三維的預血管化的工程化的組織建造物、制造以及使用組織建造物的方法

三維的預血管化的工程化的組織建造物、制造以及使用組織建造物的方法
【專利摘要】本公開內容的實施方案提供三維的(3D)預血管化的工程化的組織建造物、癌癥的3D預血管化的工程化的組織模型以及包括所述組織建造物的生物反應器和生物反應器陣列。本公開內容還提供制造組織建造物的方法、使用組織建造物的方法、使用組織建造物和/或癌癥模型發現藥物的方法、等等。
【專利說明】三維的預血管化的工程化的組織建造物、制造以及使用組織建造物的方法
[0001]相關申請的交叉引用
[0002]本申請要求2012年3月6日提交的具有序列號61/607，397的題為“PREVASCULARIZED 3D CO-CULTURED MODEL FOR BREAST CANCER DRUG DEVELOPMENT” 的美國臨時申請的優先權，其通過引用整體并入本文。
[0003]背景
[0004]當前的藥物開發平臺比如二維的(2D)體外細胞培養系統和體內動物實驗不精確預測候選療法的人體內效果。由于僅一種細胞類型被采用，這些細胞培養系統具有與原代的人細胞和組織有限的相似性，并且由于不同的物種在新陳代謝、生理機能以及行為方面具有差別，動物實驗對重現人的藥物響應具有一般有限的能力。由于當前篩選技術比如體外實驗室組織分析和動物研究的無能，很多實驗性藥物在臨床研究中未能精確預測藥物將如何在人中表現。
[0005]因此，藥物發現和開發領域需要體外平臺來測試候選療法用于人的響應的更好的預測。當前的體外系統(例如旋轉生物反應器、球狀體的懸浮液以及多孔支架上的生長)在尺寸上是有限的(l-2mm)并且傾向于是二維的。在3D組織建造物方面的嘗試只有有限的成就并且一直十分小或者具有短的壽命。這些組織模型的失敗至少部分是由于允許氧氣和營養素擴散進入組織以支撐更大量、更自然、更持久的組織生長的模型血管系統的不存在。
[0006]概要
[0007]本公開內容的實施方案提供三維的(3D)預血管化的工程化的組織建造物、用于癌癥的3D預血管化的工程化的組織模型、包括組織建造物的灌注式生物反應器、制造組織建造物的方法、使用組織建造物的方法、使用組織建造物的藥物發現的方法、等等。
[0008]本公開內容的三維的(3D)工程化的血管化的組織建造物的實施方案包括3D生物相容的支架材料；支架材料內的活細胞的3D網絡；多個微通道，所述多個微通道延伸貫穿建造物，使得通道的實質部分具有在建造物的一個表面處的入口以及在建造物的相對的表面處的出口，并且在建造物中，通道形成內腔以允許液體通過建造物；以及至少部分地在內腔形成內襯的多個內皮細胞。
[0009]本公開內容還提供用于支撐包括3D生物相容的支架材料的體外的3D組織培養物的3D血管化的生物相容的支架的實施方案，所述3D生物相容的支架材料包括固體的多孔材料、凝膠基質材料或者這些材料的組合。固體的多孔材料選自包括以下的材料的組:氣凝膠、網狀玻璃碳、顆粒穩定的泡沫以及這些材料的組合；并且凝膠基質材料選自包括以下的凝膠基質材料的組:合成的水凝膠、自然衍生的水凝膠以及這些材料的組合。3D血管化的生物相容的支架還包括多個通道，所述多個通道延伸貫穿支架，使得通道的實質部分具有在支架的一個表面處的入口以及在支架的相對的表面處的出口，并且在支架中，通道形成內腔以允許液體通過支架。在3D血管化的生物相容的支架的實施方案中，凝膠基質材料包括一種或者更多種水凝膠，所述一種或者更多種水凝膠選自包括以下的合成的以及自然衍生的水凝膠的組:膠原、纖維蛋白、Matrigel?、細菌纖維素、HuB1gel?、藻酸鹽、聚合物基水凝膠、共聚物基水凝膠、聚乙二醇(PEG)基水凝膠、彈性蛋白以及角蛋白。另外，在實施方案中，本公開內容的3D血管化的生物相容的支架包括多孔材料，所述多孔材料選自包括以下的組:氣凝膠、顆粒穩定的生物相容的泡沫、網狀玻璃碳(RVC)、天然靜電紡聚合物(natural electrospun polymers)、合成的靜電紡聚合物(synthetic electrospunpolymers)以及這些材料的組合。在本公開內容的3D血管化的組織建造物和支架的實施方案中，微通道具有約200微米至約450微米的直徑。在某些實施方案中，微通道具有約250微米或者更小的直徑。
[0010]本公開內容的實施方案還包括三維的(3D)體外血管化的癌癥模型，所述三維的(3D)體外血管化的癌癥模型包括本公開內容的3D組織建造物。在實施方案中，癌癥模型的3D組織建造物包括生物相容的支架材料；在支架材料內的活細胞的3D網絡，其中細胞的網絡包括癌細胞或者癌細胞和非癌細胞的組合；多個通道，所述多個通道延伸貫穿建造物，使得通道的實質部分具有在建造物的一個表面處的入口以及在建造物的相對的表面處的出口，在建造物中，通道形成內腔以允許流體介質通過建造物；以及至少部分地在內腔形成內襯的多個內皮細胞。在本公開內容的3D血管化的癌癥模型的實施方案中，模型是人乳腺癌模型并且活細胞的網絡包括人乳腺癌腫瘤細胞和非癌的人乳房成纖維細胞。
[0011]本公開內容還包括灌注式生物反應器，所述灌注式生物反應器包括本公開內容的3D工程化的組織建造物。在實施方案中，本公開內容的灌注式生物反應器包括如上所述的本公開內容的三維的(3D)工程化的組織建造物以及組織室，所述組織室被配置為容納組織建造物，使得組織建造物形成穿過室的介質的流上游和下游之間的屏障，導引介質的流穿過組織建造物的通道。在實施方案中，室具有組織建造物的部位上游的至少一個輸入口、組織建造物的部位下游的至少一個輸出口以及以控制穿過組織室的介質的流的至少一個泵。如上所述，在實施方案中，用于生物反應器的3D工程化的組織建造物包括3D生物相容的支架材料；在支架材料內的活細胞的3D網絡；多個通道，所述多個通道延伸貫穿建造物，使得通道的實質部分具有在建造物的一個表面處的入口以及在建造物的相對的表面處的出口，在建造物中，通道形成內腔以允許流體介質通過建造物；以及至少部分地在內腔形成內襯的內皮細胞。
[0012]本公開內容還提供體外制造三維的(3D)血管化的組織建造物的方法。在實施方案中，制造3D血管化的組織建造物的方法包括提供3D血管化的生物相容的支架，其中支架包括3D生物相容的支架材料和多個通道，所述多個通道延伸貫穿支架，使得通道的實質部分具有在支架的一個表面處的入口以及在支架的相對的表面處的出口 ；形成用于允許液體通過支架的內腔。方法還包括用內皮細胞播種內腔，使得內皮細胞在內腔的至少一部分形成內襯；以及用至少一種組織類型的細胞播種支架。方法還包括用細胞培養基灌注支架，并且溫育已經播種了的支架，使得至少一種組織類型的細胞的3D網絡在支架內生長。
[0013]本公開內容的方法還包括制造本公開內容的三維的(3D)血管化的支架材料的方法。在實施方案中，此方法包括提供3D生物相容的支架材料并且使用微通道建造物在支架材料中形成多個微通道，其中通道延伸貫穿支架，使得通道的實質部分具有在支架的一個表面處的入口以及在支架的相對的表面處的出口 ；形成用于允許液體通過支架的內腔。
[0014]本公開內容還包括篩選測試化合物的方法，所述方法包括提供本公開內容的三維的(3D)工程化的血管化的組織建造物，使3D組織建造物暴露于測試化合物；并且監測在暴露于測試化合物之后組織建造物中的任何變化，其中變化選自包括以下的組:組織學變化、生物化學變化以及生理變化或者其組合。在實施方案中，本公開內容的篩選方法包括篩選潛在的癌癥治療化合物的方法。在實施方案中，此方法包括提供本公開內容的3D工程化的血管化癌癥組織建造物，其中在支架材料內的活細胞的3D網絡包括癌細胞或者癌細胞與非癌細胞的組合，使3D癌癥組織建造物暴露于測試化合物；并且檢測在暴露于測試化合物之后癌細胞網絡的生長或者生存能力的變化，其中癌細胞的生長或者生存能力的減小表明測試化合物是潛在的乳腺癌治療化合物。在實施方案中，此方法還包括檢測癌癥治療的化合物的毒性，如通過細胞網絡的組織學變化、生物化學變化、生理學變化的一種或更多種衡量的。
[0015]本公開內容還包括生物反應器網絡，所述生物反應器網絡包括相互連接的生物反應器的陣列以及控制穿過生物反應器的介質的流速的至少一個泵，其中，陣列中的生物反應器互相流體連通。在生物反應器網絡的實施方案中，陣列中的至少一個生物反應器包含來自與陣列中的至少一個其他生物反應器中的細胞不同的組織類型的細胞。在生物反應器網絡的實施方案中，每個生物反應器包括:本公開內容的三維的(3D)工程化的組織建造物以及組織室，所述組織室被配置為容納組織建造物，使得組織建造物形成穿過室的介質的流上游和下游之間的屏障，導引介質的流穿過組織建造物的通道。其中室具有組織建造物的部位上游的至少一個輸入口以及組織建造物的部位下游的至少一個輸出口。
[0016]這些實施方案、這些實施方案的用途以及其它的用途、本公開內容的特點以及優點，當結合附圖閱讀以下優選的實施方案的詳細描述時，將對相關領域的那些一般技術人員變得更加明顯。
[0017]附圖簡述
[0018]本公開內容的很多方面參考以下附圖可以被更好地理解。附圖中的部件不必按比例，而是把重點放在清楚地說明本公開內容的原理。此外，在附圖中，相同的參考數詞標出貫穿幾個視圖的相應的部分。
[0019]圖1是用于在本公開內容的3D建造物中形成微通道的微通道建造物的實施方案的示意圖。
[0020]圖2是包括以HuB1gel形成生物相容的支架材料的至少一部分的本公開內容的3D血管化的組織建造物的實施方案的本公開內容的生物反應器的實施方案的示意圖。流速可以被引入以使通道中的內皮細胞暴露于與生理環境類似的流體切應力。灌注液可以在下游收集并且通過活檢口組織活檢是可能的。
