植物中類輪狀病毒顆粒的產生的制作方法

植物中類輪狀病毒顆粒的產生的制作方法
【專利摘要】本發明提供了在植物中產生類病毒顆粒(VLP)的方法。所述方法包括將第一核酸引入至所述植物或所述植物的部分中。所述第一核酸包含在所述植物中具有活性并且操作性地連接至編碼一個或更多個輪狀病毒結構性蛋白質(例如但不限于輪狀病毒蛋白質VP2)的核苷酸序列的第一調控區。所述核苷酸序列還可以包含一個或一個以上的擴增元件和/或區室靶向序列。可以將第二核酸引入至所述植物或所述植物的部分中。所述第二核酸包含在所述植物中具有活性并且操作性地連接至編碼一個或更多個輪狀病毒結構性蛋白質(例如但不限于輪狀病毒蛋白質VP6)的核苷酸序列的第二調控區。任選地，可以將第三核酸和/或第四核酸引入至所述植物或所述植物的部分中。所述第三核酸包含在所述植物中具有活性并且操作性地連接至編碼一個或更多個輪狀病毒結構性蛋白質(例如但不限于輪狀病毒蛋白質VP4)的核苷酸序列的第三調控區。所述第四核酸包含在所述植物中具有活性并且操作性地連接至編碼一個或更多個輪狀病毒結構性蛋白質(例如但不限于輪狀病毒蛋白質VP7)的核苷酸序列的第四調控區。在允許所述核酸表達的條件下培養所述植物或所述植物的部分，由此產生了RLP。
【專利說明】植物中類輪狀病毒顆粒的產生

【技術領域】
[0001] 本發明涉及在植物中產生輪狀病毒結構性蛋白質。更具體地，本發明涉及在植物 中產生包含輪狀病毒結構性蛋白質的類病毒顆粒。

【背景技術】
[0002] 輪狀病毒感染為全球性的問題，主要影響五歲以下的兒童。它導致嚴重的腸胃炎， 并且在最壞的情況下導致死亡。
[0003] 輪狀病毒是呼腸孤病毒科（Reoviridae)病毒（輪狀病毒屬）的成員，其感染腸 胃系統與呼吸道。該名稱源于當通過負相差電子顯微鏡（negativecontrastelectron microscopy)觀察時病毒粒子的輪狀外觀（圖la;現有技術）。輪狀病毒通常為球形，并且 因外殼和內殼或它們的雙殼衣殼結構而得名。分別地，外衣殼直徑為約70nm，內衣殼直徑為 約55nm。輪狀病毒的雙殼衣殼圍繞包括內蛋白質殼和基因組的核心。輪狀病毒的基因組由 編碼至少11個輪狀病毒蛋白的雙鏈RNA片斷組成。
[0004]dsRNA編碼六個結構性蛋白質（VP)與六個非結構性蛋白質（NSP)(圖Ic;現有技 術）。結構性蛋白質包含VP1、VP2、VP3、VP4、VP6與VP7(圖Ib;現有技術）。三個同心層 分別通過VP2、VP6與VP7的組裝形成，其中VP4在病毒結構表面上形成"刺突（spike)"。 NSPs是在受感染的細胞內合成的，并且在復制周期的多個部分中起作用或者與宿主蛋白中 的一些相互作用從而影響發病或對感染的免疫應答（GreenbergandEstes, 2009)。
[0005]VP2是102kDa的蛋白質，并且是病毒核心中含量最豐富的蛋白質。它形成最內層 的結構性蛋白質層，并且為病毒核心的組分和轉錄酶的正確組裝提供骨架（Lawton，2000)。 VPl是125kDa的最大的病毒蛋白，其作為輪狀病毒的RNA依賴性聚合酶發揮作用，產生核心 復制中間產物，并且與VP2在其二十面體頂點處相結合（VaraniandAllain, 2002;Vende 等人，2002)。VP3 (98kDa的蛋白質）也直接與病毒基因組相結合，從而起到將5'端帽結構添 加至病毒mRNA的mRNA加帽酶（cappingenzyme)的作用。VPl與VP3 -起形成附著至VP2 衣殼層的外部5倍頂點的復合物（Angel，2007)。VP6是42kDa的蛋白質，其形成病毒核心的 中層殼，它是主要衣殼蛋白，并且在病毒顆粒的總蛋白質物質中占超過50% (Gonzdlez等 人，2004 ;Estes，1996)。它是基因轉錄所必需的，并且可以通過在核心中將VPl錨定至VP2 而在輪狀病毒RNA的封裝中起作用，如在呼腸孤病毒科的另一成員藍舌病毒（bluetougue virus)中所觀察到的那樣。它還決定輪狀病毒分為五組（A至E)的分類，其中A組最常感 染人類（Palombo，1999)。輪狀病毒A組中的VP6具有至少四個亞組（SG):SGI、SGII、 SG(I+II)與SG非-(1+11)，這取決于SG特異性表位的存在與否。B組與C組缺少A組共有 的抗原，但也已知會感染人，而D組僅感染動物，例如，雞與奶牛（Thongprachum，2010)。
[0006] 兩種外部衣殼蛋白VP7,即37kDa的糖蛋白（G)與87kDa的蛋白酶敏感性VP4(P) 定義了病毒的血清型。這兩種蛋白質誘導中和抗體反應并因而被用于將輪狀病毒血清型 分類為雙命名系統，這取決于G-P抗原組合（例如，GlP[8]或G2P[4]) (Sanchez-Padilla 等人，2009)。VP4蛋白二聚化從而在病毒外殼上形成60個刺突，所述刺突直接參與宿主細 胞進入的初始階段。刺突蛋白在氨基酸（aa)位置248處包含切割位點。一旦感染，它被 蛋白酶胰蛋白酶切割，從而產生VP5(529aa，60kDa)和VP8(246aa，28kDa) (Denisova等人， 1999) 。該過程增強了病毒的感染性（宿主細胞的細胞附著與侵入）并且穩定了刺突結構 (Glass，2006)。VP7糖蛋白形成病毒的第三層或外層。目前，27G與35P基因型是已知的 (GreenbergandEstes，2009)。VP4與VP7是參與病毒中和的主要抗原并且是疫苗開發的 重要革巴標（Dennehy，2007)。
[0007] 在受感染的哺乳動物細胞中，輪狀病毒經歷獨特形式的形態發生以形成完整的 三層VP2/6/4/7病毒顆粒（Lopez等人，2005)。三層衣殼是非常穩定的復合物，使其能夠 糞-口傳播并將病毒遞送至小腸，在此其感染接近絨毛尖端的非分裂的分化腸上皮細胞 (GreenbergandEstes，2009)。首先，完整的病毒通過病毒表面上的60個VP4二聚體刺突 附著在獨立于唾液酸的受體上（LundgrenandSvensson，2001)。病毒表面上的60個VP4 二聚體刺突允許病毒附著至這些細胞受體。VP4對通過胰蛋白酶的蛋白水解切割敏感，這導 致構象變化，所述變化暴露出用于和一系列共同受體相互作用的、糖蛋白表面上的額外附 著位點。
[0008] 然而，多步附著和進入過程尚未被清楚了解，但病毒被遞送穿過宿主細胞膜。 VP7外部衣殼（也參與了進入過程）在該過程中被除去，并且雙層顆粒（DLP)在囊泡中 被遞送至細胞質（圖2;現有技術）。DLP從囊泡脫離并且進入非膜結合的細胞質內含物 (cytoplasmicinclusions)中。通過VPl的基因組早期轉錄在顆粒中開始，從而使得dsRNA 永不暴露于細胞質。RNA復制與核心形成在這些非膜結合的細胞質內含物中發生。然后，初 期（+)RNA被運輸進細胞質并用作病毒蛋白質合成的模板。VP4在胞質溶膠中產生并被運輸 至粗面內質網（RER)，并且VP7被分泌進RER。VP2與VP6在病毒體的胞液中產生并組裝， 并且隨后出芽（bud)進RER區室，在該過程中獲得瞬時膜包膜（Lopez等人，2005 ;Tian等 人，1996)。在RER中，在輪狀病毒糖蛋白NSP4的關鍵性參與下，病毒顆粒的瞬時膜包膜被 移除并被VP4與VP7蛋白質單體代替（Tian等人，1996 ;Lopez等人，2005 ;Gonzalez等人， 2000) 。NSP4在ER膜中作為細胞內受體發揮作用，并且結合新產生的亞病毒顆粒，以及還可 能結合刺突蛋白VP4 (Tian等人，1996)。NSP4也對人有毒，并且是腹瀉的致病物。隨后，完 整、成熟的顆粒通過高爾基體從RER中轉移至質膜進行分泌（Lopez等人，2005)。
[0009] 已采用多種不同的手段來產生適合保護人群以抵擋多種血清型的輪狀病毒的輪 狀病毒疫苗。這些手段包括多種Jennerian手段、使用減毒活病毒、使用類病毒顆粒、核酸 疫苗和作為免疫原的病毒亞單元。目前市場上有兩種可用的經口疫苗，然而，在一些發展中 國家由于病毒株變化以及其它病原體的存在，這些疫苗效力較低。
[0010] 美國專利No. 4, 624, 850、4, 636, 385、4, 704, 275、4, 751，080、4, 927, 628、 5, 474, 773與5, 695, 767每篇描述了多種輪狀病毒疫苗和/或制備它們的方法。該組成員 共有的共同性為這些疫苗中的每一種均依賴全病毒顆粒的使用以產生最終的輪狀病毒疫 苗。考慮到對有效的多價疫苗的長期需求，很明顯該工作主體在解決對此類疫苗的需求上 僅部分成功。
[0011] 不同于傳統疫苗生產方法，分子生物學領域的進展已允許表達各輪狀病毒蛋白。 Crawford等人（JVirol. 1994S印tember;68 (9) :5945-5952)將編碼主要衣殼蛋白的VP2、VP4、VP6與VP7克隆進桿狀病毒表達系統，并在昆蟲細胞中表達了每種蛋白質。輪狀病毒 主要結構性蛋白質的不同組合的共表達導致形成了穩定的類病毒顆粒（VLP)。VP2和VP6 的單獨共表達或與VP4的共表達導致產生了VP2/6VLP或VP2/4/6VLP，它們與雙層輪狀病毒 顆粒相似。VP2、VP6與VP7的共表達（與或不與VP4的情況下）產生了三層的VP2/6/7VLP 或VP2/4/6/7VLP，它們與天然感染性輪狀病毒顆粒相似。各VLP維持了天然粒子的結構和 功能性特征（如通過粒子電子顯微鏡觀察所確定的）、VP4與VP7上非中和表位與中和表位 的存在、和VP2/4/6/7VLP的血球凝集活性。
[0012] 從不同蛋白質組成的類病毒顆粒產生的疫苗候選物已顯示出作為亞單位疫苗的 潛力 ^O'Neal等人（''RotavirusVirus-likeParticlesAdministeredMucosallyInduce ProtectiveImmunity, 〃J.Virology, 71 (11) :8707-8717(1997))顯示當將含有VP2 與VP6 的VLP或含有VP2、VP6與VP7的VLP在加入和未加入霍亂毒素的情況下施用至小鼠時，它們 在免疫小鼠中誘導了保護性免疫，而當各VLP與霍亂毒素（CT) 一起施用時保護更為有效。
[0013] 類核心顆粒（CLP)與VLP還用于免疫奶牛，Fernandez等人（"PassiveImmunity toBovineRotavirusinNewbornCalvesFedColostrumSupplementsFromCows ImmunizedwithRecombinantSAllrotaviruscore-likeparticle(CLP)orvirus-like particle(VLP)vaccines, "Vaccine, 16 (5) : 507-516 (1998))。在該研究中，研究了CLPs與 VLPs產生被動免疫的能力。該研究組總結：VLP在誘導被動免疫時比CLP更有效。
[0014] 植物正被越來越多地用于重組蛋白質的大規模生產。例如，US2003/0175303公 開了經穩定轉化的番茄植株中重組輪狀病毒結構性蛋白質VP6、VP2、VP4或VP7的表達。
[0015]Saldana等人使用花椰菜花葉病毒（CaMV) 35S啟動子和重組農桿菌 (A.tumefaciens)在番爺植株的細胞質中表達了VP2與VP6 (Saldana等人，2006)。電子顯 微鏡研究顯示少部分的顆粒已組裝至2/6VLP中。在小鼠中檢測到了保護性免疫應答，并且 這在某種程度上可能是未組裝的VP導致的。各蛋白質已顯示在小鼠中引起免疫應答，如在 VP8與VP6的情況中那樣（Zhou等人，2010)。
[0016]Matsumura等人（2002)首先報道了轉基因馬鈴薯植株中牛輪狀病毒AVP6的表 達和組裝。在他們的研究中，他們使用了通過花椰菜花葉病毒（CaMV)35S啟動子調控的轉 基因馬鈴薯植株以及攜帶VP6基因的重組農桿菌（Agrobacteriumtumefaciens)。將蛋白 質表達、純化并進行免疫研究。成年小鼠中的免疫應答顯示血清中存在VP6抗體。然而，它 們未顯示出經組裝的VP6蛋白質的跡象。其可能是簡單單體或者三聚體（可能在小鼠中 引起免疫應答）。另一小組的工作顯示了使用馬鈴薯病毒X(PVX)載體在煙草（Nicotiana benthamiana)中VP6的組裝（0'Brien等人，2000)。當VP6蛋白在植物中表達時，發現它 僅在融合至PVX桿狀蛋白質（PVXproteinrods)時組裝。一旦發生切割，VP6組裝進二十 面體VLP，如Marusic等人（2001)在對HIV-PVX的類似研究中所觀察到的那樣。該結果可 能暗示輪狀病毒蛋白質可能需要額外的因子或強化來形成VLP。
[0017] 由于需要對一個或更多個重組蛋白質的合成和組裝兩者，因此VLP的生產是具有 挑戰性的工作。對于輪狀病毒（其為RNA病毒，具有由四種不同蛋白質的1860個單體形成 的衣殼）的VLP而言正是如此。對于VLP的生產，二至三個重組蛋白質的同時表達與組裝 是必需的。這些包括120個分子的VP2(內層）、780個分子的VP6(中間層）與780個分子 的糖蛋白VP7 (外層），最終形成了雙層或三層顆粒。另外，大多數VLP的生產需要若干重組 蛋白的同時表達與組裝，對于類輪狀病毒顆粒（RLP)的情況而言，這需要在單一宿主細胞 中發生。
[0018] 最近的研究顯示使用甜菜黑色焦枯病毒（Beetblackscorchvirus,BBSV)介導 的表達系統在紅藜（Chenopodiumamaranticolor)中成功表達了經密碼子優化的人輪狀病 毒VP6。該蛋白質被工程化為BBSV的外殼蛋白開放閱讀框的代替物。使用基于植物的VP6 蛋白對雌性BALB/c小鼠進行經口免疫，誘導了高效價的抗VP6粘膜IgA與血清IgG(Zhou 等人，2010)。然而，該研究組并未提及VP6蛋白組裝進VLP還是顆粒。
[0019] 輪狀病毒VP7也已被成功地表達進煙草植株中，并且其顯示在小鼠中維持了其中 和性免疫應答（YuandLangridge，2001)。使用轉基因馬鈴薯植株來表達VP7的另一研究 顯示VP7基因在經轉化的植物中穩定超過50代。來自第50代的VP7蛋白在成年小鼠中誘 導了保護性抗體以及中和性抗體兩者（Li等人，2006)。
[0020] Yang等人（YangYM，LiX，YangH等人，2011)將ARV組（P[8]Gl)的三個輪狀 病毒衣殼蛋白質VP2、VP6與VP7共表達進了煙草植株中，并且研究了這些蛋白質的表達水 平以及類輪狀病毒顆粒的形成與免疫原性。從轉基因煙草植株中純化了VLP并通過電子顯 微鏡和Western印跡法進行了分析。Yang等人的結果表明植物來源的VP2、VP6與VP7蛋 白質自組裝進直徑60-80nm的2/6或2/6/7類輪狀病毒顆粒。


【發明內容】

[0021] 本發明涉及在植物中產生輪狀病毒結構性蛋白質。更具體地，本發明還涉及在植 物中產生包含輪狀病毒結構性蛋白質的類病毒顆粒。
[0022]根據本發明，提供了在植物中產生類輪狀病毒顆粒（RLP)的方法（A)，所述方法包 括：
