] 于另一個態樣中，本發明的特征為一種用于治療膀胱癌的套組，其含有IL-2融合 蛋白和一種或多種治療劑。
[0011] 任何以上態樣或本文描述的發明的任何其它態樣的多個具體實施例中，IL-2融合 蛋白不特異性地以癌癥為目標或結合癌癥。于另一個具體實施例中，IL-2融合蛋白包括T 細胞受體（TCR)結構域。于又另一個具體實施例中，T細胞受體結構域為單鏈T細胞受體。 于進一步具體實施例中，一種或多種治療劑是選自由下列各者所組成群組：乙酸阿比特龍 醋（abiraterone)、六甲密胺（altretamine)、脫水長春花喊（anhydrovinblastine)、歐瑞 斯他汀（auristatin)、阿扎胞苷（azacitidin)、AZD 8477、苯達莫司汀（bendamustin)、貝 伐單抗（bevacizumab)、荷薩羅丁（bexarotene)、比卡魯胺（bicalutamide)、BMS184476、 2, 3, 4, 5, 6-五氟-N-(3-氟-4-甲氧基苯基）苯磺酰胺、博來霉素（bleomycin)、硼替佐米 (bortezomib)、N，N-二甲基-L-纈氨酰基-L-纈氨酰基-N-甲基-L-纈氨酰基-L-脯氨酰 基-I-L-脯氨酸-第三丁基酰胺、惡病質素（cachectin)、卡培拉濱（capecitabin)、西馬多 丁（cemadotin)、西妥昔單抗（cetuximab)、瘤可寧（chlorambucil)、環磷酰胺，3'，4' -二去 氫-4' -二氧基 _8' -諾文（norvin)-長春喊（caleukoblastine)、多西他賽（docetaxol)、 多稀紫杉醇（doxetaxel)、環磷酰胺、卡鉬（carboplatin)、卡莫司汀（carmustine) (BCNU)、順鉬、念珠藻環肽（cryptophycin)、環磷酰胺、阿糖胞苷（cytarabine)、達卡巴 嗪（dacarbazine) (DTIC)、更生霉素（dactinomycin)、達沙替尼（dasatinib)、柔紅霉 素（daunorubicin)、多拉斯他丁（dolastatin)、多韋替尼（dovitinib)、多柔比星（阿 霉素）（adriamycin)、表阿霉素（epirubicin)、埃坡霉素 B(epothilone B)、埃羅替尼 (erlotinib)、艾瑞布爾（eribulin)、依托泊苷（etoposide)、依維莫司（everolimus)、 5-氟尿啼啶、非那利得（finasteride)、氟他胺（flutamide)，吉非替尼（gefitinib)、 吉西他濱（gemcitabine)、輕基脲和輕基脲紫杉焼類、宜佛斯酰胺（ifostamide)、干擾素 α、伊馬替尼（imatinib)、伊匹單抗（ipilimumab)、依利諾替康（irinotecan)、拉鉤它索 (Iargotaxel)、拉帕替尼（Iapatinib)、來那度胺（Ienalidomid)、利阿挫（Iiarozole)、洛 那法尼（Ionafarnib)、氯尼達明（Ionidamine)、洛莫司汀（Iomustine) (CCNU)、二氯甲基二 乙胺（mechlorethamine)(氮芥）、美法侖（melphalan)、輕乙基磺酸米伏布爾（mivobulin isethionate)、利索新（rhizoxin)、什汀尼夫（sertenef)、鏈脲霉素（streptozocin)、 絲裂霉素（mitomycin)、甲氨蝶呤、5-氟尿啼啶、尼魯米特（niIutamide)、奧那司酮 (onapristone)、草酸鉬（oxaliplatin)、他克挫（paclitaxel)、帕尼單抗（panitumumab)， 帕挫帕尼（pazopanib)，普拉曲沙（pralatrexate)、潑尼莫司汀（prednimustine)、卩比曲 克辛（卩；[1'；!_奸61；!_111)、丙卡巴餅（卩1'00&1^&2；!_116)、啦挫卩林口丫啶（卩7『&2010&(31^(1；!_116)、利妥 昔單抗（rituximab)、RPR109881、羅米地辛（romidepsin)、索拉非尼（sorafinib)、磷酸 雌莫司汀（stramustine磷酸醋）、舒尼替尼（sunitinib)、它莫西芬（tamoxifen)、他索 爾明（tasonermin)、紫杉醇（taxol)、替莫挫胺（temozolomide)、拓撲替康（topotecan)、 曲妥珠單抗（transtuzumab)、維A酸（tretinoin)，三甲曲沙（trimetrexate)、威羅菲尼 (vemurafenib)、長春花堿、長春新堿（vincristine)、硫酸長春地辛（vindesine sulfate)、 長春氟寧（vinflunine)以及伏立諾他（vorinostat)。在其它具體實施例中，一種或多種治 療劑是選自由吉西他濱和以鉑為主的化合物（包含順鉑）所組成群組。于又另一具體實施 例中，癌癥是選自由膀胱癌、尿道、輸尿管以及腎盂的尿道上皮細胞癌、腎臟癌、乳癌、結腸 癌、頭頸癌、肺癌、前列腺癌、神經膠母細胞瘤、骨肉瘤、脂肪肉瘤、軟組織肉瘤、卵巢癌、黑色 素瘤、肝癌、食道癌、胰臟癌以及胃癌所組成群組。在進一步具體實施例中，癌癥是膀胱或尿 道上皮細胞癌。在又進一步具體實施例中，癌癥有化學抗性。在其它具體實施例中，IL-2融 合蛋白和一種或多種治療劑在約7至14天內給藥。在又其它具體實施例中，IL-2融合蛋白 和一種或多種治療劑是在約3至5天內給藥或同時給藥。在額外的具體實施例中，IL-2融 合蛋白是ALT-801，而且一種或多種治療劑是順鉑。于進一步具體實施例中，一種或多種治 療劑是吉西他濱。在又額外的具體實施例中，IL-2融合蛋白特異性地以癌癥細胞為目標。 于一些具體實施例中，IL-2融合蛋白特異性地以癌癥細胞表面上的p53勝肽/HLA絡合物 為目標。
[0012] 本發明所定義的組成物和物件是單獨的，或相反地是與根據以下提供的實施例有 關而制造。將從【具體實施方式】和從權力要求書清楚了解所述發明的其它特征和優點。
[0013] 定義
[0014] 所謂"腫瘤負擔"（亦稱為"腫瘤負荷"）意指身體中的癌癥細胞的數目、腫瘤的尺 寸或癌癥的量。
[0015] 所謂"IL-2融合蛋白"意指含有與第二多肽融合的整個全長IL-2蛋白質或其生物 上有活性的片段的多肽。第二多肽可為目標多肽，亦即，抗體或其抗原結合片段；T細胞受 體（TCR)或其勝肽結合片段；受體或其配位體結合結構域等，其中所述第二多肽特異性地 以IL-2融合蛋白為目標或將IL-2融合蛋白導向癌癥細胞。或者，第二多肽可為非目標多 肽，亦即，不特異地以IL-2融合蛋白為目標或將IL-2融合蛋白導向癌癥細胞的多肽。
[0016] 所謂"T細胞受體（TCR)結構域"意指包括需要結合呈現于適當的MHC或HLA分子 中的同族勝肽的T細胞受體的所有部分的多肽。TCR結構域的非限制性實例是描述于美國 專利第7, 456, 263號；美國專利第6, 534, 633號；美國專利申請公開案第US2003/0144474 號；以及美國專利申請公開案第US2011/0070191號，其等全文是以參考方式納入本文中。
[0017] 所謂"ALT-801"意指能結合人類p53勝肽（氨基酸264至272) HLA-A*0201(c264scTCR-IL-2)的IL-2和TCR結構域之間的融合物。一個ALT-801的闡釋 性氨基酸序列包含以下信號序列：
[0018] Metdtlllwvlllwvpgstgqsvtqpdarvtvsegaslqlrckysysgtpylfwyvqyprqglqlllky ysgdpvvqgvngfeaefsksnssfhlrkasvhwsdsavyfcvlsedsnyqliwgsgtkliikpdtsggggsggggsg gggsggggsssnskviqtprylvkgqgqkakmrcipekghpvvfwyqqnknnefkfIinfqnqevlqqidmtekrfs aecpsnspcsleiqsseagdsalylcasslsgggtevffgkgtrltvvedlnkvfppevavfepseaeishtqkatI vclatgffpdhvelswwvngkevhsgvstdpqplkeqpalndsrycIssrlrvsatfwqnprnhfrcqvqfyglsen dewtqdrakpvtqivsaeawgradvnakttapsvypIapvsgaptssstkktqlqlehlIldlqmilnginnyknpk ltrmltfkfympkkatelkhlqcleeelkpleevlnlaqsknfhlrprdlisninvivlelkgsettfmceyadeta tiveflnrwitfcqsiistlt
[0019] -個成熟ALT-801 (但沒有信號序列）的闡釋性氨基酸序列為：
[0020] qsvtqpdarvtvsegaslqlrckysysgtpylfwyvqyprqglqlllkyysgdpvvqgvngfeaefsks nssfhIrkasvhwsdsavyfcvlsedsnyqliwgsgtkliikpdtsggggsggggsggggsggggsssnskviqtpr ylvkgqgqkakmrcipekghpvvfwyqqnknnefkflinfqnqevlqqidmtekrfsaecpsnspcsleiqsseagd salylcassIsgggtevffgkgtrltvvedlnkvfppevavfepseaeishtqkatIvclatgffpdhvelswwvng kevhsgvstdpqplkeqpalndsryclssrlrvsatfwqnprnhfrcqvqfyglsendewtqdrakpvtqivsaeaw gradvnakttapsvyplapvsgaptssstkktqlqlehllldlqmilnginnyknpkltrmltfkfympkkatelkh lqcleeelkpleevlnlaqsknfhlrprdlisninvivlelkgsettfmceyadetativeflnrwitfcqsiist It
[0021] -個編碼ALT-801的闡釋性核酸為：
[0022] atggagacagacacactcctgttatgggtactgctgctctgggttccaggttccaccggtcagtcagtg acgcagcccgatgctcgcgtcactgtctctgaaggagcctctctgcagctgagatgcaagtattcctactctgggac accttatctgttctggtatgtccagtacccgcggcaggggctgcagctgctcctcaagtactattcaggagacccag tggttcaaggagtgaatggcttcgaggctgagttcagcaagagtaactcttccttccacctgcggaaagcctctgtg cactggagcgactctgctgtgtacttctgtgttttgagcgaggatagcaactatcagttgatctggggctctgggac caagctaattataaagccagacactagtggtggcggtggcagcggcggtggtggttccggtggcggcggttctggcg gtggcggttcctcgagcaattcaaaagtcattcagactccaagatatctggtgaaagggcaaggacaaaaagcaaag atgaggtgtatccctgaaaagggacatccagttgtattctggtatcaacaaaataagaacaatgagtttaaattttt gattaactttcagaatcaagaagttcttcagcaaatagacatgactgaaaaacgattctctgctgagtgtccttcaa actcaccttgcagcct agaaattcagtcctctgaggcaggagactcagcactgtacctctgtgccagcagtctgtc agggggcggcacagaagttttctttggtaaaggaaccagactcacagttgtagaggacctgaacaaggtgttcccac ccgaggtcgctgtgtttgagccatcagaagcagagatctcccacacccaaaaggccacactggtgtgcctggccaca ggcttcttccctgaccacgtggagctgagctggtgggtgaatgggaaggaggtgcacagtggggtcagcacggacc cgcagcccctcaaggagcagcccgccctcaatgactccagatactgcctgagcagccgcctgagggtctcggccacc ttctggcagaacccccgcaaccacttccgctgtcaagtccagttctacgggctctcggagaatgacgagtggaccc aggatagggccaaacccgtcacccagatcgtcagcgccgaggcctggggtagagcagacgttaacgcaaagacaacc gccccttcagtatatccactagcgcccgtttccggagcacctacttcaagttctacaaagaaaacacagctacaact ggagcatttactgctggatttacagatgattttgaatggaattaataattacaagaatcccaaactcaccaggatgc tcacatttaagttttacatgcccaagaaggccacagaactgaaacatcttcagtgtctagaagaagaactcaaacct ctggaggaagtgctaaatttagctcaaagcaaaaactttcacttaagacccagggacttaatcagcaatatcaacgt aatagttctggaactaaagggatctgaaacaacattcatgtgtgaatatgctgatgagacagcaaccattgtagaat ttctgaacagatggattaccttttgtcaaagcatcatctcaacactaacttaa
[0023] 所謂"MART-lscTCR/IL-2"意指能結合呈現于HLA-A*0201內容中的MRT-I勝肽 (氨基酸27至35)的IL-2和TCR結構域之間的融合物。一個MART-lscTCR/IL-2(包含信 號序列）的闡釋性氨基酸序列為：
[0024] Metdtlllwvlllwvpgstgqkeveqnsgplsvpegaiaslnctysdrgsqsffwyrqysgkspelimf iysngdkedgrftaqlnkasqyvsllirdsqpsdsatylcavnfgggklifgqgtelsvkpdtsggggsgggasggg gsggggsssiagitqaptsqilaagrrmtlrctqdmrhnamywyrqdlglglrIihysntagttgkgevpdgysvsr antddfpltlasavpsqtsvyfcasslsfgteaffgqgtrltvvedlnkvfppevavfepseaeishtqkatlvcla tgffpdhvelswwvngkevhsgvstdpqplkeqpalndsryclssrlrvsatfwqnprnhfrcqvqfyglsendewt qdrakpvtqivsaeawgradvnakttapsvyplapvsgaptssstkktqlqlehllldlqmilnginnyknpkltrm ltfkfympkkatelkhlqcleeelkpleevlnlaqsknfhlrprdlisninvivlelkgsettfmceyadetative flnrwitfcqsiistlt
[0025] -個成熟MART-lscTCR/IL-2 (但沒有信號序列）的闡釋性氨基酸序列為：
[0026] Qkeveqnsgplsvpegaiaslnctysdrgsqsffwyrqysgkspelimfiysngdkedgrftaqlnkas qyvsllirdsqpsdsatylcavnfgggklifgqgteIsvkpdtsggggsgggasggggsggggsssiagitqaptsq iIaagrrmtlrctqdmrhnamywyrqdlglglrlihysntagttgkgevpdgysvsrantddfpltlasavpsqtsv yfcasslsfgteaffgqgtrltvvedlnkvfppevavfepseaeishtqkatIvclatgffpdhveIswwvngkevh sgvstdpqplkeqpalndsrycIssrlrvsatfwqnprnhfrcqvqfyglsendewtqdrakpvtqivsaeawgrad vnakttapsvyplapvsgaptssstkktqlqlehllldlqmilnginnyknpkltrmltfkfympkkateIkhlqcl eeeIkpleevlnlaqsknfhlrprdlisninvivielkgsettfmceyadetativeflnrwitfcqsiistlt
[0027] -個編碼MART-lscTCR/IL-2的闡釋性核酸的為：
[0028] atggagacagacacactcctgttatgggtactgctgctctgggttccaggttccaccggtcagaaggag gtggagcagaattctggacccctcagtgttccagagggagccattgcctctctcaactgcacttacagtgaccgagg ttcccagtccttcttctggtacagacaatattctgggaaaagccctgagttgataatgttcatatactccaatggtg acaaagaagatggaaggtttacagcacagctcaataaagccagccagtatgtttctctgctcatcagagactcccag cccagtgattcagccacctacctctgtgccgtgaacttcggaggaggaaagcttatcttcggacagggaacggagtt atctgtgaaacccgacactagtggtgggggtgggagcgggggtggtgctagcggtggcggcggttctggcggtggcg gttcctccagcattgcagggatcacccaggcaccaacatctcagatcctggcagcaggacggcgcatgacactgaga tgtacccaggatatgagacataatgccatgtactggtatagacaagatctaggactggggctaaggctcatccatta ttcaaatactgcaggtaccactggcaaaggagaagtccctgatggttatagtgtctccagagcaaacacagatgatt tccccctcacgttggcgtctgctgtaccctctcagacatctgtgtacttctgtgccagcagcctaagtttcggcact gaagctttctttggacaaggcaccagactcacagttgtagaggacctgaacaaggtgttcccacccgaggtcgctgt gtttgagccatcagaagcagagatctcccacacccaaaaggccacactggtgtgcctggccacaggcttcttccctg accacgtggagctgagctggtgggtgaatgggaaggaggtgcacagtggggtcagcacggacccgcagcccctcaag gagcagcccgccctcaatgactccagatactgcctgagcagccgcctgagggtctcggccaccttctggcagaaccc ccgcaaccacttccgctgtcaagtccagttctacgggctctcggagaatgacgagtggacccaggatagggccaaac ccgtcacccagatcgtcagcgccgaggcctggggtagagcagacgttaacgcaaagacaaccgccccttcagtatat ccactagcgcccgtttccggagcacctacttcaagttctacaaagaaaacacagctacaactggagcatttactgct ggatttacagatgattttgaatggaattaataattacaagaatcccaaactcaccaggatgctcacatttaagtttt acatgcccaagaaggccacagaactgaaacatcttcagtgtctagaagaagaactcaaacctctggaggaagtgcta aatttagctcaaagcaaaaactttcacttaagacccagggacttaatcagcaatatcaacgtaatagttctggaact aaagggatctgaaacaacattcatgtgtgaatatgctgatgagacagcaaccattgtagaatttctgaacagatgga ttaccttttgtcaaagcatcatctcaacactaactta〇
[0029] 所謂"劑"意指任何小分子化學化合物、抗體、核酸分子或多肽或其片段。
[0030] 所謂"治療劑"意指用于癌癥治療的任何化學治療或生物治療劑。治療劑的 非限制性闡釋實例包含乙酸阿比特龍、六甲密胺、脫水長春花堿、歐瑞斯他汀、阿扎胞 苷、AZD 8477、苯達莫司汀、貝伐單抗、蓓薩羅丁、比卡魯胺、BMS184476、2, 3, 4, 5, 6-五 氟-N_(3-氟-4-甲氧基苯基）苯磺酰胺、博來霉素、硼替佐米、N，N-二甲基-L-纈氨酰 基-L-纈氨酰基-N-甲基-L-纈氨酰基-L-脯氨酰基-I-L脯氨酸-第三丁基酰胺、惡病質 素、卡培拉濱、西馬多丁、西妥昔單抗、瘤可寧、環磷酰胺、3'，4' -二去氫-4' -二氧基-8' -諾 文-長春堿、多西他賽、多烯紫杉醇、環磷酰胺、卡鉑、卡莫司汀（BCNU)、順鉑、念珠藻環肽、 環磷酰胺、阿糖胞苷、達卡巴嗪（DTIC)、更生霉素、達沙替尼、柔紅霉素、多拉斯他丁、多韋替 尼、多柔比星、表阿霉素、埃坡霉素 B、埃羅替尼、艾瑞布爾、依托泊苷、依維莫司、5-氟尿嘧 啶、非那利得、氟他胺、吉非替尼、吉西他濱、羥基脲以及羥基脲紫杉烷類、宜佛斯酰胺、干擾 素 α、伊馬替尼、伊匹單抗、依利諾替康、拉鉤它索、拉帕替尼、來那度胺、利阿唑、洛那法尼、 氯尼達明、洛莫司汀（CCNU)、二氯甲基二乙胺（氮芥）、美法侖、羥乙基磺酸米伏布爾、利索 新、什汀尼夫、鏈脲霉素、絲裂霉素、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、尼魯米特、奧那司酮、草酸鉑、他 克唑、帕尼單抗、帕唑帕尼、普拉曲沙、潑尼莫司汀、吡曲克辛、丙卡巴肼、吡唑啉吖啶、利妥 昔單抗、RPR109881、羅米地辛、索拉非尼、磷酸雌莫司汀、舒尼替尼、它莫西芬、他索爾明、紫 杉醇、替莫唑胺、拓撲替康、曲妥珠單抗、維A酸、三甲曲沙、威羅菲尼、長春花堿、長春新堿、 硫酸長春地辛、長春氟寧以及伏立諾他。
[0031] 所謂"化學抗性"意指已變成對一種或多種治療劑有抗性的癌癥或癌癥細胞。
[0032] 所謂"改善"意指減少、抑制、衰減、縮減、遏止、或穩定疾病的發展或惡化。
[0033] 所謂"誘發針對腫瘤的耐久性免疫記憶反應"意指對后續激發或腫瘤再生長或癌 性生長的治療誘發的抗性。
[0034] 所謂"變化〃意指如以標準領域中已知的方法（諸如描述于本文者）所偵測的表 達水平或基因或多肽活性的變化（增加或減少）。如本文中使用，變化包含表達水平的10% 變化，優選為表達水平的25 %變化，更優選為40 %變化，以及最優選為50 %或更大的變化。
[0035] 所謂"類似物"意指非相同，但具有類似功能性或結構性特征的分子。例如，多肽 類似物保留相應的自然產生多肽的生物活性，同時具有增強類似物相對于自然產生多肽的 功能的某種生物化學改性。此生物化學改性可增加類似物的蛋白酶抗性、膜滲透率或半衰 期，但沒有改變，例如，配位體結合。類似物可包含非天然氨基酸。