[0021]圖3A-3B闡明包括本公開內容的3D血管化的組織建造物的本公開內容的單個生物反應器的實施方案。在所闡明的實施方案中，3D建造物具有用于已播種了細胞的建造物的增強的灌注的微通道的陣列。圖3A顯示生物反應器的部件分解圖，而圖3B顯示裝配好的生物反應器的視圖。
[0022]圖4A-4B是表示本公開內容的生物反應器的實施方案的數碼圖像。圖4A顯示裝配好的生物反應器的側視圖，并且圖4B顯示敞開的生物反應器的頂視圖。
[0023]圖5闡明在500X放大率下本公開內容的3D組織建造物中的微通道的實施方案的數碼圖像。圖5顯示以細菌纖維素作為支架材料的本公開內容的建造物的實施方案內的250微米直徑的通道的圖像。比例尺是30微米。
[0024]圖6是顯示由開孔網絡提供的格狀結構骨架的可商購的網狀玻璃碳(RVC)在1X放大率下拍攝的EM圖像。比例尺是4mm。
[0025]圖7是闡明在顆粒穩定的泡沫上生長的MDA-MB-231細胞在第七天在40 X放大率下的相差顯微鏡(PCM)圖像。
[0026]圖8是在RVC 45孔/英寸(ppi)上生長的MDA-MB-231細胞在第七天的PCM圖像。與背景中的(2D)平面細胞相比，能觀察到3D細胞團在材料周圍生長。比例尺是400微米。
[0027]圖9是在RVC 45孔/英寸(ppi)上生長的MDA-MB-231腫瘤細胞在第11天的PCM圖像。細胞粘附在支架材料的單個孔的內部上是可見的。比例尺是400微米。
[0028]圖10是在RVC 45孔/英寸(ppi)上生長的MDA-MB-231腫瘤細胞在第16天的圖像。比例尺是400微米。
[0029]圖11是在與3D支架材料不同的平面基材上生長的MDA-MB-231腫瘤細胞在第16天的2D對照的圖像。比例尺是400微米。
[0030]圖12是在RVC 65孔/英寸(ppi)上生長的MDA-MB-231腫瘤細胞在第17天的圖像。比例尺是400微米。
[0031]圖13A-13B是在本公開內容的不同的支架材料上生長的MDA-MB-231細胞的圖像。比例尺是200微米。圖13A顯示在氣凝膠基材(比如以下在實施例3中所述的)上生長的第11天的細胞。細胞粘附在支架材料的單個孔的內部上是可見的。圖13B顯示在RVC 65上生長的第11天的MDA-MB-231細胞。
[0032]圖14A-14D是本公開內容的血管化的支架建造物的實施方案的圖像。圖14A顯示45ppi膠原/RVC支架(L 5mg/ml膠原/RVC)的圖像，所述45ppi膠原/RVC支架具有顯示為滲透穿過4mm厚的RVC/膠原支架的兩個400微米直徑的微通道。圖14B顯示45ppi膠原/Matrigel/RVC 支架(1.9mg/ml 膠原 /Matrigel/RVC)的圖像,所述 45ppi 膠原 /Matrigel/RVC支架具有穿過支架的三個400微米直徑的微通道。圖14C是穿過膠原/RVC/Matrigel支架材料的切片(10um)的圖像；微通道作為空白區可見，RVC支架材料的部分作為黑色部分可見。圖14D是闡明在微通道的內腔形成內襯的內皮細胞的穿過凝膠材料的切片(20um)的圖像。
[0033]圖15A是對于測量為1mm直徑X 3mm高度(例如實施例4中的版本I生物反應器)的本公開內容的生物反應器的實施方案，本公開內容的盤狀支架的實施方案的支架的示意圖。圖15B是對于測量為1mm寬度X 5mm長度X 2.4mm高度(例如實施例4中的版本2生物反應器)的本公開內容的生物反應器的另一實施方案，矩形狀支架的實施方案的示意圖。
[0034]圖16是為本公開內容的組織建造物的矩形的實施方案設計的本公開內容的生物反應器的實施方案的數碼圖像。
[0035]詳細描述
[0036]在以更加詳細的方式描述本公開內容之前，應理解的是本公開內容不限于所述的特定實施方案并且如此當然可以變化。還應理解的是，本文所用的術語僅是為了描述特定實施方案的目的，并不是意圖限制，因為本公開內容的范圍將僅由所附權利要求限定。
[0037]在值的范圍被提供時，應理解，在該范圍的上限和下限之間，每個居中值到下限單位的十分之一(除非上下文另外明確指出)，和該所述范圍內任何其他指出的或者居中值都包括在本公開內容內。這些較小范圍的上下限可獨立地被包括在較小范圍內并也包括在本公開內容內，受所述范圍內任何特別排除的限值的影響。在所述范圍包括限值中的一個或者兩個時，排除那些所包括限值中任一或者兩個的范圍也包括在本公開內容內。
[0038]除非另外規定，否則本文使用的所有技術以及科學術語具有本公開內容所屬領域的普通技術人員所通常理解的相同含義。雖然在本公開內容的實踐或者測試中也可以使用與本文所述的方法和材料類似或者相當的任何方法和材料，但現在描述優選的方法和材料。
[0039]在本說明書中列舉的所有出版物和專利通過引用并入到本文中，如同每個單獨的出版物或者專利具體和單獨地被表明通過引用并入到本文中，并且被通過引用并入到本文中以與公開和描述結合提及出版物的方法和/或材料來并入到本文中。任何出版物的引用是因為其公開在申請日之前，并且不應該解釋成承認:本公開內容由于先前的公開而不具有先于這樣的出版物發生的資格。而且，所提供的公布日期可能與實際的出版日期不同，且可以需要獨立地證明。
[0040]如閱讀了本公開內容后將對本領域技術人員明顯的，本文所描述和闡明的每個單獨的實施方案具有離散的組成部分和特征，其可以容易地與任何其它一些實施方案的特征分離或者相結合而不背離本公開內容的范圍或者精神。任何所列舉的方法可按照所列舉的事件的順序進行，或者以邏輯上可能的任何其它順序進行。
[0041]除非另有指示，否則，本公開內容的實施方案將采用化學技術、有機化學技術、有機金屬化學技術、高分子化學技術、微生物學技術以及類似的技術，這在本領域技術人員的知識范圍內。這些技術在文獻中得到了充分解釋。
[0042]提出下列實施方案以對本領域普通技術人員提供對于如何進行該方法和使用所公開和要求保護的組合物和化合物的完全的公開和說明。已經做出努力以保證數值(例如量、溫度等等)的精確性，但應該考慮一些誤差和偏差。除非另有指示，份數是重量份數，溫度是。C，以及壓力是在或者接近大氣壓的。標準溫度和壓力定義為20°C和I個大氣壓。
[0043]在詳細描述本公開內容的實施方案之前，應該理解，除非另有指示，本公開內容不限于特定材料、試劑、反應材料、制造工藝或者類似物，因為這些都可以改變。還應理解，本文使用的術語僅僅是為了描述特定實施方案的目的，并不是用來限制。在本公開內容中，還可能的是，可以用邏輯上可能的不同順序來進行各個步驟。
[0044]必須指出，說明書和所附權利要求中使用的單數形式“一個(a) ”、“一種(an) ”和“所述(the)”包括復數指代對象，除非上下文清楚地另外規定。因此，例如，“一支撐物”的提及包括多個支撐物。在本說明書和后面的權利要求中，將提及許多術語，所述術語將被定義為具有下列含義，除非明顯具有相反的意義。
[0045]定義
[0046]在描述和要求所公開的主題時，將遵循下文陳述的定義使用以下術語。
[0047]如本文使用的，術語“工程化”表示工程化的物體由人類創造和/或改變。工程化的物體可以包括自然衍生的物質，但物體本身通過人為干涉和設計在某些方面改變。
[0048]如本文使用的術語“血管化”表示物體包括能夠輸送流體(例如培養基、液體介質中的細胞、營養素等)穿過物體/建造物的管道(例如血管、通道、管)。
[0049]如本文使用的術語“通道”或者“微通道”指在建造物內的似管的形成物。通道具有大體圓柱形狀，所述圓柱形狀具有通常圓的橫截面。通道具有為流體的輸送創造渠道/管道的敞開的(例如中空的或者大體中空的)內部(指如本文的“內腔”)。如本文使用的微通道具有在微米范圍(例如100-900微米、200-500微米等等)的直徑。
[0050]如本文使用的術語“生物相容”指與活的生物物質和/或生物系統(例如細胞、細胞組成部分、活組織、器官等等)共存而不對生物物質或者生物系統發揮過度的脅迫、毒性或不良影響的能力。
[0051]如本文使用的術語“生物相容的支架材料”指具有提供支撐活的生物物質(例如活細胞)的生長的基材的充分的結構穩定性的任何化合物物質。在本公開內容的實施方案中，生物相容的支架材料具有三維結構(而不是平面的2-二維結構)以支撐活細胞的三維生長。
[0052]術語“凝膠基質材料”指具有凝膠樣稠度和能夠支撐活的生物物質(活細胞)的生長的結構的半固體至固體材料的幾種不同類型。合成的凝膠基質材料和自然衍生的凝膠基質材料兩者都存在并且被本領域的技術人員在使用。凝膠基質材料包括水凝膠，比如生物相容的自然衍生的水凝膠或者合成的水凝膠，比如但不限于聚合物基水凝膠、PEG基水凝膠、纖維素、角蛋白、彈性蛋白、膠原以及類似物。凝膠基質材料還包括生物相容的聚合物基或者共聚物基凝膠材料，比如聚合物基和共聚物基水凝膠。凝膠基質材料還可包括膠凝劑或者交聯劑(例如甲醛、戊二醛等)以增強凝膠的結構穩定性(例如以給予其更加“結實的”特性)。
[0053]如本文使用的，短語“固體的多孔材料”指具有固體(而不是凝膠樣的)稠度和具有敞開的或者多孔的結構的支架材料，所述敞開的或者多孔的結構是為了提供用于支撐活細胞的3D網絡的生長的結構骨架，固體的多孔材料具有比凝膠基質材料比如水凝膠更加剛性的支撐。在實施方案中，用于本公開內容的支架材料和建造物的這些固體的多孔材料是惰性材料，所述惰性材料對在其骨架內/其骨架上生長的生物材料不干涉或者發揮負面影響。在實施方案中，本公開內容的固體的多孔材料可以具有似晶格的結構，所述似晶格的結構提供足夠的表面面積來支撐三維細胞生長。可以被包括在本公開內容的實施方案中的固體的多孔材料的實施例在以下討論中被描述。
[0054]術語“細胞的網絡”指互相連接的或者以其他方式互相細胞連通的多個細胞(例如三個或者更多個)的分組。術語“細胞的3D網絡”包括如上所述的細胞的網絡，其中，細胞占據三維空間。換言之，三個或者更多個細胞以多于一個平面的形式聚集在一起。