[0023]a)將下述第一核酸、第二核酸和第三核酸引入至該植物、植物的部分或植物細胞 中，所述第一核酸包含在該植物中具有活性并且操作性地連接至編碼第一輪狀病毒結構性 蛋白質的第一核苷酸序列的第一調控區，所述第二核酸包含在該植物中具有活性并且操作 性地連接至編碼第二輪狀病毒結構性蛋白質的第二核苷酸序列的第二調控區，所述第三核 酸包含在該植物中具有活性并且操作性地連接至編碼第三輪狀病毒結構性蛋白質的第三 核苷酸序列的第三調控區，
[0024]b)在允許所述第一、第二和第三核酸瞬時表達的條件下培育所述植物、植物的部 分或植物細胞，由此產生RLP。
[0025] 此外，在步驟a)中，可以將下述第四核酸引入至該植物、植物的部分或植物細胞， 所述第四核酸包含在植物中具有活性并且操作性地連接至編碼第四輪狀病毒結構性蛋白 質的第四核苷酸序列的第四調控區，并且當在步驟b)中培育該植物、植物的部分或植物細 胞時所述第四核酸被表達。
[0026] 如以上方法（A)中所述，第一輪狀病毒結構性蛋白質可以是VP2,第二輪狀病毒結 構性蛋白質可以是VP6,并且第三輪狀病毒結構性蛋白質可以是VP4或VP7。此外，第四輪 狀病毒結構性蛋白質可以是VP7或VP4。蛋白酶可以在植物內共表達。
[0027] 本發明還提供了產生類輪狀病毒顆粒（RLP)的方法（B)，所述方法包括：
[0028]a)將下述核酸引入至植物、植物的部分或植物細胞，所述核酸包含在植物中具有 活性并且操作性地連接至編碼一個或更多個輪狀病毒結構性蛋白質的第一核苷酸序列的 調控區，
[0029]b)在允許所述第一核酸瞬時表達的條件下培育所述植物、植物的部分或植物細 胞，由此產生RLP。
[0030] 如上所述的方法（B)還可以包括：在步驟a)中引入第二核酸，所述第二核酸包含 在該植物中具有活性并且操作性地連接至編碼一個或更多個輪狀病毒結構性蛋白質的第 二核苷酸序列的第二調控區，并且，當在步驟b)中培育該植物、植物的部分或植物細胞時 表達第二核酸。
[0031] 如上所述的方法（B)還可以包括：在步驟a)中將第三核酸引入至該植物，所述第 三核酸包含在該植物中具有活性并且操作性地連接至編碼一個或更多個輪狀病毒結構性 蛋白質的第三核苷酸序列的第三調控區，并且，當在步驟b)中培育該植物、植物的部分或 植物細胞時表達第三核酸。
[0032] 此外，在方法（A)或（B)中，可以在該植物、植物的部分或植物細胞中表達下述其 它的核酸，并且其中所述其它的核酸包含在該植物中具有活性并且操作性地連接至編碼沉 默抑制子的核苷酸序列的調控區。
[0033] 可以將核苷酸序列密碼子的使用調整為優選的人密碼子使用、提高的GC含量或 其組合。
[0034] 輪狀病毒結構性蛋白質可以包括截短的天然或非天然信號肽。非天然的信號肽可 以是蛋白質二硫鍵異構酶信號（roi)肽。
[0035] 可以將第一、第二、第三或第四核苷酸序列或其組合操作性地連接至豇豆花葉病 毒（CPMV)調控區。
[0036] 如上所述的方法（A)或（B)還可以包括以下步驟：
[0037] c)收獲所述植物、植物的部分或植物細胞，和
[0038] d)從所述植物、植物的部分或植物細胞純化RLP。
[0039] 在方法（A)或（B)中的收獲或純化步驟期間，可以使用胰蛋白酶、胰蛋白酶樣蛋白 酶、絲氨酸蛋白酶、糜蛋白酶樣蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶加工或切割VP4,以產生VP5和VP8。
[0040] RLP的尺寸可以在70-100nm的范圍內，并且可以在存在鈣的情況下被純化。
[0041] 本發明提供了通過如上所述的方法（A)或⑶產生的RLP。所產生的RLP可以至 少包含VP4輪狀病毒結構性蛋白質。可以使用蛋白酶，例如，胰蛋白酶、胰蛋白酶樣蛋白酶、 絲氨酸蛋白酶、糜蛋白酶樣蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶，將VP4切割成VP5和VP8。蛋白酶可以 在植物內共表達或者在收獲、純化或兩者期間加入。此外，通過方法（A)或（B)產生的RLP 可以是雙層RLP和/或三層RLP。
[0042] 此外，本發明提供了核苷酸序列。編碼VP2的核苷酸序列可以包含與如SEQID N0:13、SEQIDN0:14或SEQIDN0:45所定義的核苷酸序列80%至100%的同一性。編碼 VP6的核苷酸序列可以包含與如SEQIDNO:17、SEQIDNO:18或SEQIDNO:46所定義的 核苷酸序列80%至100%的同一性。編碼VP7的核苷酸序列可以包含與如SEQIDNO:19、 20、48、49、52、53、54或57所定義的核苷酸序列80%至100%的同一性。并且，編碼VP4的 核苷酸序列可以包含與SEQID勵：15、16、47、50或51所定義的核苷酸序列80%至100% 的同一性。另外，VP2可由包含與SEQIDNO:1或SEQIDNO:25所定義的氨基酸序列的 80%至100%同一性的氨基酸序列編碼。VP6可由包含與SEQIDNO:3或SEQIDNO:31所 定義的氨基酸序列的80%至100%同一性的氨基酸序列編碼。VP7可由包含與SEQIDNO: 4、39、43或59所定義的氨基酸序列的80%至100%同一性的氨基酸序列編碼。VP4可由包 含與SEQIDNO:2或SEQIDNO:36、33所定義的氨基酸序列的80%至100%同一性的氨基 酸序列編碼。所述一個或更多個輪狀病毒結構性蛋白質可以是VP2、VP4、VP6和/或VP7。 可以將VP4加工成VP5和VP8。一個或更多個輪狀病毒結構性蛋白質可以選自輪狀病毒株 G9P[6]、輪狀病毒AWA株、輪狀病毒A疫苗USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8]株以 及輪狀病毒SAll株。
[0043] 在如上所述的方法（A)中，第一、第二或第三核酸序列或其組合可以包含下述在 該植物中具有活性的調控區，所述調控區被操作性地連接至一個或一個以上豇豆花葉病毒 (comovirus)增強子、連接至一個或一個以上擴增元件以及連接至編碼輪狀病毒結構性蛋 白質的核苷酸序列，并且其中可以將編碼復制酶的第四核酸引入至該植物、植物的部分或 植物細胞。
[0044] 在如上所述的方法（B)中，第一、第二、第三或第四核酸序列或其組合可以包含下 述在該植物中具有活性的調控區，所述調控區被操作性地連接至一個或一個以上豇豆花葉 病毒（comovirus)增強子、連接至一個或一個以上擴增元件以及連接至編碼輪狀病毒結構 性蛋白質的核苷酸序列，并且其中可以將編碼復制酶的第五核酸引入至該植物、植物的部 分或植物細胞。
[0045] 另外，根據本發明，提供了在植物中產生類輪狀病毒顆粒（RLP)的方法（C)，所述 方法包括：
[0046]a)將下述核酸引入至植物或植物的部分，所述核酸包含在植物中具有活性并且操 作性地連接至編碼一個或更多個輪狀病毒結構性蛋白質的核苷酸序列的調控區，
[0047]b)在允許所述第一核酸瞬時表達的條件下培育所述植物、植物的部分，由此產生 RLP。
[0048] 此外，可以將第二核酸引入至植物或植物的部分，所述第二核酸包含在該植物中 具有活性并且操作性地連接至編碼一個或更多個輪狀病毒結構性蛋白質的第二核苷酸序 列的第二調控區，并且其中當在步驟b)中培育該植物或植物的部分時，第二核酸被表達。 [0049] 此外，可以將第三核酸引入至植物或植物的部分，所述第三核酸包含在該植物中 具有活性并且操作性地連接至編碼一個或更多個輪狀病毒結構性蛋白質的第三核苷酸序 列的第三調控區，并且其中當在步驟b)中培育該植物或植物的部分時，第三核酸被表達。
[0050] 如上所述的方法（C)還可以包含收獲植物和提取RLP的步驟。
[0051] 方法（C)的一個或更多個輪狀病毒結構性蛋白質可以是輪狀病毒蛋白質VP2、VP4 或VP6。所述第一或第二核苷酸序列編碼的一個或更多個輪狀病毒結構性蛋白質可以是 VP2或VP6。第三核苷酸序列編碼的一個或更多個輪狀病毒結構性蛋白質可以是VP4。可以 將VP4切割以產生VP5和VP8。
[0052] 所述第一、第二或第三核苷酸序列還可以編碼、包含、或者編碼并包含一個或一個 以上的區室靶向序列和/或擴增元件。所述一個或更多個區室靶向序列將一個或更多個輪 狀病毒結構性蛋白質引向植物細胞的內質網（ER)、葉綠體、質體或質外體。
[0053] 本發明還提供了產生類輪狀病毒顆粒（RLP)的方法（D)，所述方法包括：
[0054]a)提供包含下述核酸的植物或植物的部分，所述核酸包含在植物中具有活性并且 操作性地連接至編碼一個或更多個輪狀病毒結構性蛋白質的核苷酸序列的調控區，
[0055] b)在允許所述核酸瞬時表達的條件下培育所述植物、植物的部分或植物細胞，由 此產生RLP。
[0056] 此外，方法（D)的植物或植物的部分還可以包含：
[0057] i)第二核酸，其包含在植物中具有活性并且操作性地連接至編碼一個或更多個輪 狀病毒結構性蛋白質的第二核苷酸序列的第二調控區，
[0058] ii)第二和第三核酸，其中所述第二核酸包含在植物中具有活性并且操作性地連 接至編碼一個或更多個輪狀病毒結構性蛋白質的第二核苷酸序列的第二調控區，并且所述 第三核酸包含在植物中具有活性并且操作性地連接至編碼一個或更多個輪狀病毒結構性 蛋白質的第三核苷酸序列的第三調控區，
[0059] 其中當在步驟b)中培育植物或植物的部分時，所述第二核酸、或所述第二和第三 核酸被表達。
[0060] 方法（D)中的一個或更多個結構性蛋白質可以是輪狀病毒蛋白質VP2、VP4或 VP6。所述第一或第二核苷酸序列編碼的一個或更多個輪狀病毒結構性蛋白質可以是VP2 或VP6。所述第三核苷酸序列編碼的一個或更多個輪狀病毒結構性蛋白質可以是VP4。可 以使用蛋白酶，例如，胰蛋白酶、胰蛋白酶樣蛋白酶、絲氨酸蛋白酶、糜蛋白酶樣蛋白酶、枯 草桿菌蛋白酶，將VP4切割成VP5和VP8。蛋白酶可以在植物內共表達，或者在收獲、純化或 兩者期間加入。
[0061] 本發明提供了通過如上所述的方法（A)、方法（B)、方法（C)、方法（D)或它們的組 合產生的RLP。所述RLP可以包含一個或更多個輪狀病毒結構性蛋白質，其可以包含植物特 異性N-聚糖或經修飾的N-聚糖。
[0062] 本發明包括含有有效劑量的RLP和可藥用載體的組合物，所述RLP是通過如剛才 所述的方法（A)、方法（B)、方法（C)、方法（D)或它們的組合制備的，用于誘導免疫應答。 [0063] 本發明還包括在受試者中誘導對輪狀病毒感染的免疫性的方法，所述方法包括將 如剛才所述的RLP施用于受試者。可以將RLP經口、皮內、鼻內、肌內、腹膜內、靜脈內或皮 下施用于受試者。
[0064] 本發明還提供了植物材料，所述植物材料包含通過如上所述的方法（A)、方法 (B)、方法（C)、方法（D)或它們的組合產生的RLP。可以將植物材料用于在受試者中誘導對 輪狀病毒感染的免疫性。植物材料還可以作為食品補充劑被混合。
[0065] 在如上所述的方法（方法A、B、C或D)中，植物或植物的部分還可以與編碼沉默抑 制子的另一核酸序列一起施用，或者還可以包含編碼沉默抑制子的另一核酸序列。
[0066] 此外，本發明還提供了在植物中產生輪狀病毒結構性蛋白質的方法（E)，所述方法 包括：
[0067]a)將下述核酸引入至植物或植物的部分，所述核酸包含在植物中具有活性并且操 作性地連接至編碼一個或更多個輪狀病毒結構性蛋白質的核苷酸序列的調控區；
[0068]b)在允許所述核酸瞬時表達的條件下培育所述植物或植物的部分，由此產生一個 或更多個輪狀病毒結構性蛋白質。
[0069] 本
【發明內容】
不意味著描述了本發明的全部特征。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0070] 通過參考附圖進行的下列描述，本發明的這些和其它特征將變得更明顯，其中：
[0071] 圖1顯示了輪狀病毒結構和基因-蛋白質分配。（A)輪狀病毒顆粒的透射電子顯微 結果（比例條表示IOOnm)。（B)病毒衣殼蛋白質的組織，其包括內部、中間與外部。（C)按 照大小與功能排列的輪狀病毒dsRNA片斷。可以通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離dsRNA(D)。 通過⑶中的dsRNA片斷表示（C)中的蛋白質。圖片來自：Crawford等人，1997 (A),Swiss InstituteofBioinformatics，2008(B)和GreenbergandEstes,2009(D)。
[0072] 圖2顯示了輪狀病毒的細胞進入與復制。當輪狀病毒進入細胞時，VP4與VP7丟 失，從而形成雙層顆粒（DLP)。dsRNA的轉錄開始，從而導致VP2、VP4、VP6與VP7的翻譯。 在病毒工廠（也稱作病毒原質）產生了具有復制酶活性的子代核心。在這些子代核心中發 生后期轉錄。在病毒工廠（virusfactories)的周圍，這些核心被VP6包覆，從而形成出芽 并穿過內質網膜的未成熟DLP，獲得經ER駐留病毒糖蛋白NSP4與VP7修飾的瞬時脂膜；這 些包膜的顆粒還包含VP4。當顆粒朝ER潴泡（cisternae)內部移動時，瞬時脂膜和非結構 性蛋白質NSP4丟失，而病毒表面蛋白VP4與VP7重排以形成最外病毒蛋白質層，從而產生 成熟的具有感染性的三層顆粒（參見SwissInstituteofBioinformatics(ViralZone): viralzone.expasy.org/viralzone/all_by_species/107.html)〇
[0073]圖 3 顯示了農桿菌載體pTRAc、pTRAkc-rbcsl-cTP與pTRAkc-ERH。P35SS，具有重 復轉錄增強子的CaMV35S啟動子；CHS,查耳酮合酶（chalconesynthase)的5'非翻譯區； pA35S，CaMV35S多腺苷酸化信號；SAR，煙草Rb7基因的骨架結合區（scaffoldattachment region) ;LB與RB,T-DNA整合的左邊界與右邊界；ColElori，大腸桿菌（E.coli)的復制起 點；RK2ori，農桿菌（Agrobacterium)的復制起點；bla，氨節青霉素/羧節青霉素抗性bla 基因；LPH，來自鼠mAb24重鏈的信號肽序列；his6,6XHis標記序列；SEKDEL，ER-駐留信 號序列；rbcsl-cTP，來自馬鈴薯（Solanumtuberosum)的Rubisco小亞單位基因（rbcSl) 的葉綠體轉運肽序列；nptII，卡那霉素抗性nptII基因；Pnos與pAnos，胭脂氨酸合酶 (nopalinesynthase)基因的啟動子與多腺苷酸化信號（Maclean等人，2007)。
[0074] 圖4顯示了輪狀病毒克隆和浸潤（infiltration)流程的概況。