[0036] 于這揭示內容中，"包括（comprises) "、"包括（comprising) "、"含有 (containing)"以及"具有（having)"等可具有將彼等歸結于美國專利法中的意思，而且 可意指"包含（includes) "、"包含（including) 〃等；"基本上由…所組成（consisting essentially)"或"基本上由…組成（consists essentially) 〃同樣具有歸結于美國專利 法中的意思，而且所述術語為開放式，只要所敘述的基本或新穎特征并非藉由存在超過所 敘述者而改變，允許存在超過所敘述者，但排除前案的具體實施例。
[0037] "偵測"意指辨別欲偵測的分析物的存在、不存在或量。
[0038] 所謂"可偵測的標記"意指當組成物鍵合至感興趣的分子時，使得后者可經由光 譜、光化學、生物化學、免疫化學或化學方式偵測。例如，有用的標記包含放射性同位素、磁 性珠、金屬珠、膠體粒子、熒光染料、電子密集試劑、酵素（例如，如ELISA中常用者）、生物 素、地高辛配體（digoxigenin)或半抗原。
[0039] 所謂"疾病"意指任何破壞或干擾細胞、組織或器官的正常功能的病癥或異常。疾 病的實例包含癌癥。
[0040] 所謂"有效量"或"治療量"意指相對于未經治療的患者，需要治療、預防或改善疾 病癥狀的量。用以實踐本發明以治療性處理疾病的一種或多種活性化合物的有效量是依 據受試者的給藥方式、年齡、體重以及一般健康而改變。最終，主治醫師或獸醫將決定適當 的量及劑量療方。此量被稱為"有效"量。
[0041] 所謂"片段"意指多肽或核酸分子的一部分。優選地，這部分含有參考核酸分子或 多肽的整個長度的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。片段可含有 10、20、30、40、50、60、70、80、90，或100、200、300、400、500、600、700、800、900或 1000個核苷 酸或氨基酸。
[0042] "雜交"意指氫鍵結，其可為互補核堿基之間的瓦特生-克里克（Watson-Crick)、 胡格斯丁（Hoogsteen)或反向胡格斯丁氫鍵結。例如，腺嗓呤和胸腺喃啶為通過形成氫鍵 而配對的互補核堿基。
[0043] 所謂"單離的多核苷酸"意指核酸（例如，DNA)，其不含在衍生本發明的核酸分 子的生物體的自然產生基因組中會在所述基因側面的基因。因此，所述術語包含，例如，并 入質體、并入自發性復制的質體或病毒、或并入原核生物或真核生物的基因組DNA的重組 DNA ;或存在為無關其它序列的個別分子者（例如，藉由PCR或限制性內切酶酶切而產生的 cDNA或基因組或cDNA片段）。此外，所述術語包含從DNA分子轉錄的RNA分子，以及為編 碼額外多肽序列的雜合基因的一部分的重組DNA。
[0044] 所謂"單離的多肽〃意指已自天然伴隨的組分分離的本發明的多肽。典型地，當多 肽至少60重量％自與其天然聯結的蛋白質和自然產生的有機分子游離時，所述多肽為單 離的。優選地，制備本發明的多肽的至少75%，更優選為至少90%，以及最優選為至少99 重量％。本發明的單離多肽可，例如，藉由萃取自天然來源；藉由表達編碼此多肽的重組核 酸；或藉由化學合成蛋白質而獲得。純度可藉由任何適當的方法，例如，柱色譜法、聚丙烯酰 胺凝膠電泳法而測量，或藉由HPLC分析。
[0045] 所謂"標志"意指任何具有聯結疾病或異常的表達水平或活性變化的蛋白質或多 核苷酸。
[0046] 如本文中所使用，"獲得一劑"中的"獲得"包含合成、購買或取得所述劑。
[0047] "引物組"意指一組可使用于如PCR的寡核苷酸。引物組會由至少2、4、6、8、10、12、 14、16、18、20、30、40、50、60、80、100、200、250、300、400、500、600 或更多個引物所組成。
[0048] 如本文中所使用，"重組"包含參考使用表達編碼多肽的異源多核苷酸的細胞而產 生的多肽。細胞產生重組多肽，因為彼等已藉由導入適當的單離的核酸序列而被基因上地 改變。所述術語亦包含參考細胞或核酸或質體，其是已藉由導入異源核酸或將天然核酸改 變成對所述細胞而言非天然形式而改性，或所述細胞是衍生自因此改性的細胞。因此，例 如，重組細胞表達非發現于細胞的天然（非重組）形式內的基因、表達發現于天然形式內的 基因的突變體、或表達不正常地表達、表達不足或完全不表達的天然基因。
[0049] 所謂"減少"意指至少10%、5%、50%、75%，或100%的負向變化。
[0050] 所謂"參考品"意指標準或控制條件。
[0051] "參考序列"是定義為用作序列比較的基準序列。參考序列可為指定序列的子集或 全部；例如，全長cDNA或基因序列的節段或完整的cDNA或基因序列。至于多肽，參考多肽 序列長度將通常是至少約16個氨基酸，優選為至少約20個氨基酸，更優選為至少約25個 氨基酸，以及甚至更優選為約35個氨基酸、約50個氨基酸或約100個氨基酸。至于核酸， 參考核酸序列的長度將通常是至少約50個核苷酸，優選為至少約60個核苷酸，更優選為至 少約75個核苷酸，以及甚至更優選為約100個核苷酸或約300個核苷酸或周圍或之間的任 何整數。
[0052] 所謂"特異性地結合"意指識別和結合表達特定標志的癌癥細胞，但實質上不會識 別和結合樣本中的其它細胞的融合蛋白。
[0053] 所謂"實質上相同"意指對參考氨基酸序列（例如，本文所述氨基酸序列的任何一 者）或核酸序列（例如，本文所述核酸序列的任何一者）展現至少50%同一性的多肽或核 酸分子。優選地，此序列與用于比較的序列在氨基酸濃度或核酸方面有至少60%，更優選為 80%或85%，以及更優選為90%、95%或甚至99%相同。
[0054] 序列一致性典型地是使用序列分析軟件（例如，Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center，1710University Avenue，Madison，Wis.53705，BLAST，BESTFIT，GAP 或 PILEUP/ PRETTYBOX程序）測量。此軟件藉由分配多個取代、缺失及/或其它改性的同源性程度而比 對相同或相似的序列。保守性取代典型地包含內以下群組內的取代：甘氨酸、丙氨酸；纈氨 酸、異亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；絲氨酸、蘇氨酸；賴氨酸、精 氨酸；以及苯丙氨酸、酪氨酸。在測定一致性程度的例示性方法中，可為使用BLAST程序，其 中一和^T icici之間的概率分數表示有密切相關的序列。
[0055] 所謂"受試者"意指哺乳動物，包含，但非限制于，人類或非人類的哺乳動物，諸如， 牛、馬、犬、綿羊或貓。
[0056] 本文中所使用的"腫瘤"意指所有無論是惡性或良性的腫瘤細胞生長和增殖，而且 意指所有癌性前期和癌性的細胞和組織。
[0057] 應了解本文提供的范圍為范圍內所有值的速記。例如，應了解1至50的范圍包含 任何數字、數字的組合或由 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、 22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、 47、48、49或50所組成群組的次范圍。
[0058] 如本文中所使用，術語"治療（treat) "、"治療（treating) "、"治療（treatment) " 等意指減少或改善與所述治療聯結的異常及/或癥狀。應將了解雖然未排除，治療異常或 病癥不需要完全移除與其聯結的異常、病癥或癥狀。
[0059] 除非具體地注明或從前后文顯而易見，如本文中所使用，應了解術語"或"包含 邊值。除非具體地注明或從前后文顯而易見，如本文中所使用，應了解術語"一（a) "、"一 (an) "以及"所述"為單數或復數。
[0060] 除非具體地注明或從前后文顯而易見，如本文中所使用，應了解術語"約"是技術 領域中的正常公差范圍內，例如，平均值的2個標準差內。應了解"約"是在注明的值的 10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0· 5%、0· 1%、0· 05%或 0· 01% 內。除非前 后文清楚顯示，否則本文提供的所有數值是由術語"約"改變。
[0061] 本文變量的任何定義中的化學群組列表的敘述包含將變數定義成任何單一群組 或所列群組的組合。本文的變數或態樣的具體實施例的敘述包含那具體實施例作為任何單 一具體實施例或與任何其它具體實施例或其部分的組合。
[0062] 本文提供的任何組成物或方法可與本文提供的一種或多種任何其它組成物和方 法組合。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0063] 圖1是顯示于40天進行吉西他濱+順鉑；ALT-801 ;或吉西他濱+順鉑+ALT-801 的兩個治療循環后，裸鼠中的皮下人類UMUC-14膀胱腫瘤異體移植物的腫瘤體積平均值變 化的圖表。
[0064] 圖2是顯示48天進行以11天休息隔開的吉西他濱+順鉑；吉西他濱 +MART-lscTCR/IL-2 ;ALT-801 ;或吉西他濱+ALT-801的兩個治療循環后，裸鼠中的皮下人 類UMUC-14膀胱腫瘤異體移植物的腫瘤體積平均值變化的圖表。
[0065] 圖3是顯示ALT-801和MART-lscTCR/IL-2與化學療法療方的組合對裸鼠中的皮 下人類膀胱UMUC-14異體移植物的生長效果的圖表。
[0066] 圖4是顯示ALT-801和MART-lscTCR/IL-2與化學療法療方的組合對小鼠體重效 果的圖表。
[0067] 圖5是顯示ALT-801和MART-lscTCR/IL-2與化學療法療方的組合對裸鼠中的皮 下人類膀胱KU7P異體移植物的生長效果的圖表。
[0068] 圖6是顯示ALT-801和MART-lscTCR/IL-2與化學療法療方的組合對小鼠體重效 果的圖表。
[0069] 圖7是顯示吉西他濱、ALT-801以及MART-lscTCR/IL-2對裸鼠中的皮下人類膀胱 KU7P異體移植物的生長效果的圖表。
[0070] 圖8是顯示以ALT-801或PBS (對照組）治療得到原位MB49Iuc腫瘤的白子 C57BL/6小鼠的存活率的圖表。
[0071] 圖9A是顯示以ALT-801或PBS (對照組）治療得到原位MB491uc腫瘤的C57BL/6 小鼠的存活率的圖表。圖9B為顯示未接受治療或以ALT-801治療的C57BL/6小鼠的原位 MB491uc腫瘤的生物發光的影像。
[0072] 圖10是顯示以ALT-801或PBS (對照組）治療得到原位MB491uc腫瘤的C57BL/6 小鼠的存活率的圖表。
[0073] 圖11是顯示以ALT-801治療具有MB491UC淺表性膀胱腫瘤的C57BL/6小鼠的存 活率的圖表。
[0074] 圖12A和12B是顯示以ALT-801每周治療一次（"1X4"）（圖12A)或每周治療兩 次（"2X4"）（圖12B)(為期四周）具有MB491UC淺表性膀胱腫瘤的C57BL/6小鼠，的存活 率的圖表。
[0075] 圖13是來自以PBS或ALT-801治療后的正常和帶有MB491uc腫瘤的C57BL/6小 鼠的經H&E-染色的膀胱組織剖面影像。
[0076] 圖14A和14B是顯示來自以PBS或ALT-801治療后的正常和帶有MB491uc腫瘤的 C57BL/6小鼠的PMBC(圖14A)和脾臟（圖14B)中的免疫細胞群體的圖表。
[0077] 圖15是顯示來自以PBS或ALT-801治療后在研宄第10天的帶有MB491uc腫瘤的 C57BL/6小鼠的膀胱組織剖面的經染色的巨噬細胞的影像。
[0078] 圖16A和16B是顯示來自以PBS或ALT-801治療后的正常（圖16A)和帶有MB491uc 腫瘤的C57BL/6小鼠（圖16B)的膀胱中的巨噬細胞的濃度變化的圖表。
[0079] 圖17A和17B是顯示以PBS或ALT-801治療后的正常和帶有MB491uc腫瘤的 C57BL/6小鼠的尿中IFNy (圖17A)和TNFa (圖17B)的變化的圖表。
[0080] 圖18是顯示以ALT-801而非IL-2治療延長帶有原位MB491UC膀胱腫瘤的小鼠的 存活率的圖表。在研宄第O天，以聚賴氨酸預處理膀胱后，對C57BL/6小鼠（10至11周齡） 膀胱內滴注1849111(：細胞（31104個細胞/膀胱）。在1^49111(3腫瘤細胞滴注后第7、10、14 以及17天，靜脈內給藥六1^'-801(1.611^/1^，11 = 8)，1'11^2(0.4211^/1^，11 = 8)或？135(100 4 1^ η = 8)。顯示比較研宄組的卡普蘭-邁耶（Kaplan-Meier)存活曲線。
[0081] 圖19Α至19D描述Μ0、ΝΚ、⑶4以及⑶8細胞耗盡對帶有小鼠 MB491uc原位膀胱 腫瘤的C57BL/6小鼠中的ALT-801功效的效果。圖19Α是描述給藥ALT-801的小鼠相較于 給藥PBS的小鼠的存活率的圖表。圖19B是描述給藥ALT-801和藉由于研宄第2、3、6、9、13 以及16天腹腔內注射抗NK抗體（Ab)(克隆PK136,100 μ L中有250 μ g)而使NK細胞耗盡 的小鼠相較于給藥PBS的小鼠的存活率的圖表。圖19C是描述給藥ALT-801和藉由于研宄 第6、9、13以及16天腹腔內注射氟弗松（Clophosome) (150yL/劑量）而使M0耗盡的小鼠 相較于給藥PBS的小鼠存活率的圖表。圖19D是描述給藥ALT-801和藉由于研宄第2、3、 6、9、13以及16天腹腔內注射抗〇)4413(克隆61(1.5，10(^1^中有25(^8)和抗〇)8413(克 隆53-6. 72,100 μ L中有250 μ g)而使⑶4和⑶8細胞耗盡的小鼠相較于給藥PBS的小鼠 的存活率的圖表。展示卡普蘭-邁耶存活繪圖。P值<0.05被認為是顯著的。
[0082] 圖20是描述帶有小鼠 MB491UC原位膀胱腫瘤的C57BL/6小鼠的血液MDSC濃度的 變化的圖表。條狀物表示平均值土SEM。*與對照組比較為P彡0. 05。
[0083] 圖21是帶有MB491UC原位膀胱腫瘤的小鼠膀胱中的巨噬細胞的免疫組織化 學染色影像。于研宄第0天，小鼠接收MB491UC滴注，而且11天后靜脈內接收PBS或 ALT-801 (1.6mg/kg)治療。治療之后24小時犧牲小鼠，并且收集膀胱以染色。將膀胱剖面 以抗iNOS (Ml巨噬細胞標志）及抗MMP-9 (M2巨噬細胞標志）及抗F4/80 (巨噬細胞pan標 志）Abs染色。顯示代表性組織剖面。放大率為200x。
[0084] 圖22是描述免疫細胞子集在C57BL/6小鼠中的血清IFN- γ濃度的ALT-801介導 誘發中的角色的圖表。將C57BL/6雌性小鼠腹腔內注射抗CD4(GK1. 5)、抗CD8(53-6. 72) 及/或抗NKL l(PK136)Abs，以耗盡免疫細胞子集。接著，將小鼠靜脈內注射1.2mg/kg ALT-801，并于24小時后以ELISA測定血清IFN-γ濃度。條狀物表示平均值土標準誤差 (η = 5/ 群組）。
[0085] 圖23是描述IFN-γ對MB491uc細胞體外生長的效果的圖表。MB491uc細胞（2χ 1〇5/孔）是在有Ing/mL或10ng/mL IFN-γ的RPMI-10中培養2天。MB491UC細胞的凋亡 是于膜聯蛋白V染色后以流式細胞儀測定。
[0086] 圖24是描述ALT-801誘發的針對MB491uc腫瘤細胞的LAK細胞細胞毒性的圖表。 淋巴激素活化殺手細胞（LAK)是從小鼠脾細胞制備，接著以20nM ALT-801進行體外活化3 天。LAK 細胞（4x IO6/ 孔）與 PKH67 標示的 MB491uc (4x IO5/ 孔）在有 0 至 50nM ALT-801 的RPMI-10中培養。24小時后采收培養細胞，并且以0. OOlmg/mLPI標示。死PI1B491UC 細胞的百分比是以流式細胞儀測定。
[0087] 圖25是描述吉西他濱減少帶有MB491uc腫瘤的小鼠中的脾細胞MDSC濃度的圖 表。將雌性C57BL/6小鼠靜脈內注射MB491uc細胞（Ix 106/小鼠）。10天之后，將一個 群組的小鼠以40mg/kg吉西他濱靜脈內治療。3天后犧牲小鼠，并且將脾細胞單離。脾臟 Grl+⑶llb+MDSCs的百分比是以流式細胞儀測定。
[0088] 圖26描述磁性分選后MDSC純度的流式細胞儀分析。以MACS柱正向選擇的細胞 是以抗⑶Ilb-PE和抗Grl-FITC抗體染色。稍后進行過繼轉移（adoptive transfer)的 ^1化+61*1+細胞具有96%的純度。
[0089] 圖27是描述ALT-801以MDSC過繼轉移后的免疫細胞而誘發腫瘤細胞殺死的圖 表。收集來自MDSC接收方小鼠（黑色）或載體對照組的小鼠（白色）的脾細胞，并且藉由 與50nM ALT-801培育而活化成LAK細胞。接著將LAK效應細胞與MB491uc目標細胞混合， 以評估彼等的細胞溶解活性。亦標繪來自沒有ALT-801活化的新鮮脾細胞的數據以及殺死 期期間添加 ALT-801后所評估的細胞溶解活性。*林：P〈0. 001。η = 2。
[0090] 圖28描述針對臨床試驗第Ι/ΙΙ期的尿道上皮細胞癌中ALT-801與吉西他濱和順 鉑的組合給藥的研宄設計和治療方案。
[0091] 圖29描述針對臨床試驗第I/II期的尿道上皮細胞癌中ALT-801與吉西他濱和順 鉑的組合給藥的研宄設計和治療方案。
[0092] 圖30描述在尿道上皮細胞癌中ALT-801與吉西他濱和順鉑的組合給藥的臨床試 驗第I/II期的患者人口統計變量和疾病狀態。
[0093] 圖31描述在尿道上皮細胞癌中ALT-801與吉西他濱和順鉑的組合給藥的臨床試 驗第I/II期中的腫瘤評估。
[0094] 圖32描述在尿道上皮細胞癌中ALT-801與吉西他濱和順鉑組合給藥的臨床試驗 第Ι/Π 期中，給藥ALT-801的患者的客觀反應。
[0095] 圖33描述在尿道上皮細胞癌中ALT-801與吉西他濱和順鉑組合給藥的臨床試驗 第Ι/Π 期中，給藥ALT-801的患者的無惡化存活期。
[0096] 圖34是描述給藥ALT-801的患者中增加的血清IFN-γ濃度（左區塊：0. 04mg/kg ALT-801 ;右區塊：0.06mg/kg ALT-801)的圖表。

【具體實施方式】
[0097] 本發明提供治療癌癥或其癥狀的方法，包括對受試者（例如，哺乳動物，諸如，人 類）給藥治療有效量的包括IL-2融合蛋白和一種或多種治療劑的醫藥組成物。因此，一個 具體實施例為治療患有或易得到癌癥或其癥狀的受試者的方法。所述方法包含在治療癌癥 的條件下，對哺乳動物給藥足以治療癌癥或其癥狀的治療量的IL-2融合蛋白和一種或多 種治療劑的步驟。本發明亦提供治療癌癥或其癥狀的方法，包括對受試者（例如，哺乳動 物，諸如，人類）單獨給藥治療有效量的IL-2融合蛋白。
[0098] 本發明至少部分是基于對具有膀胱癌（本文亦稱為尿道上皮細胞癌）的受試者給 藥IL-2融合蛋白與一種或多種治療劑的組合1)改善了癌癥，2)減少了腫瘤負擔，3)增加 了受試者的存活，以及4)誘發針對癌癥的耐久性免疫記憶反應的發現。此外，發現IL-2融 合蛋白與一種或多種治療劑的組合對于治療化學抗性膀胱癌是有效的。再者，發現不特異 性地以癌癥細胞或組織為目標的IL-2融合蛋白，如特異性地以癌癥細胞為目標的IL-2融 合蛋白，對治療膀胱癌上是有效的，。在某些具體實施例中，發現IL-2融合蛋白單一療法對 于治療膀胱癌（包含化學抗性的癌癥）是有效的。
[0099] 已充分認知免疫治療，包含IL-2,為用于增強針對某種癌癥類型的抗腫瘤免 疫力的有效方法。IL-2對包含T和B細胞、單核細胞、巨噬細胞、淋巴激素活化殺手細 胞（LAK)以及NK細胞的一些免疫細胞類型具有刺激效果（Waldmann，T. A.，Nat Rev Immunol, 6:595-601，2006)。基于其提供耐久性且有冶愈性的抗腫瘤反應的能力，重組 人類IL-2 (Prokukin?)的全身性給藥已核準治療轉移性黑色素瘤或腎臟細胞癌瘤患者 (Rosenberg，S.A.等人，Ann Surg, 210:474-484;討論484-475, 1989 ;Fyfe，G.等人，J Clin Oncol, 13:688-696, 1995;以及 Atkins, M.B.等人，J Clin Oncol, 17:2105-2116, 1999)。 不幸地，與這治療聯結的可觀毒性使在腫瘤的位置達到有效劑量是困難的，且限制了可 治療的群體。例如，忍受劑量的IL-2的全身性治療在實際上所有治療患者中誘發淋巴 性活化，但只有在少數的這些個體中觀察到抗腫瘤反應（R〇senberg，S.A.等人，Ann Surg，210:474-484 ;討論484-475, 1989)。結果，高劑量IL-2的使用局限于有經驗的人員 與專業的程序，而且其通常提供給有反應和具有優異的器官功能的患者（Tarhini，A.A.等 人，Curr Opin Investig Drugs, 6:1234-1239, 2005)。較低劑量的 IL-2 治療同時具有較 少毒性和更多的方便性，產生較低反應速率且似乎是對于治療轉移性腫瘤無效（Yang，J. C.等人，J Clin Oncol, 21:3127-3132, 2003)。已顯示以IL-2進行淺表性膀胱癌患者 的局部治療（膀胱內）提供腫瘤退化，并且在一些臨床研宄中延長的無退化時間（Den Otter, W.等人，J Urol, 159:1183-1186, 1998 ;and Den Otter, W.等人，Cancer Immunol Immuotherher，57:931-950, 2008)。在第2期研宄中，相較使用單劑或組合救援性化學療 法所觀察到的6至7個月，對順鉑有抗性的晚期/轉移性尿道上皮癌瘤（其中65%為膀胱 癌）的患者全身性IL-2給藥提供超過10個月的存活中位數，暗示對IL-2療法的膀胱癌瘤 敏感性的進一步證據（Kim, J.等人，Urol Oncol, 21:21-26, 2003 ;以及 Gallagher, D. J.等 人，Cancer, 113:1284-1293, 2008)。然而，這些患者中的IL-2誘發毒性是顯著的，并且限制 了治療療方（Kim, J.等人，Urol Oncol, 21:21-26, 2003)。因此，對于增強IL-2的冶愈效果， 減少其毒性，且在沒有危害臨床益助和擴張其效用超過目前核準的條件上的創新策略有迫 切需要。
[0100] 亦已顯示特異性地以惡性腫瘤為目標的治療策略是有效的。然而，雖然用于 膀胱癌的分子和基因標志已明顯特征化，仍有使用針對膀胱癌的分子目標劑的少數 臨床試驗。使用針對HER-2/neu或VEGF的治療抗體（Abs)或口服EGFR拮抗劑的晚 期/轉移性膀胱癌的患者的最近臨床研宄已顯示相較于標準化學療法無改善的功效 / 毒性剖面（Vaughn，D.J.，J Clin 0ncol，25:2162-2163,2007;Hussain，M.H.等人，J Clin 0ncol，25:2218-2224,2007;lHahn，N.M.等人，J Clin 0ncol，27:5018,2009;and Philips, G.K.等人，BJU Int，101:20-25, 2008)，表示這些目標不適用于膀胱癌。有趣地，基 因研宄說明膀胱癌腫瘤的發病機理主要是由兩個分歧但重迭的途徑所組成（Wu，X. R.，Nat Rev Cancer，5:713-725, 2005)。非肌肉侵入性膀胱腫瘤被認為是從簡單和結節性增生發 生，而且得到成纖維細胞生長因子受體3、Ha-Ras以及PIK3CA基因中的頻繁突變。肌肉 侵入性膀胱癌腫瘤被認為是源自原位扁平腺癌、重度言語障礙癥或重生（de novo)。這些 腫瘤的至少50 %在腫瘤抑制物p53及/或成視網膜細胞瘤基因中含有缺陷（Rosser，C. J.等人，Expert Rev Anticancer Ther, 1:531-539, 2001)。與這發現一致，提升的 p53 的 腫瘤過度表達與膀胱癌患者中的轉移性疾病的惡化相關（van Rhijn，B.W.G.等人，Cancer Research，64:1911-1914, 2004)。這亦由膀胱癌的轉基因小鼠模式所支持。尿道上皮中表 達SV40大T抗原（其結合并且滅活p53蛋白質）的小鼠發展原位癌瘤和隨機的肌肉侵 入性癌瘤，而過度表達Ha-ras的小鼠發展增生和淺表性疾病（Zhang，Z. T.等人，Onco基 因，20:1973-1980, 2001 ;and Zhang, Ζ· Τ·等人，Cancer Res, 59:3512-3517, 1999) ο