[0055]本文使用的術語“癌癥”將被給予其通常意義，作為其中異常細胞不受控制地分裂并且形成癌細胞或者贅生性細胞或者組織的疾病的通用術語。術語癌癥可包括癌細胞和/或癌變前細胞。特別地，并且在本公開內容的實施方案的上下文中，癌癥指血管發生相關的癌癥。癌細胞可以侵襲附近的組織并且可以通過血流和淋巴系統蔓延到身體的其它部分。有幾種主要的類型的癌癥，例如癌是始于皮膚或者始于在內臟中形成內襯或者覆蓋內臟的組織的癌癥。肉瘤是始于骨骼、軟骨、脂肪、肌肉、血管或者其它結締組織或者支撐的組織的癌癥。白血病是開始于形成血液的組織比如骨髓并且引起大量的不正常血液細胞被產生并且進入血流的癌癥。淋巴瘤是始于免疫系統的細胞的癌癥。
[0056]當正常細胞失去其表現為特化的、受控制的以及協調的單元的能力時，可形成腫瘤。通常，實體瘤是通常不包含囊腫或者液體區(盡管某些腦腫瘤的確具有囊腫以及充有液體的中央壞死區)的組織的不正常的塊。單一的腫瘤可以甚至具有不同的細胞群在其內，具有已經出錯的相異的進程。實體瘤可以是良性的(非癌性的)或者惡性的(癌性的)。實體瘤的不同類型對形成其的細胞的類型命名。實體瘤的實例是肉瘤、癌以及淋巴瘤。白血病(血液的癌癥)通常不形成實體瘤。
[0057]典型的癌癥包括但不限于膀胱癌、乳腺癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌、頭頸癌、白血病、肺癌、淋巴瘤、黑素瘤、非小細胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌、睪丸癌、子宮癌、宮頸癌、甲狀腺癌、胃癌、腦干膠質瘤、小腦星形細胞瘤、大腦星型細胞瘤、成膠質細胞瘤、室管膜瘤、尤文氏肉瘤家族腫瘤、生殖細胞瘤、顱外癌、霍奇金病、白血病、急性成淋巴細胞白血病、急性髓性白血病、肝癌、成神經管細胞瘤、成神經細胞瘤、通常的腦腫瘤、非霍奇金淋巴瘤、骨肉瘤、骨骼的惡性纖維組織細胞瘤、成視網膜細胞瘤、橫紋肌肉瘤、通常的軟組織肉瘤、幕上原始神經外胚層腫瘤以及松果體腫瘤、視路以及下丘腦膠質瘤、維爾姆斯腫瘤、急性淋巴細胞白血病、成人急性髓性白血病、成人非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴細胞白血病、慢性髓性白血病、食道癌、毛細胞白血病、腎癌、多發性骨髓瘤、口腔癌、胰腺癌、原發性中樞神經系統淋巴瘤、皮膚癌、小細胞肺癌，除了別的之外。
[0058]腫瘤可以被歸類為惡性的或者良性的。在兩種情況中，有細胞的不正常的聚集以及增殖。在惡性腫瘤的情況下，這些細胞更加侵略性地行為，獲得增強的侵襲性性能。最后，腫瘤細胞甚至可以獲得從腫瘤細胞在其中起源的微觀環境脫離，蔓延至身體的另一區(具有通常不有益于其生長的非常不同的環境)，并且在此新的位置繼續其迅速的生長以及分裂的能力。這叫做轉移。一旦惡性細胞開始轉移，實現治療就更加困難。
[0059]良性腫瘤具有較少的侵入的傾向并且不太可能轉移。腦腫瘤在腦內廣泛蔓延但通常不轉移到腦外部。神經膠質瘤在腦內部是非常有侵略性的，甚至橫跨大腦半球。然而，它們以不受控制的方式分裂。取決于其位置，它們可以正如惡性病變一樣威脅生命。其實例將是腦中的良性腫瘤，其可以生長并且占據頭顱內的空間，導致在腦上增加的壓力。
[0060]應注意，癌變前細胞、癌癥、腫瘤常常可交換地使用在本公開內容中。
[0061]術語“聚合物”包括由互相共價結合的兩個或者更多個單體單元所組成的任何化合物，其中，單體單元可以是相同的或者不同的，使得聚合物可以是均聚物或者雜聚物。典型的聚合物包括聚酰胺比如多肽、聚-N-取代甘氨酸(聚類肽物(polypeptoids))，多糖，聚乙二醇或者聚氧化乙烯，塑料(例如聚-L-乳酸、聚-L谷氨酸及其共聚物)，核酸以及類似物，其中聚合物可以是自然發生的、非自然發生的或者合成的。術語“生物聚合物”指由生物衍生的和/或生物相容的化合物組成的聚合物。
[0062]術語“附接”或者短語“相互作用”以及“相關聯”指穩定的物理關聯、生物關聯、生物化學關聯和/或化學關聯。一般來說，關聯可以是化學鍵結(例如共價地或者離子鍵地)、生物的相互作用、生物化學的相互作用以及在某些情況下的物理相互作用。關聯可以是共價鍵、非共價鍵、離子鍵、金屬離子螯合相互作用以及通過相互作用比如但不限于疏水相互作用、親水相互作用比如水凝膠鍵結、電荷-電荷相互作用、η堆積相互作用、其組合以及類似的相互作用被連接的部分。
[0063]討論
[0064]本公開內容提供三維的(3D)工程化的血管化的組織建造物，包括建造物的生物反應器，制造建造物的方法以及使用建造物用于組織設計、藥物發現和很多其他用途的各種方法。本公開內容的3D工程化的血管化的組織建造物代表定制的微生理學平臺，該平臺支撐長期的組織生長、重演生理組織功能、提供人的疾病進展或者對外部攻擊(藥物或者病原體)的響應的模型，以及其他優于現有技術的優勢。
[0065]現有藥物發現平臺利用2D細胞培養系統復制組織微環境和生理端點。利用原代的人細胞的3D組織模型更好地復制了組織的生物化學特性和生物物理學特性。此外，與2D培養相比，3D培養的基因表達譜更加精確地模擬天然組織并且更加精確地再現藥物靈敏度反應。目前，利用合成的(水凝膠、藻酸鹽)或者動物源(Matriger、HUBi0ger、膠原)生物基質支架開發很多3D組織模型。此外，大部分3D組織建造方法通常僅培養原代的實質細胞類型而不合并間質或者血管部件。相比之下，本公開內容的3D血管化的組織建造物通過使用生物基質支架來精確地模擬組織功能和對藥物的反應來表現更加“完全的人類”組織建造物，該生物基質支架適合于在血管化的網絡中長期培養帶有實質和間質細胞組件的恰當的人原代細胞類型。
[0066]在本公開內容的組織建造物內工程化的微通道的網絡對建造物提供血管化以克服在較大組織中的氧氣擴散局限性并且允許引入循環的機械刺激用來提供適當的內皮功能以及與周圍組織的新陳代謝連通。組織建造物的血管化允許更好的三維生長以及更大規模的生長和更長的持續性。在3D組織模型技術上的這些進展通過提供具有更加生理有關的功能以及結構并且從而具有更加似體內的新陳代謝和分子預測端點的組織建造物將加速藥物開發。
[0067]本公開內容的3D血管化的組織建造物與各種細胞類型相容，并且因此可以被用來生長包括任何不同細胞類型的組織建造物，所述任何不同細胞類型然后可以被采用用于很多不同的用途。例如，在本3D血管化的組織支架的生理學環境中可以生長健康的細胞和患病的細胞兩者并且這兩種細胞可以被用來模擬各種疾病狀態、器官系統等等。并且，來自捐贈者和患者的人細胞可以被用在本建造物中以創建生理相關的組織建造物和疾病狀態的精確的表現。在制造本公開內容的3d血管化的組織建造物中利用患者細胞可以提供用于個體化用藥的平臺，比如通過提供用于與患者本身的組織的體外測試藥物相互作用的個體化模型。
[0068]這些3D多細胞組織建造物在新型的微生理灌注式生物反應器中被培養，所述微生理灌注式生物反應器允許組織功能和連接多個器官系統(以即插即用的設計)的能力的實時的非破壞性的測定以重現復雜的生物體生理機能。本公開內容的生物反應器被工程化為與取樣和光學成像技術整合在一起來評估組織特異功能以及對藥物和毒素攻擊的反應。生物反應器可以被合并成為陣列，每個生物反應器支撐組織建造物。這些“即插即用”平臺可以被互相連接并且被重新配置為包括多種不同的組織。在實施方案中，本公開內容的3D組織建造物可以被整合成為具有不同組織類型和/或疾病狀態的組織建造物的陣列系統以形成整合的微生理系統，用于更具預測性、更迅速并且更加成本有效的藥物發現、藥物開發、藥物功效以及毒理學試驗策略。這些創造性方法將代替和/或加強用于藥物開發和藥物驗證的利用2D細胞培養和動物試驗方案的現有方法，所述現有方法是昂貴的，具有有限的預測能力并且需要大量的完成時間。本公開內容的3D組織建造物和組織建造物的整合的陣列將提供對于藥物從實驗到臨床的更加成本有效和及時的轉化的強大的新型的范例。
[0069]本公開內容的3D血管化的組織建造物、利用組織建造物的疾病狀態模型、用于組織建造物的生長和保持的生物反應器、生物反應器陣列、利用組織建造物篩選測試化合物的方法、以及制造本公開內容的組織建造物的方法的實施方案和本公開內容的其它實施方案在以下更加詳細地被描述。
[0070]3D工程化的血管化的組織建造物
[0071]本公開內容的3D工程化的血管化的組織建造物包括用于對細胞生長提供結構支撐的三維的生物相容的支架材料；在支架材料內的活細胞的三維的網絡；延伸貫穿建造物的多個微通道，其中微通道用內皮細胞被至少部分地在內表面(內腔)上形成內襯。本公開內容包括3D血管化的組織建造物以及用于支撐組織生長的3D血管化的支架(例如不含活細胞的網絡的播種前的支架)兩者。
[0072]生物相容的支架材料:
[0073]為了支撐三維空間中細胞的生長，本公開內容的組織建造物提供生物相容的支架材料，所述生物相容的支架材料對建造物提供結構支撐和結構完整性。在實施方案中，生物相容的支架材料是凝膠基質材料、固體的多孔材料或者這些材料的兩者的組合。
[0074]凝膠基質材料用于組織工程化和芯片實驗室的設計的應用是眾所周知的。在本公開內容的建造物的實施方案中，在這些應用中使用的任何此種生物相容的凝膠基質材料可以被用來提供本公開內容的結構支架。代表性的凝膠基質材料包括但不限于合成的和自然衍生的水凝膠。本公開內容的凝膠基質材料可以包括合成的水凝膠、自然衍生的水凝膠以及合成的水凝膠和自然的水凝膠兩者的組合。此種水凝膠在本領域中是眾所周知的并且可以被定制為具有各種物理性質(例如通過摻入各種聚合物材料)并且可以用營養素和其他蛋白質(例如生長因子)被加強。盡管不意圖限制本公開內容的范圍，以下討論水凝膠的某些方面和代表性的水凝膠。