[0075] 圖5顯示了質外體蛋白質提取流程。（A)對植物細胞與質外體位置的闡示。VP蛋 白質表達于胞質溶膠中，并且靶向質外體（紅色箭頭）。（B)-在時間試驗后，將植物葉片 用PBS真空浸潤（1)，并且置于穿孔離心柱中（2)，然后在2ml微量離心管（Eppendorf)中 離心以收集汁液（3)。
[0076] 圖6顯示了對7天內在植物葉細胞區室中的輪狀病毒VP6蛋白質表達的Western 印跡分析。使用小鼠抗輪狀病毒VP6抗體（1:5000)以對膜進行探測。（+)和（-)分別表 示在有或沒有沉默抑制子的情況下的表達。紅線表示VP6蛋白質在多個分析樣品中的位置 (?40kDa)。VP6的表達和提取效率在細胞質中是最佳的。
[0077] 圖7顯示了Western印跡,其展示了在第3天、在本塞姆氏煙草（N.benthamiana) 植株葉片的細胞質中經組氨酸標記的輪狀病毒蛋白質的各自的表達。+ve-細菌表達的輪 狀病毒VP2 ;M-分子量標志物；VP-輪狀病毒衣殼蛋白質。VP7浸潤導致葉片（b)黃化。
[0078] 圖8顯示了在第3天、祀向多個本塞姆氏煙草（N.benthamiana)植物葉細胞區 室的輪狀病毒VP2(a)和VP4(b)的表達。使用分別針對VP2與VP4的雞抗輪狀病毒血清 (1:2000)來探測蛋白質。cTp-葉綠體；ER-內質網；pTRAc-細胞質；A-質外體；陰性對 照（_ve)-僅用沉默抑制子浸潤的植物；（a)中的陽性對照組（+ve)-細菌表達的VP2,（b) 中的陽性對照組-細菌表達的VP4;(_與+)有或沒有沉默抑制子；M-分子量標志物。箭 頭表示所關注的蛋白質條帶的位置。
[0079] 圖9顯示了對在本塞姆氏煙草（N.benthamiana)葉片的細胞質中共表達的 VP2/6/4的第3天提取物的Western印跡分析。用雞抗輪狀病毒血清（抗VP2 (1/5000)與 抗VP4(l/5000))和小鼠抗VP6抗體（1:5000)的混合物探測蛋白質。用沉默抑制子完成重 組農桿菌的浸潤。陰性對照（_ve)-僅用沉默抑制子浸潤的整株植物；M-分子量標志物。
[0080] 圖10顯示了經乙酸鈾酰（uranylacetate)染色的第3天細胞質提取的輪狀病毒 蛋白質的電子顯微鏡圖。（a)具有沉默抑制子的陰性蛋白質樣品提取物；(b)VP6蛋白質提 取物；（c)VP2/6蛋白質提取物和（d)VP2/6/4蛋白質提取物。比例條= 200nm。所有檢測的 RLP的直徑均在70-100nm之間。（b)中的箭頭表示VP6鞘/墊（sheath/mat)。（C)中的箭 頭表示aRLP的一個實例。所有蛋白質均是在存在沉默抑制子的情況下表達的。所有蛋白 質均用小鼠抗VP6抗體（1:2000)捕獲。
[0081] 圖11顯示了共表達的VP2/6與VP2/6/4的蔗糖梯度純化（a)。經蔗糖梯度純化的 VP2/6(b)和VP2/6/4(c)的斑點印跡。將蛋白質提取物加載到蔗糖梯度（10-60%)上并超 速離心。通過用（b)小鼠抗VP6抗體（1:5000)和（c)雞抗VP2和VP4血清（1:5000)探測 來分析級分。
[0082] 圖12顯示了對VP2/6的級分的Western印跡分析（a)，對級分VP2/6的級分16與 17的SDS-PAGE考馬斯染色凝膠照片（b)，和對級分16與17的Western印跡分析（C)。在 Western印跡法（a)中使用小鼠抗VP6(1:5000)和雞抗VP2血清（1:5000)，并且在（c)中 僅使用小鼠抗VP6(1:5000)。（a)與（c)中的陰性對照（_ve)-細菌表達的VP4,（b)中的 陰性對照（_ve)-用沉默抑制子浸潤和用蔗糖梯度純化的植物；粗制的-未純化的VP2/6 提取物；（a)中的陽性對照（+ve) _細菌表達的VP2,（b)與（c)中的陽性對照（+ve)-植 物表達的VP6 ;VP6-SF9 -在SF9昆蟲細胞中表達的已知濃度的VP6蛋白質。箭頭表示所討 論的蛋白質條帶。
[0083] 圖13顯示了對經蔗糖密度梯度純化的VP2/6的級分中總可溶性蛋白質的測定。 (a) -IgG標準曲線，（b) - 750nm下讀取的級分的吸光度讀值。關注的點：級分16至19。
[0084] 圖14顯示了對細胞質共表達的VP2/6/4級分的蔗糖密度梯度分析。在750nm讀 取原始吸光度讀值，以驗證先前在VP2/6/4的斑點印跡上檢測的蛋白質峰。
[0085] 圖15顯示了經蔗糖密度梯度純化的VP2/6顆粒的透射式電子顯微鏡照片。（a)和 (b) 兩者顯示在銅網上觀察到的兩種不同的截面。被檢測的所有RLP的直徑均在70-100nm 之間。用小鼠抗VP6抗體（1:2000)捕獲樣品。比例條代表200nm。
[0086] 圖16a顯示了輪狀病毒VP2的氨基酸序列（SEQIDNO:1)和核苷酸序列（SEQID NO: 13和14)。圖16b顯示了輪狀病毒VP4的氨基酸序列（SEQIDNO:2)和核苷酸序列 (SEQIDNO:15和16)。圖16c顯示了輪狀病毒VP6的氨基酸序列（SEQIDNO:3)和核苷 酸序列（SEQIDN0:17和18)。圖16d顯示了輪狀病毒VP7的氨基酸序列（SEQIDN0:4) 和核苷酸序列（SEQIDNO:19和20)。
[0087] 圖 17A顯示了引物IF-WA_VP2(opt).sl+3c的核苷酸序列（SEQIDNO:21)。圖 17B 顯示了引物IF-WA_VP2(opt).sl-4r的核苷酸序列（SEQIDNO:22)。圖17C顯示了構建體 1191的示意圖。用于質粒線性化的SacII與StuI限制酶位點被注釋在示意圖上。
[0088] 圖18顯示了構建體1191從左t-DNA邊界至右t-DNA邊界（下劃線）的核苷酸序 列（SEQIDN0:23)。具有質體藍素-P19-質體藍素沉默抑制子表達盒的2X35S/CPMV-HT/ NOS。
[0089] 圖19顯示了編碼來自輪狀病毒AWA株的VP2 (opt)的核苷酸序列（SEQIDNO: 45)。
[0090] 圖20顯示了來自輪狀病毒AWA株的VP2的氨基酸序列（SEQIDNO:25)。
[0091] 圖21顯示了構建體1710號的示意圖。
[0092] 圖22A顯示了構建體193的示意圖。用于質粒線性化的SacII與StuI限制酶位 點被注釋于示意圖上。圖22B顯示了構建體193的核苷酸序列（SEQIDNO:26)。構建體 193以從左t-DNA邊界至右t-DNA邊界的形式被顯示（下劃線）。2X35S/CPMV-HT/N0S以攜 帶質體藍素-P19-質體藍素沉默抑制子表達盒的方式進入BeYDV(m)+復制酶擴增系統。
[0093] 圖23顯示了表達盒1710的核苷酸序列（SEQIDNO:27)。表達盒1710號以從 2父355啟動子至勵5終止子的形式被顯示。來自輪狀病毒4 14株的￥?2(〇?〇以下劃線表 /Jn〇
[0094] 圖24顯示了構建體1711號的示意圖。
[0095]圖 25A顯示了引物IF-WA_VP6(opt).sl+3c的核苷酸序列（SEQIDNO:28)。圖 25B顯示了引物IF-WA_VP6(opt).sl-4r的核苷酸序列（SEQIDN0:29)。圖25c顯示了從 2X35S啟動子至NOS終止子的表達盒1713號（SEQIDNO:30)。來自輪狀病毒AWA株的 VP6 (opt)以下劃線表示。圖25d顯示了編碼來自輪狀病毒AWA株的VP6 (opt)的核苷酸序 列（SEQIDNO:46)。
[0096] 圖26顯示了來自輪狀病毒AWA株的VP6的氨基酸序列（SEQIDNO:31)。
[0097] 圖27顯示了構建體1713號的示意圖。
[0098] 圖28顯示了表達盒1714號的從2X35S啟動子至NOS終止子的核苷酸序列（SEQ IDNO: 32)。來自輪狀病毒AWA株的VP6 (opt)以下劃線表示。
[0099] 圖29顯示了構建體1714號的示意圖。
[0100]圖 30A顯示了引物IF-Rtx_VP4(opt).sl+3c的核苷酸序列（SEQIDNO:33)。圖 30B顯示了引物IF-Rtx_VP4(opt).sl-4r的核苷酸序列（SEQIDNO:34)。
[0101] 圖31A顯示了表達盒1731號的從2X35S啟動子至NOS終止子的核苷酸序列（SEQ IDNO:35)。來自輪狀病毒ARotarix株的VP4(opt)以下劃線表示。圖31B顯示了來自 RVA/Vaccine/USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8]株的輪狀病毒AVP4 的經優化的編 碼序列（SEQIDN0:47)。圖31C顯示了表達盒1730號的從2X35S啟動子至NOS終止子的 核苷酸序列（SEQIDNO:44)。來自輪狀病毒ARotarix株的VP4 (opt)以下劃線表示。
[0102] 圖32顯示了來自輪狀病毒ARotarix株的VP4的氨基酸序列（SEQIDNO:36)。
[0103] 圖33A顯示了構建體1730號的示意圖。圖33B顯示了構建體1731號的示意圖。
[0104]圖 34A顯示了引物IF-Rtx_VP7(opt).sl+3c的核苷酸序列（SEQIDNO:37)。圖 34B顯示了引物IF-Rtx_VP7(opt).sl-4r的核苷酸序列（SEQIDNO:38)。圖 34C顯示了 從2X35S啟動子至NOS終止子的表達盒1733號的核苷酸序列。來自輪狀病毒A疫苗USA/ Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8]株的VP7 以下劃線表示（SEQIDN0:24)。圖 34D顯 示了編碼來自輪狀病毒A疫苗USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8]株的VP7的核苷酸 序列（SEQIDN0:48)。圖 34E顯示了來自RVA/Vaccine/USA/Rotarix-A41CB052A/1988/ G1P1A[8]株的輪狀病毒AVP7的經優化的編碼序列（SEQIDNO:54)。
[0105] 圖 35 顯示了來自輪狀病毒A疫苗USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8]株的 VP7的氨基酸序列（SEQIDNO:39)。
[0106] 圖36顯示了構建體1733號的示意圖。
[0107] 圖 37 顯示了引物IF-Rtx_VP7(opt).s2+4c的核苷酸序列（SEQIDNO:40)。
[0108] 圖38顯示了構建體1192的示意圖。用于質粒線性化的SacII與StuI限制酶位 點被注釋于示意圖上。
[0109] 圖39顯示了構建體1192從左t-DNA邊界至右t-DNA邊界的核苷酸序列（下劃 線）（SEQIDN0:41)。具有質體藍素-P19-質體藍素沉默抑制子表達盒的2X35S/CPMV-HT/ PDISP/N0S被示出。
[0110] 圖40A顯示了表達盒1735號的從2X35S啟動子至NOS終止子的核苷酸序 列（SEQIDNO:42)。來自輪狀病毒A疫苗USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] 株的roiSP/VP7(opt)以下劃線表示。圖40B顯示了編碼來自輪狀病毒A疫苗USA/ Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8]株的PDISP/VP7(opt)的核苷酸序列（SEQIDNO:49)。
[0111] 圖 41 顯示了來自輪狀病毒A疫苗USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8]株的 TOISP/VP7 的氨基酸序列（SEQIDNO:43)。
[0112] 圖42顯示了構建體1735號的示意圖。
[0113] 圖 43A顯示了來自RVA/Simian-tc/ZAF/SAll-H96/1958/G3P5B[2]株的輪狀病毒A VP4 的編碼序列（SEQIDN0:50)。圖 43B顯示了來自RVA/Simian-tc/ZAF/SAll-H96/1958/ G3P5B[2]株的輪狀病毒AVP4的經優化的編碼序列（SEQIDN0:51)。圖43C顯示了來自 RVA/Simian-tc/ZAF/SAll-H96/1958/G3P5B[2]株的輪狀病毒AVP7 的編碼序列（SEQID NO:52)。圖 43D顯示了來自RVA/Simian-tc/ZAF/SAll-H96/1958/G3P5B[2]株的輪狀病毒 AVP7的經優化的編碼序列（SEQIDNO:53)。
[0114] 圖 44A顯示 了引物IF-TrSP+Rtx_VP7(opt).sl+3c的核苷酸序列（SEQIDNO: 55)。圖 44B顯示了引物IF-Rtx_VP7(opt).sl-4r的核苷酸序列（SEQIDNO:56)。圖 44C 顯示了來自RVA/Vaccine/USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8]株的輪狀病毒AVP7 的經優化的編碼序列的核苷酸序列（SEQIDNO:57)。圖44D顯示了表達盒1734號的從 2X35S啟動子至NOS終止子的核苷酸序列（SEQIDN0:58)。來自輪狀病毒A疫苗USA/ Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8]株的VP7以下劃線表示。圖44E顯示了來自輪狀病毒 A疫苗USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8]株的TrSp-VP7 的氨基酸序列（SEQIDNO: 59)。圖44F顯示了構建體1734號的示意圖。
[0115] 圖45顯示了通過碘克沙醇（iodixanol)密度梯度離心對包含VP2和VP6的類輪狀 病毒顆粒的純化。圖45A為對離心前的加載物以及級分1至10進行的考馬斯染色SDS-PAGE 分析（級分1在管底部）。箭頭顯示了輪狀病毒抗原的位置。圖45B為使用兔多克隆抗輪 狀病毒抗體對與（A)中相同的級分進行的Western印跡分析。圖45C為使用兔多克隆抗 VP2抗體對與（A)中相同的級分進行的Western印跡分析。
[0116] 圖46顯示了通過碘克沙醇密度梯度離心對包含VP2、VP6和VP7的類輪狀病毒顆 粒的純化。圖46A為對離心前的加載物以及級分1至10進行的考馬斯染色SDS-PAGE分析 (級分1在管底部）。箭頭顯示了輪狀病毒抗原的位置。圖46B為與（A)中級分相同的使 用兔多克隆抗輪狀病毒抗體的Western印跡分析。圖46C為與（A)中級分相同的使用兔多 克隆抗VP7抗體的Western印跡分析。
[0117] 圖47顯示了通過碘克沙醇密度梯度離心的包含VP2、VP4、VP6和VP7的類輪狀病 毒顆粒的純化。圖47A為離心前的加載物以及級分1至10的考馬斯染色SDS-PAGE分析 (級分1在管底部）。箭頭顯示了輪狀病毒抗原的位置。圖47B為使用兔多克隆抗輪狀病 毒抗體對與（A)中相同的級分進行的Western印跡分析。圖47C為使用兔多克隆抗VP7抗 體對與（A)中相同的級分進行的Western印跡分析。