[0101] 申請人:辨識出腫瘤細胞中的ρ53蛋白以作為治療干預的目標。腫瘤細胞中的 Ρ53基因中的錯義突變的非常高頻率出現和后續ρ53蛋白的過度表達創造晚期或轉移性 膀胱癌瘤的患者中以ρ53作為腫瘤抗原而為目標的機會。ρ53為作用以遏止細胞增殖的 細胞內腫瘤抑制蛋白（Levine，A.J.等人，似1：1^6,351:453-456，1991;&11(1￥〇118(1611，1(· H. and Prives，C.，Cell, 120:7-10,2005)。當突變時，其喪失抑制不正常增殖的能力，并 且在腫瘤細胞中發生（Levine, A. J.等人，Nature, 351:453-456, 1991 ; & &Vousden，K. H. and Prives，C.，Cell, 120:7-10, 2005)。結果，p53突變/過度表達與腫瘤擴散和復 發與相關，而且與整體較低存活率和對各式各樣的癌癥類型（包含膀胱癌）中化學治 療干預的抗性聯結（van Rhijn，B.W.G.等人，Cancer Research, 64:1911-1914, 2004; Strano，S.等人，Oncogene, 26:2212-2219, 2007 ;and Goebell，P.J.等人，Urol Oncol, 28:377-388, 2010)。超過3, 400位膀胱癌患者的最近分析揭示腫瘤試樣中可偵測 的P53過度表達相對于腫瘤分級和腫瘤期之間的高度顯著相關（Goebell，P. J.等人，Urol Oncol，28:377-388, 2010)。腫瘤中的p53的過度表達亦與腫瘤惡化和晚期膀胱癌患者的差 存活率顯著相關。由于正常組織中僅可偵測到低量的天然 P53,腫瘤相對于正常組織中所展 示的P53的差別創造出治療性地以這蛋白為目標的機會。然而，p53為細胞內蛋白質，而且 非展示于細胞表面上，因此無法以Ab為主的劑接近。如同其它細胞內蛋白質，p53被處理， 而且P53勝肽是以HLA分子的形式呈現在細胞表面上。 申請人:辨識出HLA-A*0201呈現的 P53的勝肽表位（氨基酸264至272)以高濃度展示在不同人類腫瘤細胞和組織的表面上， 而正常組織不呈現可偵測濃度的此絡合物。由于這表位是在P53中很少突變的區域內，其 細胞表面展示作為過度表達P53的腫瘤的廣泛目標。 申請人:請求保護的方法部分是基于人 類腫瘤細胞的表面上的P53勝肽表位的展示。
[0102] 如本文中所使用，術語"治療（treat) "、"治療（treating) "、"治療（treatment) "、 "療法（therapy)"等意指減少或改善與所述治療聯結的異常及/或癥狀。應將了解雖然未 排除，治療異常或病癥不需要完全移除與其聯結的異常、病癥或癥狀。
[0103] 如本文中所使用，術語"預防（prevent) "、"預防（preventing) " "預防 (prevention) "、"預防治療（prophylactic treatment) "等意指減少在不具有但有風險或 易于發展異常或病癥的受試者中發展異常或病癥的概率。
[0104] 如本文中所使用，術語"有效（effective) "、"功效（efficacy) "、"有效的 (effective) "等意指治療、預防或改善與聯結的疾病、異常及/或癥狀的能力。
[0105] 本發明的治療方法（其包含預防治療）中通常包括對有需要的受試者（例如，動 物、人類），包含哺乳動物，特別是人類，給藥治療有效量的IL-2融合蛋白與一種或多種治 療劑的組合。此治療將適合對患有、具有、易有癌癥或有癌癥的風險，特別是膀胱（或尿道 上皮）癌癥的受試者（特別人類）給藥。彼等"有風險"的受試者的測定可藉由受試者或 健康照護提供者的診斷試驗或意見的任何客觀或主觀測定而進行（例如，基因試驗、酵素 或蛋白質標志、標志（如本文中所定義）、家族歷史等）。
[0106] 于一個具體實施例中，本發明提供一種監控治療進度的方法。所述方法包含測定 患有或易有與癌癥（特別是膀胱癌）聯結的異常或其癥狀的受試者中的診斷標志（Marker) (例如，其蛋白質或指示劑等）的水平或診斷測量（例如，掃描、測定法、用于腫瘤尺寸評估 的掃描、手術移除的組織/活組織檢查中的病理組織學評估等）的步驟，其中已對所述受試 者給藥足以治療疾病或其癥狀的治療量的本文化合物。方法中的標志水平或測量的測定可 與健康正常控制者或其它飽受疾病所苦的患者中的標志的已知水平或測量比較，以建立受 試者的疾病狀態。于優選的具體實施例中，受試者中的標志或測量的第二濃度是于測定第 一濃度后的時間點測試，而且比較兩個濃度以監控療法的病程或功效。在某些優選的具體 實施例中，受試者中的標志的預處理水平或測量是在根據本發明的開始處理之預定；這標 志的預處理水平或測量可接著與處理開始后受試者中的標志水平或測量比較，以測定處理 的功效。在某些優選的具體實施例中，治療功效的監控是基于使用固體腫瘤委員會中的反 應評估標準（Response Evaluation Criteria in Solid Tumors Committee, RECIST) I. I 建議的新國際標準評估癌癥的客觀反應而完成。在其它具體實施例中，治療功效是基于受 試者的整體存活或無惡化存活時間或存活率評估。
[0107] 醫藥組成物
[0108] 本文描述的方法仰賴于單獨給藥IL-2融合蛋白或隨著一種或多種治療劑給藥。 本發明的IL-2融合蛋白包括與第二多肽融合的整個成熟IL-2多肽或其生物上有活性的片 段。在某些具體實施例中，第二多肽具有目標性功能，因為其特異性地結合癌癥細胞上的表 位、勝肽、配位體或特征。據此，目標多肽的非限制性實例包含抗體和其抗原結合片段、T細 胞受體和其勝肽結合片段、以及受體和其配位體結合片段。能特異性地結合癌癥細胞的任 何多肽可作為目標的IL-12融合蛋白的第二多肽。
[0109] 令人驚訝地，本發明提供有效作為所述方法中的目標IL-12融合蛋白的非目標性 IL-2融合蛋白。非目標IL-2融合蛋白的第二多肽包含抗體和其抗原結合片段、T細胞受體 和其勝肽結合片段、以及受體和其配位體結合片段。然而，這些案例中，第二多肽不特異性 地結合欲治療的癌癥細胞。于優選的具體實施例中，第二多肽為T細胞受體（TCR)，而且最 優選為單鏈T細胞受體（scTCR)。適合用于第二多肽的TCR分子的實例是描述于美國專利 第7,456,263號；美國專利第6,534,633號；美國專利申請公開案第舊2003/0144474號； 以及美國專利申請公開案第US2011/0070191號，其等全文是以參考方式納入本文中。
[0110] 特別地，已產生具有顯著地增加作為治療分子的利用的TCR融合和接合絡合物。 具體地，已創造融合分子的新類別，其增加細胞表面駐留時間，并且改善藥物動力學剖面， 例如，這些分子具有較長的血漿半衰期。本發明亦提供編碼此包括共價地連結生物上有活 性的多肽或分子的TCR分子的絡合物的表達質體，以及制造方法和此融合和接合絡合物及 表達質體和接合絡合物的用途。
[0111] T細胞藉由在細胞表面上表達T細胞受體的方式而識別呈現在細胞表面上的抗 原。TCR是雙硫鏈接的異二聚體，大部分是由α和β鏈醣蛋白質所組成。相似于在B細 胞中所操作用于產生抗體多樣性的機轉，T細胞使用機轉以產生彼等受體分子的多樣性 (Janeway and Travers ;Immunobiology 1997)。與免疫球蛋白基因相似，TCR基因是由在T 細胞的發展期間重新排列的節段所構成。TCR多肽是由氨基終端可變和羧基終端恒定區域 所組成。羧基終端區域作用為跨膜固定區且當受體被占用時參予細胞內信號傳送的同時， 可變區域負責識別抗原。TCRa鏈含有僅由V和D節段所編碼的可變區域，同時β鏈含有 額外的連結（J)節段。這些節段的重新排列和可變區域的突變和成熟造成能識別令人難以 置信的大數量的不同TCR分子中展示的不同抗原的TCR的多樣譜型（repertoire)。
[0112] 先前已發展技術以產生識別特定抗原的高度特異性T細胞受體（TCR)。例如，待審 查的美國專利申請案u. S. S. N. 08/813, 781和美國專利第6, 534633號，其等全文是藉由參 考方式納入本文中；以及國際公開案PCT/US98/04274和PCT/US99/24645,而且其中討論的 參考文獻揭露制備和使用特異性TCR的方法。額外地，特定特異性TCR已藉由重組方法而 產生成為可溶性、單鏈TCR(scTCR)。已揭露用于產生和scTCRs的方法和用途，而且描述于 國際申請案PCT/US98/20263,其是以參考方式并入本文中。可改變此TCR和scTCR，以便創 造融合物或接合物以產生有用于作為治療劑的TCR和scTCR。本發明的TCR絡合物可產生 藉由將重組地產生的TCR或scTCR編碼區基因上稠合編碼生物上有活性的多肽或分子的基 因，而產生TCR融合接合物。或者，TCR或scTCRs亦可將生物上有活性的分子化學地結合， 以產生TCR接合絡合物。
[0113] 本文所使用的術語"融合分子"意指藉由重組、化學或其它適合的方法共價地連結 (亦即，稠合）的IL-2和第二多肽，諸如，TCR結構域。若有需要，融合分子可通過勝肽連接 子序列于一個或多個位置融合。或者，勝肽連接子可用以協助融合分子的構筑。本發明的 融合分子展現使其等作為較佳的治療分子的改善特征。
[0114] 本文所使用的術語"增加的細胞表面駐留時間"說明請求保護的融合分子與細胞 表面上的蛋白質聯結比單獨融合分子的任何組分更長的時期。在某些具體實施例中，細胞 表面駐留時間增加 20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%或更高。
[0115] 本文所使用的術語"血清半衰期"或"血漿半衰期"意欲說明當本發明的融合分子 的濃度或量在身體中減少至特定濃度或量的切確二分之一時所需的時間。本發明的融合 分子展示比當IL-2未于融合分子中時顯著更長的衰期。例如，當非為融合蛋白一部分時， 至于請求保護分子的組分的血清半衰期，所揭露的分子的血清半衰期可增加20%、30%、 40 %,50 %,60 %,70 %,80 %,90 %U00 %>200 %,300 %,400 %,500 %,750 %Λ000 %, 1250 %、1500 %、1750 %、2000 % 或更高。
[0116] "多肽"意指無論其尺寸，優選的基本上由20個天然氨基酸的任何者所組成的任 何聚合物。雖然術語"蛋白質"通常是參考相對大的蛋白質使用，"勝肽"通常是參考小多肽 使用，這些術語的使用通常在本領域中重迭。除非注明，否則術語"多肽"通常意指蛋白質、 多肽以及勝肽。如由標準分子測尺寸技術諸如離心或SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法所判斷， 根據本發明有用的勝肽通常將在約〇. 1和100KD或更高達1000KD之間，優選在約0. 1、0. 2、 0· 5、1、2、5、10、20、30 以及 50KD 之間。
[0117] 額外地，IL-2融合蛋白可為適合用于診斷或成像研宄，諸如，熒光標記，諸如，綠色 熒光蛋白質、藻紅蛋白、細胞色素或德州紅；或放射性核素，例如，碘-131、紀-90、錸-188或 鉍-212的可偵測地標示分子。參見，例如，Moskaug,等人J.Biol.Chem. 264,15709(1989); Pastan, I.等人·Cells 47,641，1986 ;Pastan 等人，Recombinant Toxins as Novel Therapeutic, Ann. Rev. Biochem.61,331, (1992) ;〃Chimeric Toxins^Olsnes and Phil, Pharmac. Ther. , 25, 355 (1982);公開 PCT 申請案第 WO 94/29350 號；公開 PCT 申請案 第WO 94/04689號；以及美國專利5, 620, 939的有關制造和使用包括效應物或標志的蛋白 質的揭示內容。
[0118] -個IL-2融合蛋白的具體實例如下：sc-TCR，諸如，融合IL-2的 c264sc-TCR(ALT-801)可藉由轉染哺乳動物細胞而產生。融合絡合物的c264scTCR/ IL-2蛋白識別來自以人類HLA抗原；HLA-2. 1形式呈現的人類野生型p53腫瘤抑制蛋白 的處理的勝肽片段。c264scTCR和其勝肽配位體已描述于Card等人，Cancer Immunoll Immuother(2004)53:345,Belmont,等人 Clin Immunol. (2006) 121:29, and Wen,等人 Cancer Immunother. (2008) 57:1781。c264scTCR識別的人類 p53 (氨基酸 264 至氨基酸 272) 勝肽序列（本文中稱為264勝肽或p264)為LLGRNSFEV。腫瘤抑制蛋白p53的表達在惡性 細胞上向上調節。在本發明的特定具體實施例中，由c264scTCR/IL-2蛋白融合辨別在其表 面上呈現P53 (氨基酸264至氨基酸272)勝肽/HLA-A2絡合物的腫瘤細胞促進針對腫瘤細 胞的免疫活性，特此提供抗癌癥治療活性。這目標識別可有益于治療具有過度表達P53的 腫瘤（包含膀胱腫瘤）的受試者。
[0119] 本發明的其它融合分子包括融合對聯結的腫瘤或病毒勝肽抗原（包含衍生自 MART-l、gplOO、MAGE、HIV、甲、乙以及丙型肝炎、CMV、氨基酸V、LCMV、JCV、流行性感冒、HTLV 以及其它病毒者）有特異性的其它scTCR的IL-2,其中，所述scTCR直接或通過連接子連結 IL-2〇
[0120] 此外，IL-2融合蛋白可進一步包括額外的多肽標志。例如，一個標志是在生理pH， 諸如，例如，6xHIS，帶有電荷的多肽。在這種情況下，TCR融合物或接合絡合物可藉由可商購 的金屬-瓊脂糖凝膠基質（諸如，Ni-瓊脂糖凝膠，其能在約pH 6至9特異性地結合6xHIS 標志）而純化。EE表位和myc表位為適合的蛋白質標志的進一步實例，而且表位可以一種 或多種可商購單克隆抗體特異性地結合。
[0121] 如所注明，本文揭露的融合蛋白的組分，例如，IL-2和第二多肽，可以幾乎任何方 式組織，前提為IL-2融合蛋白具有意欲功能。特別地，若有需要，融合蛋白的各組分可以 至少一個適合的勝肽連接子序列隔開另一種組分。再者，組分可藉由連接子以定位，致使 IL-2可結合其受體，并且提供最佳免疫刺激活化性及/或第二多肽可結合其受體/配位體 和介導其活性。額外地，例如，融合蛋白可包含標志，以利于辨識及/或純化融合蛋白。
[0122] 本發明的IL-2融合蛋白具有令人驚訝的增加 IL-2的血漿半衰期（超過單獨IL-2 的血漿半衰期）或結合細胞表面蛋白質（例如，細胞表面受體）的融合分子的表面駐留時 間（超過單獨IL-2的表面駐留時間）的能力。本發明的IL-2融合蛋白可具有增加分子的 血漿半衰期和增加分子的表面駐留時間的能力，藉此導致請求保護的分子的功效的顯著增 加。
[0123] 通常，本發明的IL-2融合蛋白的制備可藉由本文所揭露的程序和藉由涉及識別 重組DNA技術而達成，例如，聚合酶鏈式擴增反應（PCR)、質體DNA的制備、以限制酶斷裂 DNA、寡核苷酸的制備、DNA的連接、mRNA的單離、將DNA引入適合的細胞、宿主的轉化或轉 染、宿主的培養。額外地，融合分子可用離散劑和公知的電泳、離心以及色譜方法純化單 離和純化。通常，參見 Sambrook 等人，Molecular Cloning:A Laboratoty Manual (2nd ed. (1989) ；and Ausubel 等人,Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley&Sons，New York(1989)的有關這些方法的揭示內容。
[0124] 本發明進一步提供編碼本發明的融合蛋白的核酸序列且特別為DNA序列。優選 地，DNA序列是由適合染色體外復制的質體所攜帶，諸如，噬菌體、病毒、質體、噬菌粒、黏粒、 YAC或附加體。特別地，編碼期望的融合蛋白的DNA質體可用以促進本文描述的制備性方 法，而且獲得顯著量的融合蛋白。DNA序列可插入適當的表達質體，亦即，含有用于插入的蛋 白質編碼的序列的轉錄和翻譯所需要的組件的質體。各式各樣的宿主-質體系統可用以表 達蛋白質編碼的序列。這些包含感染病毒（例如，牛痘病毒、腺病毒等）的哺乳動物細胞系 統；感染病毒（例如，桿狀病毒）的昆蟲細胞系統；微生物體，諸如，酵母含有酵母質體，或 以細菌噬菌體DNA、質體DNA或黏粒DNA轉化細菌。取決于所利用的宿主-質體系統，可使 用一些適合的轉錄和翻譯組件的任何一者。通常，參見前述的Sambrook等人，以及前述的 Ausubel 等人。
[0125] 通常，根據本發明的優選的DNA質體包括以磷酸二酯鍵連結的核苷酸序列，其包 括5'至3'方向的第一克隆位置以引入編碼TCR鏈的第一核苷酸序列，其操作性連結編碼 IL-2的序列。
[0126] 在大部分的情況下，優選為DNA質體編碼的各融合蛋白組分是以"盒（cassette) " 形式提供。所謂術語"盒"意指各組分可輕易地以標準重組方法取代另一種組分。
[0127] 為了制造編碼TCR融合絡合物的質體，編碼TCR分子的序列藉由使用適合的連 接酶連結編碼IL-2的序列。編碼呈現的勝肽的DNA可藉由從天然來源（諸如，適合的 細胞系）單離DNA或藉由已知的合成方法，例如，磷酸酯三酯方法而獲得。參見，例如， Oligonucleotide Synthesis, IRL Press (M. J. Gait, ed.，1984)。合成的寡核苷酸亦可使用 可商購的自動化的寡核苷酸合成器制備。一旦單離，編碼TCR分子的基因可藉由聚合酶鏈 式反應（PCR)或其它【技術領域】中已知的手段擴增。擴增TCR勝肽基因的適合的PCR引物的 可給PCR產物添加限制位點。PCR產物優選地包含IL-2多肽的剪接位點，而且TCR-IL-2融 合絡合物的適當的表達和分泌所需的前導序列。PCR產物亦優選為包含編碼連接子的序列， 或用于連接此序列的限制酶位置的序列。
[0128] 本文描述的融合蛋白優選地是藉由標準重組DNA技術而產生。例如，一旦單離編 碼TCR蛋白的DNA分子，序列可連接編碼IL-2多肽的另一種DNA分子。編碼TCR分子的核 苷酸序列可直接連結編碼IL-2勝肽的DNA序列，或更典型地，本文討論的編碼連接子序列 的DNA序列可插入編碼TCR分子的序列和編碼IL-2勝肽的序列之間，并且使用適合的連接 酶連結。產生的雜合DNA分子可于適合的宿主細胞中表達，以產生IL-2融合蛋白。DNA分 子以5'至3'定向彼此連接，致使于連結后，編碼多肽的翻譯框未改變（亦即，DNA分子于 框內彼此連接）。產生的DNA分子編碼框內融合蛋白。
[0129] 其它核苷酸序列亦可包含于基因構筑物中。例如，控制編碼與IL-2勝肽融合的 TCR勝肽的序列的表達的啟動子序列，或將IL-2融合蛋白導向細胞表面或培養基的前導序 列可包含構筑物中或存在于于其中插入構筑物的表達質體中。特別優選為免疫球蛋白或 CMV啟動子。
[0130] 融合蛋白的組分可以幾乎任何順序組織，前提為各者能進行其所欲功能。例如，在 一個具體實施例中，TCR是位于IL-2分子的C或N終端。
[0131] 如所注明，根據本發明的融合分子或結合分子可以許多方式組織。在例示性構型 中，TCR的C-端操作性地連結IL-2分子的N-端。若有需要，此連結可以重組方法達成。然 而，在另一個構型中，TCR的N-端連結IL-2分子的C-端。
[0132] 連接子序列優選地包括約1至20個氨基酸，更優選包括約1至16個氨基酸。優 選地，連接子序列有彈性，故能不以單一不期望的構象拉牢IL-2。連接子序列可用以，例如， 將識別位置與融合分子隔開。具體地，勝肽連接子序列可位于TCR鏈和IL-2勝肽之間，例 如，以相同地化學交聯且提供分子彈性。優選地，連接子主要包括具有小側鏈的氨基酸，諸 如，甘氨酸、丙氨酸以及絲氨酸，以提供彈性。優選地，約80或90百分比或更高的連接子 序列包括甘氨酸、丙氨酸或絲氨酸殘基，特別是甘氨酸和絲氨酸殘基。至于含有異二聚體 的TCR IL-2融合蛋白，連接子序列適合地連結TCR分子的β鏈，雖然連接子序列亦可附 接TCR分子的α鏈。或者，連接子序列可連結至TCR分子的α和β鏈兩者，以創造單鏈 分子。適合的連接子序列是 SGGGGSGGG(亦即，Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly)、 TSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSS以及VNAKTTAPSVYPLAPVSQ。可使用不同的連接子序列包含任 何數目的已成功地使用將抗體可變區域連接在一起的彈性連接子設計，參見Whitlow，M. 等人，（1991)方法：A Companion to Methods in Enzymology 2:97-105。適合的連接子序 列可輕易地依經驗辨識。額外地，連接子序列的適合的尺寸和序列亦可藉由基于TCR分子 的預測尺寸和形狀的傳統計算器模擬技術而測定。
[0133] 可采用一些策略以表達本發明的IL-2融合蛋白。例如，上述IL-2基因融合構筑 物可以已知手段（諸如，藉由限制酶的使用而在用于插入構筑物的質體中造成切口，接著 連接）并入適合的質體。接著將含有基因構筑物的質體引入適合的宿主以表達IL-2融合 勝肽。通常，參見前述的Sambrook等人。基于有關克隆化實驗計劃的因素，可實驗地進行 適合的質體的選擇。例如，質體應與被采用宿主的兼容，而且具有適合被采用宿主的復制 子。又，質體必須能容納編碼欲表達的IL-2融合蛋白的DNA序列。適合的宿主細胞包含真 核和原核細胞，優選為彼等可在培養基中輕易地轉化和展現快速生長的細胞。特定優選的 宿主細胞包含原核生物，諸如，大腸桿菌（E. coli)、枯草桿菌（Bacillus subtillus)等以 及真核生物，諸如，動物細胞和酵母菌株，例如，釀酒酵母（S. cerevisiae)。哺乳動物細胞 通常為優選的，特別是J558、NS0、SP2-0或CH0。其它適合的宿主包含，例如，昆蟲細胞諸如 Sf9。采用傳統的培養條件。參見前述的Sambrook。接著，可選擇安定的轉化或轉染的細胞 系。表達本發明的TCR融合絡合物的細胞可以已知的程序測定。例如，連結免疫球蛋白的 TCR融合絡合物的表達可以對連結免疫球蛋白有特異性的ELISA及/或免疫印漬測定。
[0134] 如上述通常，宿主細胞可用于制備性目的，以擴增編碼期望的融合蛋白的核 酸。因此，宿主細胞可包含其中具體意欲產生融合蛋白的原核或真核細胞。因此，宿主 細胞具體地包含能擴增編碼融合物的核酸的酵母菌、蠅、蠕蟲、植物、青蛙、哺乳動物細 胞以及器官。可使用的哺乳動物細胞系的非限制性實例包含CHO dhfr-細胞（Urlaub and Chasm, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980))、293 細胞（Graham 等人，J Gen. Virol. ,36:59 (1977))或類骨髓瘤細胞 SP2 或呢0(6&1仕6311(1]\^18七6丨11，]^也· Enzymol. , 73(B) :3(1981)) 〇
[0135] 能擴增編碼期望的融合蛋白的核酸的宿主細胞涵蓋非哺乳動物真核細胞，包含昆 蟲（例如，秋夜盜蛾（Sp. frugiperda))、酵母（例如，釀酒酵母、粟酒裂殖酵母（S. pombe)、 畢赤酵母（Ρ· pastoris.)，乳酸克魯維酵母（Κ· lactis)、多形漢森酵母（Η· polymorpha);如 Fleer, R. , Current Opinion in Biotechnology, 3 (5) :486496 (1992)) 一般性評論、真菌以 及植物細胞。亦預期某種原核生物，諸如大腸桿菌和桿菌（Bacillus)。