[0075]通常描述的，水凝膠是以水作為分散介質的親水性的聚合物鏈的自然的或者合成的網絡。水凝膠是非常能吸收的(其可以包含超過99.9%的水)并且由于其顯著的水含量具有與自然組織非常相似的彈性程度。通過控制并且優化其孔隙度和共軛黏附以及其它生物識別或者凝膠交聯分子，水凝膠可以被定制為具有緊密匹配自然組織的機械性質的材料性質。
[0076]在實施方案中，水凝膠可以通過可調的材料性質(例如凝膠剛度、孔隙度以及降解速率)被特別地設計。組成水凝膠的多肽的選擇以及多肽的交聯程度(例如通過添加各種交聯劑、膠凝劑以及類似物)可以被用來控制水凝膠的材料特性。此外，水凝膠可以被設計為控制所提供的生物基材(例如粘附基材、蛋白酶基材以及類似物)的濃度。在實施方案中，水凝膠可以是合并合成的聚合物比如聚乙二醇加上生物合成所得到的重復的蛋白質的混合的合成材料。在某些實施方案中，水凝膠可以由蛋白質聚合物構成，蛋白質聚合物可以利用化學交聯劑、物理交聯劑和/或生物交聯劑(例如酶)被交聯成為水凝膠。在某些實施方案中，水凝膠已經被合成為包括特定的蛋白結合結構域；從而能夠實現對細胞生長和保持有用的蛋白質比如生長因子的結合。
[0077]本公開內容的建造物可以包括自然衍生的和合成的水凝膠的任何一個或者兩者。在本公開內容的實施方案中，代表性的自然衍生的水凝膠包括但不限于以下:膠原、纖維蛋白、Matrigel?、細菌纖維素、HuB1gel?及其組合。
[0078]在本公開內容的3D血管化的組織建造物的實施方案中，凝膠基質材料可以是細菌纖維素和/或纖維蛋白的自然衍生的水凝膠。細菌纖維素水凝膠和纖維蛋白水凝膠具有不同的化學組成、機械結構，并且可以支撐不同的細胞類型。來源于通過細菌的纖維素納米纖維的合成的不可降解的水凝膠-細菌纖維素已被證明為支撐血管平滑肌細胞、內皮細胞以及造骨細胞。在哺乳類動物中發現的凝血的可降解的產物-纖維蛋白凝膠已被證明為支撐包括乳腺癌細胞的很多細胞類型。纖維蛋白還在組織再生以及組織修復中起重要作用。其是血栓的主要的蛋白質成分并且經由通過酶凝血酶裂解蛋白纖維蛋白原形成。纖維蛋白可以在生理溫度形成凝膠并且已被廣泛使用在從心血管組織工程到創傷修復嘗試的生物醫學工程應用中。
[0079]膠原是可以被用在本公開內容的3D血管化的組織建造物中的另一自然的水凝膠。膠原其是在哺乳類動物中發現的最豐富的蛋白質并且是細胞外基質的主要組分。I型膠原是所有的膠原中最豐富的并且在組織再生以及組織修復中起重要作用。其作為溶解材料是可商購的并且在很多生物醫學工程應用和包括整形外科組織工程的組織工程應用中已經被用作為3D基質材料。I型膠原在生理溫度形成水凝膠。
[0080]Matrigel?(BD B1sciences)是從鼠科動物腫瘤30中提取的溶解的基底膜基質。此水凝膠還被使用在很多組織工程應用中。HuB1gel?是由Vivo B1sciences (VBI)產生的為人生物基質的水凝膠。HuB1gel是包括Col-1、層粘連蛋白、Col-1V、Col-n1、巢蛋白(entactin)以及HSPG的自然的細胞外基質(ECM)，但是缺乏所有主要的已知的生長因子。其與人組織更加相容并且更加安全，既不是生成血管的也不是致有絲分裂的。HuB1gel經由局部生長因子信號促進細胞生長和分化并且允許長期培養一種或者更多種細胞類型。其與人細胞相容和/或用于人組織模型的生長。
[0081]在本公開內容的實施方案中，代表性的合成的水凝膠包括但不限于以下:藻酸鹽、聚乙二醇(PEG)基水凝膠、聚合物低聚(聚延胡索酸乙二醇酯)(OPF)、其它生物相容的聚合物基或者共聚物基水凝膠以及這些材料的組合。
[0082]OPF水凝膠是合成的聚乙二醇(PEG)基水凝膠。OPF是在Rice University開發的新型的水凝膠并且已經被用作為用于軟組織工程應用和整形外科組織工程應用36-39的3D基質。其性能比如無毒性、生物相容性以及迅速的膠凝作用使其成為用于3D細胞培養的有前途的材料。OPF水凝膠、其它的PEG基水凝膠、藻酸鹽以及其它合成的水凝膠可以被用作為用于形成本公開內容的生物相容的支架材料的凝膠基質。
[0083]在其中生物相容的支架材料包括凝膠基質材料的本公開內容的實施方案中，其還可以包括一種或者更多種交聯劑、膠凝劑或者組合，其中此類試劑能夠增加凝膠基質材料的結構穩定性和/或結構完整性。由于水凝膠的高含量，某些水凝膠可以具有比本公開內容的建造物中所期望的更流動的稠度。因此，在某些實施方案中，膠凝劑和/或交聯劑或者類似物可以被用來“凝固”或者“固化”水凝膠。在某些實施方案中，單獨的熱的應用可能足以膠凝或者“固化”水凝膠。熱供應、凝膠劑或者交聯劑或者其它填充物的使用的組合可以被使用在本公開內容的實施方案中以提供支架材料的期望的結構完整性。
[0084]雖然凝膠基質材料比如水凝膠在具有孔板設計或者薄的芯片實驗室技術的組織工程應用和細胞培養應用中具有使用的歷史，但其在過去不能支撐大的3D組織建造物的生長和/或長期的保持。如由本公開內容提供的建造物的血管化克服這些困難的某些，允許培養基、營養素以及類似物另外遞送至細胞以允許更加持久的和大量的組織生長。在本公開內容的實施方案中，凝膠基質材料單獨作為支架材料對用于孔板格式、某些生物反應器設計以及其它實施方案的建造物的實施方案是合適的。然而，對于某些應用，另外的結構完整性可以是支架材料中期望的。
[0085]在本公開內容的3D血管化的組織建造物的實施方案中，生物相容的支架材料可以包括固體的多孔材料比如但不限于氣凝膠、顆粒穩定的生物相容的泡沫、網狀玻璃碳(RVC)、天然靜電紡聚合物、合成的靜電紡聚合物以及這些材料的組合。此種固體的多孔材料提供用于支撐活細胞的3D網絡的生長的固體結構骨架。在實施方案中，用于本公開內容的建造物的支架材料的這些固體的多孔材料是惰性材料，所述惰性材料對在其骨架內部/骨架上生長的生物材料不干涉或發揮不良影響。
[0086]這些固體多孔材料的某些具有似晶格的結構，所述似晶格的結構提供足夠的表面面積來支撐三維細胞生長。例如網狀玻璃碳(RVC)具有由敞開的孔隙網絡提供的固體的晶格結構。RVC的圖像顯示在圖7中。其它固體的多孔結構也提供晶格型或者似網的結構特征，比如氣凝膠、顆粒穩定的生物相容的泡沫、自然的和合成的靜電紡聚合物等等。氣凝膠是來源于凝膠的固體材料，其中液體已經從凝膠蒸發，留下超輕但牢固的固體骨架。這些材料和其它生物相容的固體的多孔材料可以被單獨或者與其它材料比如以上討論的凝膠基質材料結合使用于形成本公開內容的支架材料。
[0087]因此，在本公開內容的3D血管化的組織建造物和3D血管化支架材料的實施方案中，生物相容的支架材料可以包括一種或更多種固體的多孔材料和一種或更多種凝膠基質材料，以及用來加強、修改或控制支架材料的性質的任何其他的化合物(例如粘合劑、膠凝齊U、交聯劑、蛋白質、聚合物等等)。在本公開內容的實施方案中，生物相容的支架材料包括與一種或更多種凝膠基質材料結合的網狀玻璃碳和/或氣凝膠，所述凝膠基質材料比如但不限于Matrigel?、細菌纖維素、膠原、纖維蛋白、彈性蛋白、角蛋白、HuB1gel及其組合。在本公開內容的實施方案中，生物相容的支架材料包括RVC、Matrigel?和膠原，以及任選的交聯劑和/或凝膠劑比如但不限于戊二醛、甲醛以及類似物。
[0088]支架的血管化:
[0089]本公開內容的3D工程化的血管化的組織建造物和3D血管化的支架材料包括延伸貫穿建造物的多個通道。在實施方案中，通道是微通道。在實施方案中，微通道具有約I微米至約1000微米、從約5微米至約600微米、或者從200微米至約450微米以及在所陳述的范圍內和/或者重疊所陳述的范圍的其它范圍的直徑。在實施方案中，微通道具有約250微米或者更小的直徑。在實施方案中，微通道具有從約5微米至約250微米的直徑。微通道被配置使得通道的實質部分具有在建造物的一個表面處的入口以及在建造物的相對的表面處的出口。微通道是大體中空的，使得通道形成內腔以允許液體通過建造物。因此，微通道在支架建造物內創建血管網絡以促進細胞培養基、營養素、氧氣、蛋白質、生長因子以及類似物遞送至3D建造物的各個部分，允許在建造物內生長的細胞的改進的生長和保持。在實施方案中，微通道是大體對齊的(例如其是通常面向在同一方向以允許流體/介質單向流動穿過通道)。
[0090]在本公開內容的3D血管化的建造物和支架的實施方案中，微通道是至少部分地以內皮細胞在內部表面(內腔)上形成內襯。這些內皮細胞可以形成完整的網絡以近似于生理血管的內襯。內皮細胞被引入通道并且被培養以便多個內皮細胞至少部分地在內腔形成內襯。內皮細胞可以以對本領域技術人員已知的各種方式被引入。例如，在實施方案中，在建造物內形成的具有微通道的支架/建造物可以被放置在包含內皮細胞的培養基中并且被溫育足夠量的時間用于內皮細胞生長。在其他的實施方案中，內皮細胞可以如下播種:通過用包含內皮細胞的介質灌注到生物反應器中，通過注射泵，通過注入微通道中或者遞送內皮細胞至建造物的微通道的其它方法。
[0091]在本公開內容的制造建造物和支架的方法的實施方案中，微通道通過使用微通道建造物形成。在實施方案中，微通道建造物由剛性的耐用的材料比如金屬(例如不銹鋼)、玻璃、聚合物、可再吸收的細絲以及類似物構成。微通道建造物可以具有底部和用于形成微通道的棒或者線的陣列。圖1表示本公開內容的微通道建造物的實施方案的示意圖。在本公開內容的實施方案中，棒或者線具有大體圓柱形狀并且具有類似于微通道的期望的橫截面的橫截面。因此，棒/線可以具有約10微米至約1000微米、100微米至約600微米、約200微米至約400微米和約250微米以及類似的直徑。在實施方案中，微通道還可以通過激光切削加工被形成。