[0118] 圖48顯示了通過抗VP4特異性ELISA對包含VP2、VP4、VP6和VP7的經純化的類 輪狀病毒顆粒中VP4含量的評價。
[0119] 圖49顯示了包含VP2和VP6(左側部分）和包含VP2、VP4、VP6和VP7(右側部分） 的經純化的類輪狀病毒顆粒的低溫電子顯微鏡圖像。

【具體實施方式】
[0120] 以下是關于優選實施方式的說明。
[0121] 本發明涉及包含一個或更多個輪狀病毒結構性蛋白質（即類輪狀病毒顆粒、輪狀 病毒VLP或RLP)的類病毒顆粒（VLP)以及在植物中生產類輪狀病毒顆粒（RLP)的方法。因 此，類輪狀病毒顆粒（RLP)可以包含一個或更多個輪狀病毒結構性蛋白質。RLP可以是雙層 或三層的。
[0122] 本發明部分地提供了在植物中產生類輪狀病毒顆粒（RLP)的方法。所述方法可以 包括將包含下述調控區的一個或更多個核酸引入至植物或植物的部分，所述調控區在植物 中具有活性并且操作性地連接至編碼一個或更多個輪狀病毒結構性蛋白質的核苷酸序列。 這之后在允許所述核酸瞬時表達的條件下培育所述植物或植物的部分后，由此產生了RLP。
[0123] 此外，本發明部分地提供了在植物中產生類輪狀病毒顆粒（RLP)疫苗候選物的方 法。所述方法可以包括：將第一核酸、第二核酸和第三核酸引入至該植物、植物的部分或植 物細胞中，所述第一核酸包含在該植物中具有活性并且操作性地連接至編碼第一輪狀病毒 結構性蛋白質的第一核苷酸序列的第一調控區，所述第二核酸包含在該植物中具有活性并 且操作性地連接至編碼第二輪狀病毒結構性蛋白質的第二核苷酸序列的第二調控區，所述 第三核酸包含在該植物中具有活性并且操作性地連接至編碼第三輪狀病毒結構性蛋白質 的第三核苷酸序列的第三調控區。這之后在允許所述第一、第二和第三核酸瞬時表達的條 件下培育所述植物、植物的部分或植物細胞，由此產生了RLP。RLP可以是單層、雙層或三層 的。
[0124] "輪狀病毒結構性蛋白質"可以表示從輪狀病毒分離的輪狀病毒結構性蛋白質序 列的所有或一部分，它存在于任何天然或變異型輪狀病毒株或分離株中。因此，術語輪狀病 毒結構性蛋白質等包括在病毒生命周期期間通過突變產生的或者應答于選擇性壓力（例 如，藥物療法，宿主細胞趨性的擴張或感染性等）而產生的天然輪狀病毒結構性蛋白質序 列變體。如本領域技術人員所理解的，還可以使用重組技術產生這些輪狀病毒結構性蛋白 質序列及其變體。
[0125] 此外，結構性蛋白質可以包括衣殼蛋白（例如，VP2與VP6)和/或表面蛋白質（例 如，VP4)。所述結構性蛋白質還可以包括例如VP7。
[0126] 輪狀病毒結構性蛋白質的非限制性實例為輪狀病毒蛋白質VP2、VP4、VP6和VP7， 以及VP2、VP4、VP6和VP7的片段。可以根據本發明使用的VP2、VP4、VP6和VP7、或VP2、 VP4、VP6和VP7蛋白質的片段的非限制性實例包括來自輪狀病毒株G9P[6]、輪狀病毒AWA 株、輪狀病毒A疫苗USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8]株與輪狀病毒SAl1株的那些 VP2、VP4、VP6 與VP7 蛋白質。
[0127]VP2結構性蛋白質的實例被示于SEQIDNO:1與SEQIDNO:25的氨基酸序列中， 但這不應被認為是限制性的。此外，VP2結構性蛋白質可以包括SEQIDNO:1、SEQIDNO: 25示出的序列，或與它們具有至少約90-100%序列相似度（包括在這些范圍內的任何百分 比相似度，如與它們具有91、92、93、94、95、96、97、98、99%的序列相似度）的序列。另外， VP2結構性蛋白質可以由SEQIDN0:13、14、25或45示出的核苷酸序列編碼，或由與它們 具有至少約80-100%序列相似度（包括在這些范圍內的任何百分比相似度，如與它們具有 81、 82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99% 的序列相似度）的序 列的編碼。
[0128]VP4結構性蛋白質的實例被示于SEQIDNO:2與SEQIDNO:36的氨基酸序列中， 但這不應被認為是限制性的。此外，VP4結構性蛋白質可以包括SEQIDNO:2、SEQIDNO: 36示出的序列，或與它們具有至少約90-100 %序列相似度（包括在這些范圍內的任何百分 比相似度，如與它們具有91、92、93、94、95、96、97、98、99%的序列相似度）的序列。另外， VP4結構性蛋白質可以由SEQIDN0:15、16、47、50或51示出的核苷酸序列編碼，或由與它 們具有至少約80-100%序列相似度（包括在這些范圍內的任何百分比相似度，如與它們具 有 81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99% 的序列相似度）的 序列編碼。
[0129]VP6結構性蛋白質的實例被示于SEQIDNO:3與SEQIDNO:31的氨基酸序列中， 但這不應被認為是限制性的。此外，VP6結構性蛋白質可以包括SEQIDNO:3、SEQIDNO: 31示出的序列，或與它們具有至少約90-100%序列相似度（包括在這些范圍內的任何百分 比相似度，如與它們具有91、92、93、94、95、96、97、98、99%的序列相似度）的序列。另外， VP6結構性蛋白質可以由SEQIDNO:17、18或46示出的核苷酸序列編碼，或由與它們具有 至少約80-100%序列相似度（包括在這些范圍內的任何百分比相似度，如與它們具有81、 82、 83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99%的序列相似度）的序列編 碼。
[0130]VP7結構性蛋白質的實例被示于SEQIDNO:4與SEQIDNO:39的氨基酸序列中， 但這不應被認為是限制性的。此外，VP7結構性蛋白質可以包括SEQIDNO:4、SEQIDNO: 39和SEQIDNO:43示出的序列，或與它們具有至少約90-100%序列相似度（包括在這些范 圍內的任何百分比相似度，如與它們具有91、92、93、94、95、96、97、98、99%的序列相似度） 的序列。另外，VP7結構性蛋白質可以由SEQID勵：19、20、48、49、52、53或54示出的核 苷酸序列編號，或由與它們具有至少約80-100%序列相似度（包括在這些范圍內的任何百 分比相似度，如與它們具有 81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、 99 %的序列相似度）的序列編碼。
[0131] 可以通過使用BLASTP與TBLASTN程序（其采用BLAST(基本局部比對搜尋工 具）2.0算法）來計算氨基酸序列相似度或同一性。用于計算氨基酸序列相似度或同一性 的技術是本領域技術人員公知的，并且，BLAST算法的使用被描述于ALTSCHUL等人（1990,J Mol.Biol. 215:403-410)和ALTSCHUL等人（1997,NucleicAcidsRes. 25:3389-3402)中。
[0132] 術語"類病毒顆粒（VLP) "或"VLP"指下述結構，所述結構自組裝而成并且包含一 個或更多個結構性蛋白質（如，例如，輪狀病毒結構性蛋白質，例如但不限于VP2、VP4、VP6 和/或VP7結構性蛋白質）。包含輪狀病毒結構性蛋白質的VLP還可被稱為"輪狀病毒VLP"、 "類輪狀病毒顆粒（RVLP) "、"類輪狀病毒顆粒（RLP) "、"類輪狀病毒顆粒"、"RVLP"或"RLP"。 VLP或RLP通常在形態上和抗原性上與感染中產生的病毒粒子相似，但缺少足以復制的遺 傳信息并因而是非感染性的。可以在適合的宿主細胞（包括植物宿主細胞）中生產VLP。 在從宿主細胞提取并在適合條件下分離并進一步純化后，可以將VLP純化為完整結構。RLP 可以是單層、雙層或三層的RLP。可以通過表達一個輪狀病毒結構性蛋白質（如VP2或VP6) 獲得單層的RLP。可以通過表達二個輪狀病毒結構性蛋白質（如，例如，通過共表達VP2與 VP6兩者）獲得雙層的RLP，這可在有或沒有VP4的情況下進行。可以通過至少三個輪狀病 毒結構性蛋白質的同時表達（例如，VP2、VP6與VP7的共表達）獲得三層的RLP，這可在有 或沒有VP4的情況下進行。VP4的共表達導致產生了帶有刺突的顆粒，其與天然輪狀病毒類 似。可以將VP4加工或切割以產生VP5和VP8。這種加工可以使用內源蛋白酶或通過共表 達合適的蛋白酶（例如，胰蛋白酶、胰蛋白酶樣蛋白酶、絲氨酸蛋白酶、糜蛋白酶樣蛋白酶、 枯草桿菌蛋白酶）發生于宿主內。備選地，可以在RLP提取流程的任何步驟期間或者在RLP 純化之后，通過加入適合的蛋白酶（例如，胰蛋白酶、胰蛋白酶樣蛋白酶、絲氨酸蛋白酶、糜 蛋白酶樣蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶）加工VP4,以產生VP5和VP8。
[0133] 每種輪狀病毒結構性蛋白質具有不同的特性和大小，并且對于組裝成RLP所需 的量不同。術語"輪狀病毒VLP"、"輪狀病毒類病毒顆粒（RVLP) "、"輪狀病毒類病毒顆粒 (RLP) "、"輪狀病毒類病毒顆粒"、"RVLP"或"RLP"是指包含一個或更多個輪狀病毒結構性 蛋白質的類病毒顆粒（VLP)。輪狀病毒結構性蛋白質的實例可以包括但不限于VP2、VP4(或 者VP5和VP8)、VP6和VP7結構性蛋白質。
[0134] 本發明還提供了在植物中產生RLP的方法，其中編碼第一輪狀病毒結構性蛋白質 (例如，VP2或VP6蛋白質）的第一核酸（第一核酸）、與編碼第二輪狀病毒結構性蛋白質 (例如，VP6或VP2蛋白質）的第二核酸共表達。此外，編碼第三輪狀病毒結構性蛋白質（例 如，VP4或VP7)的第三核酸可以與第一和第二核酸共表達，從而在植物中共表達第一、第二 核酸和第三核酸。第一核酸、第二核酸與第三核酸可以在相同步驟中被引入至植物中，或者 可以順序引入至植物中。通過共表達編碼適合的蛋白酶（例如，胰蛋白酶、胰蛋白酶樣蛋白 酶、絲氨酸蛋白酶、糜蛋白酶樣蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶）的核酸，可以在宿主內對VP4進行 加工或切割，以產生VP5和VP8。備選地，可以在RLP提取的任何步驟期間或者在RLP純化 之后，通過加入可滿足的（satiable)蛋白酶（例如，胰蛋白酶、胰蛋白酶樣蛋白酶、絲氨酸 蛋白酶、糜蛋白酶樣蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶）來加工VP4。
[0135] 此外，可以用編碼第四輪狀病毒結構性蛋白質（例如，VP7或VP4蛋白質）的第四 核酸進一步轉化表達第一核酸（編碼第一輪狀病毒結構性蛋白質）、第二核酸（編碼第二輪 狀病毒結構性蛋白質）與第三核酸（編碼第三輪狀病毒結構性蛋白質）的植物，從而使得 第一、第二核酸、第三和第四核酸在植物中共表達。通過共表達編碼適合的蛋白酶（例如， 胰蛋白酶、胰蛋白酶樣蛋白酶、絲氨酸蛋白酶、糜蛋白酶樣蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶）的核 酸，可以在宿主內對VP4進行加工或切割，以產生VP5和VP8。備選地，可以在RLP提取的任 何步驟期間或者在RLP純化之后，通過加入可滿足的蛋白酶（例如，胰蛋白酶、胰蛋白酶樣 蛋白酶、絲氨酸蛋白酶、糜蛋白酶樣蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶）來加工VP4。
[0136]此外，可以將表達編碼一個或更多個輪狀病毒結構性蛋白質（例如，VP2或VP6蛋 白質）的第一核酸的第一植物與表達編碼一個或更多個輪狀病毒結構性蛋白質（例如但不 限于VP6或VP2蛋白質）的第二核酸的第二植物雜交，以產生共表達分別編碼VP2和VP6、或 分別編碼VP6和VP2的第一與第二核酸的子代植物（第三植物）。此外，可以將表達分別編 碼VP2和VP6、或分別編碼VP6和VP2的第一與第二核酸的第三植物與表達編碼一個或更多 個輪狀病毒結構性蛋白質（例如但不限于VP4或VP7)的第三核酸的第四植物雜交，以產生 共表達分別編碼VP2、VP6、和VP4或VP7的第一、第二和第三核酸的進一步的子代植物（第 五植物）。可以使用宿主蛋白酶，或者通過在第一、第二、第三或第四植物之一中共表達編碼 適合的蛋白酶（例如，胰蛋白酶、胰蛋白酶樣蛋白酶、絲氨酸蛋白酶、糜蛋白酶樣蛋白酶、枯 草桿菌蛋白酶）的核酸，在植物內對VP4進行加工或切割，以產生VP5和VP8。備選地，可以 在RLP提取的任何步驟期間或者在RLP純化之后，通過加入可滿足的蛋白酶（例如，胰蛋白 酶、胰蛋白酶樣蛋白酶、絲氨酸蛋白酶、糜蛋白酶樣蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶）來加工VP4。
[0137]如以下更詳細說明的，可以通過表達編碼一個或更多個輪狀病毒結構性蛋白質 (例如但不限于VP2、VP6或VP7)的核酸（第一核酸）在植物中生產RLP。可以在植物中共 表達編碼第二輪狀病毒結構性蛋白質（例如但不限于VP7、VP6或VP2)的第二核酸。此外， 可以在植物中共表達編碼第三輪狀病毒結構性蛋白質（例如但不限于VP6、VP7或VP2)的 第三核酸。核酸、第二核酸與第三核酸可以在相同步驟中被引入至植物中，或者它們可以被 順序引入至植物中。核酸、第二核酸與第三核酸可以以瞬時方式或以穩定方式被引入至植 物中。
[0138]此外，可以用編碼第二輪狀病毒結構性蛋白質（例如但不限于VP6或VP7)的第二 核酸來轉化表達編碼第一輪狀病毒結構性蛋白質（例如，VP2蛋白質）的第一核酸的植物， 從而使得第一核酸與第二核酸兩者在植物中共表達。可以用編碼第三輪狀病毒結構性蛋白 質（例如但不限于VP7或VP6)的第三核酸對所述植物進行進一步的轉化。
[0139]備選地，可以用編碼VP2蛋白質的第一核酸來轉化表達VP6或VP7蛋白質（第二 核酸）的植物，從而使得第一核酸與第二核酸兩者在植物中共表達。可以用編碼第三輪狀 病毒結構性蛋白質（例如但不限于VP7或VP6)的第三核酸對所述植物進行進一步的轉化。
[0140]另外，可以用編碼第三輪狀病毒結構性蛋白質（例如，VP4或VP7)的第三核酸來 轉化表達編碼第一和第二輪狀病毒結構性蛋白質（例如，VP2和VP6蛋白質）的第一和第 二核酸的植物。通過共表達編碼適合的蛋白酶（例如，胰蛋白酶、胰蛋白酶樣蛋白酶、絲氨 酸蛋白酶、糜蛋白酶樣蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶）的核酸，可以對VP4進行加工或切割，以產 生VP5和VP8。備選地，可以在RLP提取的任何步驟期間或者在RLP純化之后，通過加入可 滿足的蛋白酶（例如，胰蛋白酶、胰蛋白酶樣蛋白酶、絲氨酸蛋白酶、糜蛋白酶樣蛋白酶、枯 草桿菌蛋白酶）來加工VP4。