[0136] 編碼期望的融合蛋白的核酸可以用于轉染細胞的標準技術引入宿主細胞。術語 "轉染（transfecting) "或"轉染（transfection) "意欲涵蓋用于將核酸引入宿主細胞的所 有傳統的技術，包含磷酸鈣共沉淀、DEAE-葡聚糖介導的轉染、脂質轉染、電穿孔、顯微注射、 病毒轉導及/或整合。用于轉染宿主細胞的適合的方法可發現于前述的Sambrook等人， 以及其它實驗室教科書。
[0137] 本發明進一步提供用于單離IL-2的感興趣的融合蛋白的產生過程。在過程中，已 引入編碼操作性地連結調控序列的感興趣的蛋白質的核酸的宿主細胞（例如，酵母菌、真 菌、昆蟲、細菌或動物細胞）在培養基中和融合蛋白的存在下以生產規模生長，以刺激編碼 感興趣的融合蛋白的核苷酸序列的轉錄。隨后，從采收的宿主細胞或從培養基單離感興趣 的融合蛋白。標準蛋白質純化技術可用以從培養基或從采收的細胞單離感興趣的蛋白質。 特別地，純化技術可用以表達和純化來自各式各樣的器具，包含軋輥瓶、旋轉器燒瓶、組織 培養盤、生物反應器或發酵器的大規模（亦即，以至少數毫克量計）的期望的融合蛋白的純 度。
[0138] 表達的IL-2融合蛋白可藉由已知方法單離和純化。典型地，將培養基離心，并且 接著以親和性或免疫親和性色譜法，例如，蛋白質-A或蛋白質-G親和性色譜法或免疫親和 性實驗計劃（包括使用結合表達的融合絡合物（諸如，連結的TCR或其免疫球蛋白區域） 的單克隆抗體）純化上清液。本發明融合蛋白可藉由已知技術的適當組合而分離和純化。 這些方法包含，例如，利用溶解度諸如鹽沉淀和溶劑沉淀的方法、利用分子重量的差異的方 法諸如透析、超過濾、凝膠過濾以及SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法、利用電荷差異的方法諸 如離子交換柱色譜法、利用特定親和性的方法諸如親和性色譜法、利用疏水性差異的方法 諸如反相高效液相色譜法以及利用等電點差異方法諸如等電聚焦電泳、金屬親和性柱諸如 Ni-NTA。通常，參見前述的Sambrook等人以及前述的Ausubel等人的有關這些方法的揭示 內容。
[0139] 優選地，本發明IL-2融合蛋白是實質上純的。亦即，融合蛋白已從天然伴隨的細 胞取代物單離，致使融合蛋白優選地以至少80%或90%至95%同構型（重量/重量）存在。 對于許多醫藥、臨床以及研宄應用而言，融合蛋白最優選具有至少98至99%同構型（重量 /重量）。一旦實質上地純化，融合蛋白應實質上不含污染物已用于治療應用。一旦部分地 純化或有實質純度，可治療地使用可溶性融合蛋白，或以本文揭露的體外或體內測定法中 進行。實質純度可以各式各樣的標準技術諸如色譜法和凝膠電泳法測定。
[0140] 本發明的截斷的IL-2融合蛋白含有足以截斷的TCR分子，使得TCR融合絡合物于 表達之后可分泌入培養基。因此，截斷的IL-2融合蛋白將不包含富含疏水性殘基的區域， 典型為TCR分子的跨膜和細胞質結構域。因此，例如，至于本發明的優選的截斷TCR分子， 優選為TCR分子的β鏈的殘基約199至237和α鏈的殘基約193至230不包含于截斷的 TCR融合絡合物中。
[0141] 有關融合蛋白的術語"錯誤折迭"意指部分地或完整未折疊（亦即，變性）的蛋白 質。融合蛋白可藉由接觸以下討論的一種或多種離散劑而部分地或完整錯誤折迭。更通常 地，本文揭露的錯誤折迭融合蛋白為相應的天然蛋白質的高吉布斯自由能（AG)形式的代 表。優選為通常為正確折迭的天然融合蛋白，其可完全溶于水溶液，而且具有相對低AG。 據此，天然融合蛋白在大部分情況下是安定的。
[0142] 藉由傳統的策略或傳統的策略的組合而偵測融合蛋白錯誤折迭是可能的。例如， 錯誤折迭可藉由各式各樣的傳統的生物物理技術，包含使用天然（對照組）和錯誤折迭分 子的旋光度測量而偵測。
[0143] 所謂術語"可溶性"或相似術語意指融合分子，特別是在低G力離心下（例如，標 準離心中每分鐘少于約30, 000旋轉）不輕易地從緩沖水溶液（例如，細胞培養基）沉降的 融合蛋白。再者，若融合分子于在低濃度或無濃度的陰離子性或非離子性的清潔劑的存在 下，在大于約5至37°C的溫度及在或幾乎中性pH中的水溶液中殘留，則其是可溶的。在這 些條件下，可溶性蛋白質將通常具有低沉降值，例如，少于約10至50斯維德伯格單位。
[0144] 本文參考的水溶液典型地具有緩沖化合物以建立pH，典型地在約5至9的pH范圍 內，以及在約2mM和500mM之間的陰離子性強度范圍。有時添加蛋白酶抑制劑或溫和非離 子性清潔劑。額外地，若有需要，可添加載體蛋白，諸如，少許mg/ml的牛血清白蛋白（BSA)。 例示性緩沖水溶液包含標準磷酸鹽緩沖的生理鹽水、Tris緩沖生理鹽水或其它公知的緩沖 劑和細胞培養基調配物。
[0145] 醫藥治療
[0146] 本發明包含有用于治療腫瘤形成的IL-2融合蛋白。在一個特定具體實施例中，本 發明的IL-2融合蛋白有用于預防或減少腫瘤生長或用于減少腫瘤形成細胞入侵周邊組織 或腫瘤轉移的傾向。至于治療用途，本文揭露的IL-2融合蛋白可全身性地給藥，例如，在醫 藥上可接受的緩沖劑（諸如，生理條件的生理鹽水）中的調配。優選的給藥路徑，包含，例 如，在患者中提供連續性、持續濃度的藥物的皮下、靜脈內、腹腔間地、肌內、或皮內注射。人 類患者或其它動物的治療將使用治療有效量的于生理上可接受的載體的本文辨識的治療 劑進行。描述適合的載體和其調配物，例如，于Remington's Pharmaceutical Sciences by E. W. Martin。治療劑的量取決于給藥方式、患者的年齡和體重以及腫瘤形成的臨床癥狀而 改變給藥。通常，雖然因為化合物增加的特異性，在某些情況下將需要較低量，但量將在彼 等用于與治療與腫瘤形成有聯結的其它疾病中使用的其它劑的范圍中。
[0147] 治療方法
[0148] 本發明的IL-2融合蛋白是有用于預防或改善腫瘤形成疾病。在一種治療方式中， 對可能的或實際受到疾病影響的組織的位置給藥或全身性地給藥本文辨識或描述的劑。給 藥的劑的劑量是取決于一些因素，包含各別患者的尺寸和健康。至于任何特定受試者，特定 劑量療法應根據各別需求和個人給藥或監督組成物給藥的專業判斷而隨著時間調整。
[0149] 醫藥組成物的調配物
[0150] 用于治療腫瘤形成的治療劑的給藥可為造成治療劑與其它組分的組合有效于改 善、減少或穩定化腫瘤形成的濃度的任何適合手段。化合物可以任何適當的量和以任何適 合的載體物質包含，而且通常是以組成物的總重量的1至95重量％的量存在。組成物可適 合用于非經口的（例如，皮下地、靜脈內地、肌內地、膀胱內地或腹膜內地）給藥路徑的劑 量形式提供。一種給藥的有利的方法是靜脈內輸注。醫藥治療劑可根據傳統的醫藥實踐 調配（參見，例如，Remington:The Science and Practice of Pharmacy(20th ed.)，ed. A. R. Gennaroj Lippincott Williams&Wilkins, 2000and Encyclopedia of Pharmacology Technology, eds. J. Swarbrick and J. C. Boylanj 1988-1999, Marcel Dekker，New York) 〇
[0151] 可調配根據本發明的醫藥組成物，以在實質上剛給藥時即釋放IL-2融合蛋白或 在任何預測定的時間或給藥之后的時期釋放IL-2融合蛋白。已知后者類型的組成物通常 作為控制釋放的調配物，其包含（i)在延長的時期在身體內創造實質上恒定濃度的藥物的 調配物；（ii)預定的延遲時間后在體內創造實質上恒定濃度的藥物延長的期間的調配物； (iii)藉由維持身體中的相對、恒定及有效濃度和同時與活性物質的血漿濃度中的波動聯 結的非所欲的副作用（鋸齒動力圖案）的最小化，而于預定時期持續作用的調配物；（iv) 局部化作用的調配物，所述局部化作用是藉由，例如，相鄰或接觸胸腺的控制釋放組成物的 空間布置；(V)允許方便用劑，致使例如每周或每兩周一次給藥劑量的調配物；以及（vi)藉 由使用載體或化學衍生物將治療劑傳遞至特別的細胞類型（例如，腫瘤形成細胞）而形成 腫瘤的調配物。至于一些應用，控制釋放調配物避免白天頻繁用劑的需求，以持續治療水平 的血漿濃度。
[0152] 可探求任何數目的策略，以獲得其中釋放的速率勝過有問題的化合物的代謝速率 的控制釋放。在一個實施例中，控制釋放是藉由適當選擇多個調配物參數和成分，包含，例 如，多種類型的控制釋放組成物和涂層而獲得。因此，治療劑是以適當的賦形劑調配成醫藥 組成物，其在給藥時，以控制的方式釋放治療劑。實例包含單一單位或多單位的錠劑或囊劑 組成物、油性溶液、懸浮液、乳劑、微囊劑、微球體、分子絡合物、奈米粒子、貼片劑以及脂質 體。
[0153] 非經口的組成物
[0154] 醫藥組成物可藉由非經口地注射、滲入或植入（皮下、靜脈內、肌內、腹膜內、膀胱 內或類似者）的劑量形式、調配物或經由適合的傳遞裝置或含有傳統的、非毒性醫藥上可 接受的載體和佐劑植入物而給藥。此組成物的調配和制備為彼等醫藥調配物領域中公知 者。調配物科發現于前述的 Remington:The Science and Practice of Pharmacy。
[0155] 非經口的用途的組成物可以單位劑量形式提供（例如，于單一劑量安瓿）或于含 有許多劑量且其中可添加適合的防腐劑的小玻璃瓶（參見以下）。組成物可以溶液、懸浮 液、乳劑、滲入裝置或植入用傳遞裝置的形式，或其可以為使用之前以水或另一種適合的載 體復原的干燥粉劑呈現。除了減少或改善腫瘤形成活性劑之外，組成物可包含適合的非經 口地可接受的載體及/或賦形劑。一種或多種活性治療劑可并入用于控制釋放的微球體、 微囊劑、奈米粒子、脂質體或類似者。再者，組成物可包含懸浮、溶解、安定、PH調節劑、張力 調節劑及/或分散劑。
[0156] 如上所述，根據本發明的醫藥組成物可為適合用于無菌注射的形式。為了制備此 組成物，將一種或多種適合的治療劑溶解或懸浮于非經口地可接受的液體載體。可接受的 載體和溶劑中可采用水、藉由添加適當量的氫氯酸、氫氧化鈉或適合的緩沖劑、1，3-丁二 醇、林格式溶液（Ringer' s solution)以及等張氯化鈉溶液和右旋糖溶液而調整至適合的 pH的水。水性調配物亦可含有一種或多種防腐劑（例如，對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸 乙酯或對羥基苯甲酸正丙酯）。在其中一種化合物僅是不太或稍可溶于水中的情況下，可添 加溶解增強或溶解劑，或溶劑可包含10至60%重量/重量的丙二醇或類似者。
[0157] 控制釋放非經口的組成物
[0158] 控制釋放非經口的組成物可為水性懸浮液、微球體、微囊劑、磁性微球體、油性溶 液、油性懸浮液或乳劑的形式。或者，抗體可并入生物兼容的載體、脂質體、奈米粒子、植入 物或滲入裝置。
[0159] 用于制備微球體及/或微囊劑的材料為，例如，生物能降解的/生物可腐蝕的聚合 物，諸如聚泌乳素、聚-(氰基丙烯酸異丁酯）、聚（2-羥基乙基-L-谷氨酰胺）以及聚（乳 酸）。當調配控制釋放的非經口的調配物時，可使用的生物兼容的載體為碳水化合物（例 如，葡聚糖）、蛋白質（例如，白蛋白）、脂蛋白或抗體。用于植入物的材料可為非生物能降 解的（例如，聚二甲基硅氧烷）或生物生物能降解的（例如，聚（己內酯）、聚（乳酸）、聚 (乙醇酸）或聚（原酸酯）或其組合）。
[0160] 用于口服使用的固體劑量形式
[0161] 用于口服使用的調配物包含含有一種與多種活性成份混合的非毒性醫藥上可接 受的賦形劑的錠劑。此調配物對熟練的技術人員而言是已知的。賦形劑可為，例如，惰性稀 釋劑或填充劑（例如，蔗糖、山梨糖醇、糖、甘露糖醇、微晶纖維素、包含馬鈴薯淀粉的淀粉、 碳酸鈣、氯化鈉、乳糖、磷酸鈣、硫酸鈣或磷酸鈉）；造粒和崩解劑（例如，包含微晶纖維素的 纖維素衍生物、包含馬鈴薯淀粉的淀粉、交聯羧甲基纖維素鈉、海藻酸鹽或海藻酸）；結合 劑（例如，蔗糖、葡萄糖、山梨糖醇、金合歡屬、海藻酸、海藻酸鈉、明膠、淀粉、預糊化淀粉、 微晶纖維素、硅酸鎂鋁、羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、乙基纖維素、聚 乙烯基吡咯烷酮或聚乙二醇）；以及潤滑劑、助流劑以及抗粘著劑（例如，硬脂酸鎂、硬脂酸 鋅、硬脂酸、二氧化硅、氫化蔬菜油或滑石）。其它醫藥上可接受的賦形劑可為著色劑、調味 劑、增塑劑、濕潤劑、緩沖劑等。
[0162] 錠劑可為未經涂怖或牠們可藉由已知技術涂布，視需要地延遲胃腸道中的崩解和 吸收，藉此于較長期間提供持續的作用。涂層可經調整以釋放預定圖案中的活性藥物（例 如，為了達成控制釋放調配物），或其可經調整成直到穿過胃（腸涂層）之后才釋放活性藥 物。涂層可為糖涂層、膜涂層（例如，基于羥丙基甲基纖維素、甲基纖維素、甲基羥乙基纖維 素、羥丙基纖維素、羧甲基纖維素、丙烯酸酯共聚物、聚乙二醇及/或聚乙烯基吡咯烷酮）或 腸涂層（例如，基于甲基丙烯酸共聚物、乙酸酞酸纖維素、酞酸羥丙基甲基纖維素、乙酸琥 珀酸羥丙基甲基纖維素、聚乙烯基乙酸酯酞酸酯、紫膠及/或乙基纖維素）。再者，可采用時 間延遲材料，諸如，例如，單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。
[0163] 固體錠劑組成物可包含經調整以保護組成物免于不要的化學變化（例如，釋放 嵌合抗體之前的化學分解）的涂層。涂層可以前述的Encyclopedia of Pharmaceutical Technology中所述相似方式施用于固體劑量形式上。
[0164] 口服使用的調配物亦可以可咀嚼錠劑、或其中活性成份與惰性固體稀釋劑（例 如，馬鈴薯淀粉、乳糖、微晶纖維素、碳酸鈣、磷酸鈣或高嶺土）混合的硬明膠囊劑、或其中 活性成份與水或油性培養基，例如，花生油、液體石蠟或橄欖油混合的軟明膠囊劑呈現。可 以使用，例如，混合器、液床式儀器或噴霧干燥設備的傳統方式，在上述錠劑和囊劑下使用 成分以制備粉體和顆粒。
[0165] 控制釋放口服劑量形式
[0166] 口服使用的控制釋放組成物可為，例如，經構筑成藉由控制活性物質的溶解及/ 或擴散而釋放嵌合抗體治療劑。溶解或擴散控制釋放可藉由化合物的錠劑、囊劑、丸劑以及 顆粒調配物的適當涂層，或將化合物并入適當的基質而達成。控制釋放涂層可包含上述一 種或多種涂層物質及/或，例如，紫膠、蜂蠟、糖蠟、蓖麻蠟、棕櫚蠟、硬脂醇、單硬脂酸甘油 酯、二硬脂酸甘油酯、硬脂酸棕櫚酸甘油酯、乙基纖維素、丙烯酸樹脂、dl-聚乳酸、乙酸丁酸 纖維素、氯化聚乙烯、乙酸聚乙烯酯、乙烯基吡咯啶酮、聚乙烯、聚丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸 甲酯、丙烯酸2-羥基甲酯、甲基丙烯酸酯水凝膠、1，3 丁二醇、乙二醇甲基丙烯酸酯、及/或 聚乙二醇。在控制釋放基質調配物中，基質材料亦可包含，例如，水合甲基纖維素、棕櫚蠟以 及硬脂醇、卡波姆（carb〇p〇l)934、聚硅氧烷、三硬脂酸甘油酯、丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸甲 酯、聚乙烯基氯化物、聚乙烯及/或鹵代氟碳。
[0167] 含有一種或多種治療化合物的控制釋放組成物亦可為易浮的錠劑或囊劑的形式 (亦即，口服給藥時在胃內容物的頂部浮動特定時期的錠劑或囊劑）。一種或多種化合物的 易浮的錠劑調配物可藉由將一種或多種化合物與賦形劑和20至75%重量/重量的水膠體 (諸如，羥乙基纖維素、羥丙基纖維素或羥丙基甲基纖維素）的混合物造粒而制備。接著，可 將所獲得顆粒體可壓縮成錠劑。與接觸胃液時，錠劑在其表面周圍形成實質上不透水的凝 膠屏障。這凝膠屏障參予維持密度少于一，藉此允許錠劑在胃液中保持浮的。
[0168] 組合療法
[0169] 本發明提供IL-2融合蛋白和一種或多種治療劑的組合給藥。IL-2融合蛋白可在 給藥治療劑之前、同時或之后給藥。此外，若超過使用一種治療劑，則這些劑可同時或分別 給藥。另外，IL-2融合蛋白和一種或多種治療劑的給藥可以多個劑量方案給藥。在特定具 體實施例中，IL-2融合蛋白和一種或多種治療劑可藉由一種或多種以休息期隔開的多種用 劑方案給藥。
[0170] 取決于患者的疾病階段，新佐劑設定中的本發明的IL-2融合蛋白和一種或多種 治療劑的組合是在額外的療法或手術之前，或作為第一線、第二線或后線療法。于優選的具 體實施例中，組合療法對囊腫切除術之前的膀胱癌受試者有特異性。此療法可根除微腫瘤 轉移，降期腫瘤，減少循環腫瘤細胞手術后的植入以及增進存活。在其它具體實施例中，本 發明的組合療法是對晚期或轉移性膀胱癌受試者有特異性的第一線或第二線療法。此治療 可提供有抗性或不適合標準療法的受試者。IL-2融合蛋白作為單一療法的用途亦可有效地 用于這些治療設定。
[0171] 本發明的IL-2融合蛋白和一種或多種治療劑的組合可較以各別劑的治療有利地 提供更有效的療法。在某些優選的具體實施例中，組合療法包括ALT-801作為IL-2融合蛋 白，和順鉑及/或吉西他濱作為治療劑。額外地，本發明的具體實施例包含膀胱（或尿道 上皮）癌癥受試者的治療，其中所述癌癥可為轉移性細胞癌瘤、癌瘤（或腫瘤）原位、非肌 肉-侵入性、肌肉-侵入性、局部晚期、腫瘤轉移、第I至IV期或低或高惡性。
[0172] 于優選具體實施例中，IL-2融合蛋白和一種或多種治療劑的組合給藥較以治療劑 的單獨治療更有效地治療或預防受試者的癌癥。使用IL-2融合蛋白和一種或多種治療劑 的組合治療成效可在預期或回推的基準上以與治療劑的單獨治療比較，使用相似研宄組或 交叉研宄的歷史功效手段。可良好建立用于癌癥治療的功效測量，而且其可包含整體腫瘤 反應（亦即，基于RECIST、WHO或其它標準的惡化疾病的速率、安定的疾病、部分反應或完整 反應的速率）、無惡化存活、惡化的時間、整體存活或存活率、風險比、復發率或時間、腫瘤生 物標志分析、生活質量測量、額外的治療的速率或時間等。使用IL-2融合蛋白和一種或多 種治療劑的組合治療的相較于治療劑的單獨治療的較佳的功效是典型地定義為統計學上 地顯著的功效手段的改善（亦即，P值〈0. 10或優選為〈0. 05)，或可為定義為周、月或年測 量的事件的時間增加 1%、5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、 100 %、200 %、300 %、400 %、500 %、750 %、1000 %、1250 %、1500 %、1750 %、2000 % 或更高 的改善速率測量。在非限制性實例中，使用本發明的ALT-801和吉西他濱+順鉑組合給藥 治療晚期或轉移性膀胱癌受試者提供較先前報導的以吉西他濱+順鉑或其它以順鉑為主 的化學療法療方治療的晚期/轉移性膀胱癌受試者為更佳的抗腫瘤功效。具體地，von der Maase等人（J. Clin. Oncol. (2000) 17:3068)報導在晚期或轉移性膀胱癌患者的第III期臨 床研宄中，以獨立輻射學復查，以吉西他濱+順鉑的治療造成49. 4% (182位評估患者中有 81位）的整體腫瘤反應速率（亦即，部分反應和完整反應的速率）和12.2%的完整反應速 率。這研宄亦報導以甲氨蝶呤、長春花堿、多柔比星以及順鉑治療的患者中有相似的整體反 應速率（45. 7%，181位評估患者中有69位）和完整反應速率（11. 9% )。其它化學療法療 方（亦即，單劑、雙重峰、三重峰）的后續研宄中，這報導的患者群體有類似或低劣的反應速 率（Yafi等人的評論Curr. Oncol. (2011) 18: e25)。令人驚訝地，對晚期/轉移性膀胱（尿 道上皮）癌癥患者組合給藥本發明的ALT-801和吉西他濱+順鉬，提供了較von der Maase 等人或其它人報導的吉西他濱+順鉑或其它以順鉑為主的化學療法療方更佳的整體反應 和完整反應速率。
[0173] 額外地，IL-2融合蛋白和一種或多種治療劑的組合給藥對治療或預防對化學療法 有抗性的受試者的癌癥有效。在特定具體實施例中，本發明的組合治療包含讓癌癥有抗性 的一種或多種治療劑。在其它具體實施例中，本發明的組合治療包含不同于讓癌癥有抗性 的一種或多種治療劑。在非限制性實例中，ALT-801和吉西他濱+順鉑的組合給藥對于在 先前吉西他濱+順鉬療法中惡化的膀I光癌患者提供完整反應（CR)是有效的。在370位以 順鉑為主的療法后惡化的晚期尿道上皮細胞癌患者的第III期研宄中無 CR被報導的事實 下，這結果是高度未預料到的（Bellmunt等人J. Clin. Oncol. (2009)27:4454)。
[0174] 本發明的IL-2融合蛋白和一種或多種治療劑的組合可通過各式各樣的機轉提供 更有效的療法。IL-2融合蛋白和細胞毒性治療劑療方可通過這些劑的組合對癌癥的直接 效果而提供功效。在一些情況中，這些效果的時序可提供改善的結果。例如，針對巨瘤癥的 細胞毒性治療劑的快速活性與針對殘余疾病的IL-2融合蛋白的耐久性長期活性的組合可 提供較單獨劑更佳的功效。或者，治療劑不僅對腫瘤細胞有直接細胞毒性效果，但亦可經 由所謂偏離目標效果（off-target effect)增效免疫系統，以與本發明IL-2融合蛋白的 組合達到有效率的抗癌癥免疫力（Galluzzi，L.等人，Nat Rev藥物Discov, 11:215-233)。 例如，以治療劑的治療可增加癌癥細胞表面上的抗原目標的表達，藉此允許IL-2融合蛋白 誘發更有效的抗腫瘤免疫反應。于一些具體實施例中，藉由IL-2融合蛋白的組分和免疫 反應識別的抗原目標是IL-2融合蛋白交互作用導向針對腫瘤細胞。在一個實例中，治療 劑增加腫瘤細胞表面上的HLA或HLA/勝肽絡合物濃度，并且增強TCR-IL2融合蛋白的識 另IJ。在其它具體實例中，以鉑為主的化合物（包含順鉑、草酸鉑以及卡鉑）不僅誘發第I 類HLA表達，也明顯地減少人類腫瘤細胞上T細胞抑制分子TO-L2的表達（Lesterhuis，W. J.等人，J Clin Invest, 121:3100-3108)。PD-L2的向下調節可造成IL-2融合蛋白刺激 的T細胞的增強的抗腫瘤的效果。多種治療劑（包含順鉑、他克唑以及多柔比星）具有藉 由增加腫瘤細胞對顆粒酶的滲透率，而將腫瘤細胞敏化成細胞毒性T淋巴球（CTL)的能力， 藉此使得牠們易受CTL介導的溶胞，甚至若牠們不表達識別的CTL抗原（Ramakrishnan，R. 等人，J Clin Invest, 120:1111-1124)。在本發明的其它具體實施例中，由于吉西他濱 的活性增加腫瘤細胞上第I類HLA的表達和增強對IL-2融合蛋白活化的CD8+T細胞交 叉呈現腫瘤抗原，IL-2融合蛋白與吉西他濱的組合可造成更有效的療法（Liu, W.M.等 人，Br J Cancer，102:115_123;Nowak，A.K·等人，J Immunoll，170:4905_4913,2003;and Nowak, Α· Κ·等人，Cancer Res, 63:4490-4496, 2003)。在本發明中的組合療法中，吉西他 濱的使用亦可選擇性地殺死負責抑制抗原特異性的T-細胞反應的衍生自骨髓的抑制細胞 (MDSC) (Mundy_Bosse，B.L·等人，Cancer Res，71:5101_5110;Vincent，J·等人，Cancer Res, 70:3052-3061 ;Suzuki，E.等人，Clin Cancer Res, 11:6713-6721，2005 ;and Κο，Η· J.等人，Cancer Res，67:7477-7486, 2007)，藉此提供IL-2融合蛋白介導的抗腫瘤免疫活 性的較佳環境。化學療法亦可誘發腫瘤自我吞噬，導致腺苷5'-三磷酸酯的釋放，能吸引和 刺激抗腫瘤免疫反應（Michaud, M.等人，Science, 334:1573-1577)。整體上，本發明的組合 治療的抗腫瘤作用機轉可不仰賴于治療劑的直接細胞毒性活性。因此，組合治療可對于其 腫瘤對治療劑組分有抗性的受試者是有效的。
[0175] 套組