[0092]微通道建造物可以被用來以各種方式在3D支架材料中形成通道。在支架材料包括凝膠基質材料的實施方案中，在固化(例如交聯、膠凝或者以其他方式“凝固”)凝膠基質材料之前，微通道建造物可以被插入到凝膠基質材料中或者固體的多孔材料和凝膠基質材料的組合中。然后在凝膠已經固化后，微通道建造物可以被移除，留下微通道在支架/建造物內。在其它實施方案中，在固化、形成或者將通道“戳入”到支架/建造物中后，微通道建造物可以被插入/戳入凝膠基質材料、固體的多孔材料或者固體的多孔材料和凝膠基質的組合中)。用于在建造物/支架中形成微通道的其它方法也可以被采用并且被認為是在本公開內容的范圍內。
[0093]細胞的3D網絡:
[0094]本公開內容的3D血管化的組織建造物還包括在支架材料內的細胞的3D網絡。細胞的網絡包括生長在三維空間中(例如在多于一個平面中)的多個細胞，其中細胞以某種方式比如物理接觸、細胞連通等等互相連接。本公開內容的組織建造物可以支撐幾乎任何種類的細胞的生長，特別感興趣的是動物細胞。在實施方案中，本公開內容的組織建造物包括哺乳動物細胞，特別地人細胞。細胞可以來自感興趣的任何組織，包括健康的組織和/或患病的組織。在支架材料和微通道的形成之后，或者在某些實施方案中，與凝膠基質材料或者其它試劑的添加同時，細胞可以被引入支架材料。細胞可以通過注射、灌注、共溫育或者這些方法的組合以及對本領域的技術人員已知的其它方法被引入培養基中。
[0095]本公開內容的組織建造物可以包括病理性細胞(例如用于建模患病組織)、健康細胞或者健康細胞和病理性細胞的組合。總之，細胞類型可以是弓I起或者能夠引起疾病比如癌癥的病理性細胞。在實施方案中，細胞類型可以包括癌癥細胞，比如癌性人細胞和/或癌前人細胞。在實施方案中，癌細胞可以包括癌細胞比如轉移癌細胞。在實施方案中，癌性人細胞可以包括人癌細胞比如轉移性的人癌細胞。細胞類型可以對應于癌癥比如以上定義的那些。特別地，細胞類型可以包括人或者哺乳類動物中的前列腺癌細胞，乳腺癌細胞、腦癌細胞、卵巢癌細胞、膀胱癌細胞、肺癌細胞以及結腸癌細胞。盡管本文涉及到癌癥以及癌細胞，但癌癥以及癌細胞可以被替換為致病細胞。
[0096]在實施方案中，細胞包括癌細胞和健康(非癌)細胞的組合。以這種方式，用本公開內容的建造物以類似于疾病的體內狀態的方式建模某些疾病狀態是可能的。例如，在某些腫瘤的情況下，本公開內容的3D血管化的組織建造物允許模擬宿主中腫瘤的結構和構成的與健康組織組合的3D腫瘤的形成。由支架材料提供的結構以及由微通道提供的血管化允許細胞的改進的生長以形成具有更加類似于生理狀態的空間定向和結構的組織。
[0097]在本公開內容的某些實施方案中，建造物可以被用來提供三維的(3D)體外血管化的癌癥模型。在某些這類實施方案中，3D組織建造物包括具有在支架材料內的活細胞的三維網絡的生物相容的支架材料，其中細胞的網絡包括癌細胞或者癌細胞與非癌細胞的組合。3D血管化的癌癥模型還包括延伸貫穿建造物的多個通道以形成內腔以及至少部分地在內腔形成內襯的多個內皮細胞，如上所述的。
[0098]在實施方案中，本公開內容的3D血管化的組織建造物可以被用來提供人乳腺癌的模型。在實施方案中，3D血管化的組織建造物包括細胞的網絡，所述細胞包括乳腺癌腫瘤細胞和健康乳房組織細胞比如但不限于乳房成纖維細胞和/或乳房上皮細胞)。在本公開內容的乳腺癌模型的某些實施方案中，乳腺癌腫瘤細胞形成球狀體結構。球狀體常常由具有乳腺癌的宿主的乳腺癌細胞體內形成。本公開內容的實施方案還包括利用本公開內容的3D血管化的組織建造物的其它癌癥以及其它疾病的模型。
[0099]3D血管化的支架和組織建造物的配置:
[0100]在實施方案中，3D血管化的組織建造物和/或3D生物相容的血管化的支架的物理性質(例如大小、形狀、密度等等)可以被配置和/或調整用于各種應用。例如，本公開內容的3D支架/組織建造物可以被調整為具有不同的大小、形狀、厚度、密度以及類似物用于各種試驗、培養、成像和篩選應用以及其它用途和應用。例如，在某些實施方案中，組織建造物被配置為被放置在孔板和/或扁平的平行板的流動室中。在其它實施方案中，組織建造物被配置用于在共焦成像設備、熒光成像設備、相差成像設備、或者可交換地在這些設備的任何一個上放置。在實施方案中，本公開內容的組織建造物和/或支架適合于被放置在生物反應器組織室以及一種或者更多種其它的上述的設備中。例如，適用于孔板格式的組織建造物可不需要同樣多的結構完整性，所以較柔軟的凝膠基質支架材料可以是合適的。在其中需要更多的結構完整性的某些實施方案中，固體的多孔材料比如RVC可以被包含在支架材料中。形狀也可以對適當的應用定制。例如，在對于孔板的實施方案中，用于建造物的更加似盤的結構可能是需要的(例如圖15A)，而，對于在共焦成像設備上的應用，更加矩形的形狀可能是合適的(例如圖15B)。
[0101]而且，建造物的形狀可以被調整用于各種生物反應器中。例如，建造物可以具有略微圓柱形狀或者盤狀(例如圖15A)用于圓柱形生物反應器，比如圖4A和4B中所示，同時建造物可以具有更加矩形的形狀(例如圖15B)用于矩形生物反應器，比如圖16中所示。
[0102]如上所述，本公開內容不僅包含本公開內容的三維的(3D)血管化的組織建造物，也包含用于支撐體外3D組織培養的3D血管化的生物相容的支架。3D血管化的生物相容的支架類似于組織建造物，但還不包括在支架材料內的細胞的3D網絡。因此，這些支架可以被用來如上所述地生長細胞的3D網絡并且制造組織模型和如上所述的疾病模型。在實施方案中，本公開內容的3D生物相容的支架材料可以包括固體的多孔材料、凝膠基質材料或者其組合，如上所述。
[0103]血管化的生物相容的支架的微通道可以或者可以不包括在內腔內的內皮細胞的層。內皮細胞可以在感興趣的細胞的添加稍后的時間、之前或者同時被添加到支架。本公開內容還包括成套元件，所述成套元件包括本公開內容的3D生物相容的支架，所述本公開內容的3D生物相容的支架包括生物相容的支架材料和如上所述的多個微通道，并帶有或者不帶有在微通道的內腔形成內襯的內皮細胞。在實施方案中，成套元件還可包括內皮細胞的培養物和/或感興趣的其它組織細胞的培養物以及用于添加內皮細胞和/或感興趣的其它組織細胞以產生本公開內容的3D血管化的組織建造物的說明書。
[0104]制造組織建造物和支架的方法
[0105]本公開內容還提供制造本公開內容的3D血管化的組織建造物和生物相容的支架的方法以及體外生長三維的(3D)組織建造物的方法。在實施方案中，制造本公開內容的3D血管化的支架的方法包括提供三維的(3D)血管化的生物相容的支架，其中支架包括3D生物相容的支架材料和多個延伸貫穿支架的通道，其中通道形成允許液體通過支架的內腔。
[0106]在實施方案中，制造本公開內容的生物相容的支架和組織建造物的方法包括通過利用本公開內容的微通道建造物形成微通道，如上所述。在某些實施方案中，微通道通過利用建造物以將通道戳入支架材料中被形成，而在其他實施方案中，微通道建造物被插入用于形成支架材料的材料(比如凝膠基質材料或者凝膠基質材料與固體的多孔材料的組合)中，并且凝膠基質材料在微通道建造物周圍被固化或者膠凝。然后建造物被移除，留下通道在支架材料內。在實施方案中，方法還包括用內皮細胞播種內腔，使得內皮細胞在內腔的至少一部分形成內襯。制造本公開內容的3D血管化的組織建造物的實施方案還包括用至少一種組織類型的細胞播種支架。支架然后可以用包括感興趣的細胞的細胞培養基灌注(或者以其他方式接觸感興趣的細胞)以用感興趣的細胞播種支架材料。在實施方案中，播種了的支架材料被溫育并且所述至少一種組織類型的細胞的3D網絡在支架內生長。
[0107]生物反應器
[0108]本公開內容的3D血管化的組織建造物也適合于被包括在生物反應器中。用于容納本公開內容的組織建造物的生物反應器也包括在本公開內容的范圍中。在實施方案中，生物反應器被提供具有用于容納組織建造物的組織室和用于流體(例如培養基)的轉移的上游口和下游口以及用于控制培養液的流的任選的泵。本公開內容的生物反應器的實施方案的原理圖在圖2中被闡明。本公開內容的生物反應器可以被設計和/或調整用于組織建造物的各種實施方案。例如，生物反應器可以被調整用于盤狀的組織建造物，并且在其他實施方案中，生物反應器可以被調整用于大體矩形狀的組織建造物。在實施方案中，生物反應器還與成像設備比如共焦成像設備、熒光成像設備、相差成像設備或者可交換地與這些設備的任一種兼容。在實施方案中，生物反應器被配置為當組織建造物在生物反應器內時允許組織建造物成像。
[0109]本公開內容的代表性的生物反應器的實施方案在圖3中示出，其將在本文作為代表性的實施方案被更詳細的描述。生物反應器(10)包括用于容納具有多個微通道(13)的3D血管化的組織建造物(12)的組織室(11)。生物反應器還包括輸入區/室(14)，和輸出區/室(16)以及蓋(18)。輸入室以及輸出室包括口(20)。輸入室是組織室的上游并且包括輸入口(22)(比如但不限于用于引入新鮮介質團的輸入口(22A)和用于引入新鮮檢驗試劑的輸入口(22B))。并非所有的實施方案將包括此處說明和描述的每個口，因為在某些實施方案中，某些輸入口可以有助于輸入多種物品，同時某些輸出口還可以用于多種不同的輸出物。在實施方案中，生物反應器包括上游輸出口(24)。在實施方案中，輸出口(24A)提供用于從用于分析的建造物中提取流體的口。另一輸出口(24B)可以提供機會以沖洗流體，進行介質改變以及類似的。在實施方案中，生物反應器還包括用于灌注液從輸出室(16)離開的下游輸出口(28)。本公開內容的生物反應器還可以包括用于將連續的介質流輸入輸入室中的輸入(26)。在實施方案中，生物反應器還包括用于從組織建造物提取活檢樣品的活檢口(30)以及用于對其它設備或者系統比如另一生物反應器密封的任選的O型環(31)。在本公開內容的實施方案中，組織建造物充當輸入室和輸出室(14和16)之間的屏障，使得通過泵、注射器等等引入的介質的流流過建造物的微通道。