[0141] 本發明還提供了在植物中產生RLP的方法，所述方法包括將一個或更多個核酸引 入至植物、植物的部分或植物細胞中，所述一個或更多個核酸編碼一個或更多個輪狀病毒 結構性蛋白質、并且操作性地連接至在植物中具有活性的調控區、和一個或一個以上區室 靶向序列和/或擴增元件。然后，在允許所述一個或更多個核酸表達的條件下培養植物、 植物的部分或植物細胞，由此產生RLP。所述一個或更多個輪狀病毒結構性蛋白質可以是 VP2、VP4 (或VP5 和VP8)、VP6、VP7,VP2、VP4 (或VP5 和VP8)、VP6、VP7 的片段或其組合。
[0142] 本發明還提供了包含一個或更多個輪狀病毒結構性蛋白質的RLP，所述輪狀病毒 結構性蛋白質例如但不限于VP2、VP4(或VP5和VP8)、VP6、VP7或其組合。可以通過如本 發明所提供的一個或更多個方法產生RLP。
[0143] 可以使用任何適合的方法，例如密度梯度離心或尺寸排除色譜來檢測RLP的出 現。可以通過例如電子顯微鏡或通過尺寸排除色譜來評估RLP的結構和大小。
[0144] 對于尺寸排除色譜而言，可以通過在提取緩沖液中將經冷凍-擠壓的植物材料樣 品勻楽化（PoIytron)，來從植物組織中提取總可溶性蛋白質，并通過離心除去不溶材料。用 冰冷的丙酮或PEG進行沉淀也可能是有益的。對可溶性蛋白質進行定量，并將提取物通過 Sephacryl?柱，例如Sephacryl?S500柱。可以使用BlueDextran2000作為校準標準 品。在色譜法后，可以通過免疫印跡法進一步分析級分，以確定級分的蛋白質補體（protein complement) 〇
[0145] 例如，分離的級分可以是上清液（如果通過離心、沉積或沉淀）或濾液（如果通過 過濾），并且富集了蛋白質或超結構蛋白質，如例如納米管，納米球，或較高階、較高分子量 的顆粒，如單層（si)、雙層（dl)或三層（tl)的RLP。
[0146] 可以通過例如額外的離心步驟、沉淀、色譜步驟（例如，尺寸排除色譜、離子交換 色譜、親和色譜）、切向流過濾或它們的組合，對經分離的級分進行進一步加工，以對蛋白 質、超結構蛋白質或較高階的顆粒進行分離、純化、濃縮或它們的組合。可以通過例如天然 或SDS-PAGE、使用適當檢測抗體的免疫分析、毛細管電泳、電子顯微鏡或對本領域技術人員 顯而易見的任何其它方法確認純化的蛋白質、超結構蛋白質或較高階顆粒（如RLP)的存 在。
[0147] 根據本發明產生的RLP可純化或部分純化自植物、植物的部分或植物材料，或者 其可以使用如本領域技術人員所知的方法作為經口疫苗施用。
[0148]RLP純化可以包括梯度離心，例如，蔗糖、碘克沙醇、OptiPr印"或氯化銫（CsCl)密 度梯度可用于從經轉化的植物的生物質來純化或部分純化RLP。如例如圖45中所示，可以 使用碘克沙醇步驟梯度或碘克沙醇連續梯度來純化RLP和/或表達的輪狀病毒結構性蛋白 質。
[0149] 已顯示鈣（Ca2+)濃度對三層顆粒（TLP)向雙層顆粒（DLP)轉化很重要，并且其是 毒株依賴性的（參見，例如Martin等人.JournalofVirology,Jan2002,該文獻通過引 用并入本文）。外衣殼蛋白質從TLP的完全丟失（TLP脫帽作用）在[Ca2+]納摩爾的范圍 中發生。因此，RLP的純化和/或提取可以在存在鈣的情況下進行，并且梯度離心步驟可以 在存在鈣的情況下進行，例如，在存在CaCl2的情況下進行。例如，CaC12的濃度可以在ImM 至IOOOmM之間，或者可以是它們之間的任何量，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、 15、20、25、30、40、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、50、600、650、700、750、800、 850、900、950mM或者它們之間的任何量。
[0150] 可以對植物或植物碎片進行最小程度的加工。術語"最小程度的加工"指下述植 物材料，例如，被部分純化以獲得植物提取物、勻漿、植物勻漿部分等（即最小程度地加工） 的、包含所關注的蛋白質和/或RLP的植物或其部分。部分純化可包括但不限于破壞植物 細胞結構，由此產生包含可溶性植物成分、以及不溶性植物成分（可以通過例如但不限于 離心、過濾或其組合分離）的組合物。在這方面，可以使用真空或離心提取而容易地獲得在 葉片或其它組織的細胞間隙內分泌的蛋白質，或者組織可在壓力下被提取，這通過滾筒或 研磨等進行，以從細胞間隙內擠壓或釋放蛋白質。最小程度的加工還可以包括對可溶性蛋 白質的粗提物的制備，因為這些制備可能將具有來自次級植物產物的可忽略的污染。此外， 最小程度的加工可以包括從葉片對可溶性蛋白質進行水溶液提取，然后用任何適合的鹽進 行沉淀。其它方法可以包括大規模浸漬和汁液提取，以使得提取物能夠直接使用。可以使 用任何適合的方法（例如，機械提取或生化提取）來純化或提取RLP。
[0151] 一個或更多個輪狀病毒結構性蛋白質可以以相對每公斤植物鮮重而言高達2g的 量被合成。例如，合成的結構性蛋白質的量可以在相對每公斤植物鮮重而言1至2g之間， 或者是它們之間的任何量，如相對每公斤鮮重而言為I. 〇、l. 1、1. 2、1. 3、1. 4、1. 5、1. 6、1. 7、 1.8、1.9、2g或者它們之間的任何量。例如，結構性蛋白質可以以相對每公斤植物鮮重而言 高達1.54g的量合成。
[0152] 此外，RLP可以以相對每公斤植物鮮重而言高達I. 5g的量被合成。例如，合成的 RLP的量可以為相對每公斤植物鮮重而言0. 5至I. 5g之間，或者是它們之間的任何量，如相 對每公斤植物鮮重而言為 〇. 5、0. 6、0. 7、0. 8、0. 9、1. 0、1. 1、1. 2、1. 3、1. 4、1. 5g。例如，RLP 可以以相對每公斤植物鮮重而言高達I.Ig的量被合成。
[0153] 可以通過例如動態光散射（DLS)或電子顯微鏡（EM)技術來測量上文定義的RLP 的尺寸（即直徑），該尺寸通常在50至IlOnm之間，或者為它們之間的任何尺寸。例如，完 整RLP結構的尺寸可以在約70nm至約IlOnm的范圍內，或者是它們之間的任何尺寸，例如， 75nm、80nm、85nm、90nm、95nm、IOOnm、105nm或者是它們之間的任何尺寸。
[0154] 本發明還提供了包含下述核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列編碼一個或更多個 輪狀病毒結構性蛋白質并操作性地連接至在植物中具有活性的調控區。可以針對例如人密 碼子的使用或植物密碼子的使用對核苷酸序列進行優化。此外，一個或更多個輪狀病毒結 構性蛋白質可以操作性地連接至一個或一個以上的擴增元件。另外，一個或更多個輪狀病 毒結構性蛋白質可以操作性地連接至一個或一個以上的區室靶向序列。通過所述核苷酸序 列編碼的一個或更多個輪狀病毒結構性蛋白質可以是例如VP2、VP4、VP6或VP7。此外，通 過所述核苷酸序列編碼的一個或更多個輪狀病毒結構性蛋白質可以來自例如，組A至組G 的任何輪狀病毒，但更優選地來自組A的輪狀病毒。此外，通過所述核苷酸序列編碼的一個 或更多個輪狀病毒結構性蛋白質可以來自具有從Gl至G27和從Pl至P34 (更優選地從Gl 至G19和從Pl至P27)的G-型與P-型的任何組合的基因型的任何輪狀病毒株，包括但不 限于GlP[8]、G2P[4]、G2P[8]、G3P[8]、G4P[8]、G9P[6]、G9P[8]、輪狀病毒AWA株、輪狀病 毒A疫苗USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8]株或輪狀病毒SAll株。
[0155] 對本發明中提到的核酸序列而言，如果所述核酸序列與一條或一條以上如本文所 定義的核苷酸序列或核苷酸序列的互補序列在嚴格雜交條件下雜交，則所述核酸序列可以 是與所述序列或所述序列的互補序列"基本同源的"、"基本相似的"或"基本同一的"。對復 數條序列而言，當核苷酸中的至少約70%、或70%至100%之間、或它們之間的任何量（例 如，70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100%或它們之間的任何量）在核 苷酸序列的給定長度上匹配時，所述序列是"基本同源的"、"基本相似的"或"基本同一的"， 但前提是這些同源序列顯示出該序列的或如本文所述的編碼產物的一種或一種以上的性 質。
[0156] 例如，本發明提供了經分離的多核苷酸，其包含編碼一個或更多個輪狀病毒結構 性蛋白質的核酸，所述輪狀病毒結構性蛋白質與例如SEQIDNO:13、14、15、16、17、18、19、 20、45、46、47、49、50、51、52、53、54 中所定義的序列具有至少 60%、65%、70%、75%、80%、 85 %,86 %,87 %,88 %,89 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %,96 %,97 %,98 %,99 %, 100%或者它們之間的任何量的同一性。所述多核苷酸可以是通過本領域中已知的任何方 法進行了人密碼子優化的多核苷酸。
[0157] 此外，本發明提供了包含輪狀病毒結構性蛋白質的RLP，所述輪狀病毒結構性蛋 白質是例如通過下述核酸編碼的，所述核酸與例如SEQIDNO:13、14、15、16、17、18、19、 20、45、46、47、49、50、51、52、53、54 中所定義的序列具有至少 60%、65%、70%、75%、80%、 85 %,86 %,87 %,88 %,89 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %,96 %,97 %,98 %,99 %, 100 %或它們之間的任何量的同一性。
[0158] 可以使用核苷酸序列比較程序來確定所述序列相似度或同一性，如DNASIS內所 提供的（其中使用例如但不限于下列參數：缺口罰分（GAPpenalty)為5、#頂部對角線 為5、固定缺口罰分為10、k元（ktuple)為2、浮動缺口（floatinggap)為10,以及窗口 尺寸為5)。但本領域還公知其它用于比較的序列比對方法，例如Smith&Waterman的算法 (1981，Adv.Appl.Math.2:482)、Needleman&Wunsch的算法（J.Mol.Biol. 48:443, 1970)、 Pearson&Lipman的算法（1988,Proc.Nat'I.Acad.Sci.USA85:2444)以及這些算法 的計算機化實施（GAP、BESTFIT、FASTA與BLAST，可通過NIH獲得），或通過手動比對 和目視檢查（參見，例如，CurrentProtocolsinMolecularBiology,Ausubel等人 主編.1995supplement)，或使用嚴格條件下的Southern或Northern雜交法（參見， Maniatis等人于MolecularCloning(ALaboratoryManual),ColdSpringHarbor Laboratory，1982中記載的）。優選地，基本同源的序列在分子的給定長度上顯示出至少約 80 %，并且最優選地至少約90 %的序列相似度。
[0159] -種此類嚴格雜交條件的實例可以是在65°C下在4XSSC中雜交過夜（約16-20 小時），然后在65°〇下以0.1\55(：清洗1小時，或者在651：下以0.1\55(：清洗兩次，每次 20或30分鐘。備選地，一種示例性嚴格雜交條件可以是在42°C下在50%甲酰胺、4XSSC中 雜交過夜（16-20小時），然后在65°〇下以0.1\55(：清洗1小時，或者在651：下以0.1\55〇 清洗兩次，每次20或30分鐘；或者可以是在65 °C下在Church磷酸鹽水性緩沖液（7% SDS;0. 5MNaP04緩沖液，pH7. 2 ;10mMEDTA)中雜交過夜（16-20小時），并在50°C下以 0. 1XSSC、0. 1%SDS清洗兩次，每次20或30分鐘，或在65°C下以2XSSC、0. 1%SDS清洗 兩次，每次20或30分鐘（針對獨特的序列區域）。
[0160] 可以將編碼輪狀病毒結構性多肽的核酸描述為"輪狀病毒核酸"、"輪狀病毒核苷 酸序列"、"輪狀病毒核酸"或"輪狀病毒核苷酸序列"。例如，可以將包含一個或更多個輪狀 病毒結構性蛋白質或輪狀病毒結構性多肽的類病毒顆粒描述為"輪狀病毒VLP"、"RVLP"或 "RLP"，但這不應被視為限制。
[0161] 多種生物在延伸的肽鏈中顯示出使用特定密碼子來編碼特定氨基酸插入的偏好。 密碼子優選或密碼子偏好（生物之間密碼子使用的差異）由遺傳密碼的簡并度承擔，并且 被很好地記錄于多種生物中。密碼子偏好通常與信使RNA(mRNA)的翻譯效率相關，其進而 被認為取決于要翻譯的密碼子的性質以及特定轉運RNA(tRNA)分子的可用性等等。細胞中 所選擇的tRNA的優勢通常是對肽合成中最常使用的密碼子的反映。因此，可以基于密碼子 優化對基因進行調整，以實現在給定的生物中的最優基因表達。優化編碼異源表達的蛋白 質的核苷酸序列的過程可能是提高表達產量的重要步驟。優化的要求可以包括提高宿主生 產外來蛋白質的能力的步驟。
[0162] "密碼子優化"被定義為：通過用在另一生物或物種的基因中可能更常用或最常用 的密碼子代替天然序列的至少一個、大于一個或顯著數量的密碼子來修飾核酸序列，以提 高在所關注的細胞中的表達。多種物種顯示出對特定氨基酸的某些密碼子的特定偏好。
[0163] 本發明包括已經經過密碼子優化的合成多核苷酸序列，例如，已經針對人密碼子 使用或植物密碼子使用優化過的序列。然后，可以在植物中表達經密碼子優化的多核苷酸 序列。更具體地，可以在植物中表達針對人密碼子的使用或植物密碼子的使用優化過的序 列。在不希望被理論束縛的情況下，認為針對人密碼子優化過的序列提高了序列的鳥嘌 呤-胞嘧啶含量（GC含量），并且改善了在植物中的表達產量。
[0164] 本領域中已知存在不同的密碼子優化技術，用于改善翻譯低效的蛋白質編碼區的 翻譯動力學。這些技術主要依賴于鑒定針對特定宿主生物的密碼子使用。如果在該生物中 應表達特定基因或序列，那些此類基因和序列的編碼序列將被修飾，從而用宿主生物中更 常用的密碼子代替所關注序列的密碼子。
[0165] 可以在包含基于病毒的DNA或RNA表達系統的表達系統中表達輪狀病毒結構性蛋 白質或多肽，所述表達系統例如但不限于基于豇豆花葉病毒（comovirus)的表達盒和基于 雙生病毒（geminivirus)的擴增元件。