[0176] 本發明提供用于治療或預防腫瘤形成的套組。在一個具體實施例中，套組包含含 有治療有效量的單位劑量形式的IL-2融合蛋白和一種或多種治療劑的治療或預防組成 物。于優選具體實施例中，IL-2融合蛋白為ALT-801，而且一種或多種治療劑為順鉑及/或 吉西他濱。于一些具體實施例中，套組包括含有治療或預防細胞組成物的無菌容器；此容 器可為盒、安瓿、瓶、小玻璃瓶、管、袋、囊、泡罩包裝或其它【技術領域】中已知的適合的容器形 式。此容器可由塑料、玻璃、層壓紙、金屬箔或適合用于保持藥劑的其它材料所制。
[0177] 若有需要，本發明的IL-2融合蛋白和一種或多種治療劑與用于對具有癌癥或有 發展癌癥的風險（例如，膀胱癌）的受試者給藥IL-2融合蛋白和一種或多種治療劑的指令 一起提供。指令將通常包含關于將組成物用于治療或預防腫瘤形成的信息。在其它具體實 施例中，指令包含以下至少一者：治療劑的描述；用于治療或預防其局部缺血或癥狀的劑 量方案和給藥；預防措施；警告；適應癥；禁忌癥；過量信息；不良反應；動物藥理學；臨床 研宄；及/或參考文獻。指令可打印直接到容器上（當存在時）或為作為標簽而施用于容 器的，或作為個別片、小冊子、卡片或夾子而存在容器中或與容器一起供應。
[0178] 重組多肽表達
[0179] 除非另行說明，本發明的實踐采用分子生物學（包含重組技術）、微生物學、 細胞生物學、生物化學以及免疫學，其是在熟練的技術人員的良好理解范圍內的傳統 的技術。此技術在文獻，諸如，"Molecular Cloning:A Laboratory Manual"，第二 版（Sambrook，1989) ;"01igonucleotide Synthesis"（Gait, 1984) ;"Animal Cell Culture"(Freshney, 1987) ;''Methods in Enzymology"(31) "Handbook of Experimental Immunology"（Weir, 1996) ；aGene Transfer Vectors for Mammalian Cells"（Miller and Calos,1987) ;"Current Protocols in Molecular Biology" （Ausubel,1987); "PCR:The Polymerase Chain Reaction"，（Mullis, 1994) ;"Current Protocols in Immunology"(Coligan,1991)中完全解釋。這些技術可應用于本發明的多核苷酸和多肽的 產生，諸如，可在本發明的制造和實踐中考慮。用于特定具體實施例的特別有用的技術將在 以下段落討論。
[0180] 提出以下實施例，以便提供彼等【技術領域】中具有通常知識者和如何制造和使用測 定法、篩選以及本發明的治療方法的完整揭示內容和描述，而非意欲限制發明人視為他們 發明的范疇。
[0181] 實施例
[0182] 實施例I:靜脈內給藥新穎IL-2融合蛋白ALT-801抑制小鼠模式中的膀胱癌。
[0183] ALT-801是白介素-2和能識別呈現人類p53勝肽（氨基酸264-272)/HLA-A*0201 絡合物的腫瘤的T細胞受體（TCR)結構域之間的融合蛋白。當時與PBS治療比較時，靜脈 內給藥ALT-801顯著地延長帶有MB491UC原位肌肉侵入性和淺表性膀胱癌的C57BL/6小鼠 的存活。以ALT-801治療的小鼠亦存活以MB491UC腫瘤細胞的再激發（rechallenge)，表 示長效免疫反應和長期記憶。額外地，裸鼠中，ALT-801展現針對人類膀胱癌HLA-A*0201 +/ P53+UMUC-14和HLA-A*0201-陰性/p53+KU7異體移植的強效抗腫瘤活性，證實ALT-801的 TCR結構域目標活性對于功效是不需要的。UMUC-14和KU7異體移植模式中，ALT-801與吉 西他濱的組合顯示較吉西他濱+順鉑（GC)化學療法更佳的抗腫瘤效果和更低毒性，盡管這 些腫瘤細胞對GC有不同敏感性。
[0184] 實施例2 :ALT-801與吉西他濱和順鉑的組合對裸鼠中人類膀胱癌UMUC-14的原發 腫瘤生長的效果。
[0185] 單獨c264scTCR-IL2 (ALT-801)和其與吉西他濱和順鉑的組合的多發性劑量給藥 的抗腫瘤功效是在帶有人類膀胱UMUC-14和KU7P細胞的無胸腺裸鼠中的原發腫瘤評估。用 吉西他濱和順鉑療方的治療是轉移性膀胱癌患者的照護標準。為了評估這些化學治療劑對 人類膀胱癌細胞的體外效果，以單獨吉西他濱和順鉑和其組合治療HLA-A2 +p53+UMUC-14細 胞。24小時培育之后，由于G0/G1細胞周期遏止，吉西他濱、順鉑以及吉西他濱+順鉑造成 UMUC-14細胞增殖的劑量依賴性減少。此等結果與此等藥劑在細胞生長的作用機轉一致。 與吉西他濱+順鉑的組合在體外培育亦誘發在UMUC-14腫瘤細胞表面上呈現p53勝肽（氨 基酸264至272)/HLA-A*0201絡合物，表示藉由這治療提升ALT-801的抗原目標。
[0186] 使用細胞增殖測定法進一步評估人類膀胱腫瘤細胞系對吉西他濱和順鉑的敏感 性。將UMUC-14和KU7P細胞平鋪于含有多種量的吉西他濱和順鉑的培養基，并且在24小 時后使用WST-I試劑測定細胞增殖。經發現吉西他濱以2030 μΜ的IC5tl抑制UMUC-14細胞 生長，而以0. 05μΜ的IC5tl抑制KU7P細胞生長。順鉑亦顯示對KU7P細胞（IC5(l，1.4yM)有 較UMUC-14細胞（IC 5(I，9.2 μ M)更大的抑制。整體上，這些結果說明UMUC-14細胞生長對化 學治療劑相對有抗性，KU7P細胞生長則對化學治療劑敏感。
[0187] 接著，評估吉西他濱、順鉑以及ALT-801治療在帶有皮下UMUC-14人類膀胱腫 瘤的裸鼠中的抗腫瘤效果。在這研宄中，四組帶有UMUC-14腫瘤的小鼠（5只小鼠/群 組）進行研宄藥物治療的兩個周期，各周期持續3周。至于ALT-801與吉西他濱及順 鉑（Gem+Cis+ALT-801)的組合，順鉑（Cis) (3mg/kg)是在研宄第1天（SDl)和SD22靜 脈內給藥，吉西他濱（Gem) (40mg/kg)是在SD1、SD8、SD22以及SD29靜脈內給藥，以及 ALT-801 (I. 6mg/kg)是在 SD3、SD5、SD8、SD10、SD24、SD26、SD29 以及 SD31 (圖 1)靜脈內 給藥。其它研宄實驗組包含ALT-801單一療法、Gem+Cis組合療法或PBS依適當的預定表 給予。與以PBS治療的小鼠中所觀察到者比較，三種測試的治療療方（Gem+Cis+ALT-801 ; ALT-801 ;Gem+Cis)各造成統計學上顯著地減少皮下UMUC-14人類膀胱腫瘤的生長（圖1)。 三個實驗組之間，Gem+Cis+ALT-801顯示最佳功效，其中腫瘤生長抑制（TGI)(相對于以PBS 治療的小鼠中的腫瘤）為 87%，接著 ALT-801 (77% TGI)和 Gem+Cis (52% TGI)。以 Gem+Cis 治療看見的腫瘤體積的減少僅在治療的第二周期的期間觀察到，而且可已部分歸因于大腫 瘤的斷裂或壞死，而不是導向抗腫瘤活性。ALT-801與吉西他濱和順鉑治療的組合無顯著地 減少小鼠體重，而且無觀察到死亡率或毒性的治療后征兆，暗示治療療方是安全的。
[0188] 實施例3:ALT-801或MART-lscTCR/IL-2融合蛋白與吉西他濱的組合對裸鼠中 UMUC-14人類膀胱癌的原發腫瘤生長的效果。
[0189] 進行這作為追蹤的研宄評估ALT-801 (c264scTCR-IL2)加上吉西他濱和非目標性 的cTCR/IL-2融合蛋白（MART-lscTCR/IL-2)加上吉西他濱的多發性劑量給藥對帶有人 類膀胱UMUC-14細胞的無胸腺裸鼠的原發腫瘤生長的抗腫瘤功效。ALT-801 (c264scTCR/ IL-2)識別展示p53 (氨基酸264至272) /HLA-A*0201絡合物的腫瘤細胞，而且已證 實抑制無胸腺裸鼠中的HLA-A*0201+/p53 +皮下腫瘤的生長（Belmont,等人2006Clin Immunoll. 121:29, Wen,等人 2008Cancer Tmmunol Immuother. 57:1781)。MART-lscTCR/ IL-2為一種不同的scTCR/IL-2融合蛋白，識別以HLA-A*0201的形式呈現的MART-I (氨 基酸27至35)勝肽，但非p53(氨基酸264至272)/HLA-A*0201。這蛋白質已在與 HLA-A*0201+/p53+皮下腫瘤的研宄中作為非目標性的控制試劑。ALT-801和MART-lscTCR/ IL-2展現相當的結合細胞表面IL-2受體和刺激NK細胞反應的能力。然而，針對小鼠模式 中的皮下HLA-A*0201 +/p53+A375人類黑色素瘤腫瘤，ALT-801展現較MART-1 scTCR/IL-2更 佳的抗腫瘤活性（Wen,等人2008Cancer Immunol Immunother. 57:1781)。此效果可能是由 于ALT-801蛋白質的腫瘤特異性識別。
[0190] 評估ALT-801和MART-lscTCR/IL-2與吉西他濱的組合的功效，以測定腫瘤對 scTCR/IL-2融合蛋白的抗腫瘤活性的貢獻，接收吉西他濱加上順鉑的帶有腫瘤的小鼠作為 這研宄的對照組。
[0191] 帶有皮下UMUC-14腫瘤（平均體積為80mm3)的無胸腺裸鼠（4只動物/群組）是 以吉西他濱（40mg/kg) (Gem)加上順鉬（3mg/kg) (Cis)、ALT-801 (I. 6mg/kg)加上Gem(40mg/ kg)或 MART-lscTCR/IL-2(2.4mg/kg，ALT-801 的劑量相當活性）加上 Gem(40mg/kg)靜脈 內治療（i.v.)，給兩次治療周期。第一治療周期是由在第一周期中的研宄第1天（SDl)的 Cis注射，SD 1和SD 8的兩次Gem注射，以及SD 3、SD 5、SD 8以及SD 10的ALT-801或 MART-lscTCR/IL-2的四次注射所組成。11天休息期（SD 15至SD 21)之后，使用與第一周 期中的相同療方進行此研宄的第二治療周期，接著進行6天追蹤期（SD42至SD47)。
[0192] 相較于以Gem+Cis治療的小鼠中所觀察到者，使用ALT-801+Gem或MART-lscTCR/ IL-2+Gem的治療造成皮下UMUC-14人類膀胱腫瘤的生長的統計學上顯著的減少（圖2)。 整體上，無發現ALT-801+Gem和MART-lscTCR/IL-2+Gem治療之間的抗腫瘤活性有顯著的差 異，雖然ALT-801+Gem顯示療程期間有較佳抗腫瘤功效的趨勢。這些結果確認先前結果證 實這模式中的ALT-801治療療方的強效抗腫瘤活性。額外地，從非目標性的MART-lscTCR/ IL-2融合蛋白所觀察到的功效說明了 UMUC-14人類膀胱異體移植亦對以IL-2為主的療法 高度敏感。因此，這數據證實ALT-801的c264scTCR組分的目標活性對于其針對UMUC-14 膀胱腫瘤細胞的強效功效是必要的。與實施例2 -起，結果清楚說明IL-2融合蛋白與化學 療法（吉西他濱+順鉑或吉西他濱）的組合造成針對人類膀胱腫瘤的有效治療，包含對化 學治療劑有抗性的腫瘤細胞。
[0193] 治療療方的期間無觀察到死亡或毒性的治療后征兆。在療程期間的數個時間點， 相較于以Gem+C治療的動物，ALT-801+Gem和MART-lscTCR/IL-2+Gem實驗組中觀察到顯著 的體重流失。然而，ALT-801+Gem和MART-lscTCR/IL-2+Gem實驗組兩者的小鼠體重平均值 在11天休息期和一周追蹤期的期間快速復原。這些發現證實此模式中充分忍受有短暫毒 性的 ALT-801+Gem 和 MART-lscTCR/IL-2+Gem 治療療方。
[0194] 實施例4 :ALT-801或MART-lscTCR/IL-2融合蛋白與吉西他濱的組合對裸鼠中的 UMUC-14和KU7人類膀胱癌的原發腫瘤生長的效果。
[0195] 進行這些研宄以評估ALT-801 (c264scTCR/IL-2)與吉西他濱的組合或吉西他濱 和順鉑及非目標性的scTCR/IL-2融合蛋白（MART-lscTCR/IL-2)與吉西他濱的組合對帶有 人類膀胱UMUC-14或KU7P細胞的無胸腺裸鼠中的原發腫瘤生長的多發性劑量給藥的抗腫 瘤功效。帶有腫瘤的小鼠接收PBS或Gem加上Cis作為這研宄的對照組。Gem和Cis為轉 移性膀胱癌患者的照護標準化學療法。
[0196] 帶有皮下UMUC-14腫瘤（平均體積為84mm3)的無胸腺裸鼠（5只動物/群組）是以 卩85、66111(4〇11^/1^)加上（^8(311^/1^)、嫩1?1'-18(31'0?/11^-2(2.1911^/1^41^-801的劑量相當 活性）加上 Gem(40mg/kg)、ALT_801 (I. 6mg/kg)加上 Gem(40mg/kg)或 ALT-801 (I. 6mg/kg) 加上Gem(40mg/kg)和Cis(3mg/kg)治療，給兩次周期的治療。第一治療周期是由第一周期 的研宄第9天（SD9)的Cis注射，SD 9和SD16的兩次Gem注射，以及SD 11、SD 13、SD 16 以及SD 18的ALT-801或MART-1 scTCR/IL-2的四次注射。11天休息期（SD 19至SD 30) 之后，使用與第一周期中相同的療法進行這研宄的治療的第二周期，接著進行10天休息期 (SD40 至 SD49)。
[0197] 相較于以PBS治療的小鼠中所觀察到者，使用MART-lscTCR/IL-2+Gem、 ALT-801+Gem或ALT-801+Gem+Cis的治療造成皮下UMUC-14人類膀胱腫瘤的生長有統計學 上顯著的減少（圖3)。觀察到統計學上顯著減少的生長，即使腫瘤的一些表面破裂明顯地 影響PBS (從SD38開始）和Gem+Cis (從SD29開始）組中的腫瘤體積測量的精確度。實驗 組 MART-lscTCR/IL-2+Gem、ALT-801+Gem 以及 ALT-801+Gem+Cis 之間沒發現抗腫瘤活性有 顯著差異，雖然ALT-801+Gem+Cis顯示目前研宄的療程期間有較佳抗腫瘤功效的趨勢。這 些結果證實于先前結果所顯現的此動物模式中的ALT-801治療療方的強效抗腫瘤活性。額 外地，所觀察到的非目標性的MART-lscTCR/IL-2融合蛋白功效說明UMUC-14人類膀胱異體 移植亦對以IL-2為主的療法高度敏感。因此，這數據進一步證實ALT-801的264scTCR組 分的目標活性對其針對UMUC-14膀胱腫瘤細胞的強效功效是不需要的。
[0198] 治療療方期間無觀察到死亡。然而，在療程期間的數個時間點，相較于未以Cis 治療的動物，Gem+Cis和ALT-801+Gem+Cis實驗組中無觀察到顯著的體重流失（圖4)。 藉由使用Cis和從體重流失緩慢恢復表示這模式中的Cis的更高毒性，無發現抗腫瘤活 性的顯著差異。這些結果顯示在此治療中Cis不提供治療益助。當與PBS群組比較時， ALT-801+Gem和MART-lscTCR/IL-2+Gem實驗組兩者中亦發現體重流失，然而，ALT-801+Gem 和MART-lscTCR/IL-2+Gem實驗組兩者中的小鼠體重平均值在11天休息期和13天追蹤期 的期間快速復原。這些發現證實這模式中充分忍受ALT-801+Gem和MART-lscTCR/IL-2+Gem 治療療方的短暫毒性。
[0199] 隨著后續追蹤，使用不同的人類膀胱腫瘤細胞系KU7P以進一步評估ALT-801和 MART-lscTCR/IL-2與Gem或Gem+Cis的組合的功效。細胞系是HLA-A*0201陰性和過度 表達P53的細胞系，而且不展示ALT-801或MART-lscTCR/IL-2分子識別的抗原。因此， 這模式的結果可提供進一步scTCR/IL-2融合物與Gem的組合的"非目標性"的抗腫瘤活 性的證據針對裸鼠中的原發人類膀胱腫瘤異體移植是有效的。接收PBS或Gem+Cis的帶 有腫瘤的小鼠作為這研宄的對照組。帶有皮下KU7P腫瘤（除了 PBS群組[約70mm3]之 夕卜，平均體積為81mm3)的無胸腺裸鼠（5只動物/群組）是以PBS、Gem(40mg/kg)加上 Cis(3mg/kg)、MART-lscTCR/IL-2(2. 19mg/kg，ALT-801 的劑量相當活性）加上 Gem(40mg/ kg)、ALT_801(1.6mg/kg)加上 Gem(40mg/kg)或 ALT_801(1.6mg/kg)加上 Gem(40mg/kg)和 Cis(3mg/kg)治療，給兩次治療周期。第一治療周期是由第一周期中的研宄的第7天（SD 7)的Cis注射所組成的，SD 7和SD 14的兩次Gem注射，以及SD 9、SD 11、SD 14以及SD 16的ALT-801或MART-lscTCR/IL-2的四次注射所組成。11天休息期（SD 17至SD 27)之 后，使用與第一周期中相同的療方進行這研宄的第二治療周期，接著進行6天追蹤期（SD37 至 SD45)。
[0200] 相較于以PBS治療的小鼠中所觀察到者，使用Gem+Cis、MART-lscTCR/IL-2+Gem、 ALT-801+Gem或ALT-801+Gem+Ci s的治療造成皮下KU7P人類膀胱腫瘤的生長的統計 學上顯著的減少（圖5)。整體上，雖然ALT-801+Gem+Cis顯示較佳的抗腫瘤功效的趨 勢走向，療程期間無發現實驗組Gem+Cis、MART-IscTCR/IL-2+Gem、ALT-801+Gem以及 ALT-801+Gem+Cis之間的抗腫瘤活性有統計學上顯著的差異（亦即，相較于Gem+Cis)。這 些結果與以上參考的研宄結果一致，所述研宄結果證實于UMUC-14膀胱腫瘤異體移植模式 中ALT-801和MART-lscTCR/IL-2治療療方的強效抗腫瘤活性。額外地，觀察到的ALT-801 和MART-lscTCR/IL-2與Gem的組合對裸鼠中的HLA-A*0201-陰性/過度表達p53的KU7P 的人類膀胱腫瘤的非目標性的功效說明KU7P人類膀胱異體移植對以Gem+IL-2為主的療法 高度敏感。因此，這數據進一步證實ALT-801的264scTCR組分的目標活性對于與Gem的組 合對于針對KU7P膀胱腫瘤細胞的強效功效是不需要的。這研宄的結果亦說明Gem+Cis療 方對于抑制KU7P膀胱腫瘤的生長較UMUC-14膀胱腫瘤模式中更有效，而且ALT-801針對這 些膀胱癌細胞是有效的，但不論其對Gem+Cis療方的敏感性。這些結果與上述KU7P細胞 的體外敏感性和UMUC-14細胞對吉西他濱和順鉑的抗性一致。發現單獨以IL-2融合蛋白 ALT-801或MART-1 scTCR/IL-2或其與Gem+Cis的組合治療針對化學療法敏感和有抗性膀胱 腫瘤兩者是有效。
[0201] 治療療方期間無觀察到死亡。然而，與以上參考的研宄一致，相較于無以Cis治 療的動物，Gem+Cis和ALT-801+Gem+Cis實驗組中觀察到顯著的體重流失（圖6)。以上說 明，KU7P膀胱腫瘤對Cis敏感，并且在當給藥ALT-801+Gem的組合時展現稍微較佳的抗腫 瘤活性。然而，從Cis實驗組中流失的體重的緩慢恢復表示Cis的較高毒性，因此，這模式 中有不理想的治療指數。當與PBS組比較時，ALT-801+Gem和MART-lscTCR/IL-2+Gem實驗 組兩者中亦發現體重流失，尤其是在第2治療周期中，然而，ALT-801+Gem和MART-lscTCR/ IL-2+Gem實驗組兩者的小鼠體重平均值在11天休息期和8天追蹤期的期間快速復原。這 些發現暗示這模式中充分忍受ALT-801+Gem和MART-lscTCR/IL-2+Gem治療療方的短暫毒 性。
[0202] 皮下KU7P膀胱腫瘤異體移植模式中進行相似研宄，以使用上述相同治療方案 檢驗以 Gem(40mg/kg)、MART-lscTCR/IL-2(2. 19mg/kg，ALT-801 的劑量相當活性）或 ALT-801 (I. 6mg/kg)的單一療法的抗腫瘤的效果。如圖7中顯示，相較于以PBS治療的小 鼠中所觀察到者，以Gem、MART-lscTCR/IL-2或ALT-801治療造成皮下KU7P人類膀胱腫瘤 生長的統計學上顯著減少。這效果顯示較低的耐久性，相較于從Gem+MART-lscTCR/IL-2及 Gem+ALT-801組合中所觀察到的其中連續治療后看見少或無的腫瘤再生長（圖3和5)。因 此，IL-2融合蛋白和化學療法（在這情況下是吉西他濱）的組合治療顯示提供針對人類膀 胱腫瘤的最有效抗腫瘤活性。
[0203] 實施例5:ALT-801對帶有MB491uc原位肌肉侵入性膀胱腫瘤的C57BL/6和白子 C57BL/6小鼠的存活的效果。ALT-801的TCR結構域的目標活性對于抗腫瘤活性是不需要 的。
[0204] 評估ALT-801 (c264scTCR-IL2)的多重劑量給藥對帶有同源MB491uc原位肌肉侵 入性膀胱腫瘤的免疫活性C57BL/6和白子C57BL/6小鼠的存活的效果。因為這些腫瘤缺 乏ALT-801所辨識的p53 (氨基酸264至272) /HLA-A*0201絡合物，這研宄是設計成評估 ALT-801針對膀胱癌的"非目標性"的抗腫瘤活性。
[0205] 使用免疫活性白子C57BL/6小鼠中的相關和可繁殖的小鼠膀胱癌模式（鼠胱癌細 胞系MB491uc)以評估ALT-801的功效。MB491uc細胞系表達螢光素酶，允許其使用生物發 光測定法偵測。在研宄第0天，膀胱的胰蛋白酶-EDTA預處理后，對白子C57BL/6小鼠（17 周齡）的膀胱內滴注入MB491uc(lx IO6個細胞/膀胱）。MB491UC腫瘤細胞滴注后第9、 16、23以及30天，靜脈內給藥？85(11 = 5)或41^-801(1.611^/1^，11 = 4)。維持小鼠以評估 腫瘤滴注之后實驗組之間的存活率作為功效端點。相較于PBS，ALT-801顯著地延長帶有 MB491UC的小鼠的存活率（P = 0. 0171)(圖8)。ALT-801實驗組中存活的動物于最初滴注 之后第84天以膀胱內滴注MB491UC細胞（lx IO6個細胞每小鼠）而再激發。額外地，將首 次接受試驗的C57BL/6對照小鼠于同日滴注腫瘤細胞，以作為對照組。于以MB491UC細胞 再激發之后第16天，進行以螢光素酶為主的成像偵測MB491UC細胞。先前以ALT-801治療 的群組的腫瘤細胞再激發的小鼠無顯示生物發光腫瘤信號，而首次滴注MB491UC的小鼠顯 示腫瘤細胞信號的證據，證實先前以ALT-801治療的群組的小鼠對MB491uc腫瘤細胞的再 植入有抗性。卡普蘭-邁耶存活曲線顯示先前以ALT-801治療的群組再激發的小鼠的存活 較首次滴注MB491uc的小鼠為顯著更長（P = 0. 0246)。
[0206] 同樣地，于另一種實驗中，膀胱的聚賴氨酸預處理之后，在研宄第0天，對C57BL/6 小鼠（9至10周齡）的膀胱內滴注MB491uc (0. 075x IO6個細胞/膀胱）。在MB491uc腫瘤 細胞滴注之后第7、14、21以及28天，靜脈內給藥PBS(n = 6)或ALT-801(1.6mg/kg，η = 6)。維持小鼠，以評估實驗組之間的存活率作為功效端點。相較于以PBS，ALT-801顯著地延 長帶有MB491UC的小鼠的存活率（P = 0. 007)(圖9A)。最初滴注之后第62天，對ALT-801 治療的存活者以膀胱內滴注MB491uc細胞（每只小鼠0.075x IO6個細胞）而再激發。額外 地，將首次接受試驗的C57BL/6對照的小鼠 （η = 2)于同日滴注腫瘤細胞以作為對照。接 著，于以MB491UC細胞再激發之后第16天進行成像。先前以ALT-801治療的群組的腫瘤細 胞再激發的小鼠無顯示生物發光腫瘤信號，而首次滴注MB491UC的小鼠顯示腫瘤細胞信號 的證據，暗示先前以ALT-801治療的小鼠對MB491uc腫瘤細胞的再植入有抗性（圖9B)。比 起首次接受試驗的小鼠，先前以ALT-801治療的小鼠在再激發之后存活更長，雖然使用卡 普蘭-邁耶分析顯示兩個群組之間的存活時間無統計學上的顯著性（P = 0. 0896)，但可能 是由于每群組中使用小數目的小鼠。