[0110]在本公開內容的生物反應器的實施方案中，生物反應器包括三維的(3D)工程化的組織建造物；被配置為容納組織建造物的組織室；以及控制穿過組織室的介質的流的至少一個微泵、注射泵或者蠕動泵，所述三維的(3D)工程化的組織建造物包括三維的生物相容的支架材料(如上所述)；在支架材料內的活細胞的三維網絡；以及多個通道，所述多個通道延伸貫穿建造物，使得通道的實質部分具有在建造物的一個表面處的入口以及在建造物的相對的表面處的出口 ；以及至少部分地在內腔形成內襯的多個內皮細胞，所述被配置為容納組織建造物的組織室使得組織建造物形成穿過室的介質的流上游和下游之間的屏障并導引介質的流穿過組織建造物的通道，其中所述室具有組織建造物的部位上游的至少一個輸入口以及組織建造物的部位下游的至少一個輸出口。
[0111]生物反應器網絡/陣列
[0112]如以上所討論的，本公開內容的生物反應器可以被調整為是互相連接的以創建生物反應器的陣列。在陣列中，不同的生物反應器可以支撐不同的組織類型的組織建造物，使得不同的組織類型可以在陣列中互相連接。這允許組織類型之間的細胞相互作用以及其它的相互作用的測試、檢驗、觀察、分析。其還允許人們監測被提議的治療劑或者其它的化合物如何對一種組織類型發揮影響并且可以如何對另一組織類型發揮不同的影響。此“即插即用”設計允許人們混合組織類型并且以更加精確地建模宿主系統的配置使組織類型互相連接。
[0113]在實施方案中，生物反應器網絡包括根據本公開內容的互相連接的生物反應器的陣列以及至少一個泵，所述至少一個泵控制穿過生物反應器的介質的流，使得陣列中的生物反應器互相流體連通。
[0114]篩選方法
[0115]本公開內容還包括利用本公開內容的3D血管化的組織建造物篩選測試化合物的方法。在實施方案中，組織建造物可以被用作患病組織和/或健康組織的模型以確定候選藥物、治療劑、生物試劑或者其他化合物對組織的效果。在實施方案中，篩選方法包括提供帶有支架材料內的感興趣的組織的活細胞的網絡的如上所述的三維的(3D)工程化的血管化的組織建造物；將3D組織建造物暴露于測試化合物；以及監測在暴露于測試化合物之后組織建造物中的任何變化，其中變化選自由以下組成的組:組織學變化、生物化學變化以及生理學變化或者其組合。建造物可以被用來不僅監測患病組織類型對潛在的候選藥物的響應并且監測健康組織對相同的化合物的反應以便測試毒性和/或不良影響。
[0116]在實施方案中，本公開內容的組織建造物可以被用來篩選潛在的乳腺癌治療化合物。化合物可以利用模擬人乳腺癌疾病(例如包括乳腺癌細胞和/或乳腺癌細胞與其它健康的人乳房細胞的組合)的組織建造物被篩選。在此實施方案中，將包括3D乳腺癌組織和/或其它患病的細胞或者健康的細胞的建造物與所測試化合物(例如潛在的乳腺癌治療齊U)接觸。方法包括在暴露于所測試化合物后檢測乳腺癌細胞網絡和/或健康的乳房細胞在生長或者生存能力上的變化。在實施方案中，乳腺癌細胞在生長或者生存能力上減少表明所測試的化合物是潛在的乳腺癌治療化合物。方法還可包括檢測乳腺癌治療化合物的毒性，如通過細胞網絡的組織學變化、生物化學變化、生理變化或者其組合所測量的。這些方法以及這些方法的改變形式可以被用來為對各種組織類型的影響篩選多種化合物，所述各種組織類型可以被生長在本公開內容的3D血管化的組織建造物中。
實施例
[0117]既然已經描述了本公開內容的實施方案，通常，實施例描述本公開內容的某些另外的實施方案。雖然本公開內容的實施方案結合實施例以及相應的文本和圖形被描述，并非意圖將本公開內容的實施方案限制于此描述。相反的，意圖是覆蓋包括在本公開內容的實施方案的精神和范圍內的所有的可選方案、變型以及等同物。
[0118]實施例1-具有凝膠基質支架的3D血管化的組織建造物
[0119]本實施例描述用于評價乳腺癌藥物治療的3D工程化的組織模型的創建。預料的是此平臺將顯著地減少與抗癌治療的監管審批有關的時間和成本，目前為數十億美元的努力。以3D形成的細胞/生物材料模型代表藥物開發中的新興的范例，新型的治療化合物在其中被迅速開發、賦予新的用途或者終止。然而，具有將提供氧氣和營養素給細胞至更大的體積的預制的血管網絡系統的3D模型之前未被開發。本公開內容的預血管化的3D工程化的組織建造物模擬人乳腺癌，提供將以代表體內的人的響應的方式響應抗癌治療性干預的該疾病的3D模型。
[0120]材料和方法:
[0121]所使用的兩種支架是細菌纖維素和纖維蛋白。通道通過微通道建造物(圖1)的使用被創建在每個生物材料中。支架材料通過借助于具有直徑為大約250微米的線/微棒的陣列的微通道建造物形成直徑為250 μ m或者更小的微通道被預血管化。對于細菌纖維素建造物，微通道建造物被插入支架材料-包括細菌纖維素的凝膠基質材料中。在微通道建造物的插入之后，細菌纖維素基質材料被固化(例如“膠凝”)。
[0122]在基質材料膠凝形成支架之后，微通道建造物被移除，留下穿過支架建造物的微通道的陣列。對于纖維蛋白凝膠建造物，微通道建造物在膠凝之后被戳入纖維蛋白凝膠的凝膠基質材料中；微通道建造物的移除留下穿過纖維蛋白凝膠支架建造物的微通道的陣列。
[0123]SEM被用來對通道成像(圖5)。細菌纖維素通道然后通過HUVEC灌注穿過生物反應器系統被內皮化。
[0124]結果:
[0125]SEM確證，微通道在引進微通道建造物之后被形成。圖5顯示在細菌纖維素凝膠支架材料中的微通道的SEM圖像。組織學以及H&E染色驗證，通道內襯有內皮細胞的融合性的層。成像還確證內皮細胞在由細菌纖維素支架材料(未顯示)做成的建造物中的微通道的內腔形成內襯。
[0126]結論:
[0127]細菌纖維素和纖維蛋白通過SEM圖像兩者都已被證明支撐通道制造。此外，H&E染色已表明細菌纖維素通道被內皮化來創建預血管化的支架以支撐其它細胞網絡比如成纖維細胞和乳腺癌細胞的生長。因此，細菌纖維素和纖維蛋白兩者代表用于模擬人乳腺癌環境的用于預血管化的3D共培養模型生物材料的建造的有前途的支架材料。
[0128]實施例2-具有具有凝膠基質支架的3D血管化的組織建造物的生物反應器
[0129]以上的實施例1描述在水凝膠生物材料內的預血管化的3D體積的成功的創建；本實施例描述在本公開內容的支架上的哺乳動物細胞的生長以及用于組織建造物的生長、保持以及觀察/分析的生物反應器的建造。
[0130]本實施例的組織建造物包括人乳腺癌細胞。兩種生物材料被選擇用于建造預血管化的支架來支撐乳腺癌細胞，所述兩種生物材料為:細菌纖維素和纖維蛋白凝膠。如以上實施例I中所述，這些材料用直徑小于約250 μ m的微通道被成功預血管化，并且這些微通道用血管內皮細胞播種，這表明微通道可以支撐融合性的血管內皮細胞層。本實施例進一步表明用乳腺癌細胞播種3D預血管化的組織建造物并且本公開內容的這些組織建造物可以被連續地灌注到流式生物反應器中。此實施例表明此建造物和生物反應器可以充當支撐乳腺癌上皮細胞、乳房成纖維細胞以及血管內皮細胞的可行的3D共培養的開發的基礎。
[0131]生物反應器設計
[0132]圖2是如在本實施例中所使用的在室內包括3D血管化的組織建造物的本公開內容的生物反應器的組織建造物室的示意圖。如圖3的原理圖中說明的以及如圖4A和4B的圖像中所示的圓柱形的流通式生物反應器是用聚碳酸酯建造的以便用培養基使微通道經受脈動流。生物反應器被設計以便預血管化的盤狀的生物材料可以被安裝到更大的盤狀座位中并且被放置在圓柱形的流通式室內部。生物材料以及座位代表上游流和下游流之間的隔離物，從而強迫介質穿過微通道的陣列。兩個蓋密封生物反應器并且能夠實現上游硅膠管路與泵連接并且下游管路充當對儲存器的返回。如以上實施例1中所述，細菌纖維素的微通道在250 μ m直徑的線的陣列周圍形成，而纖維蛋白的微通道通過在膠凝之后將陣列戳入支架中被形成。具有5_X5_X Imm的尺寸的不銹鋼板被用作微通道建造物基部。掃描電鏡術確證，細菌纖維素和纖維蛋白中的微通道在引進微通道建造物之后被形成。H&E染色也顯示細菌纖維素通道中的內皮細胞的融合性的層。然而，細菌纖維素通道在形狀上是不規則的并且具有不平坦的以及漏斗形狀的通道開口。人乳腺癌細胞(MDA-MB-231)以及人乳房成纖維細胞(HT1080)的多培養物被播種到纖維蛋白支架建造物中并且成功地在培養中生長并且維持持續2周。
[0133]3D微生理生物反應器
[0134]穿過每個預血管化的組織建造物生物反應器系統的介質流由可商購的高性能微泵提供。這些微泵適合于遞送精確的介質的流至每個組織室。微泵將用對組織類型特異性的介質灌注組織。穿過每個3D組織的全部的流被均勻分配穿過在組織內的每個圓柱形通道。流由Navier-Stokes方程支配，當慣性項對粘性項的比率(以Reynolds數Re為特征)變得可以忽略時(Re << I)，該方程在微流體系統中可以被簡化。這導致適用Stokes方程估算微通道壓力梯度:
[0135]O--Vp+u/2 u
[0136]其中P是壓力，U是流體速度，并且μ是介質的動態粘度。在圓柱形微通道的情況下，拋物線型的流形成并且對于切應力的關系可以通過Hagen-Poiseuille方程被描述:
r n
[0137]T =——γ-
Mr'
[0138]其中τ是在通道壁處的通道切應力中的介質的流體，Q是容積流率，r是通道的半徑并且μ是介質的動態粘度。為了估算微通道的壁處的切應力的目的，介質將被假設為是在壁處不具有滑的剛性壁邊界的單相牛頓的(Newtonian)。