[0166] 如本文所述的表達系統可以包括基于二分病毒（bipartitevirus)或帶有二分 基因組（bipartitegenome)的病毒的表達盒。例如，二分病毒可以是紅豆花葉病毒科 (Comoviridaefamily)的。紅豆花葉病毒科的屬包括紅豆花葉病毒屬（Comovirus)、懦傳 病毒屬（Nepovirus)、豆科病毒屬（Fabavirus)、搜桃挫葉病毒屬（Cheravirus)和溫州蜜 柑矮縮病毒屬（Sadwavirus)。SEs?花葉病毒屬包括紅S?花葉病毒（CPMV)、紅3?嚴重花葉 病毒（CPSMV)、南瓜花葉病毒（SqMV)、紅三葉草斑駁病毒（RCMV)、菜豆莢斑駁病毒（BPMV)、 蕪菁環斑病毒（TuRSV)、蠶豆真花葉病毒（BBtMV)、蠶豆染色病毒（BBSV)、蘿卜花葉病毒 (RaMV)。包含可以用于本發明的多個方面的增強子元件的豇豆花葉病毒RNA-2序列的實例 包括但不限于：CPMVRNA-2(GenBank登錄號No.NC_003550)、RCMVRNA-2(GenBank登錄號 No.NC_003738)、BPMVRNA-2(GenBank登錄號No.NC_003495)、CPSMVRNA-2(GenBank登錄 號No.NC_003544)、SqMVRNA-2(GenBank登錄號No.NC_003800)、TuRSVRNA-2(GenBank登 錄號No.NC_013219.I)、BBtMVRNA-2(GenBank登錄號No?⑶810904)、BBSVRNA2(GenBank 登錄號No.FJ028650)、RaMV(GenBank登錄號No.NC_003800)。
[0167] 二分豇豆花葉病毒RNA基因組的片斷指RNA-I與RNA-2。RNA-I編碼參與復制的 蛋白質，而RNA-2編碼細胞-細胞運動所需的蛋白質以及兩個衣殼蛋白。可以使用任何適 合的基于豇豆花葉病毒的盒，包括CPMV、CPSMV、SqMV、RCMV或BPMV，例如，所述表達盒可以 基于CPMV。
[0168] "表達盒"指下述核苷酸序列，所述核苷酸序列包含所關注的核酸，所述核酸處于 用于在宿主細胞中轉錄所述所關注的核酸的適合的啟動子或其它調控元件的控制下，并且 可操作地（操作性地）連接至所述適合的啟動子或其它調控元件。
[0169] 表達系統還可以包含來自雙生病毒（geminivirus)的擴增元件，例如，來自豆類 黃矮病毒（BeYDV)的擴增元件。BeYDV屬于Mastreviruses屬（其適應于雙子葉植物）。 BeYDV是具有單鏈環狀DNA基因組的單分病毒（monopartite)，并且它可以通過滾環機制復 制至非常高的拷貝數。BeYDV來源的DNA復制子載體系統已被用于在植物中進行快速、高產 量的蛋白質生產。
[0170] 如本文所使用的，術語"擴增元件"指包含雙生病毒基因組的一個或更多個長基因 間區（longintergenicregion)或長基因間重復（longintergenicrepeat,LIR)的至 少一部分的核酸片斷。如本文所使用的，"長基因間區"或"長基因間重復"指包含rep結 合位點的長基因間區的區域，所述rep結合位點能夠介導通過雙生病毒Rep蛋白質進行的 切除和復制。在一些方面，包含一個或更多個LIR的核酸片斷還可以包含雙生病毒基因組 的短基因間區或小基因間區（SIR)。如本文所使用的，"短基因間區"或"小基因間區"指 互補鏈（Mastrevirus的短IR(SIR))。可以在本文中使用任何適合的來源于雙生病毒的擴 增元件。參見，例如，W02000/20557;W02010/025285;ZhangX?等人（2005，Biotechnology andBioengineering,Vol.93,271-279),HuangZ?等人（2009,Biotechnologyand Bioengineering，Vol. 103,706-714),HuangZ?等人（2009,Biotechnologyand Bioengineering,Vol. 106,9-17);以上文獻通過引用并入本文）。如果在構建體中使用了 多于一個LIR，例如，兩個LIR，那么啟動子、CMPV-HT區和所關注的核酸序列以及終止子 被兩個LIR中的每個圍住。此外，擴增元件可以例如來源于Halley-Stott等人.（2007) ArchivesofVirologyl52:1237-1240 中公開的序列，其以GenBank登錄號DQ458791(其 通過引用并入本文）登記。包含LIR的核酸片段是連接的核苷酸2401?2566與1?128。 包含SIR的核酸片段是核苷酸1154?1212。
[0171] 如本文所述，通過煙草本塞姆氏（Nicotianabenthamiana)葉片的農桿菌滲入進 行的對來源于豆類黃矮病毒（BeYDV)的載體和R印/RepA供給載體的共遞送導致了高效的 復制子擴增和強大的蛋白質生產。
[0172] 基于豇豆花葉病毒的表達盒和來源于雙生病毒的擴增元件可以包含于不同的載 體上，或者，各組成部分可以被包含在一個載體中。如果使用兩個載體，則可以將第一和第 二載體同時或分別引入至植物細胞中。
[0173] 還可以將病毒復制酶包括在如本文所述的表達系統中，以提高所關注的核酸的 表達。復制酶的非限制性實例是編碼BeYDVR印與R印A的BeYDV復制酶（pREPllO) (C2/ Cl;Huang等人，2009,Biotechnol.Bioeng. 103,706-714 ;該文獻通過引用并入本文）。在 Halley-Stott等人.（2007)ArchivesofVirology152:1237-1240 中公開了復制酶的另 一個非限制性實例，其以GenBank登錄號DQ458791(其通過引用并入本文）登記。包含 Cl:C2基因的核酸片斷是核苷酸1310至2400。
[0174] "共表達"指兩條或兩條以上核苷酸序列在大致相同的時間被表達于植物內和該 植物的相同組織內。然而，核苷酸序列不必在完全相同的時間表達。相反，兩條或更多條核 苷酸序列以使編碼產物有機會相互作用的方式表達。使用瞬時表達系統可以共表達兩條 或超過兩條的核苷酸序列，其中在兩條序列均表達的條件下在大致相同的時間將兩種或更 多種序列引入到植物內。備選地，可以使用以瞬時方式引入平臺植物的編碼所關注蛋白質 (例如，一個或更多個輪狀病毒結構性蛋白質）的其它序列，以穩定的方式轉化包含核苷酸 序列之一的平臺植物。
[0175] 蛋白質的正確折疊對蛋白質的穩定性、多聚體的形成、RLP的形成與功能可能是重 要的。蛋白質的折疊可以受一種或多種因素的影響，這些因素包括但不限于：蛋白質的序 列，蛋白質的相對豐度，細胞內擁擠程度，可以與折疊、部分折疊或未折疊的蛋白質結合或 與它們瞬時相關的輔因子的可用性。此外，表達蛋白質的植物內的區室或亞區室可影響蛋 白質的折置和表達水平。
[0176] 可以在轉基因植物中通過農桿菌浸潤將一個或更多個輪狀病毒結構性蛋白質的 表達靶向至特定的植物細胞區室和/或亞區室。區室或亞區室可以例如為質體、內質網 (ER)、葉綠體或質外體。在不希望受理論束縛的情況下，區室或亞區室靶向可以將蛋白質向 所靶向的區室或亞區室中的積累提高至超過細胞質積累。區室或亞區室積累可以保護蛋白 質免于被細胞質中存在的蛋白酶降解和/或允許其積累至更高的濃度而不影響植物細胞 的功能。
[0177] 因此,可以對表達盒或載體加以改變，以使其適合將載體或從載體表達的輪狀病 毒結構性蛋白質或多肽引導至植物中的目標區室或亞區室。
[0178] 例如，可以通過使得表達的輪狀病毒結構性蛋白質或多肽包括能夠與質體的類囊 體膜相互作用的部分（特別地，類囊體膜的轉運機制），對表達盒或載體加以改變，以使其 適合于靶向質體。這種相互作用可以導致輪狀病毒結構性蛋白質或多肽從表達它的細胞質 輸入至質體。在不希望受理論束縛的情況下，從細胞質的輸入機制對于蛋白質的正確折疊 來說可能是重要的。應當理解，可對表達盒或載體加以改變，以使得其適合于靶向質體本 身從而成為經轉化的狀態，并且輪狀病毒結構性蛋白質或多肽的表達可以完全在質體內發 生。
[0179] 術語"靶向序列"指靶向序列可以包括在載體或表達盒中。可以將此類靶向序列 翻譯成將載體或其產物引導至植物中的目標區室或亞區室（例如，質體）的肽。例如，用于 將蛋白質靶向至質體的質體信號肽（在本領域中還稱為"質體轉運肽"）在本領域中是已知 的。可以使用的質體轉運肽的非限制性實例是rbcsl-cTP。葉綠體轉運肽序列的適合的實 例為來自例如馬鈴薯（Solanumtuberosum)的Rubisco小亞單位基因（rbcSl)。
[0180]因此，輪狀病毒結構性蛋白質或多肽可以包括與多肽或蛋白質的其余部分相同來 源或異源的信號肽。術語"信號肽"在本領域中是公知的，并且通常是指短的（約5-30個氨 基酸的）氨基酸序列，其通常被發現于多肽的N端，可以指導新翻譯的多肽轉位至特定細胞 器，協助多肽鏈的特定結構域相對于其它結構域的定位。作為非限制性實例，所述信號肽可 以將蛋白質的轉位靶向至內質網，和/或協助新生多肽的N端近端結構域相對于膜錨定結 構域的定位，從而輔助成熟蛋白質（例如，輪狀病毒結構性蛋白質，但這不應被視為限制） 的切割和折置。
[0181] 信號肽（SP)可以是對蛋白質或病毒蛋白質而言天然的，或者信號肽可以是相對 于要表達的蛋白質或病毒蛋白質的一級序列而言異源的。例如，輪狀病毒結構性蛋白質的 天然信號肽可以用于在植物系統中表達輪狀病毒結構性蛋白質。
[0182] 信號肽也可以是非天然的，例如，來自蛋白質、病毒蛋白質或除輪狀病毒蛋白質之 外的病毒的天然結構性蛋白質，或者來自植物、動物或細菌的多肽。可以使用的信號肽的非 限制性實例是苜蓿（alfalfa)的蛋白質二硫鍵異構酶（PDISP)(登錄號No.Z11499的核苷 酸32-103)。此外，信號肽可完全缺失或被截短。截短或其各種詞性形式表示從信號肽上缺 失了 1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、 75%、80 %、85%、90 %、95%、100 %或它們之間的任何量的氨基酸殘基。優選地，截短的氨 基酸殘基是連續的，并且截短從第二個甲硫氨酸向前發生。
[0183] 本發明由此提供了包含天然、非天然信號肽或截短的信號肽的輪狀病毒結構性蛋 白質，如，例如VP2、VP4、VP6和/或VP7,以及提供了編碼這些輪狀病毒結構性蛋白質的核 酸。
[0184] 可以在經本發明所述的核苷酸序列、構建體或載體轉化的任何適合的植物宿主中 表達本發明的一個或多于一個的遺傳構建體。適合的宿主的實例包括但不限于農作物，包 括苜猜、油菜籽、蕓苔屬（Brassicaspp.)、玉米、煙草屬（Nicotianaspp.)、馬鈴薯、人參、 豌豆、燕麥、水稻、大豆、小麥、大麥、向日葵、棉花等。
[0185] 可以使用1、2、3、4或5個二元質粒載體將編碼輪狀病毒結構性蛋白質的核苷酸序 列轉移進植物宿主中。因此，每個二元質粒載體可以包含1、2、3、4或5個編碼輪狀病毒結 構性蛋白質的核苷酸序列。
[0186] 本發明的一個或更多個遺傳構建體還可以包含3'非翻譯區。3'非翻譯區指包含 下述DNA片斷的基因部分，所述DNA片斷含有多腺苷酸化信號和能夠使mRNA加工或基因 表達有效進行的任何其它調節信號。多腺苷酸化信號的特征一般在于使得向mRNA前體的 3'端添加多腺苷酸鏈得以有效進行。多腺苷酸化信號通常通過與標準形式5'AATAAA-3' 的同源性的存在來識別，但是變異也不少見。適合的3'區的非限制性實例是含有以下基 因的多腺苷酸化信號的3'經轉錄的非翻譯區，所述基因為：農桿菌（Agrobacterium)致瘤 (Ti)質粒基因（如胭脂氨酸合酶（NOS)基因）、植物基因（如大豆貯藏蛋白基因）、核酮 糖-1，5-二磷酸羧化酶小亞單位的基因（ssRUBISCO;US4962028,其通過引用并入本文）、 在US7125978(其通過引用并入本文）中描述的用于調控質體藍素表達的啟動子。
[0187] 需要時，本發明的一個或更多個遺傳構建體還可以包含其它增強子（翻譯增強子 或轉錄增強子）。增強子可以位于將要轉錄的序列的5'或3'。增強子區域是本領域技術 人員公知的，其可以包含ATG起始密碼子、鄰近序列（adjacentsuquences)等。起始密碼 子存在時，其可以處于符合編碼序列的閱讀框的狀態（"框內的"），以提供經轉錄的序列的 正確翻譯。
[0188] 可以使用Ti質粒、Ri質粒、植物病毒載體、直接DNA轉化、顯微注射、電穿孔等 將本發明的構建體引入到植物細胞中。關于這些技術的綜述,參見例如Weissbachand Weissbach,MethodsforPlantMolecularBiology,AcademyPress,NewYorkVIII，pp 421-463(1988);GeiersonandCorey，PlantMolecularBiology，第 2 版.（1988);和 MikiandIyer,FundamentalsofGeneTransferinPlants，InPlantMetabolism，第2 版，DT.Dennis,DHTurpin,DDLefebrve,DBLayzell(eds),Addisonffesly,LangmansLtd.London,pp. 561-579(1997)。其它方法包括直接DNA攝入、脂質體的使用、電穿孔（例如，使 用原生質體）、顯微注射、微彈轟擊（microprojectile)或晶須（whiskers)、以及真空滲入 (vacuuminfiltration)。參見，例如，Bilang等人（Gene100:247-250 (1991))、Scheid等人 (Mol.Gen.Genet. 228:104-112, 1991)、Guerche等人（PlantScience52:111-116, 1987)、 Neuhause等人（Theor.ApplGenet. 75:30-36，1987)、Klein等人（Nature 327:70-73(1987));Howell等人（Science208:1265, 1980)、Horsch等人（Science 227:1229-1231，1985)、DeBlock等人（PlantPhysiology91:694-701，1989)、Methodsfor PlantMolecularBiology(WeissbachandWeissbach主編，AcademicPressInc.，1988)、 MethodsinPlantMolecularBiology(SchulerandZielinski主編,Academic PressInc. ,1989)、LiuandLomonossofT(JVirolMeth, 105:343-348,2002)、美國 專利No. 4945050 ;5036006 ;和5100792,1995年5月10日提交的美國專利申請序列號 No. 08/438666和1992年9月25日提交的美國專利申請序列號No. 07/951715(以上所有文 獻通過引用并入本文）。
[0189] 瞬時表達