[0207] 在額外的研宄中，進一步評估免疫活性C57BL/6小鼠中的原位MB491UC肌肉侵入 性膀胱癌模式中的ALT-801靜脈內給藥的功效。膀胱的聚賴氨酸預處理之后，在研宄第O 天，將MB491uc(100yL中為0.075x IO6個細胞/膀胱）膀胱內滴注入C57BL/6小鼠（10至 11周齡）的膀胱。在18491此腫瘤細胞滴注后第7、14、21以及28天，將？85(11=10)或 ALT-801 (I. 6mg/kg，η = 10)靜脈內給藥。維持小鼠，以評估腫瘤滴注之后實驗組之間的存 活率作為功效端點。相較于PBS，ALT-801顯著地延長帶有MB491UC的小鼠的存活率（Ρ = 0. 0201)(圖10)。與這模式的先前研宄一致，觀察到的針對原位MB491UC肌肉侵入性膀胱 腫瘤的ALT-801抗腫瘤效果與ALT-801融合蛋白的抗原目標活性無關。
[0208] 總而言之，這些結果證實ALT-801靜脈內治療對于延長帶有同源性MB491uc原位 肌肉侵入性膀胱腫瘤的免疫活性小鼠的存活時間是有效的。ALT-801治療亦提供針對彼等 先前暴露的腫瘤的耐久性免疫記憶反應。這些效果與ALT-801融合蛋白的目標活性無關。
[0209] 實施例6 :ALT-801的靜脈內給藥延長帶有MB491uc的C57BL/6原位淺表性膀胱腫 瘤的小鼠的存活。
[0210] 進行這研宄以評估當以多重劑量療方經由靜脈內（i. V.)注射給藥時，ALT-801對 帶有鼠 MB491UC原位淺表性膀胱腫瘤的C57BL/6小鼠的存活的效果。這研宄采用先前實施 例中描述的免疫活性C57BL/6小鼠中的相關和可繁殖的鼠 MB491UC膀胱癌模式。已證實滴 注后1至2天，將MB491UC細胞膀胱內滴注入C57BL/6小鼠的膀胱造成膀胱癌的淺表性形 式。滴注后第7至9天惡化成肌肉侵入性形式的腫瘤，而且在第2至3周后觀察到腫瘤介導 的死亡。在本研宄中，在帶有衍生自MB491UC細胞的鼠原位淺表性膀胱癌的C57BL/6小鼠 中檢驗靜脈內給藥ALT-801的存活益助。由于這些腫瘤缺乏ALT-801識別的人類p53(氨 基酸264至272)/HLA-A*0201絡合物，此研宄是設計成評估ALT-801針對小鼠原位淺表性 膀胱癌的"非目標性"的抗腫瘤活性。
[0211] 聚賴氨酸預處理膀胱之后，在研宄第0天，將MB491uc(100yL中的0. 075x IO6細 胞/膀胱）膀胱內滴注入C57BL/6小鼠（9至11周齡）的膀胱。在腫瘤細胞滴注后第1、 8、15、20、23以及27天，靜脈內給藥？85(11 = 8)或41^-801(1.611^/1^，11 = 20)。當與？83 對照比較時，ALT-801的靜脈內給藥顯著地延長小鼠的存活（P = 0. 0497)(圖11)。
[0212] 在另一種實驗中，聚賴氨酸預處理膀胱后，在研宄第0天，對C57BL/6小鼠（9至11 周齡）膀胱內滴注MB491UC細胞（0.075x IO6個細胞/膀胱）。腫瘤滴注之后，一組小鼠 (ALT-801 "lx 4"，n = 9)在SD1、SD8、SD15以及SD22經由側尾靜脈以靜脈內注射I. 6mg/ kg ALT-801 每周四次而治療，第二組小鼠（ALT-801"2x 4"，n = 9)在 SD1、SD4、SD8、SD12、 SD15、SD19、SD22以及SD26以I. 6mg/kg ALT-801注射八次（每周兩次，共四周）而治療， 以及對照組（η = 8)在 SD1、SD4、SD8、SD12、SD15、SD19、SD22 以及 SD26 以 PBS(K)O yL) 治療。當與PBS對照組比較時，1.6mg/kgALT-801的"lx 4"和"2χ 4"治療療方兩者顯著 地延長小鼠的存活（分別為 P = 〇· 0413 和 P = 0· 0010)。PBS、ALT-801 "lx 4"（圖 12Α) 和ALT-801 "2x 4"（圖12B)組的存活時間中位數分別為15. 5、19以及22天。結果暗示 ALT-801的每周兩次給藥提供針對鼠 MB491uc原位淺表性膀胱癌的最佳抗腫瘤活性。觀察 到的試驗對象的抗腫瘤效果與ALT-801融合蛋白的抗原目標活性無關。
[0213] 實施例7 :帶有MB491UC原位膀胱腫瘤的C57BL/6小鼠的ALT-801治療誘發免疫 細胞。
[0214] 進行這研宄以評估帶有鼠 MB491uc原位膀胱腫的C57BL/6小鼠瘤的ALT-801治療 的以免疫細胞為主的機轉作用。如上述，在聚賴氨酸預處理膀胱后，在研宄（SD)第O天，對 C57BL/6小鼠膀胱內滴注MB491UC細胞（0. 075x IO6個細胞/膀胱）。沒有腫瘤滴注的小鼠 作為對照。接著，在SD 7、10、14以及17,將小鼠（6只/群組）以PBS或ALT-801 (1.6mg/ kg)靜脈內治療。各治療之后三天（亦即，SD 10、13、17、20)，犧牲小鼠群組，檢驗膀胱的腫 瘤惡化（血尿、膀胱尺寸、外觀、新血管形成以及形態學），并且收集血液、脾臟以及膀胱以 進行免疫細胞分析。從血液制備PBMC，從脾臟制備細胞懸浮液，并且將膀胱固定且切割成區 塊以進行免疫組織化學染色。將PMBC中的免疫細胞（⑶3、NK以及⑶8陽性細胞）及脾細 胞以單克隆抗體染色，并且以流式細胞儀分析。以IHC評估膀胱剖面中的免疫細胞（巨噬 細胞、NK以及CD3陽性細胞），并且以H&E染色檢驗腫瘤細胞。額外地，在整個研宄中，從動 物收集尿，以ELISA評估尿中細胞活素濃度（IFNy和TNF α )。
[0215] 與先前研宄相似，MB491uc細胞的膀胱內滴注造成膀胱中的原位腫瘤建立和造成 此等腫瘤在7至20天內快速發展成肌肉層（圖13)。這些變化藉由增加血尿、膀胱的新血 管形成以及膀胱尺寸和其它外觀的變化增加反映。如先前研宄中，以ALT-801治療逆轉這 些變化，造成在SD20的正常外觀的膀胱（圖13)。然而，值得一提的是帶有MB491UC腫瘤或 正常小鼠的ALT-801治療造成浸透入膀胱的免疫細胞增加。PBMC和脾臟中亦反映這些變 化，其中ALT-801治療造成帶有MB491uc腫瘤或正常的小鼠兩者中的⑶3、⑶8以及NK細胞 的增加（圖14A和14B)。伴隨連續的ALT-801治療，經誘發的免疫細胞（除了 PBMC⑶8細 胞）在SD20回復正常水平。在膀胱中，ALT-801治療最明顯地影響巨噬細胞水平，特別是 SDlO的帶有動物的腫瘤中（圖15)。將膀胱剖面中的染色的巨噬細胞水平定量，并且在圖 16中顯示繪制的數據。結果說明ALT-801治療在正常小鼠（圖16A)和帶有MB491uc-腫瘤 的小鼠（圖16B)兩者中造成膀胱巨噬細胞水平顯著的增加。在帶有小鼠的腫瘤中，膀胱形 態學恢復正常時，經誘發的巨噬細胞水平在SD20恢復幾乎正常的水平。以ALT-801治療的 小鼠中亦見到NK和CD3陽性細胞的相似但較不顯著的變化。這些結果暗示膀胱中的巨噬 細胞和其它免疫細胞亞型的ALT-801誘發負責于此模式中所觀察到的抗膀胱腫瘤效果。
[0216] 尿中的細胞活素水平分析亦說明ALT-801治療造成免疫反應的刺激。各劑量 的ALT-801之后，從帶有MB491UC腫瘤的小鼠的尿中偵測到增加的IFNy濃度（圖17A)。 ALT-801治療無誘發這些動物的尿中的TNF α濃度（圖17B)。然而，以PBS治療的帶有腫 瘤的小鼠的TNFa濃度隨著時間增加，暗示腫瘤生長和尿TNFa濃度之間的因果關系。在 癌癥患者中觀察到ALT-801介導的血清IFNy的誘發和血清TNF a水平的治療效果的缺乏 (Fishman 等人（2011)Clin Cancer Researchl7:7765)，表示這是對 ALT-80 治療的常見免 疫反應。這些觀察共同支持產生IFNy的免疫細胞（可能為巨噬細胞）在ALT-801治療后 所觀察到的抗腫瘤活性的角色。
[0217] 實施例8 :多發性骨髓瘤的鼠模式中的小鼠的ALT-801增加的存活。
[0218] 為了調查融合蛋白ALT-801 (c264scTCR-IL2)的效果和作用機轉，對多發性骨髓 瘤的免疫活性C57BL/6小鼠模式以多發性劑量療方給藥。使用5T33P細胞（5T33骨髓瘤細 胞系的衍生物）發展人類多發性骨髓瘤的可繁殖的鼠模式。相較于PBS，ALT-801顯著延長 帶有5T33P骨髓瘤的小鼠的存活，且比起首次滴注5T33P的小鼠，ALT-801組的再激發小鼠 的存活顯著更長。這些效果與ALT-801融合蛋白的目標活性無關，而且說明ALT-801提供 針對牠們先前暴露的腫瘤有耐久性免疫記憶反應的小鼠。
[0219] 如上說明，多個研宄已顯示ALT-801展現針對缺乏T細胞的免疫缺陷小鼠的異體 移植模式中的HLA-A*0201 +/p53過度表達（p53+)的人類黑色素瘤、哺乳動物腺癌、膀胱癌以 及胰臟癌瘤的強效活性。由于CD8效應物T細胞可貢獻ALT-801的抗腫瘤活性，發展免疫 活性小鼠中的額外合成的腫瘤模式以進一步評估ALT-801的功效。這些腫瘤缺乏p53勝肽 (氨基酸264至272) /HLA-A*0201絡合物的表達。因此，這些模式中檢驗的ALT-801效果與 以scTCR為目標無關。基于免疫調節性分子對多發性骨髓瘤的已知抗癌癥效果，發展免疫 活性小鼠中的鼠骨髓瘤模式，并且使用以評估ALT-801的功效和作用機轉。
[0220] 鼠5T33骨髓瘤細胞，C57BL/KaLwRij小鼠中自發性地產生的一系列的可移植鼠骨 髓瘤中的一者，在C57BL/KaLwRij小鼠中是高度致瘤性，少至500個細胞即誘發癱瘓且早 在腫瘤植入后第36天死亡。5T33衍生細胞系，5T33P，是單離自先前已滴注lx IO7個親代 5T33細胞系而癱瘓的C57BL/6小鼠。在這模式中，需要給予至少lx IO7個5T33P細胞以造 成C57BL/6小鼠癱瘓的接受率為大約100%。通常，注射lx IO7個5T33P細胞的小鼠顯示 腫瘤接種后SD20和SD30之間的后腿癱瘓征兆。除了癱瘓以外，亦可使用BM細胞表達5T33 產生的IgG2b副蛋白質，以評估這模式中的腫瘤惡化狀態。
[0221] 在最初研宄中，體外評估ALT-801對5T33P細胞生長的直接效果。細胞凋亡分析 說明500nM的ALT-801不影響5T33P細胞增殖，并且誘發細胞凋亡。基于先前非臨床研宄， 預期這ALT-801水平是在治療范圍內。因此，ALT-801不出現對5T33P細胞具有直接的細 胞毒性效果。
[0222] 接著，檢驗帶有鼠5T33P骨髓瘤腫瘤的免疫活性C57BL/6小鼠中的ALT-801的 體內抗骨髓瘤活性。研宄天=O(SDO)時，將雌性C57BL/6小鼠（5只小鼠/群組）經由 側尾靜脈以靜脈內注射5T33P腫瘤細胞（lx IO7/小鼠）。腫瘤細胞注射之后，接著開始1 天（ALT-801-SD1實驗組）或4天（ALT-801-SD4實驗組）多重劑量ALT-801治療。至于 ALT-801-SD1 實驗組，在 SDI、SD4、SD8 以及 SD11，靜脈內給藥 1. 6mg/kg 的 ALT-801 (亦即， 4劑量）。同日，帶有5T33P腫瘤的小鼠接收PBS(劑量相當的體積）以作為對照。至于 ALT-801-SD4 實驗組，在 SD4、SD8、SD11 以及 SD15ALT-801，以 1.6mg/kg 靜脈內給藥。監控 小鼠的癱瘓或腫瘤生長和存活的臨床征兆。展現后腿癱瘓的小鼠被認為是垂死。PBS組的 所有小鼠在SD22和SD34之間顯示癱瘓征兆，而且這群組在腫瘤細胞給藥后具有29天的存 活中位數。相反地，ALT-801-SD1和ALT-801-SD4組的所有小鼠在SD73 (ALT-801-SD1組的 觀察期結束）存活，表示這些小鼠的5T33P腫瘤被治愈。因此，當時與PBS對照組比較時， 發現在SDl或SD4開始的多重劑量ALT-80治療顯著地延長帶有5T33P骨髓瘤的小鼠的存 活（ALT-801-SD1 相對 PBS，Ρ〈0· 002 ;ALT-801-SD4 相對 PBS，Ρ〈0· 002)。ALT-801-SD4 組和 ALT-801-SD1組之間無觀察到明顯差異（PM). 05)。這些結果說明ALT-801治療對這免疫活 性小鼠模式的5T33P骨髓瘤細胞是高度有效。
[0223] 為了評估ALT-801治療是否提供長期抗腫瘤效果，對以骨髓瘤細胞先前挑戰后存 活的以ALT-801治療的小鼠再給藥5T33P骨髓瘤細胞。將ALT-801-SD1實驗組的小鼠 （η =5)在SD73 (最初腫瘤細胞挑戰后）以lx IO7個5Τ33Ρ細胞再激發，以及將ALT-801-SD4 實驗組的小鼠 （η = 5)在SD106以lx 1075Τ33Ρ個細胞再激發。在各個情況下，亦將五個 未接受治療的小鼠注射lx IO7個5Τ33Ρ細胞，以作為腫瘤惡化的對照。無對任何的研宄組 進一步給藥ALT-801研宄藥物治療。腫瘤細胞再激發之后，所有五只ALT-801-SD1小鼠存 活，直到SD192實驗終止，而所有五只在SD73接收5T33P細胞的首次接受試驗的小鼠顯示 在SD89和SD107之間癱瘓和在腫瘤細胞給藥后有16天的存活中位數。同樣地，所有五只 ALT-801-SD4小鼠存活直到SD192,而五只在SD106接收5T33P細胞的首次接受試驗的小鼠 中有四只顯示在SD124和SD138之間癱瘓和在腫瘤細胞給藥后有32天的存活中位數。總 體上，5T33P骨髓瘤細胞再激發之前給100天的ALT-801治療顯著地保護小鼠免于癱瘓和 死亡。共同地，這些結果展現不僅是ALT-801針對5T33P骨髓瘤的功效，也有其誘發長效免 疫記憶的能力。以上數據亦說明T細胞及/或NK細胞子集的活化效應物和記憶細胞可在 ALT-801針對5T33P腫瘤細胞的抗腫瘤活性中扮演了至關重要的作用，而且這些免疫細胞 可能可作用至少三個月來保護C57BL/6小鼠免于腫瘤再激發。
[0224] 治療療方期間無觀察到死亡。在大部分情況下，在PBS和首次接受試驗的實驗組 中的小鼠展現后腿癱瘓之前，即觀察到連續顯著的體重流失，其是這模式中的典型征兆。 ALT-801實驗組中無發現顯著的體重流失，與使用ALT-801的其它同基因小鼠模式中所觀 察到者一致。這些發現顯示這模式中充分忍受有短暫毒性的ALT-801治療療法。無論是患 者的HLA-A*0201基因背景，應考慮患者的多發性骨髓瘤中ALT-801治療的臨床評估。
[0225] 相較于PBS，單一劑量ALT-801治療顯著地延長帶有5T33P的小鼠的存活。這些 效果與體外副蛋白質產生測定法所評估的與研宄藥物減少骨髓中的骨髓瘤細胞相關的能 力。相較于PBS群組，以一種或兩種ALT-801劑量治療的帶有5T33P腫瘤的小鼠造成血液中 CD8+T細胞和NK細胞的數目及/或百分比的顯著增加。免疫細胞耗盡研宄證實ALT-801的 抗骨髓瘤活性主要是由于CD8+T細胞，和部分是由于NK細胞。其它免疫細胞亦可在ALT-801 介導的抗骨髓瘤效果中扮演角色。
[0226] 進一步評估ALT-801對C57BL/6小鼠模式中的小鼠5T33P骨髓瘤細胞生長的效果 和功能性機轉。在這研宄的第一部分中，在這模式中評估抗單一劑量ALT-801的腫瘤活性。 將雌性C57BL/6小鼠（5只小鼠/群組）靜脈內注射5T33P骨髓瘤細胞。四天之后，對帶有 5T33P腫瘤小鼠給藥單一靜脈注射的ALT-801(1. 6mg/kg)或PBS (劑量相當的體積）。監控 小鼠的存活作為研宄端點，而當小鼠展現后腿癱瘓的被認為是垂死。PBS組中的所有五只小 鼠在腫瘤細胞注射后第35天觀察到死亡，而且存活中位數為24天。相反地，以ALT-801 治療的小鼠的死亡顯著地延遲，且存活中位數為49天（相對PBS組，P = 0.013)。ALT-801 群組的5只小鼠中的一者在整個120天觀察期間的維持活著。
[0227] 在這研宄的第二部分中，評估5T33P模式中單一劑量ALT-801對骨髓中的骨髓瘤 細胞的短期效果。以ALT-801 (I. 6mg/kg)或PBS治療帶有腫瘤的小鼠，和在治療后第1、4 以及8天收集骨髓細胞。接著將細胞體外培養6天，并且藉由ELISA分析培養上清液中的 產生副蛋白質的5T33P細胞（小鼠 IgG2b)。當與PBS組比較時，ALT-801體內治療造成后 續骨髓培養物中的顯著地較低水平的副蛋白質（P〈〇. 05)。來自ALT-801實驗組的培養物中 看見副蛋白質濃度減少高達30倍。在研宄藥物治療后采集骨髓的所有三個時間點觀察到 這效果。因此，單一劑量ALT-801治療減少骨髓5T33P骨髓瘤細胞（如由副蛋白質產生所 測量）的能力是與ALT-801對延長這模式的延長效果一致。
[0228] 設計進一步的研宄以調查效應物免疫細胞在ALT-801針對免疫活性C57BL/6小鼠 中的小鼠5T33P骨髓瘤細胞的抗骨髓瘤效果中扮演的角色。與先前造成其它非臨床研宄一 致，相較于PBS對照組中所觀察到者，以一種或兩種I. 2mg/kg劑量進行的ALT-801治療帶 有5T33P腫瘤的小鼠造成血液中的CD8+T細胞和NK細胞的數目及/或百分比的顯著增加。 ALT-801治療亦增加血液⑶4+CD25+FoxP3+Treg細胞的百分比。然而，這變化顯著地少于效 應物CD8+T細胞和NK細胞子集所見者，表示其非ALT-801治療的優勢效果。
[0229] 如使用骨髓細胞培養測定法偵測衍生自5T33P的副蛋白質所評估，治療后4天，以 一種或兩種I. 2mg/kg劑量進行的ALT-801治療亦對于減少骨髓中的5T33P骨髓瘤細胞數 目有效。免疫細胞耗盡研宄證實ALT-801的抗骨髓瘤活性是主要由于CD8+T細胞和部分由 于NK細胞。由于⑶8+和NK-細胞耗盡無法完整消除對C57BL/6小鼠中的5T33P腫瘤細胞 的抗腫瘤效果，其它免疫細胞可在ALT-801介導的抗骨髓瘤效果中扮演角色。這些研宄的 結果是與證實ALT-801治療對于延長帶有骨髓瘤的免疫活性小鼠的存活是高度有效的先 前研宄一致。
[0230] 實施例9 :ALT-801顯著地延長帶有MB491uc腫瘤的小鼠的存活。
[0231] 將靜脈內給藥ALT-801的功效與免疫活性C57BL/6小鼠的原位MB491UC肌肉侵入 性膀胱癌模式中的IL-2的功效比較。前臨床動物研宄已說明ALT-801在裸鼠中展現針對 皮下 HLA-A*0201+p53 過度表達（p53+)UMUC-14 和 HLA-A*0201-陰性 p53 過度表達（p53+)的 KU7人類膀胱腫瘤異體移植中有相似的抗腫瘤活性，表示腫瘤細胞上的目標HLA-A*0201/ p53勝肽絡合物對于ALT-801治療效力好像不是必要的。對ALT-801針對免疫活性C57BL/6 小鼠中的鼠 MB491UC原位肌肉侵入性膀胱腫瘤的效果的額外調查亦隱含ALT-801的"非目 標性"的抗腫瘤活性。已知鼠 MB491uc腫瘤細胞缺乏ALT-801所識別的人類HLA-A*0201/ P53勝肽絡合物。臨床研宄已顯示膀胱癌展現對以IL-2為主的療法的適當敏感性。為了 了解ALT-801的抗腫瘤活性，比較膀胱腫瘤模式中的IL-2和ALT-801的抗腫瘤活性是令人 感興趣的。
[0232] 在免疫活性C57BL/6小鼠的小鼠膀胱原位模式中評估ALT-801和IL-2靜脈內治 療的抗腫瘤效果。聚賴氨酸預處理膀胱后，在第〇天，對C57BL/6小鼠（10至11周齡）膀胱 內滴注MB491UC細胞（100 μ L中有3x IO4個細胞/膀胱）。在腫瘤細胞滴注后第7、10、14以 及 17 天，靜脈內給藥 ALT-801 (I. 6mg/kg，n = 8)、IL_2 (0· 42mg/kg，n = 8)或 PBS (100 μ L， η = 8)。當與IL-2和PBS對照比較時，ALT-801的四種靜脈內劑量顯著地延長小鼠的存活 (P < 0. 0002)(圖18)。IL-2和PBS對照組之間無觀察到統計學上顯著差異（P = 0. 84)， 顯示IL-2無抗腫瘤效果。這些結果說明每周兩次的ALT-801治療較針對MB491uc膀胱腫 瘤的重組人類IL-2展現更大的效力。亦從重復研宄獲得相似的結果。
[0233] 實施例1〇^1^_8〇1在1^0、疆或〇)4以及〇)8細胞耗盡后增加帶有]\^49111(3腫瘤 的小鼠的存活。
[0234] 如上述，ALT-801的治療增加帶有MB491uc的小鼠的脾臟和血液中的⑶3+T細胞、 ⑶8+T細胞以及NK細胞百分比。事實上，血液⑶8+T細胞在整個四種劑量的ALT-801療程 保持顯著地提升。帶有MB491UC腫瘤的小鼠中重復用劑ALT-801后，亦觀察到膀胱中有增 加的CD3+T細胞和NK細胞滲透。相反地，無論ALT-801治療，膀胱巨噬細胞水平隨著原位 MB491uc腫瘤惡化而增加。這些結果說明這些免疫細胞子集中的一種或多種在這ALT-801 模式中的抗腫瘤活性中有扮演角色。
[0235] 帶有小鼠 MB491uc原位膀胱腫瘤的C57BL/6小鼠中的M0 NK或CD4以及CD8細 胞耗盡后，評估ALT-801靜脈內注射的抗腫瘤效果。小鼠在SD 0接收MB491UC滴注，并且 接著在SD 7、10、14以及17接收靜脈PBS或ALT-801 (I. 6mg/kg)治療。ALT-801或PBS治 療之前，小鼠群組藉由在SD 6、9、13以及16腹腔內注射Clophosome (150 μ L/劑量）的接 收厘0耗盡；藉由在5〇2、3、6、9、13以及16疆腹腔內注射抗413的疆細胞耗盡（1〇(^1^中 有克隆PK136,250 yg);或藉由在SD 2、3、6、9、13以及16腹腔內注射抗CD4Ab(100yL中 有克隆 GKL 5, 250 μ g)和抗 CD8Ab (100 μ L 中有克隆 53-6. 72, 250 μ g)的 CD4 和 CD8 細胞 耗盡。維持小鼠，以評估研宄組之間的存活率以作為功效端點。
[0236] 相較于PBS控制的小鼠，靜脈內給藥ALT-801顯著地延長小鼠存活（P = 0. 0014) (圖19A)。當比較PBS對照的小鼠時，在已耗盡NK細胞的以ALT-801治療的小鼠中獲得相 似的結果（P = 〇. 0068)(圖19B)。在M0耗盡后廢除的ALT-801治療后（P = 0. 1435)(圖 19C)或在CD4/CD8細胞耗損后廢除的ALT-801治療后（P = 0. 5993)(圖19D)后觀察到存 活的抗腫瘤效果。
[0237] 結果說明M0及/或⑶4/⑶8細胞在ALT-801對帶有小鼠 MB491uc原位膀胱腫瘤 的C57BL/6小鼠的抗腫瘤效果中扮演重要的角色。帶有MB491UC腫瘤小鼠中的NK細胞的 耗盡無顯現對ALT-801的功效有任何效果，暗示NK細胞是不需要的或其它細胞類型補償 ALT-801介導的抗腫瘤反應中的NK細胞活性。
[0238] 有大量文獻顯示衍生自骨髓的抑制或細胞（MDSC)在廣大排列的腫瘤模式中擴 張。MDSC作用以通過各式各樣機轉抑制NK和T細胞。不受限于特定理論，帶有原位MB491uc 腫瘤的小鼠中存在的MDSC可提供免疫抑制性機轉導致腫瘤發展的證據。
[0239] 為了評估這模式中的MDSC濃度，如上述對C57BL/6小鼠膀胱內滴注MB491uc腫瘤 細胞（〇.〇3x IO6個細胞/小鼠）。對照的小鼠無接收腫瘤細胞。在腫瘤細胞滴注后第3、 5、7、10以及13天從對照和帶有腫瘤的C57BL/6小鼠（每組5只）收集血液。以流式細胞 儀評估血液中的GR-l +/CDllb+MDSC水平。帶有腫瘤的小鼠中的血液MDSC水平早在腫瘤細 胞滴注后3天提高，并且進一步增加這些動物中的時間（圖20)。MB491UC細胞滴注之后13 天，相較于對照的小鼠，帶有腫瘤的小鼠的血液MDSC水平顯著地增加。
[0240] 這些發現暗示MDSC可在抑制免疫系統中扮演角色，以促進原位MB491UC腫瘤模 式中的腫瘤生長。進行此研宄以評估不同類型的免疫細胞在腫瘤惡化上扮演的角色和 ALT-801在帶有MB491UC原位膀胱腫瘤的C57BL/6小鼠中的抗腫瘤活性。
[0241] 實施例11 :靜脈內給藥ALT-801增加帶有MB491uc原位膀胱腫瘤的C57BL/6小鼠 的膀胱中的Ml-類型巨噬細胞。