[0139]微通道在如上所述的組織建造物內被鑄造并且組織利用微泵用介質被灌注。對于具有250微米直徑的微通道的20X20mm陣列(總數=400)的1mm直徑和3mm厚的HuB1gel建造物，如果每個微通道的直徑是0.250mm，那么總的橫截面積是400 (Jir2)=400 (μ j1.1252) = 20mm2。在微通道系統內包含的介質的總體積是約60mm3或者60微升。60微升每分鐘的平均容積流率(在來自蠕動泵的脈動流的情況下)在每個通道內產生大約8-10達因/cm2的壁切應力。
[0140]實施例3-具有多孔固體和凝膠基質組合支架的3D血管化的組織建造物
[0141]利用基質以提高細胞生長的細胞培養是眾所周知的(例如MatrigeUHuB1gel)。3D細胞培養是迅速前進的領域，其中例如腫瘤細胞可以被生長，更接近地表現在體內環境中發現的腫瘤微環境。此后者的事實已經導致用于多種藥物篩選實驗中的這些3D細胞培養物的增加的使用。然而，使用3D和/或matrigel方法的問題之一是以此種方式形成的球狀體可以形成壞死中心并且當其增長到可用的大小時可以收縮，這至少部分地歸因于缺乏對包括營養素、氧氣等等的介質的可及。
[0142]以上的實施例證明在更加生理的環境中形成支撐細胞網絡的生長的3D血管化的組織建造物的潛能。本實施例證明利用多種新型的材料充當支架用于多種細胞培養應用。這些材料和此技術的應用可以包括腫瘤細胞培養物以及共培養物的生長而不需要凝膠支撐或者結合凝膠支撐以提高結構完整性。此材料的使用還可以也支撐生理學上相關的微生理系統(例如藥物開發期間被用來代替動物的微型器官模型或者疾病模型(例如乳腺腫瘤模型))的生長并且作為產生潛在的合成血管的機制，所述潛在的合成血管為以穿過一種或者更多種這些材料的內皮化的微通道的形式。
[0143]在本實施例中所使用的支架材料包括從Southern Research?所獲得的多種氣凝膠以及具有各種孔徑的以網狀玻璃碳(RVC)(圖6)的形式的商購的材料。RVC，又名玻璃碳泡沫并且以商標名稱Ultrafoam?可得，其從Ultramet?, Pacoima, CA獲得。氣凝膠/溶膠凝膠(Solgels)根據如下方法被制得，其中玻璃微珠、氣凝膠或者納米纖維被涂覆兩親物并且在含水溶液中起泡沫。溶膠凝膠作為鎖定劑被加入以保持泡沫在原位。溶膠凝膠可以通過加熱至600攝氏度被熱移除。藻酸鹽或者明膠也可以被用作為鎖定劑。來自Southern Research?的在本實施例中所使用的氣凝膠具有甲醒/間苯二酹/兩親物(沒食子酸、乙酯)的特殊的化學組成(圖13A和13B)。氣凝膠可以根據以下出版物中所述的方法被制得(兩者都通過引用被并入本文):Pekala, R.W.等人，“Resorcinol-FormaldehydeAerogels and Their Carbonized Derivatives.，，1989.American Chemical SocietyDivis1n of Polymer Preprints.30:221-223 ;以及Pekala, R.W.等人,“Carbon Aerogelsfor Electrochemical Applicat1ns.”1998.Journal of Non-Crystalline Solids225:74-80 ο
[0144]實駘備件
[0145]培養基:具有10 % FBS和I % PSG的DMEM，板:12孔細胞培養群集板(Corning#3513)，細胞系:乳腺癌MDA-MB-231 (RFP穩定系)，細胞接種:250，000細胞/孔/2ml的培養基，溫育:37°C以及5%的CO2，培養基更換:每隔2_3天，在第8天將氣凝膠移動到新的板中。
[0146]圖7表示顆粒穩定的泡沫。并入到泡沫中的是3M的二氧化硅微氣泡。間苯二酚-甲醛被用作為基質來增強RVC泡沫。在此實施例中，泡沫用乳腺癌細胞溫育。
[0147]此外，這些建造物以對于組織病理學正常的方式成功地把這些材料分段，并且采用細胞以及組織功能的其他標準的細胞和分子評估方案是可能的。利用常規的H&E處理樣品證明，細胞已經設法滲入單個的孔并且保持存活一段時間。
[0148]在此實施例中制備的所有的支架支撐在37攝氏度的02/C02環境的適當的生理介質中的各種細胞類型的生存力。圖8-10是支撐生長在RVC 45孔/英寸(ppi)上的MDA-MB-231乳腺癌腫瘤細胞的生長的RVC泡沫的在不同的時期拍攝的圖像。圖12顯示在RVC 65ppi上生長的MDA-MB-231細胞。圖11代表顯示在平坦的基材上生長的MDA-MB-231細胞的圖像的對照。圖7顯示在以上所述的顆粒穩定的泡沫上生長的MDA-MB-231細胞。圖13A顯示在以上所述的氣凝膠支架材料上生長的MDA-MB-231細胞。
[0149]實施例4-對于RVC基支架的3D血管化的組織建造物的組織建造物和生物反應器
[0150]本實施例證明，細胞外基質支架已經發展到模擬天然的細胞外基質并且包括沿著預制的血管網絡(預血管化)的相關細胞類型(例如人乳腺癌上皮細胞和人乳腺成纖維細胞)的生長。這些系統是為了支撐長期的生長、重現生理組織功能并且精確地建立對治療的響應的模型。這些可以支撐可再生的組織體積的生長的3D血管化的組織建造物的使用將通過提供可靠的、成本有效的模型改觀乳腺癌藥物開發，所述可靠的、成本有效的模型可以比當前臨床前的體內和體外模型更加精確地預測治療效果。
[0151]實驗方法
[0152]灌注式生物反應器的設計
[0153]灌注式生物反應器的兩種版本曾被設計并且制造。第一，與12孔板版式相容的圓盤形(圖15A)。第二，適合于共焦成像的矩形體積(圖15B)。富含內皮細胞(EC)的介質用泵輸送穿過在閉合回路系統中的微通道。蠕動泵誘發非穩定流。注射泵被用于短期實驗的單向流。在兩種配置中，支架充當在上游流和下游流之間的分隔物，強迫介質流動穿過支架中的制造的微通道。
[0154]支架&微通道的制造
[0155]支架由玻璃碳(RVC)和膠原組成，測量為直徑1mmX高度3mm，或者由RVC、膠原和Matrigel組成，測量為寬度1mmX長度5mmX高度2.4mm。在膠凝之前，直徑400微米的不銹鋼棒被泡在25%的戊二醛中，風干，并且然后被縱長地注入到RVC泡沫孔中。對于RVC/膠原支架，1.5mg/ml膠原的溶液被注入到RVC孔中。對于RVC/膠原/Matrigel支架，包含10%的Matrigel的1.9mg/ml膠原的溶液通過使14.7% (v/v)的DMEM/10% FBS、1.9mg/ml 膠原、10% (v/v)的 1X 介質、10% (v/v)的 Matrigel 以及 0.524M 的碳酸氫鈉混合被組成。膠原/Matrigel溶液被注入到RVC孔中。
[0156]對于膠原/matrigel混合的支架的膠凝,將凍結的Matrigel和膠原在冰中解凍。細胞培養基和碳酸氫鈉也在冰上被保持寒冷。以下成分以規定的順序被混合在2ml的微量離心管中用于產生包含10% (v/v)Matrigel的1.9mg/ml濃度的膠原溶液,所述以下成分為:介質或者去離子水_137μ 1，膠原-633μ I (逐滴)，Matrigel-100l.! 1，10X介質的體積-100 μ I,碳酸氫鈉-30 μ I (逐滴)。試管被輕微地前后倒置直到顏色均勻。使用Iml的注射器，取出0.3ml的液體溶液。27Gauge針頭被添加至注射器的末端并且溶液被插入在適當位置具有微通道建造物的RVC樣品中，注意不要用液體觸動微通道建造物線。PDMS管/RVC/基質建造物被放置在有蓋培養皿中并且用parafilm包裹。真空被用來除去氣體并且通過允許真空降至4英寸汞柱來移除氣泡。樣品被移動至保溫箱持續45分鐘以允許Matrigel和膠原的膠凝。
[0157]在所有的支架膠凝之后，棒被輕輕地移除以形成微通道，所述微通道被顯示在圖14A和14B的圖像中。
[0158]生物反應器版本1-微通道內皮化
[0159]RVC/膠原支架被放置在生物反應器中。為了用內皮細胞靜止地播種所制造的微通道，2.44X 108的大鼠腦內皮細胞(RBEC)被培養并且被鋪在每個支架的頂部上。生物反應器被密封并且放入保溫箱(37°C，5% CO2)中持續30分鐘以用RBEC靜止地播種微通道。待發的試管(primed tubing)被連接至生物反應器、儲層以及蠕動泵，泵被發動，并且生物反應器被留在保溫箱(37°C，5% CO2)中過夜以用RBEC動態地播種微通道。然后，生物反應器被拆卸并且支架被福爾馬林固定、處理、固體石蠟包埋并且用切片機切片。切片被H&E染色。蘇木精將細胞核染成紫色并且曙紅將細胞質染成粉紅色。
[0160]生物反應器版本1-共培養生存能力
[0161]膠原/RVC支架如以前被制備，但DMEM/10% FBS介質包含7.5 X 16細胞/ml的人乳腺癌上皮細胞(MDA-MB-231)和2.5 X 16細胞/ml的人乳腺成纖維細胞(F080)的細胞懸液。此外，凝膠在12孔板的生物反應器而不是灌注式生物反應器中被膠凝。在保溫箱中45分鐘以允許膠凝之后，Iml的介質被放置在支架的頂部上。支架被留在保溫箱中持續3天并且然后其被切片并且被H&E染色。
[0162]生物反應器版本2-微通道內皮化
[0163]RVC/膠原/Matrigel支架被放置在48-孔板中。為了用內皮細胞靜止地播種已制造的微通道，富含RBEC的介質(16.1 X 16細胞/支架)被添加到容納支架的48-孔板中。這些支架被放置在保溫箱(37°C，5% CO2)中持續3天以允許微通道的靜止的播種。
[0164]結果&討論
[0165]H&E染色確證，RVC/膠原和RVC/膠原/Matrigel中的微通道在膠凝之前弓I入不銹鋼棒之后被形成，并且膠原和膠原/Matrigel兩者滲入RVC泡沫孔中。此外，H&E染色顯示在RVC/膠原微通道形成內襯的內皮細胞的單層。最后，H&E染色已顯示在膠原支架中的細胞(例如MDA-MB-231和R)80)的共培養物的存活。