[0190] 在不希望受理論束縛的情況下，不同的輪狀病毒結構性蛋白質的蛋白質濃度和比 例對于RLP的組裝效率來說可能是重要的。因此，感染的多重性和時間對于控制植物中的 蛋白質濃度以及RLP的整體組裝效率來說可能是重要的。
[0191] 本發明的構建體可以在植物或植物的部分中瞬時表達。依賴于重組農桿 菌（Agrobacteriumtumefaciens)在植物、植物的部分或植物細胞中的染色體外 (epichromosomal)表達的瞬時表達系統可以用于表達被祀向至多個細胞區室或亞區室的 輪狀病毒結構性蛋白質。瞬時表達系統允許實現高的生產速度。此外，在重組農桿菌于植 物中浸潤后的數天內，可以獲得大量蛋白質（Rybicki，2010;Fischer等人，1999)。還可表 達長基因序列，并且使得多于一個基因在相同細胞中同時表達，從而允許多聚體蛋白質高 效組裝（Lombardi等人，2009)。
[0192] 編碼輪狀病毒結構性蛋白質的核苷酸序列可被轉移至植物宿主中，至1、2、3、4或 5 個轉化的農桿菌（Agrobacteriumtumefaciens)菌株。
[0193] 然而，在瞬時表達期間，轉錄后基因沉默可能會限制植物中異源蛋白質的表達。沉 默抑制子（例如，但不限于來自番爺斑萎病毒（Tomatospottedwiltvirus)的Nss)的 共表達可以用于抵消轉基因mRNA的特異性降解（Brigneti等人，1998)。備選的沉默抑制 子在本領域中是公知的，并且可以按本文所述的那樣被使用（Chiba等人，2006,Virology 346:7-14;該文獻通過引用并入本文），例如但不限于HcPro、TEV-pl/HC-Pro(煙草蝕刻 病毒-pl/HC-Pro)、BYV-p21、番茄叢矮病毒的pl9(TBSVpl9)、番茄皺縮病毒的衣殼蛋白 質（TCV-CP)、黃瓜花葉病毒的2b(CMV-2b)、馬鈴薯病毒X的p25(PVX-p25)、馬鈴薯病毒M 的pll(PVM-pll)、馬鈴薯病毒S的pll(PVS-pll)、藍莓枯萎病毒pl6(BScV-pl6)、柑橘速 衰病毒的p23 (CTV-p23)、葡萄藤卷葉聯合病毒-2的p24 (GLRaV-2p24)、葡萄藤病毒A的 plO(GVA-plO)、葡萄藤病毒B的P14(GVB-pl4)、白芷潛伏病毒的plO(HLV-plO)或大蒜普通 潛伏病毒的P16(GCLV-pl6)。因此，沉默抑制子（例如，HcPro、TEV-pl/HC-Pro、BYV-p21、 TBSVpl9、TCV-CP、CMV-2b、PVX-p25、PVM-pll、PVS-pll、BScV-pl6、CTV-p23、GLRaV-2p24、 GBV-pl4、HLV-plO、GCLV-pl6或GVA-plO)可以與一個或更多個輪狀病毒結構性蛋白質（例 如，VP2、VP4、VP6或它們的組合）一起共表達，以進一步確保植物或植物的部分內高水平的 蛋白質廣生。
[0194] 本發明還提供了如上所述的方法，其中，其它的（第二、第三、第四或第五）核苷 酸序列在植物內表達，編碼沉默抑制子的其它的（第二、第三、第四或第五）核苷酸序列操 作性地與在植物中具有活性的其它的（第二、第三、第四或第五）調控區連接。編碼沉默 抑制子的核苷酸序列可以是例如Nss、HcPro、TEV-pl/HC-Pro、BYV-p21、TBSVpl9、TCV-CP、 CMV-2b、PVX-p25、PVM-pll、PVS-pll、BScV-pl6、CTV-p23、GLRaV-2p24、GBV-pl4、HLV-plO、 GCLV-p16 或GVA-plO。
[0195] 如下所述，可以使用瞬時表達方法來表達本發明所述的構建體（參見Liuand Lomonossoff, 2002,JournalofVirologicalMethods, 105:343-348;該文獻通過引用并 入本文）。備選地，可以使用基于真空的瞬時表達方法，如Kapila等人，1997 (該文獻通過引 用并入本文）所述。這些方法可以包括（例如，但不限于）農桿菌接種（Agro-inoculation) 或農桿菌浸潤（Agro-infiltration)、注射器浸潤（syringeinfiltration)的方法，但還可 以如上文所述使用其它瞬時方法。通過農桿菌接種、農桿菌浸潤或注射器浸潤，包含所期望 的核酸的農桿菌混合物進入組織細胞間隙，例如，葉、植物氣生部分（包括莖、葉以及花）、 植物其它部分（莖、根、花）或整株植物。在穿過表皮后，農桿菌感染t-DNA拷貝并將其轉 移至細胞。t-DNA以游離方式被轉錄，mRNA被翻譯，從而導致在被感染的細胞中產生所關注 的蛋白質，但t-DNA穿進核內是瞬時的。
[0196] 為協助鑒別經轉化的植物細胞，可以對本發明的構建體進行進一步的操作， 以包括進植物可選擇標志物。有用的可選擇標志物包括提供對化學物質的抗性的酶， 所述化學物質例如抗生素，例如，慶大霉素、潮霉素、卡那霉素；或除草劑，如草胺磷 (phosphinothrycin)、草甘膦、氯磺隆等。類似地，可以使用能產生可通過顏色變化（如 GUS(P-葡萄糖苷酸酶））或發光性（如螢光酶素和GFP)來鑒別的化合物的酶。
[0197] 含有本發明的遺傳構建體的轉基因植物、植物細胞或種子也被認為是本發明的一 部分。從植物細胞再生整株植物的方法在本領域中也是已知的。一般地，在適合的培養基 中培養經轉化的植物細胞，所述培養基可以包含選擇性試劑（如抗生素），其中可選擇標志 物用于輔助鑒別經轉化的植物細胞。一旦形成愈傷組織，則可以根據已知方法通過使用適 合的植物激素促使芽形成，并將所述芽轉移至生根培養基中以再生植物。然后，所述植物可 被用于建立重復世代，這可從種子實現或使用營養生殖技術實現。轉基因植物還可以不使 用組織培養而產生。
[0198] 在本申請中，術語"調控區"、"調控元件"或"啟動子"的使用表示反映核酸的一部 分，所述部分通常（但非總是）位于基因的蛋白質編碼區的上游，該編碼區可包含DNA或 RNA、或DNA與RNA兩者。當調控區為活性的、并且與所關注的基因處于操作性結合的狀態 下或與所關注的基因操作性地連接時，這可實現所關注的基因的表達。調控元件可以能夠 介導器官特異性，或控制發育或時序基因活化。"調控區"可以包含啟動子元件、展示出基礎 啟動子活性的核心啟動子元件、具有應答于外部刺激的誘導性的元件、介導啟動子活性的 元件，如負調控元件或轉錄增強子。如本文所使用的，"調控區"還可包含轉錄后具有活性的 元件，例如，調節基因表達的調控元件，如翻譯和轉錄增強子、翻譯和轉錄抑制子、上游激活 序列以及mRNA不穩定性決定子（mRNAinstabilitydeterminants)。后者這些元件中的若 干可以位于接近編碼區的位置。
[0199] 在本公開文本的上下文中，術語"調控元件"或"調控區"典型地表示通常（但非 總是）位于結構性基因的編碼序列上游（5'）的DNA序列，其通過提供對RNA聚合酶和/ 或轉錄所需的其它因子的識別以在特定位點開始，來控制編碼區的表達。然而，應當理解， 位于內含子內的其它核苷酸序列或序列的3'也可能有助于對所關注的編碼區的表達的調 控。提供對RNA聚合酶或其它轉錄因子的識別以確保在特定位點起始化的調控元件的實例 是啟動子元件。大部分但非全部的真核生物啟動子元件均包含TATA盒、包含腺苷與胸苷核 苷酸堿基對的保守核酸序列（其通常位于轉錄起始位點上游約25個堿基對處）。啟動子元 件包含負責轉錄起始的基礎啟動子元件，以及修飾基因表達的其它調控元件（如上文列出 的）。
[0200] 存在若干種類型的調控區，包括發育調控型、誘導型或組成型的那些。發育調控 型的或控制基因處于其控制下的差異表達的調控區在該器官或組織的發育期間的特定 時間、在某些器官或器官組織內被激活。然而，一些發育調控型的調控區可優選在特定 發育階段在某些器官或組織內具有活性，它們還可以以發育調控的方式而具有活性，或 者在植物內的其它器官或組織中也以基礎水平存在。組織特異性調控區的實例（例如， see-特異性調控區）包括napin啟動子和cruciferin啟動子（Rask等人，1998,J.Plant Physiol. 152:595-599;Bilodeau等人，1994,PlantCell14:125-130)。葉特異性啟動子 的實例包括質體藍素啟動子（參見US7, 125, 978,其通過引用并入本文）。
[0201] 誘導型調控區是應答于誘導劑而能夠直接或間接激活一個或更多個DNA序列或 基因的轉錄的調控區。在不存在誘導劑時，所述DNA序列或基因將不會被轉錄。典型地， 特異性結合至誘導型調控區以激活轉錄的蛋白因子可以以非活性形式存在，其然后以通過 誘導劑被直接或間接轉化為活性形式。然而，所述蛋白因子也可以不存在。所述誘導劑可 以是化學試劑，如蛋白質、代謝產物、生長調節劑、除草劑或酚類化合物，或者是通過熱、冷、 鹽或毒性元素直接施加的或通過病原體或疾病媒介（如病毒）的作用間接施加的生理應 激。可以通過向所述細胞或植物外部施用誘導劑，而將含有誘導型調控區的植物細胞暴露 于誘導劑，例如，通過噴灑、澆水、加熱或類似方法來進行。誘導型調控元件可以來源于植物 基因或非植物基因（例如，Gatz,C.andLenk,LR.P.，1998,TrendsPlantSci. 3, 352-358 ; 其通過引用并入）。可能的誘導型啟動子的實例包括但不限于四環素誘導型啟動子 (Gatz,C.，1997,Ann.Rev.PlantPhysiol.PlantMol.Biol. 48, 89-108 ;其通過引用并 入）、類固醇誘導型啟動子（Aoyama.T.andChua,N.H.，1997,PlantI. 2, 397-404 ;其通過 引用并入）和乙醇誘導型啟動子（Salter，M.G.等人，1998，PlantJournal16,127-132; Caddick，M.X?等人，1998,NatureBiotech. 16, 177-180,其通過引用并入），細胞分裂 素誘導的IB6 和CKI1 基因（Brandstatter,I.andK.ieber,I.I.，1998，PlantCell 10, 1009-1019 ;Kakimoto,T.，1996,Science274, 982-985 ;其通過引用并入）和生長素誘 導型元件DR5(Ulmasov，T.等人，1997,PlantCell9, 1963-1971;其通過引用并入）。
[0202] 組成型調控區在植物的多個部分中并且在整個植物發育過程中連續指導基因 表達。已知的組成型調控元件的實例包括與下述基因或轉錄本相關的啟動子，所述基 因或轉錄本為：CaMV35S轉錄本（Odell等人，1985,Nature, 313:810-812)，水稻肌動 蛋白l(Zhang等人，1991，PlantCell, 3:1155-1165)、肌動蛋白 2(An等人，1996，Plant J.，10:107-121)或tms2 (U.S. 5, 428, 147,其通過引用并入本文），和磷酸丙糖異構化酶 I(Xu等人，1994,PlantPhysiol. 106:459-467)基因，玉米泛素 1 基因（Cornejo等人， 1993,PlantMol.Biol. 29:637-646)，擬南芥泛素 1 和 6 基因（Holtorf等人，1995,Plant Mol.Biol. 29:637-646)，和煙草翻譯起始因子 4A基因（Mandel等人，1995,PlantMol. Biol.29:995-1004)。
[0203] 如本文所使用的術語"組成型"不必然表明處于組成型調控區控制下的基因在所 有細胞類型中均以相同水平表達，而是意味著所述基因在廣泛的細胞類型中表達，盡管經 常觀察到豐度差異。組成型調控元件可以與其它序列偶聯，以進一步增強它們操作性地連 接的核苷酸序列的轉錄和/或翻譯。例如，CPMV-HT系統來源于豇豆花葉病毒（CPMV)的非 翻譯區域，并且展示出相關編碼序列增強的翻譯。"天然的"表示核酸或氨基酸序列是天然 存在的，或是"野生型"的。"操作性地連接的"表示特定序列（例如，所關注的編碼區和調 控元件）直接或間接相互作用，以發揮預期的功能，如介導或調節基因表達。操作性地連接 的序列的相互作用可例如通過與所述操作性地連接的序列相互作用的蛋白來介導。
[0204] 在植物內生產的RLP可以誘導包含植物特異性N聚糖的輪狀病毒VP7結構性蛋白 質。因此，本發明還提供了包含具有植物特異性N聚糖的VP7的RLP。
[0205] 此外，對植物中N-聚糖的修飾是已知的（參見，例如U.S. 60/944, 344;其通過引 用并入本文），并且可以產生具有經修飾的N-聚糖的VP7。可以獲得包含經修飾的糖基化模 式的VP7 (例如，具有降低的巖藻糖基化、木糖基化、或巖藻糖基化與木糖基化兩者的N-聚 糖），或者可以獲得具有經修飾的糖基化類型的VP7 (其中蛋白質缺少巖藻糖基化、木糖基 化或兩者，并且包含提高的半乳糖苷化）。此外，對翻譯后修飾的調節（例如，末端半乳糖的 添加）可以導致表達的VP7的巖藻糖基化和木糖基化較之表達VP7的野生型植物而言有所 降低。
[0206] 例如（但不應被視為限制），可以通過將VP7以及編碼￠-1. 4半乳糖基轉移酶 (GalT)(例如但不限于哺乳動物GalT或人GalT，但還可以使用其他來源的GalT)的核苷酸 序列一起共表達，來實現具有經修飾的糖基化類型的VP7的合成。還可以將GalT的催化域 融合至N-乙酰葡糖氨基轉移酶（GNTl)的CTS結構域（即胞質尾，跨膜結構域，莖區）以產 生GNTl-GalT雜交酶，并且該雜交酶可以與VP7共表達。VP7還可以與編碼N-乙酰葡糖氨 基轉移酶III(GnT-III)(其例如但不限于哺乳動物GnT-III或人GnT-III，還可以使用來自 其它來源的GnT-III)的核苷酸序列一起共表達。另外，還可以使用GNTl-GnT-III雜交酶， 其包含融合至GnT-III的GNTl的CTS。
[0207] 因此，本發明還提供了包含具有經修飾的N聚糖的VP7的RLP。
[0208] 在不希望受理論束縛的情況下，VP7上的植物N-聚糖的存在可以通過促進VP7與 抗原遞呈細胞的結合來刺激免疫應答。Saint-Jore-Dupas等人（2007)已提出了使用植物 N聚糖來刺激免疫應答。
[0209] 在以下實施例中將進一步闡述本發明。
[0210] 實施例
[0211] 實施例1
[0212] 本塞姆氏煙草（N.benthamiana)植物葉片中輪狀病毒蛋白質的表達和VLP的產生
[0213] 下列分析使用了來自G9P[6]輪狀病毒株的輪狀病毒衣殼蛋白質，并且評估了類 輪狀病毒顆粒是否在本塞姆氏煙草（N.benthamiana)葉細胞的多個區室中形成。對煙草植 物葉片中VP2與VP6的共表達以及VP2、VP6、VP7與VP4的多種組合的共表達進行了研究。
[0214] 材料和方法
[0215] 質粒構建