[0242] 在先前的臨床動物研宄中，靜脈內給藥ALT-801延長帶有MB491UC原位小鼠膀胱 癌的C57BL/6小鼠的存活。來自帶有MB491UC腫瘤的小鼠的膀胱的IHC染色在重復用劑 ALT-801之后較以PBS對照治療的小鼠的膀胱中所見者展現更高水平的⑶3和NK細胞滲 透。以F4/80pan巨噬細胞標志偵測巨噬細胞說明，無論治療，腫瘤生長惡化時，更多巨噬細 胞滲入膀胱。進行這研宄，以特征化對帶有MB491UC的小鼠的膀胱中的巨噬細胞的功能性 表型的ALT-801介導的效果。
[0243] 由于其豐度、可塑性以及多樣性，巨噬細胞在固體腫瘤中扮演重要的角色。識別 巨噬細胞的兩個相異的活化狀態：傳統活化的（Ml)表型和另外活化的（M2)表型。各類型 的巨噬細胞具有其本身用于辨識的標志。Ml巨噬細胞的特征包含iNOS的表達、ROS以及 IL-12的產生。M2巨噬細胞是與IL-10、IL-lb、VEGF以及基質金屬蛋白酶（MMP)的大量產 生聯結。
[0244] 這研宄包含兩組實驗組PBS和ALT-801 (3只小鼠/群組）。聚賴氨酸預處理后10 分鐘之后，在研宄（SD)的第0天，將MB491UC細胞（0. 06x IO6個細胞/小鼠）膀胱內滴注 入膀胱。在SD 11，將IOOyL的ALT-801 (1.6mg/kg)或PBS通過尾靜脈以靜脈內注射。治 療的24小時內，犧牲小鼠，并且將其膀胱以液態氮在OCT中急凍。進行IHC染色，以檢查膀 胱中的巨噬細胞的活化狀態。使用iNOS和MMP-9以分別辨識Ml和M2巨噬細胞。
[0245] IHC結果說明相較于以PBS治療的帶有腫瘤的小鼠的膀胱，ALT-801的靜脈注射增 加帶有MB491uc腫瘤的小鼠的膀胱中的Ml類型巨噬細胞（圖21)。除了 ALT-801組中的一 只小鼠，可在PBS和ALT-801組兩者的所有小鼠中偵測到MMP-9陽性細胞。那只特定的小 鼠在ALT-801治療之后似乎無腫瘤，而且即使可偵測到F4/80pan標志無顯示任何iNOS或 MMP-9的陽性染色。這些結果說明由于iNOS和MMP-9是巨噬細胞活化標志，無腫瘤的環境 中不激發巨噬細胞。F4/80抗體染色顯示相較于非帶有腫瘤的小鼠，帶有MB491uc原位腫 瘤的小鼠的膀胱中有實質數目的巨噬細胞。就膀胱巨噬細胞的F4/80抗體染色水平而論， PBS和ALT-80實驗組之間無顯著差異。總結，帶有MB491uc小鼠進行靜脈內ALT-801治療 之后，將膀胱中的更高的巨噬細胞百分比再極化成Ml表型。與ALT-801功效是取決于帶有 MB491uc腫瘤的小鼠中的巨噬細胞的發現一致，這些結果暗示再極化的Ml巨噬細胞可貢獻 ALT-801發揮的抗腫瘤效果。
[0246] 實施例12:ALT-801誘發C57BL/6小鼠中的產生IFN-γ的細胞。
[0247] 先前研宄已證實在免疫活性C57BL/6小鼠中的原位MB491UC肌肉侵入性膀胱癌模 式中的靜脈內ALT-801給藥的抗腫瘤活性。小鼠 MB491UC細胞不表達由ALT-801所識別的 人類p53(氨基酸264至272)/HLA-A*0201絡合物。因此，假設ALT-801針對MB491uc腫瘤 有"非目標性"的抗腫瘤活性。評估ALT-801針對鼠 MB491UC膀胱腫瘤細胞的作用機轉。
[0248] 先前顯示ALT-801治療增加動物模式和癌癥患者中的IFN- γ血清水平 (Fishman 等人，Clin Cancer Res, 17:7765-7775, 2011 ；ffen 等人,Cancer Tmmunol Immuother, 57:1781-1794, 2008)。IFN-γ藉由抑制各種腫瘤細胞生長、向上調節腫瘤細胞 上的MHC分子的表達、多種免疫細胞的活化以及抗血管新生而在抗腫瘤免疫力中扮演重要 的角色。活化之后，可由免疫細胞，例如，CD4+T細胞、CD8+T細胞以及NK細胞的多個子集產 生IFN-γ。在這報告中，評估以1.6mg/kg靜脈內給藥ALT-801后24小時，來自C57CL/6 小鼠的血液中的IFN-γ水平。對照的小鼠 （η = 5)的血清中的IFN-γ不可偵測，但在給 藥ALT-801之后達成196 (±44) pg/mL的濃度（η = 5)(圖22)。為了調查ALT-801治療之 后哪些細胞類型為IFN-γ的主要產生者，將針對小鼠 CD4、CD8以及NK細胞的單克隆抗體 腹腔地注射入C57BL/6雌性小鼠，以耗盡相對應的免疫細胞子集。ALT-801注射24小時之 后，測定耗盡免疫細胞的小鼠中的血清IFN-γ水平。結果顯示ALT-801給藥之后，⑶4、NK 以及三重⑶4、⑶8以及NK細胞耗盡的小鼠 （η = 5/群組）的血清中的IFN-γ濃度分別達 到 75(±58)pg/mL、74(±25)pg/mL 以及 82(±52)pg/mL(圖 22)。相反地，CD8T 細胞耗盡 的小鼠 （η = 5)的血清IFN-γ濃度達到257 (±60)pg/mL。結果說明⑶4+T細胞和NK細胞 是ALT-801誘發的IFN-γ的主要產生者，但⑶8+T細胞則否。血清IFN-γ的顯著誘發仍 可在進行ALT-801治療具有⑶4 +、⑶8+T細胞以及NK細胞的三重耗盡的小鼠后偵測。此發 現說明了除了 CD4+T細胞和NK細胞以外，其它類型細胞亦貢獻以ALT-801治療的小鼠中的 IFN-γ產生。
[0249] 在這研宄的第二部分中，調查IFN-γ對MB491uc細胞生長的效果。在具有1或 10ng/mL的IFN-γ的RPMI-10中培養MB491uc細胞（2x IO5/孔）。采收以IFN-γ治療的 MB491UC細胞，并將其以FITC標示的膜聯蛋白V染色。以流式細胞儀測定膜聯蛋白V陽性 細胞凋亡MB491uc細胞。IFN-γ治療不直接造成針對MB491uc細胞的可偵測的細胞毒性 (圖 23)。
[0250] 在具有20nM ALT-801的RPMI-IO中培養小鼠細胞3天，接著在細胞毒性測定法中 用作針對PKH67標示的MB491uc目標細胞的效應物LAK細胞。在含有0至50nM ALT-801 的RPMI-IO中，于37°C培養效應細胞（4x 1〇7孔）和目標細胞（4x IO5/孔）24小時。基于 用碘化丙啶染色，以流式細胞儀，評估LAK細胞針對MB491UC細胞的細胞毒性。ALT-801活 化的細胞是取決于細胞毒性測定法期間存在的ALT-80的濃度的方式，有效地溶解MB491uc 細胞（圖24)。
[0251] 吉西他濱是用于肌肉侵入性膀胱癌的標準組合化學療法的藥物中的一者。已報 導吉西他濱減少帶有腫瘤的小鼠中的衍生自骨髓的抑制細胞（MDSC)。在此報告中，吾等研 宄吉西他濱對小鼠中的MB491uc細胞所誘發的MDSC的效果。將帶有MB491uc腫瘤的小鼠 以40mg/kg的吉西他濱靜脈內地治療。天吉西他濱治療后三天，單離脾細胞，并且以流式 細胞儀測定Grl +CDllb+MDSC的百分比。沒有MB491uc腫瘤的正常對照的小鼠中，MDSC負責 I. 19(±0. 25)百分比的細胞。帶有MB491uc腫瘤的小鼠中，這些MDSC增加至4. 29(±1. 32) 百分比的脾細胞。相反地，以吉西他濱治療帶有腫瘤的小鼠造成脾臟中的MDSC減少至 1. 83 (±0. 92)百分比（圖25)。這些結果證實吉西他濱顯著地減少帶有腫瘤MB491uc的小 鼠中的脾臟中的MDSC水平。
[0252] 先前顯示ALT-801和IL-2具有相同活性，以刺激活化體外人類T細胞和NK細胞。 展示針對多種腫瘤細胞的細胞毒性的IL-2活化的免疫細胞被稱為LAK(淋巴因子活化的 殺傷）細胞。LAK細胞活性是將效應細胞ALT-801預活化的小鼠脾細胞用作效應細胞和將 MB491uc腫瘤用作目標細胞調查。這研宄的結果顯示ALT-801活化的細胞是取決于ALT-801 在殺死期的濃度的方式，有效地溶解MB491uc細胞。此發現說明ALT-801能活化效應物免 疫細胞和增大它們針對膀胱腫瘤細胞的細胞毒性活性。額外地，吉西他濱治療顯著地減少 帶有MB491UC腫瘤的小鼠的脾臟中的MDSC濃度。
[0253] 實施例13 :MDSC過繼轉移之后ALT-801誘發免疫細胞殺死腫瘤細胞。
[0254] 在C57BL/6小鼠中靜脈內或皮下注射MB491UC膀胱腫瘤細胞后建立腫瘤造成血液 和脾臟中的MDSC水平顯著增加。MDSC是由骨髓前體細胞、不成熟巨噬細胞、不成熟樹突狀 細胞以及不成熟粒細胞所組成的不成熟骨髓細胞的異質群體。大量文獻顯示在寬排列的腫 瘤模式中的MDSC擴增。MDSC作用以抑制NK和T細胞通過直接細胞接觸、細胞因子以及代 謝途徑的副產物、控制Tregs的擴增和活化以及支持腫瘤細胞的新生血管形成和轉移性擴 散。在小鼠中，MDSC是由CDllb和Grl的細胞表面表達所界定。正常小鼠僅具有一小部分 (2至4% )的脾臟細胞為⑶llb+Grl+，但具有這表型的細胞可在一些小鼠腫瘤模式中達到 20至40%。為了調查這些細胞的活性，從帶有皮下MB49G腫瘤的C57BL/6小鼠采收脾臟，并 且以抗Grl和抗Ly6G Ab珠磁性分選而單離MBSC。通過這程序，從各動物收集純度為96 % 的 IX IO7MDSC(圖 26)。
[0255] 接著，將純化的MDSC轉移入同基因的正常小鼠，以允許評估它們對正常免疫效應 細胞的免疫抑制活性。過繼轉移后四十小時，收集接收方小鼠的脾臟細胞，并且藉由以50nM ALT-801培養兩天而活化。將產生的LAK效應細胞與以PKH67標示的MB491uc腫瘤細胞目 標共培養隔夜，以評估腫瘤細胞殺死。與先前對ALT-801的抗腫瘤效果的非臨床研宄一致， 發現來自正常C57BL/6小鼠的ALT-801活化的LAK細胞有效地殺死MB491uc腫瘤細胞，而 沒有ALT-801活化的新鮮脾細胞展現微弱的細胞溶解活性（圖27)。更重要地，以ALT-801 體外刺激后，MDSC轉移后從小鼠單離的脾細胞顯示顯著減少的作為具有抗腫瘤細胞溶解活 性的LAK細胞的可能性。不受限于特定理論，這些發現說明體內腫瘤誘發的MDSC的存在損 害脾臟效應細胞對后續ALT-801活化反應的能力。因此，此研宄結果支持膀胱腫瘤誘發的 MDSC活性不利于ALT-801的抗腫瘤效果的假說。
[0256] 至于多種免疫細胞功能的強效抑制劑，MDSC是用于抗癌癥治療的可能治療目標。 例如，吉西他濱為廣泛使用的化學治療，可選擇性地消除帶有腫瘤的動物中的MDSC，并且增 強腫瘤-抑制性免疫活性（Suzuki等人，Clin Cancer Res, 11:6713-6721，2005)。在小鼠 膀胱腫瘤模式中的非臨床研宄中，發現與吉西他濱和ALT-801的組合療法較使用任一劑的 單一療法更為有效。例如，以ALT-801(0.8mg/kg，次佳劑量）與吉西他濱（40mg/kg)的組合 治療帶有吉西他濱有抗性皮下MB49G腫瘤的小鼠造成較以PBS治療的小鼠顯著更慢的腫瘤 生長，而單獨以41^-801(0.811^/1^)和吉西他濱（4〇11^/1^)治療的小鼠中的腫瘤惡化與？83 組并無顯著的不同。這些結果暗示吉西他濱治療減少MDSC的免疫抑制活性，允許ALT-801 更有效地活化抗腫瘤免疫反應，而不是直接作用在腫瘤生長上。
[0257] 實施例14 :ALT_801的抗腫瘤機轉作用的模式。
[0258] 已進行廣泛的努力來揭示使用多種動物模式、免疫耗盡研宄、免疫組織化學、細胞 活素測定法、基因剔除小鼠、細胞介導的殺死方法以及流式細胞儀所分析的ALT-801針對 癌癥的作用機轉。不受限于特定理論，這些研宄活動的結果是與以下觀察一致：
[0259] · ALT-801 活化 CD4+和 NK 細胞以分泌 IFN- γ。
[0260] · IFN- γ活化巨噬細胞，將腫瘤聯結的巨噬細胞（TAM)從腫瘤-促進M2再極化成 腫瘤-破壞性Ml期，以及誘發針對腫瘤細胞的T hI免疫反應。
[0261] · ALT-801單獨刺激記憶⑶8+Τ細胞以增殖和向上調節內生類型的殺傷受體。
[0262] ?這些活化的CD8+記憶細胞展示針對腫瘤的強效，但無抗原特異性的細胞殺死免 疫反應。
[0263] · IFN-γ依賴途徑和非特定⑶8+記憶細胞兩者對于ALT-801的體內抗腫瘤效力 是必要的。
[0264] IFN-γ和腫瘤聯結的巨噬細胞的再極化
[0265] 正常和帶有腫瘤的小鼠中滲入時，ALT-801治療誘發IFN-γ的分泌。ALT-801靜 脈內滲入后大約4至6小時，血清和尿兩者中的有高濃度的IFN-γ (Fishman等人，Clin Cancer Res, 2011. 17:7765)。基于免疫耗盡研宄，CD4+和NK細胞為血清IFN-γ的主要來 源，顯示ALT-801給藥誘發的IFN- γ的血清水平是藉由消除小鼠中的CD4+T細胞和NK細 胞而實質上減少（實施例12)。膀胱癌細胞中，IFN-γ無抑制膀胱癌細胞生長或誘發細胞 凋亡。然而，在IFN-γ基因剔除（KO)的C57BL/6小鼠中，ALT-801喪失其針對膀胱內植入 MB491UC膀胱腫瘤的抗膀胱癌活性。不受限于特定理論，免疫組織化學染色結果說明這可能 因為需要IFN-γ來將M2TAM再極化成M1TAM(實施例11)。這些MlTAM展示針對腫瘤的快 速和強效的抗腫瘤反應。
[0266] IFN- γ為單核細胞和巨噬細胞的最強效刺激劑（Schroder等人，J Leukoc Biol, 2004. 75:163)。顯示使用脂質體的單核細胞的耗盡移除ALT-801針對原位MB491uc 膀胱腫瘤的功效的研宄結果所證實單核細胞/巨噬細胞在ALT-801介導的抗腫瘤活性中 的關鍵角色（實施例10)。因此，IFN-γ (來自ALT-801活化的⑶4+和NK細胞）具有活 化循環單核細胞和巨噬細胞（諸如，肝臟中的Kupffer細胞）以滲入細胞介導的腫瘤殺死 的腫瘤病變（Seki等人，Clin Dev Immunol, 2011,2011:868345)的可能性。除了再極化 TAM和活化單核細胞和巨噬細胞以外，亦已知INF-γ (其為一種多效性細胞活素）展現多 種抗腫瘤功能（Schroder 等人，J Leukoc Biol, 2004, 75:163 ;Zaidi 等人，Clin Cancer Res, 2011，17:6118)。亦可想到從以ALT-801活化的CD4+和NK細胞分泌的INF-γ經由大量 次級反應基因的活化而直接影響腫瘤生長（Boehm等人，Annu Rev Immunol, 1997, 15:749) 〇
[0267] 發現CD4+T細胞耗盡亦移除ALT-801針對C57BL/6小鼠中的MB491uc的抗腫瘤 活性，但NK細胞耗盡則否。ALT-801亦在缺乏T細胞的SCID小鼠中，喪失其抗MB491UC活 性。不受限于特定理論，ALT-801-活化的⑶4+T細胞能滲入腫瘤，并且在腫瘤微環境中分 泌IFN-γ，以有效地再極化TAM，以用于腫瘤破壞。IHC研宄的數據（實施例11)與這理論 一致。
[0268] 經由新穎機轉的記憶CD8+細胞介導的抗腫瘤活性
[0269] 在免疫耗盡研宄中，⑶8+和⑶4 +細胞的消除可消除ALT-801在C57BL/6小鼠中的 原位MB491uc膀胱腫瘤模式中的抗腫瘤活性，而單獨消除NK細胞則否。因此，ALT-801-活 化的⑶8+細胞對于ALT-801的抗膀胱癌活性是重要的。
[0270] 最近已顯示細胞因子介導的刺激可促進具有獨特表型的記憶⑶8+細胞的無抗 原特異性的擴大。不同于向上調節ro-Ι和⑶25的抗原依賴性擴大所產生的記憶⑶8+T 細胞，這些研宄中的細胞因子介導的擴大記憶的CD8+T細胞表達具有廣泛的溶胞能力 的NKG2D (其為一種顆粒酶B)，并且暗示所述能力負責癌癥免疫療法的明顯抗腫瘤效果 (Tietze等人，Blood, 2012, 119:3073)。不受限于特定理論，這類型的記憶CD8+T細胞的 ALT-801活化在小鼠中的抗MB491uc腫瘤活性中扮演主要的角色。為了評估這可能性，首 先檢驗單獨的ALT-801是否可誘發體外的記憶⑶8+T細胞擴大。以ALT-801或抗⑶3抗體 (TCR依賴性接合）活化之后，比較⑶8+⑶44 s T細胞的表型。曝露于ALT-801或抗⑶3抗體 的⑶8+T細胞產生具有明顯不同表型的⑶8+⑶44s T細胞。ALT-801刺激導致NKG2D的向上 調節，但更高水平的CD25和Η)-1表達則否，而抗CD3刺激導致更高水平的CD25和Η)-1表 達，但非NKG2D向上調節。為了檢驗體內是否發生相似現象，將不帶有腫瘤的小鼠以I. 6mg/ kg ALT-801 (于100 μ L)或PBS (100 μ L)靜脈內地注射兩次（隔72小時），并且在第二次 PBS或ALT-801治療之后分析PBMC和脾細胞的表型一天。ALT-801治療后，比較表達NKG2D 擴大的⑶8+CD44?記憶T細胞水平與以IL-2或PBS治療的小鼠中所見的水平。相反地， ⑶8+CD44?記憶T細胞群體中無觀察到ALT-801向上調節Η)-1或⑶25。
[0271] ⑶8+CD44?記憶T細胞過繼轉移實驗中亦觀察到相似的結果。在這研宄中，以 Celltrace? Violet標示的脾細胞（0. 5x IO6)從首次接受試驗的C57BL/6小鼠過繼轉移入 首次接受試驗的同基因的C57BL/6小鼠，接著在過繼細胞轉移后一天以ALT-801或PBS靜 脈內地治療小鼠。接著，第二次ALT-801或PBS治療之后一天，分析來自接收方小鼠的脾臟 的CD8+CD44? T細胞的表型。ALT-801誘發CD8+CD44? T細胞的增殖，而IL-2或PBS則否。 額外地，在以ALT-801治療的接收方小鼠中經過繼轉移和擴大的記憶⑶8+⑶44 s T細胞之間 的NKG2D-陽性細胞群體增加，但以PBS治療的接收方小鼠則否。再者，ALT-801治療后無 觀察到這些細胞的表面上有⑶25或Η)-1的向上調節。因此，這些數據證實ALT-801明顯 能以與抗原無關的方式活化具有獨特表型的CD8+CD44?記憶T細胞。
[0272] 為了進一步證實表達NKG2D的⑶8+⑶44s T細胞的百分比的增加是由于NKG2D的 重生調節，而非先前存在的NKG2D+記憶⑶8+1'細胞群體的擴大，將首次接受試驗的0578176 小鼠 NKG2D7CD257CD8+/CD44S T細胞分類。以Celltrace? Violet示蹤劑標示分類的 NKG2D7⑶257⑶87⑶44s T細胞，并且過繼轉移（0. 4x IO6個細胞/接收方小鼠）入首 次接受試驗的C57BL/6小鼠。轉移后一天，以兩種劑量的PBS或以ALT-801治療小鼠，并 且于第二次治療后一天采集脾細胞以分析NKG2D表型。來自以ALT-801治療的小鼠的以 Celltrace? Violet標示的CD8+CD44高T細胞中的NKG2D擴增且向上調節，而PBS對照組中 則否。在體外，以ALT-801活化的CD8+CD44? T細胞展現針對膀胱癌細胞的與抗原無關的強 效抗腫瘤活性。
[0273] 不受限于特定理論，結果與以抗原無關的方式使ALT-801活化CD8+T細胞以增殖 和向上調節內生類的表面受體的模式一致。這些活化的記憶T細胞展示針對膀胱癌細胞的 有效，但與抗原無關的殺死。可能是這內生類型，與抗原無關的反應是抗腫瘤活性不取決于 目標的P53-勝肽/HLA-A*0201抗原的原因。
[0274] 這新穎的機轉作用對于固體腫瘤而言與其它以T細胞為主的免疫治療劑（諸如抗 CTLA和抗ro-i抗體）不同，而且可增強支持這些結論的這些研宄的效力。
[0275] 設計有ALT-801的最佳組合療法
[0276] 已知癌癥患者（尤其是彼等有晚期疾病者）是免疫學上受損。這是因為腫瘤 細胞主動地誘發呈現抗原細胞和效應細胞的功能障礙，并且促進調控免疫細胞的擴大， 其向下調節抗腫瘤免疫力，允許腫瘤細胞逃逸免疫反應（Whiteside, J Allergy Clin免 疫 1，2010, 125:S272 ;Poschke 等人，Cancer Tmmunol Immuotherher, 2011, 60:1161 ； Talmadge, Semin Cancer Biol, 2011, 21:131)。兩個最佳特征化的免疫抑制細胞 子集為FoxP3+調控細胞（Tregs)和衍生自骨髓的抑制細胞（MDSCs) (Qin，Cell Mol Immunol, 2009,6:3 ;Gabrilovich 等人，Nat Rev Immunol, 2009,9: 162; Ostrand-Rosenberg, CAncer Immunol Immuotherher, 2010, 59:1593.)。MDSC 為由骨髓前 體細胞、不成熟巨噬細胞、不成熟樹突狀細胞以及不成熟粒細胞所組成的不成熟骨髓細胞 的異質群體（Gabrilovich等人，Nat Rev Immunol, 2009, 9:162)。大量文獻顯示在寬排 列的可移植和原位生成腫瘤模式中的MDSC擴增。由于假設細胞通過腫瘤衍生因子（諸 如，粒細胞-巨噬細胞群落-刺激因素和TNF- α )的分泌而從骨髓擴增及募集至腫瘤位 置，血液、脾臟、骨髓以及腫瘤位置的MDSC累積有可能為腫瘤惡化中的早期事件（Bayne 等人，Cancer Cell, 2012, 21:822 ;Pylayeva_Gupta 等人，Cancer Cell, 2012, 21:836; Zhao等人，J Clin Invest, 2012,122:4094.)。MDSC作用以抑制NK和T細胞通過直接 細胞接觸、細胞因子以及代謝途徑的副產物、控制Tregs的擴大和活化、Treg滲透到腫瘤 的促進，以及支持腫瘤細胞的新生血管形成和轉移性擴散（Gabrilovich等人，Nat Rev Immunol, 2009,9:162 ;Peranzoni 等人，Curr Opin Immunol, 2010,22:238 ;Marigo 等 人 Immunol Rev, 2008,222:162 ;Chioda 等人，Cancer Metastasis Rev, 2011，30:27; Schlecker 等人，J Immunol, 2012，189:5602)。
[0277] MDSC顯現與腫瘤聯結的巨噬細胞（TAM)密切相關，所述TAM通常展現M2極 化，而且可藉由產生IL-10、TGFf3以及促血管形成因子（諸如，基質金屬蛋白酶）、 VEGF以及衍生自血小板的生長因素而貢獻腫瘤發展和免疫抑制（Mantovani等人，Hum Immunol, 2009, 70:325)。最近小鼠模式的證據暗示達到腫瘤的缺氧環境時，MDSC可區分成 TAM，而且之后展示相異的表型和功能性特征（Corzo等人，.J Exp Med, 2010, 207:2439)。
[0278] 膀胱癌患者中的衍生自骨髓的抑制性細胞：由于MDSC的最初辨識，數個后續 刊物報導增加有各式各樣人類固體腫瘤的患者中MDSC循環濃度增加（Montero等人，J Immuothher, 2012, 35:107.)。報導在非肌肉侵入性和肌肉侵入性膀胱癌患者中，周圍血 液中存在 2 個相異的 MDSC 群體（Eruslanov 等人，Int J Cancer, 2012, 130:1109.) :(i) ⑶Ilb+/⑶15s/⑶33低與中性粒細胞標志⑶114和⑶117的共表達；以及（ii)⑶Ilb +/⑶15低 /⑶33s與單核細胞-巨噬細胞標志⑶14、⑶115、⑶116以及CCR2的共表達。當比較來自健 康志愿者的樣本和患者周圍血液樣本時，僅發現在膀胱癌患者中存在更高水平的CDl Ib+/ ⑶15high/⑶33?細胞，而發現健康志愿者中存在顯著量的⑶Ilb+/⑶15低/⑶33 s細胞。雖然 發現兩個群體分泌實質量的細胞因子，僅注明CDllb+/CD15high/CD33 is群體具有免疫抑制活 性。在腫瘤試樣中，發現2個相異的MDSC群體滲入腫瘤：彼等細胞中有60%至70%的被描 述成⑶I lb+/HLA-DR+，而剩下30 %至40 %被描述成⑶I Ib+和⑶15 +。未完全探討彼等細胞的 臨床顯著性。在另一個研宄中，在膀胱尿道上皮癌瘤患者中發現增加的免疫抑制性CD14+/ HLA-DRvis細胞的循環水平和臨床癌癥期及病理級別的相關性。因此，膀胱尿道上皮癌瘤的 患者展現提升MDSC的水平，包含與晚期疾病相關的免疫抑制性表型。
[0279] 已進行連接MDSC和膀胱癌的前臨床研宄，并且總結如下：
[0280] ?在C56BL/6小鼠中的原位MB491UC模式中，當疾病這化成成肌肉侵入性期時，膀 胱內植入的腫瘤實質上提高血液中的MDSC (實施例10)。