[0216] 針對VP2、VP4、VP6與VP7的經植物密碼子優化的輪狀病毒cDNA是 由Geneart,Germany提供的。按照制造商的說明書，將質體DNA轉化至DH5-a 化學感受態大腸桿菌（E.coli)細胞（E.cloni?,Lucigen)。在本研究中使用 了由RainerFischer(FraunhoferInstituteforMolecularBiologyand AppliedEcology,IME,Germany)提供的新型二元農桿菌載體pTRAc(細胞質）、 pTRAkc-rbcsl-cTP(靶向葉綠體）以及pTRAkc-ERH(靶向內質網）。另一種載體 pTRAkc-A(質外體）來源于通過在NcoI與XhoI位點進行的限制酶（RE)消化在多個克隆位 點對pTRAkc-ERH進行的修飾（圖3)。這除去了組氨酸標簽和KDEL序列（它們將蛋白質保 留在ER中）。作為替代，所述蛋白質被靶向至質外體。
[0217] 用Ncol/Xhol對VP2、VP4與VP6進行限制酶（RE)消化，并用Afllll/Xhol切割 VP7。限制酶AflllUNcoI與MluI具有相容的粘性末端。為了將DNA直接克隆進pTRAc、 pTRAkc-rbcs-cTP與pTRAkc-A，分別在AflIII/Xhol、Mlul/Xhol與Ncol/Xhol位點對每種 載體進行RE消化。根據標準規程進行載體中DNA的克隆，然后轉化進化學感受態大腸桿 菌（E.coli)DH5-a細胞（E.cloni?，Lucigen)中。通過菌落PCR確認了所選的重組菌落。 為了在pTRAkc-ERH中克隆，通過PCR擴增加入NotI限制酶位點以代替四個輪狀病毒cDNA 中每一個的終止密碼子。用表1中詳細說明的引物擴增cDNA。PCR反應條件包括：在95°C 下變性5分鐘，然后是5次下述循環，所述循環為在95°C下變性30秒、在52°C下退火1分 鐘和在72°C下延伸1. 5分鐘。進行如下所示的另外20個循環：95°C下30秒、57°C下1分 鐘、72°C下1. 5分鐘，以及72°C下5分鐘。然后，按照制造商的說明書，將擴增的片段克隆進 pGEM-T-Easy(Promega)。轉化在化學感受態大腸桿菌（E.coli)DH5_a(E.cloni?,Lucigen) 中進行。然后在所選的菌落上進行菌落PCR，對其它三個構建體也這樣進行。
[0218] 表1 :用于ER載體克隆的輪狀病毒cDNA引物
[0219]

【權利要求】
1. 在植物、植物的部分或植物細胞中產生類輪狀病毒顆粒（RLP)的方法，所述方法包 括： a) 將下述第一核酸、下述第二核酸和下述第三核酸引入至該植物、植物的部分或植物 細胞中，所述第一核酸包含在所述植物中具有活性并且操作性地連接至編碼第一輪狀病毒 結構性蛋白質的第一核苷酸序列的第一調控區，所述第二核酸包含在所述植物中具有活性 并且操作性地連接至編碼第二輪狀病毒結構性蛋白質的第二核苷酸序列的第二調控區，所 述第三核酸包含在所述植物中具有活性并且操作性地連接至編碼第三輪狀病毒結構性蛋 白質的第三核苷酸序列的第三調控區， b) 在允許所述第一、第二和第三核酸瞬時表達的條件下培育所述植物、植物的部分或 植物細胞，由此產生所述RLP。
2. 根據權利要求1所述的方法，其中在步驟a)中將下述第四核酸引入至所述植物、植 物的部分或植物細胞，所述第四核酸包含在所述植物中具有活性并且操作性地連接至編碼 第四輪狀病毒結構性蛋白質的第四核苷酸序列的第四調控區，并且，當在步驟b)中培育所 述植物、植物的部分或植物細胞時所述第四核酸被表達。
3. 根據權利要求1所述的方法，其中所述第一輪狀病毒結構性蛋白質是VP2,所述第二 輪狀病毒結構性蛋白質是VP6,并且所述第三輪狀病毒結構性蛋白質是VP4。
4. 根據權利要求1所述的方法，其中所述第一輪狀病毒結構性蛋白質是VP2,所述第二 輪狀病毒結構性蛋白質是VP6,并且所述第三輪狀病毒結構性蛋白質是VP7。
5. 根據權利要求2所述的方法，其中所述第一輪狀病毒結構性蛋白質是VP2,所述第二 輪狀病毒結構性蛋白質是VP6,所述第三輪狀病毒結構性蛋白質是VP4,并且所述第四輪狀 病毒結構性蛋白質是VP7。
6. 根據權利要求1或2所述的方法，其中在所述植物、植物的部分或植物細胞中表達其 它的核酸，并且其中所述其它的核酸包含在所述植物中具有活性并且操作性地連接至編碼 沉默抑制子的核苷酸序列的調控區。
7. 根據權利要求1或2所述的方法，其中所述核苷酸序列的密碼子使用被調整為優選 的人密碼子使用、提高的GC含量或其組合。
8. 根據權利要求1或2所述的方法，其中所述輪狀病毒結構性蛋白質包含截短的、天然 的或非天然的信號肽。
9. 根據權利要求8所述的方法，其中所述非天然信號肽是蛋白質二硫鍵異構酶信號 (roi)肽。
10. 根據權利要求1所述的方法，其中所述第一、第二或第三核苷酸序列或它們的組合 被操作性地連接至豇豆花葉病毒（CPMV)調控區。
11. 根據權利要求2所述的方法，其中所述第一、第二、第三或第四核苷酸序列或它們 的組合被操作性地連接至豇豆花葉病毒（CPMV)調控區。
12. 根據權利要求1或2所述的方法，還包括以下步驟： c) 收獲所述植物、植物的部分或植物細胞，和 d) 從所述植物、植物的部分或植物細胞純化所述RLP，其中所述RLP的大小在70-100nm 的范圍內。
13. 根據權利要求12所述的方法，其中在存在鈣的情況下純化所述RLP。
14. 通過根據權利要求1或2所述的方法產生的RLP，其中所述RLP至少包含VP4輪狀 病毒結構性蛋白質。
15. 通過根據權利要求3所述的方法產生的RLP，其中所述RLP是雙層RLP。
16. 通過根據權利要求4或5所述的方法產生的RLP，其中所述RLP是三層RLP。
17. 根據權利要求1或2所述的方法，其中所述輪狀病毒結構性蛋白質選自輪狀病毒 株 G9P[6]、輪狀病毒 A WA 株、輪狀病毒 A 疫苗 USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8]株 以及輪狀病毒SA11株。
18. 根據權利要求3、4和5中任一項所述的方法，其中編碼VP2的核苷酸序列包含與由 SEQ ID N0:13、SEQ ID N0:14或SEQ ID N0:45所定義的核苷酸序列的80%至100%的同 一性。
19. 根據權利要求3、4和5中任一項所述的方法，其中編碼VP6的核苷酸序列包含與由 SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18或SEQ ID N0:46所定義的核苷酸序列的80%至100%的同 一性。
20. 根據權利要求4和5中任一項所述的方法，其中編碼VP7的核苷酸序列包含與由 SEQ ID NO : 19、20、48、49、52、53、54或57所定義的核苷酸序列的80 %至100 %的同一性。
21. 根據權利要求3和5中任一項所述的方法，其中編碼VP4的核苷酸序列包含與由 SEQ ID勵：15、16、47、50或51所定義的核苷酸序列的80%至100%的同一性。
22. 根據權利要求3、4和5中任一項所述的方法，其中VP2是通過下述氨基酸序列編碼 的，所述氨基酸序列包含與SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :25所定義的氨基酸序列的80%至 100%的同一性。
23. 根據權利要求3、4和5中任一項所述的方法，其中VP6是通過下述氨基酸序列編碼 的，所述氨基酸序列包含與SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :31所定義的氨基酸序列的80%至 100%的同一性。
24. 根據權利要求4和5中任一項所述的方法，其中VP7是通過下述氨基酸序列編碼 的，所述氨基酸序列包含與SEQ ID NO :4、39、43或59所定義的氨基酸序列的80%至100% 的同一'I"生。
25. 根據權利要求3和5中任一項所述的方法，其中VP4是通過下述氨基酸序列編碼 的，所述氨基酸序列包含與SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :36所定義的氨基酸序列的80%至 100%的同一性。
26. 根據權利要求1所述的方法，其中所述第一、第二或第三核酸序列或它們的組合包 含在所述植物中具有活性的下述調控區，所述調控區被操作性地連接至一個或一個以上的 豇豆花葉病毒增強子、連接至一個或一個以上的擴增元件、以及連接至編碼輪狀病毒結構 性蛋白質的核苷酸序列，并且其中，將編碼復制酶的第四核酸引入至所述植物、植物的部分 或植物細胞。
27. 根據權利要求2所述的方法，其中所述第一、第二、第三或第四核酸序列或它們的 組合包含在所述植物中具有活性的下述調控區，所述調控區被操作性地連接至一個或一個 以上的豇豆花葉病毒增強子、連接至一個或一個以上的擴增元件、以及連接至編碼輪狀病 毒結構性蛋白質的核苷酸序列，并且其中，將編碼復制酶的第五核酸引入至所述植物、植物 的部分或植物細胞。
28. 根據權利要求1所述的方法，其中所述第一、第二或第三核苷酸序列或它們的組合 還被操作性地連接至區室靶向序列。
29. 根據權利要求2所述的方法，其中所述第一、第二、第三或第四核苷酸序列或它們 的組合還被操作性地連接至區室靶向序列。
30. 在植物、植物的部分或植物細胞中產生類輪狀病毒顆粒（RLP)的方法，所述方法包 括： a) 將下述核酸引入至植物、植物的部分或植物細胞，所述核酸包含在所述植物中具有 活性并且操作性地連接至編碼一個或更多個輪狀病毒結構性蛋白質的第一核苷酸序列的 調控區， b) 在允許所述第一核酸瞬時表達的條件下培育所述植物、植物的部分或植物細胞，由 此產生所述RLP。
31. 根據權利要求30所述的方法，其中在步驟a)中將第二核酸引入至所述植物、植物 的部分或植物細胞，所述第二核酸包含在所述植物中具有活性并且操作性地連接至編碼一 個或更多個輪狀病毒結構性蛋白質的第二核苷酸序列的第二調控區，并且，當在步驟b)中 培育所述植物、植物的部分或植物細胞時所述第二核酸被表達。
32. 根據權利要求31所述的方法，其中在步驟a)中將第三核酸引入至所述植物、植物 的部分或植物細胞，所述第三核酸包含在所述植物中具有活性并且操作性地連接至編碼一 個或更多個輪狀病毒結構性蛋白質的第三核苷酸序列的第三調控區，并且當在步驟b)中 培育所述植物、植物的部分或植物細胞時所述第三核酸被表達。
33. 根據權利要求30-32中任一項所述的方法，其中所述一個或更多個輪狀病毒結構 性蛋白質選自包含VP2、VP4、VP6和VP7的組。
34. 根據權利要求30-33中任一項所述的方法，其中在所述植物、植物的部分或植物細 胞中表達其它的核苷酸序列，所述其它的核苷酸序列編碼沉默抑制子，并且所述其它的核 苷酸序列操作性地連接至在所述植物中具有活性的調控區。
35. 根據權利要求30-34中任一項所述的方法，其中所述一個或更多個輪狀病毒結構 性蛋白質來自輪狀病毒株G9P [6]。
36. 根據權利要求30-35中任一項所述的方法，其中所述核苷酸序列還被操作性地連 接至區室靶向序列。
37. 根據權利要求28、29和36中任一項所述的方法，其中所述區室靶向序列將所述一 個或更多個輪狀病毒結構性蛋白質引向所述植物細胞的內質網（ER)、葉綠體、質體或質外 體。
38. 根據權利要求37所述的方法，其中所述區室靶向序列編碼質外體信號肽或質體信 號肽。
39. 根據權利要求30-38中任一項所述的方法，還包括以下步驟： c) 收獲所述植物、植物的部分或植物細胞，和 d) 從所述植物、植物的部分或植物細胞純化所述RLP，其中所述RLP的大小在70-1 OOnm 的范圍內。
40. 在植物、植物的部分或植物細胞中產生類輪狀病毒顆粒（RLP)的方法，所述方法包 括： a) 提供包含下述核酸的植物、植物的部分或植物細胞，所述核酸包含在所述植物中具 有活性并且操作性地連接至編碼一個或更多個輪狀病毒結構性蛋白質的核苷酸序列的調 控區； b) 在允許所述核酸瞬時表達的條件下培育所述植物、植物的部分或植物細胞，由此產 生所述RLP。
41. 在植物、植物的部分或植物細胞中產生類輪狀病毒顆粒（RLP)的方法，所述方法包 括： a) 提供將下述第一核酸、下述第二核酸和下述第三核酸包含進植物、植物的部分或植 物細胞中的植物、植物的部分或植物細胞，所述第一核酸包含在所述植物中具有活性并且 操作性地連接至編碼第一輪狀病毒結構性蛋白質的第一核苷酸序列的第一調控區，所述第 二核酸包含在所述植物中具有活性并且操作性地連接至編碼第二輪狀病毒結構性蛋白質 的第二核苷酸序列的第二調控區，所述第三核酸包含包含在所述植物中具有活性并且操作 性地連接至編碼第三輪狀病毒結構性蛋白質的第三核苷酸序列的第三調控區；和 b) 在允許所述第一、第二和第三核酸瞬時表達的條件下培育所述植物、植物的部分或 植物細胞，由此產生所述RLP。
42. 根據權利要求41所述的方法，其中在步驟a)中向所述植物、植物的部分或植物細 胞提供第四核酸，所述第四核酸包含在所述植物中具有活性并且操作性地連接至編碼第四 輪狀病毒結構性蛋白質的第四核苷酸序列的第四調控區，并且，當在步驟b)中培育所述植 物、植物的部分或植物細胞時所述第四輪狀病毒結構性蛋白質被表達。
43. 通過根據權利要求30至42中任一項所述的方法產生的RLP，其中所述RLP至少包 含VP4輪狀病毒結構性蛋白質。
44. 組合物，所述組合物包含有效劑量的用于在受試者中誘導免疫應答的根據權利要 求14、15、16和43中任一項所述的RLP，和可藥用載體。
45. 在受試者中誘導對輪狀病毒感染的免疫性的方法，所述方法包括施用根據權利要 求44所述的組合物。
46. 根據權利要求45所述的方法，其中將所述組合物經口、皮內、鼻內、肌內、腹膜內、 靜脈內或皮下施用至受試者。
47. 植物材料，所述植物材料包含通過根據權利要求1至13和17至42中任一項所述 的方法產生的RLP。
48. 在植物、植物的部分或植物細胞中產生輪狀病毒結構性蛋白質的方法，所述方法包 括： a) 將下述核酸引入至所述植物、植物的部分或植物細胞，所述核酸包含在所述植物中 具有活性并且操作性地連接至編碼一個或更多個輪狀病毒結構性蛋白質的核苷酸序列的 調控區； b) 在允許所述核酸瞬時表達的條件下培育所述植物、植物的部分或植物細胞，由此產 生一個或更多個輪狀病毒結構性蛋白質。
49. 根據權利要求48所述的方法，其中所述核苷酸序列還操作性地連接至區室靶向序 列。
50. 根據權利要求48所述的方法，其中所述一個或更多個輪狀病毒結構性蛋白質是 VP2、VP4、VP6 或 VP7。
【文檔編號】A61P31/14GK104284978SQ201380024759
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2013年5月10日 優先權日:2012年5月11日
【發明者】M-A·達奧斯特, N·蘭德里, P-O·拉沃伊, 新井正明, 淺原尚美, D·L·R·穆特法, I·I·希澤洛斯, E·P·里比基 申請人:麥迪卡格公司, 田邊三菱制藥株式會社