[0281] ?在此模式中，當MB491uc腫瘤細胞皮下或靜脈內地植入時，觀察到相似的結果 (實施例12)。
[0282] ?將帶有MB491uc腫瘤的C57BL/6小鼠的MDSC分類，并且過繼轉移至非帶有腫瘤 (接收方）的C57BL/6小鼠。將來自接收方小鼠或野生型C57BL/6小鼠細胞單離，并且以 ALT-801體外激發。接著，體外評估以ALT-801活化的脾細胞針對MB49 Iuc細胞的細胞毒性。 來自野生型C57BL/6小鼠的脾細胞較從MDSC接收方小鼠單離的細胞展現顯著更強的針對 MB491uc細胞的細胞毒性（實施例13)。這些數據證實MB491uc誘發的MDSC針對ALT-801 誘發的生物活性的強效免疫抑制活性。
[0283] 這些研宄的結果暗示膀胱腫瘤細胞誘發MDSC可妨礙或干擾體內的ALT-801的抗 腫瘤活性。
[0284] 吉西他濱增強ALT-801抗腫瘤免疫反應：已建議消除MDSC可顯著地增進癌癥免 疫療法（諸如，ALT-801)的抗腫瘤反應和增強的效果。
[0285] 吉西他濱為用于人類轉移性膀胱癌中第一線化學療法的主要組分，而且發現 其為治療劑量時，實質上減少帶有大腫瘤的動物的脾臟中MDSC的數目，但沒有影響 ⑶4+T細胞、⑶8+T細胞、NK細胞、巨噬細胞或B細胞的數目（Suzuki等人，Clin Cancer Res，2005, 11:6713.)。MDSC的流失伴隨CD8+T細胞和NK細胞的抗腫瘤活性的增加。以吉 西他濱預處理顯著地擴大IFN-β對大間皮瘤腫瘤的抗腫瘤效果。在C26鼠腺癌模式中，帶 有腫瘤的小鼠中較對照的小鼠在脾臟中具有顯著地提升的MDSC水平，并且如STATl磷酸化 的測量的在IFN- α和INF- γ的反應中展現減少的脾細胞活化（Mundy-Bosse等人，Cancer Res, 2011，71:5101.)。以吉西他濱或抗GRl抗體治療帶有C26的小鼠導致MDCS的耗盡和 脾細胞IFN反應性的恢復。
[0286] 已進行將吉西他濱與膀胱癌細胞誘發的MDSC活性的減少連接的臨床前研宄，并 且總結如下：
[0287] ?在MB491uc腫瘤模式的臨床前研宄中，吉西他濱治療顯著地減少帶有腫瘤的小 鼠中的MDSC水平（實施例12)。這些數據暗示吉西他濱可為對消除MDSC有用的化學治療 藥物，藉此允許ALT-801刺激的免疫效應細胞介導針對膀胱癌的抗腫瘤活性。
[0288] ?在C56BL/6小鼠中的原位MB491uc模式中，次佳濃度的ALT-801與吉西他濱的組 合是有效的，但較相同水平的ALT-801與順鉑+吉西他濱的組合針對MB491uc腫瘤展現更 少的毒性（亦即，體重流失）。同樣地，在帶有皮下MB491uc腫瘤的C57BL/6小鼠中，ALT-801 與吉西他濱的組合較單獨的A LT-801或單獨的吉西他濱造成顯著更大的抗腫瘤活性。
[0289] ?已產生有吉西他濱抗性的MB491UC腫瘤細胞，并且用以評估C57BL/6皮下腫瘤模 式中次佳劑量的ALT-801與吉西他濱的組合的功效。結果顯示次佳劑量水平的ALT-801與 吉西他濱的組合較單獨的ALT-801或吉西他濱展現顯著更大的抗腫瘤活性。
[0290] 共同地，這些結果暗示ALT-801與吉西他濱的組合可提供轉移性膀胱癌（特別是 有鉑抗性的腫瘤）的有效治療，同時順鉑可為廢除的。因此，評估ALT-801與吉西他濱的組 合在對以鉑為主的治療的晚期膀胱癌患者中的抗腫瘤活性是令人感興趣的。這功效研宄的 結果將告知是否從當前的ALT-801+吉西他濱+順鉑療方移除順鉑，以治療對順鉑+吉西他 濱有抗性的轉移性尿道上皮癌瘤患者。若以非鉑為主的療方經證明為和以鉑為主的療方一 樣有效，將亦大幅幫助具有腎功能不全的患者，而不適合接收含有順鉑的療方。已向美國 FDA提交晚期膀胱癌實驗中的ALT-801+吉西他濱試驗中招收高達十四位患者的提議，而且 這試驗的患者招收是從2012年12月開始。
[0291] 實施例15 :人類臨床試驗實驗計劃。
[0292] 研宄設計
[0293] 這是在具有膀胱、腎盂、輸尿管以及尿道的肌肉侵入性或轉移性尿道上皮細胞癌 患者中，在含有順鉑和吉西他濱的生物化學療法療方中的ALT-801的第Ib/II期，開放標 簽，多發性中心，競爭性招收以及提升劑量的研宄。以符合良好臨床實踐（Good Clinical Trial, GCP)的方式進行研宄。
[0294] 研宄包含劑量提升期以測定ALT-801與順鉑和吉西他濱的組合的最大忍受劑量 (MTD)和在MTD的兩階段擴大期。這研宄中的劑量提升是使用（3+3)劑量提升設計，而且 在MTD的二階段擴大期是使用修改的Simon兩階段設計進行。在這研宄的劑量提升期中， 除了兩個不提升的劑量水平之外，還有ALT-801的五個劑量水平（0. 04mg/kg、0. 06mg/kg和 0· 08mg/kg、0. 10mg/kg 和 0· 12mg/kg)。順鉬（70mg/m2/ 劑量）和吉西他濱（1000mg/m2/ 劑 量）的劑量在橫跨所有ALT-801劑量水平是固定的。若劑量提升期未達到MTD，則贊助商， 數據安全監控委員會（Data Safety Monitoring Board)，及主要調查者會唔以討論是否修 正實驗計劃以擴張劑量提升期，以包含額外的ALT-801劑量水平。
[0295] 治療
[0296] 計劃的最初研宄中的治療為3個療程。各療程是由順鉑（第1天）、吉西他濱（第 1天）、ALT-801 (第3天和第5天）、吉西他濱（第8天）、ALT-801 (第8天和第10天）以 及休息期（第11至21天）所組成。第二或第三個療程開始之前，受試者需求達到連續標 準。完成研宄治療的三個完整療程時，已將各招收的患者按排，而具有總共12種劑量的研 宄藥物ALT-801、3種劑量的順鉑以及6種劑量的吉西他濱。完成3個療程的最初研宄治療 之后，具有至少穩定的疾病和達到其它治療標準的患者將以每周四種額外的ALT-801劑量 重復研宄治療。實驗計劃中解決延遲或修改。這是在以下方案和圖28和29中闡釋：
[0297] 最初研宄治療：

【權利要求】
1. 一種改善受試者的癌癥的方法，包括： 對有需要的受試者給藥有效量的IL-2融合蛋白和一種或多種治療劑，藉此改善所述 癌癥。
2. 如權利要求1的方法，其中，所述比-2融合蛋白不特異性地W所述癌癥為目標或結 合所述癌癥。
3. 如權利要求1的方法，其中，所述比-2融合蛋白包括T細胞受體燈CR)結構域。
4. 如權利要求3的方法，其中，所述T細胞受體結構域為單鏈T細胞受體。
5. 如權利要求1的方法，其中，所述一種或多種治療劑是選自由下列各者所組成群組： 己酸阿比特龍、六甲密胺、脫水長春花堿、歐瑞斯他汀、阿扎胞巧、AZD 8477、苯達莫司汀、貝 伐單抗、舊薩羅了、比卡魯胺、BMS184476、2, 3, 4, 5, 6-五氣-N-(3-氣-4-甲氧基苯基）苯 橫酷胺、博來霉素、棚替佐米、N，N-二甲基鄉氨酷基鄉氨酷基-N-甲基-k鄉氨 酷基-k脯氨酷基-1-L脯氨酸-第S了基酷胺、惡病質素、卡培拉濱、西馬多了、西妥昔單 抗、瘤可寧、環磯酷胺、3'，4' -二去氨-4' -二氧基-8' -諾文-長春堿、多西他賽、多締紫 杉醇、環磯酷胺、卡銷、卡莫司汀炬CNU)、順銷、念珠藻環膚、環磯酷胺、阿糖胞巧、達卡己嗦 (DTIC)、更生霉素、達沙替巧、柔紅霉素、多拉斯他了、多韋替巧、多柔比星（阿霉素）、表阿 霉素、埃坡霉素B、埃羅替巧、艾瑞布爾、依托泊巧、依維莫司、5-氣尿喀晚、非那利得、氣他 胺、吉非替巧、吉西他濱、哲基脈W及哲基脈紫杉燒類、宜佛斯酷胺、干擾素a、伊馬替巧、 伊匹單抗、依利諾替康、拉鉤它索，拉帕替巧、來那度胺、利阿挫、洛那法巧、氯巧達明、洛 莫司汀（CCNU)，二氯甲基二己胺（氮芥）、美法侖、哲己基橫酸米伏布爾、利索新、什汀巧 夫、鏈脈霉素、絲裂霉素、甲氨蝶嶺，5-氣尿喀晚、巧魯米特、奧那司酬、草酸銷、他克挫、帕 巧單抗、帕挫帕巧、普拉曲沙、潑巧莫司汀、化曲克辛、丙卡己阱、化挫咐町晚、利妥昔單抗、 RPR109881、羅米地辛、索拉非巧、磯酸雌莫司汀、舒巧替巧、它莫西芬、他索爾明、紫杉醇、替 莫挫胺、拓撲替康、曲妥珠單抗、維A酸、立甲曲沙、威羅菲巧、長春花堿、長春新堿、硫酸長 春地辛、長春氣寧W及伏立諾他。
6. 如權利要求1的方法，其中，所述一種或多種治療劑是選自由吉西他濱和包含順銷 的W銷為主的化合物所組成群組。
7. 如權利要求1的方法，其中，所述癌癥是選自由膀脫癌、尿道、輸尿管W及腎孟的尿 道上皮細胞癌、多發性骨髓瘤、腎臟癌、乳癌、結腸癌、頭頸癌、肺癌、前列腺癌、神經膠母細 胞瘤、骨肉瘤、脂肪肉瘤、軟組織肉瘤、卵巢癌、黑色素瘤、肝癌、食道癌、膜臟癌W及胃癌所 組成群組。
8. 如權利要求1的方法，其中，所述癌癥是膀脫或尿道上皮細胞癌。
9. 如權利要求1的方法，其中，所述癌癥有化學抗性。
10. 如權利要求1的方法，其中，所述IL-2融合蛋白和所述一種或多種治療劑是在約7 至14天內給藥。
11. 如權利要求1的方法，其中，所述IL-2融合蛋白和所述一種或多種治療劑是在約3 至5天內給藥，或同時給藥。
12. 如權利要求1的方法，其中，所述比-2融合蛋白是ALT-801，而且所述一種或多種 治療劑是順銷。
13. 如權利要求12的方法，其中，所述一種或多種治療劑是吉西他濱。
14. 如權利要求1的方法，其中，所述IL-2融合蛋白特異性地W癌癥細胞為目標。
15. 如權利要求14的方法，其中，所述比-2融合蛋白特異性地W所述癌癥細胞的表面 上的p53勝膚/HLA絡合物為目標。
16. -種減少受試者的腫瘤負擔的方法，包括： 對有需要的受試者給藥有效量的IL-2融合蛋白和治療劑，藉此減少所述腫瘤的體積。
17. 如權利要求16的方法，其中，所述比-2融合蛋白不特異性地W所述癌癥為目標或 結合所述癌癥。
18. 如權利要求16的方法，其中，所述IL-2融合蛋白包括T細胞受體（TCR)結構域。
19. 如權利要求18的方法，其中，所述T細胞受體結構域是單鏈T細胞受體。
20. 如權利要求16的方法，其中，所述一種或多種治療劑是選自由下列各者所組成群 組；己酸阿比特龍、六甲密胺、脫水長春花堿、歐瑞斯他汀、阿扎胞巧、AZD 8477、苯達莫司 汀、貝伐單抗、舊薩羅了、比卡魯胺、BMS184476、2, 3, 4, 5, 6-五氣-N-(3-氣-4-甲氧基苯 基）苯橫酷胺、博來霉素、棚替佐米、N, N-二甲基-L-鄉氨酷基-L-鄉氨酷基-N-甲基-L-鄉 氨酷基脯氨酷基-1-L脯氨酸-第S了基酷胺、惡病質素、卡培拉濱、西馬多了、西妥昔 單抗、瘤可寧、環磯酷胺、3'，4' -二去氨-4' -二氧基-8' -諾文-長春堿、多西他賽、多締 紫杉醇、環磯酷胺、卡銷、卡莫司汀炬CNU)，順銷、念珠藻環膚、環磯酷胺、阿糖胞巧、達卡己 嗦值TIC)、更生霉素、達沙替巧、柔紅霉素、多拉斯他了、多韋替巧、多柔比星（阿霉素）、表 阿霉素、埃坡霉素B，埃羅替巧，艾瑞布爾、依托泊巧、依維莫司、5-氣尿喀晚、非那利得、 氣他胺，吉非替巧、吉西他濱、哲基脈W及哲基脈紫杉燒類、宜佛斯酷胺，干擾素a、伊馬 替巧、伊匹單抗、依利諾替康、拉鉤它索、拉帕替巧、來那度胺、利阿挫、洛那法巧、氯巧達明、 洛莫司汀（CCNU)、二氯甲基二己胺（氮芥）、美法侖、哲己基橫酸米伏布爾、利索新、什汀巧 夫、鏈脈霉素、絲裂霉素、甲氨蝶嶺，5-氣尿喀晚、巧魯米特、奧那司酬、草酸銷、他克挫、帕 巧單抗、帕挫帕巧、普拉曲沙、潑巧莫司汀、化曲克辛、丙卡己阱、化挫咐町晚，利妥昔單抗、 RPR109881、羅米地辛、索拉非巧、磯酸雌莫司汀、舒巧替巧、它莫西芬、他索爾明、紫杉醇、替 莫挫胺、拓撲替康、曲妥珠單抗、維A酸、S甲曲沙、威羅菲巧、長春花堿、長春新堿，硫酸長 春地辛、長春氣寧W及伏立諾他。
21. 如權利要求16的方法，其中，所述一種或多種治療劑是選自由吉西他濱和包含順 銷的W銷為主的化合物所組成群組。
22. 如權利要求16的方法，其中，所述腫瘤負擔是選自由膀脫癌、尿道、輸尿管W及腎 孟的尿道上皮細胞癌、多發性骨髓瘤、腎臟癌、乳癌、結腸癌、頭頸癌、肺癌、前列腺癌、神經 膠母細胞瘤、骨肉瘤、脂肪肉瘤、軟組織肉瘤、卵巢癌、黑色素瘤、肝癌、食道癌、膜臟癌W及 胃癌所組成群組。
23. 如權利要求16的方法，其中，所述腫瘤負擔是膀脫或尿道上皮細胞癌。
24. 如權利要求16的方法，其中，所述腫瘤負擔有化學抗性。
25. 如權利要求16的方法，其中，所述IL-2融合蛋白和所述一種或多種治療劑是在7 至14天內給藥。
26. 如權利要求16的方法，其中，所述IL-2融合蛋白和所述一種或多種治療劑是在約 3至5天內給藥，或同時給藥。
27. 如權利要求16的方法，其中，所述比-2融合蛋白是ALT-801，而且所述一種或多種 治療劑是吉西他濱和順銷。
28. 如權利要求27的方法，其中，所述一種或多種治療劑是吉西他濱。
29. 如權利要求16的方法，其中，所述IL-2融合蛋白特異性地W所述癌癥細胞為目標。
30. 如權利要求29的方法，其中，所述比-2融合蛋白特異性地W所述癌癥細胞的表面 上的p53勝膚/HLA絡合物為目標。
31. -種治療受試者的化學抗性癌癥的方法，包括： 對有需要的受試者給藥有效量的IL-2融合蛋白和治療劑，藉此治療所述化學抗性癌 癥。
32. 如權利要求31的方法，其中，所述比-2融合蛋白不特異性地W所述癌癥為目標或 結合所述癌癥。
33. 如權利要求31的方法，其中，所述IL-2融合蛋白包括T細胞受體（TCR)結構域。
34. 如權利要求33的方法，其中，所述T細胞受體結構域是單鏈T細胞受體。
35. 如權利要求31的方法，其中，所述一種或多種治療劑是選自由下述各者所組成群 組；己酸阿比特龍、六甲密胺、脫水長春花堿、歐瑞斯他汀、阿扎胞巧、AZD 8477、苯達莫司 汀、貝伐單抗、舊薩羅了、比卡魯胺、BMS184476、2, 3, 4, 5, 6-五氣-N-(3-氣-4-甲氧基苯 基）苯橫酷胺、博來霉素、棚替佐米、N，N-二甲基鄉氨酷基鄉氨酷基-N-甲基-k鄉 氨酷基脯氨酷基-1-L脯氨酸-第S了基酷胺、惡病質素、卡培拉濱、西馬多了、西妥昔 單抗、瘤可寧、環磯酷胺、3'，4' -二去氨-4' -二氧基-8' -諾文-長春堿、多西他賽、多締 紫杉醇、環磯酷胺、卡銷、卡莫司汀炬CNU)，順銷、念珠藻環膚、環磯酷胺、阿糖胞巧、達卡己 嗦值TIC)、更生霉素、達沙替巧、柔紅霉素、多拉斯他了、多韋替巧、多柔比星（阿霉素）、 表阿霉素、埃坡霉素B、埃羅替巧、艾瑞布爾、依托泊巧、依維莫司、5-氣尿喀晚、非那利得、 氣他胺、吉非替巧、吉西他濱、哲基脈W及哲基脈紫杉燒類、宜佛斯酷胺、干擾素a、伊馬替 巧、伊匹單抗、依利諾替康、拉鉤它索、拉帕替巧、來那度胺、利阿挫、洛那法巧、氯巧達明、洛 莫司汀（CCNU)、二氯甲基二己胺（氮芥）、美法侖、哲己基橫酸米伏布爾、利索新、什汀巧 夫、鏈脈霉素、絲裂霉素、甲氨蝶嶺、5-氣尿喀晚、巧魯米特、奧那司酬、草酸銷、他克挫、帕 巧單抗，帕挫帕巧、普拉曲沙、潑巧莫司汀、化曲克辛、丙卡己阱、化挫咐P丫晚、利妥昔單抗、 RPR109881、羅米地辛、索拉非巧、磯酸雌莫司汀、舒巧替巧、它莫西芬、他索爾明、紫杉醇、替 莫挫胺、拓撲替康、曲妥珠單抗、維A酸、立甲曲沙、威羅菲巧、長春花堿、長春新堿、硫酸長 春地辛、長春氣寧W及伏立諾他。
36. 如權利要求31的方法，其中，所述一種或多種治療劑是選自由吉西他濱和包含順 銷的W銷為主的化合物所組成群組。
37. 如權利要求31的方法，其中，所述癌癥是選自由膀脫癌、尿道、輸尿管W及腎孟的 尿道上皮細胞癌、多發性骨髓瘤、腎臟癌、乳癌、結腸癌、頭頸癌、肺癌、前列腺癌、神經膠母 細胞瘤、骨肉瘤、脂肪肉瘤、軟組織肉瘤、卵巢癌、黑色素瘤、肝癌、食道癌、膜臟癌W及胃癌 所組成群組。
38. 如權利要求31的方法，其中，所述癌癥是膀脫或尿道上皮細胞癌。
39. 如權利要求31的方法，其中，所述癌癥有化學抗性。
40. 如權利要求31的方法，其中，所述IL-2融合蛋白和所述一種或多種治療劑是在約 7至14天內給藥。
41. 如權利要求31的方法，其中，所述IL-2融合蛋白和所述一種或多種治療劑是在約 3至5天內給藥，或同時給藥。
42. 如權利要求31的方法，其中，所述比-2融合蛋白是ALT-801，而且所述一種或多種 治療劑是順銷。
43. 如權利要求42的方法，其中，所述一種或多種治療劑是吉西他濱。
44. 如權利要求31的方法，其中，所述比-2融合蛋白特異性地W所述癌癥細胞為目標。
45. 如權利要求44的方法，其中，所述IL-2融合蛋白特異性地W所述癌癥細胞的表面 上的p53勝膚/HLA絡合物為目標。
46. -種在受試者中誘發針對癌癥的耐久性免疫記憶反應的方法，包括： 對有需要的受試者給藥有效量的IL-2融合蛋白和治療劑，藉此誘發針對癌癥的耐久 性免疫記憶反應。
47. 如權利要求46的方法，其中，所述IL-2融合蛋白不特異性地W所述癌癥為目標或 結合所述癌癥。
48. 如權利要求46的方法，其中，所述IL-2融合蛋白包括T細胞受體（TCR)結構域。
49. 如權利要求48的方法，其中，所述T細胞受體結構域是單鏈T細胞受體。
50. 如權利要求46的方法，其中，所述一種或多種治療劑是選自由下列各者所組成群 組；己酸阿比特龍、六甲密胺、脫水長春花堿、歐瑞斯他汀、阿扎胞巧、AZD 8477、苯達莫司 汀、貝伐單抗、舊薩羅了、比卡魯胺、BMS184476、2, 3, 4, 5, 6-五氣-N-(3-氣-4-甲氧基苯 基）苯橫酷胺、博來霉素、棚替佐米、N, N-二甲基-L-鄉氨酷基-L-鄉氨酷基-N-甲基-L-鄉 氨酷基脯氨酷基-1-L脯氨酸-第S了基酷胺、惡病質素、卡培拉濱、西馬多了、西妥昔 單抗、瘤可寧、環磯酷胺、3'，4' -二去氨-4' -二氧基-8' -諾文-長春堿、多西他賽、多締紫 杉醇、環磯酷胺、卡銷、卡莫司汀炬CNU)、順銷、念珠藻環膚、環磯酷胺、阿糖胞巧、達卡己嗦 (DTIC)、更生霉素、達沙替巧、柔紅霉素、多拉斯他了、多韋替巧、多柔比星（阿霉素）、表阿 霉素、埃坡霉素B、埃羅替巧、艾瑞布爾、依托泊巧，依維莫司，5-氣尿喀晚，非那利得，氣他 胺、吉非替巧、吉西他濱、哲基脈W及哲基脈紫杉燒類、宜佛斯酷胺、干擾素a、伊馬替巧、伊 匹單抗、依利諾替康、拉鉤它索、拉帕替巧、來那度胺、利阿挫、洛那法巧、氯巧達明、洛莫司 汀（CCNU)、二氯甲基二己胺（氮芥）、美法侖、哲己基橫酸米伏布爾、利索新、什汀巧夫、鏈脈 霉素、絲裂霉素、甲氨蝶嶺、5-氣尿喀晚、巧魯米特、奧那司酬、草酸銷、他克挫、帕巧單抗、帕 挫帕巧、普拉曲沙、潑巧莫司汀、化曲克辛、丙卡己阱、化挫咐町晚、利妥昔單抗、RPR109881、 羅米地辛、索拉非巧、磯酸雌莫司汀、舒巧替巧、它莫西芬、他索爾明、紫杉醇、替莫挫胺，拓 撲替康、曲妥珠單抗、維A酸、=甲曲沙、威羅菲巧、長春花堿、長春新堿、硫酸長春地辛、長 春氣寧W及伏立諾他。
51. 如權利要求46的方法，其中，所述一種或多種治療劑是選自由吉西他濱和包含順 銷的W銷為主的化合物所組成群組。
52. 如權利要求46的方法，其中，所述癌是選自由膀脫癌、尿道、輸尿管W及腎孟的尿 道上皮細胞癌、多發性骨髓瘤、腎臟癌、乳癌、結腸癌、頭頸癌、肺癌、前列腺癌、神經膠母細 胞瘤、骨肉瘤、脂肪肉瘤、軟組織肉瘤、卵巢癌、黑色素瘤、肝癌、食道癌、膜臟癌W及胃癌所 組成群組。
53. 如權利要求46的方法，其中，所述癌癥是膀脫或尿道上皮細胞癌。
54. 如權利要求46的方法，其中，所述癌癥有化學抗性。
55. 如權利要求46的方法，其中，所述IL-2融合蛋白和所述一種或多種治療劑是在約 7至14天內給藥。
56. 如權利要求46的方法，其中，所述IL-2融合蛋白和所述一種或多種治療劑是在約 3至5天內給藥，或同時給藥。
57. 如權利要求46的方法，其中，所述比-2融合蛋白是ALT-801，而且所述一種或多種 治療劑是順銷。
58. 如權利要求57的方法，其中，所述一種或多種治療劑是吉西他濱。
59. 如權利要求46的方法，其中，所述比-2融合蛋白特異性地W所述癌癥細胞為目標。
60. 如權利要求59的方法，其中，所述IL-2融合蛋白特異性地W所述癌癥細胞的表面 上的p53勝膚/HLA絡合物為目標。
61. -種增加具有癌癥的受試者的存活的方法，包括： 對有需要的受試者給藥有效量的IL-2融合蛋白和治療劑，藉此增加所述受試者的存 活。
62. 如權利要求61的方法，其中，所述IL-2融合蛋白不特異性地W所述癌癥為目標或 結合所述癌癥。
63. 如權利要求61的方法，其中，所述比-2融合蛋白包括T細胞受體燈CR)結構域。
64. 如權利要求63的方法，其中，所述T細胞受體結構域是單鏈T細胞受體。
65. 如權利要求61的方法，其中，所述一種或多種治療劑是選自由下列各者所組成群 組；己酸阿比特龍、六甲密胺、脫水長春花堿、歐瑞斯他汀、阿扎胞巧、AZD 8477、苯達莫司 汀、貝伐單抗、舊薩羅了、比卡魯胺、BMS184476、2, 3, 4, 5, 6-五氣-N-(3-氣-4-甲氧基苯 基）苯橫酷胺、博來霉素、棚替佐米、N，N-二甲基鄉氨酷基鄉氨酷基-N-甲基-k鄉 氨酷基脯氨酷基-1-L脯氨酸-第S了基酷胺、惡病質素、卡培拉濱、西馬多了、西妥昔 單抗、瘤可寧，環磯酷胺、3'，4' -二去氨-4' -二氧基-8' -諾文-長春堿、多西他賽、多締紫 杉醇、環磯酷胺、卡銷、卡莫司汀炬CNU)、順銷、念珠藻環膚、環磯酷胺、阿糖胞巧、達卡己嗦 (DTIC)、更生霉素，達沙替巧、柔紅霉素、多拉斯他了、多韋替巧、多柔比星（阿霉素）、表阿 霉素、埃坡霉素B，埃羅替巧、艾瑞布爾、依托泊巧、依維莫司、5-氣尿喀晚、非那利得、氣他 胺、吉非替巧、吉西他濱、哲基脈W及哲基脈紫杉燒類、宜佛斯酷胺、干擾素a、伊馬替巧、伊 匹單抗、依利諾替康、拉鉤它索、拉帕替巧、來那度胺、利阿挫、洛那法巧、氯巧達明、洛莫司 汀（CCNU)、二氯甲基二己胺（氮芥）、美法侖、哲己基橫酸米伏布爾、利索新、什汀巧夫、鏈脈 霉素、絲裂霉素、甲氨蝶嶺、5-氣尿喀晚、巧魯米特、奧那司酬、草酸銷、他克挫、帕巧單抗、帕 挫帕巧、普拉曲沙、潑巧莫司汀、化曲克辛、丙卡己阱、化挫咐町晚、利妥昔單抗、RPR109881、 羅米地辛、索拉非巧、磯酸雌莫司汀、舒巧替巧、它莫西芬、他索爾明、紫杉醇、替莫挫胺、拓 撲替康、曲妥珠單抗、維A酸、=甲曲沙、威羅菲巧、長春花堿、長春新堿、硫酸長春地辛、長 春氣寧W及伏立諾他。
66. 如權利要求61的方法，其中，所述一種或多種治療劑是選自由吉西他濱和包含順 銷的W銷為主的化合物所組成群組。
67. 如權利要求61的方法，其中，所述癌癥是選自由膀脫癌、尿道、輸尿管W及腎孟的 尿道上皮細胞癌、多發性骨髓瘤、腎臟癌、乳癌、結腸癌、頭頸癌、肺癌、前列腺癌、神經膠母 細胞瘤、骨肉瘤、脂肪肉瘤、軟組織肉瘤、卵巢癌、黑色素瘤、肝癌、食道癌、膜臟癌w及胃癌 所組成群組。
68. 如權利要求61的方法，其中，所述癌癥是膀脫或尿道上皮細胞癌。
69. 如權利要求61的方法，其中，所述癌癥有化學抗性。
70. 如權利要求61的方法，其中，所述IL-2融合蛋白和所述一種或多種治療劑是在約 7至14天內給藥。
71. 如權利要求61的方法，其中，所述IL-2融合蛋白和所述一種或多種治療劑是在約 3至5天內給藥，或同時給藥。
72. 如權利要求61的方法，其中，所述比-2融合蛋白是ALT-801，而且所述一種或多種 治療劑是順銷。
73. 如權利要求72的方法，其中，所述一種或多種治療劑是吉西他濱。
74. 如權利要求61的方法，其中，所述比-2融合蛋白特異性地W所述癌癥細胞為目標。
75. 如權利要求74的方法，其中，所述IL-2融合蛋白特異性地W所述癌癥細胞的表面 上的p53勝膚/HLA絡合物為目標。
76. -種治療膀脫癌的套組，包括IL-2融合蛋白和一種或多種治療劑。
77. 如權利要求76的方法，其中，所述比-2融合蛋白是ALT-801，而且所述一種或多種 治療劑是順銷。
78. 如權利要求77的方法，其中，所述一種或多種治療劑是吉西他濱。
【文檔編號】A61K38/20GK104470535SQ201380028390
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2013年3月15日 優先權日:2012年3月29日
【發明者】J·聞, W·徐, P·羅德, H·C·黃 申請人:阿爾托生物科學有限公司