[0166]圖14A-14D顯示本實施例的血管化的支架建造物的圖像。具有顯示滲透穿過4mm厚RVC/膠原支架的兩個400微米直徑的微通道的45ppi膠原/RVC支架(1.5mg/ml膠原/RVC)在圖14A中被顯示出。圖14B顯示具有穿過支架的三個400微米直徑的微通道的膠原/Matrigel/RVC 支架(1.9mg/ml 膠原/Matrigel/RVC, 45ppi)的圖像。圖 14C 是穿過膠原 /RVC/Matrigel支架材料的切片的圖像，所述膠原/RVC/Matrigel支架材料具有作為敞開的圓形區域可見的微通道以及作為黑色部分可見的RVC支架材料的部分。圖14D是穿過顯示單一的微通道的橫截面的凝膠材料的切片(20um)的圖像，所述微通道具有在微通道的內表面形成內襯的內皮細胞。
[0167]這些結果證明在流的條件下3D體積中制造的微通道的成功的內皮化。穿過這些3D建造物的流體容積流率以及在這些通道的壁處的流體切應力，特別是循環切應力還沒有被計算出。由于內皮，在血管壁形成內襯的內皮細胞的單層，暴露于脈動的血流的振蕩流體切應力和周圍的循環應變維持血管的生理狀態，模擬或者接近生物反應器中的這些應力有助于產生生理生物材料/細胞支架[5]。此外，氧氣、營養素、廢物以及候選治療劑的內皮運輸部分地取決于在內皮處被賦予的流體切應力。因此，這些微通道不僅提供用于流體介質、細胞培養、生長因子以及類似的導管，而且還希望其可以開發額外的毛細管功能比如從液體介質提取氧氣。
[0168]結論
[0169]預血管化的工程化的組織具有變革用于疾病組織或者受創傷的組織的組織替代的潛能[6]。除組織替代之外，預血管化的3D建造物還具有模擬多種疾病狀態用于藥物開發的潛能。
[0170]此實施例證明通過預血管化這些支架，超過氧氣的擴散距離的RVC/膠原和RVC/膠原/Matrigel的3D體積的成功的產生。在膠原的情況下，微通道被產生并且成功地在建造物內內皮化，并且細胞的共培養物被生長在血管化的建造物內。這些結果為被灌注的高度界定的3D組織體積創造條件，并且可以被用于利用原代人類細胞系或者從乳腺癌患者提取的細胞評價抗癌治療。未來的工作將包括RVC/膠原/Matrigel支架微通道的完全的內皮化、RVC/膠原/Matrigel支架中MDA-MB-231和R)80的生長、以及微通道的壁切應力的流體力學參數的定量。
[0171]關于包括以上實施例以及權利要求的本文的討論，應注意比率、濃度、量以及其它的數值數據可以以范圍格式在本文表示。要理解，為了方便和簡潔起見使用此種范圍格式，并且因此應以靈活的方式被解釋為不僅包括作為范圍的限值明確列舉的數值還包括包含在該范圍內的所有單個的數值或者子區間，如同每個數值和子區間被明確列舉。舉例說明，“約0.1%至約5% ”的濃度范圍應被解釋為不僅包括約0.1被％至約5被％的明確列舉的濃度，還包括在所列舉的范圍內的單個的濃度(例如1%、2%、3%和4% )以及子區間(例如0.5%U.1%>2.2%,3.3%以及4.4% )。術語“約”可以包括被修飾的數值的± I %、±2%、±3%、±4%、±5%、±6%、±7%、±8%、±9%、±10%或者更多。此外，短語“約 ‘X’ 至‘y’”包括“約‘X’至約?”。
[0172]應強調的是，以上所述的本公開內容的實施方案僅僅是實施方式的可能的實施例，并且僅為了本公開內容的原理的清楚的理解被闡述。很多變型以及修改可以對本公開內容的以上所述的實施方案進行，而大體不背離本公開內容的精神和原理。所有此類修改以及變型意圖于此被包括在本公開內容的范圍內并且通過以下權利要求被保護。
[0173]參考文獻
[0174]所有的參考文獻以相關部分被并入本文。
[0175]1.Birgersdotter A，Sandberg R，Ernberg 1:Gene express1n perturbat1n invitro—a growing case for three-dimens1nal(3D)culture systems, Semin CancerB1l 2005， 15:405-412.
[0176]2.“FDA Issues Advice to Make Earliest Stages of Clinical DrugDevelopment More Efficient.” FDA.Jan 2006.
[0177]<http://www.fda.gov/NewsEvents/Newsroom/PressAnnouncements/2006/ucml08576.htm>
[0178]3.“U.S.Breast Cancer Statistics.”BreastCancer.0rg.0ct 2012.〈http://www.breastcancer.0rg/symptoms/understand_bc/statistics).
[0179]4.Kim SSj Utsunomiya H，Koski JAj Wu BM，Cima MJj Sohn J，Mukai Kj GriffithLGj Vacanti JP:Survival and funct1n of hepatocytes on a novel three-dimens1nalsynthetic b1degradable polymer scaffold with an intrinsic network ofchannels, Ann Surg 1998,228:8-13.
[0180]5.Davies, P.F.1995.“Flow Mediated Endothelial Mechano-transduct1n.nPhys1logical Reviews.75:pp.519-51.
[0181]6.Wuj X.等人.2004.“Tissue Engineered Microvessels on 3D B1degradableScaffolds Using Human Endothelial Progenitor Cells.，’Am J Phys1l Heart CircPhys1l.287:pp.H480-7.
[0182]7.Pec，Martina等人.2010.“Reticulated Vitreous Carbon: A Useful MaterialFor Cell Adhes1n and Tissue Invas1n.^European Cells and Materials.20:282-94.
[0183]8.Pekalaj R.W.等人，“Resorcinol-Formaldehyde Aerogels and TheirCarbonized Derivatives.1989.American Chemical Society Divis1n of PolymerPreprints.30:221-223.
[0184]9.Pekalaj R.W..等人，“Carbon Aerogel s for ElectrochemicalApplicat1ns.，，1998.Journal of Non-Crystalline Solids 225:74-80.
【權利要求】
1.一種三維的(3D)工程化的血管化的組織建造物，所述三維的(3D)工程化的血管化的組織建造物包括: 3D生物相容的支架材料； 在所述支架材料內的活細胞的3D網絡； 多個微通道，所述多個微通道延伸貫穿所述建造物，使得所述通道的實質部分具有在所述建造物的一個表面處的入口以及在所述建造物的相對的表面處的出口，其中所述通道形成內腔以允許液體穿過所述建造物；以及 至少部分地在所述內腔形成內襯的多個內皮細胞。
2.根據權利要求1所述的3D血管化的組織建造物，其中所述3D生物相容的支架材料包括固體的多孔材料、凝膠基質材料或者其組合。
3.根據權利要求2所述的3D血管化的組織建造物，其中所述生物相容的支架材料包括凝膠基質材料并且還包括增加所述凝膠基質材料的結構穩定性的交聯劑、膠凝劑或者其組口 ο
4.根據權利要求1所述的3D血管化的組織建造物，其中所述凝膠基質材料選自由以下組成的凝膠基質材料的組:合成的水凝膠、自然衍生的水凝膠及其組合。
5.根據權利要求1所述的3D血管化的組織建造物，其中所述合成的水凝膠選自由以下組成的組:藻酸鹽、生物相容的聚合物水凝膠、生物相容的共聚物水凝膠、聚乙二醇(PEG)基水凝膠及其組合。
6.根據權利要求1所述的3D血管化的組織建造物，其中所述自然衍生的水凝膠選自由以下組成的組:膠原、纖維蛋白、彈性蛋白、角蛋白、Matrigel?、細菌纖維素、HuB1gel?及其組合。
7.根據權利要求1所述的3D血管化的組織建造物，其中所述固體的多孔材料選自由以下組成的組:氣凝膠、顆粒穩定的生物相容的泡沫、網狀玻璃碳(RVC)、天然靜電紡聚合物、合成的靜電紡聚合物及其組合。
8.根據權利要求1所述的3D血管化的組織建造物，其中所述生物相容的支架材料包括網狀玻璃碳以及選自由以下組成的組的凝膠基質材料:Matrigel?、細菌纖維素、膠原、纖維蛋白、彈性蛋白、角蛋白、HuB1gel及其組合。
9.根據權利要求8所述的3D血管化的組織建造物，其中所述生物相容的支架材料包括RVC、膠原與選自Matrigel?和HuB1gel的第二凝膠基質材料的組合。
10.根據權利要求1所述的3D血管化的組織建造物，其中所述組織建造物被配置為被放置在孔板的或者扁平的平行板的流動室中。
11.根據權利要求1所述的3D血管化的組織建造物，其中所述組織建造物被配置用于在共焦成像設備、熒光成像設備、相差成像設備、或者可交換地在這些設備的任何一個上放置。
12.根據權利要求1所述的3D血管化的組織建造物，其中所述微通道具有約200微米至約450微米的直徑。
13.根據權利要求1所述的3D血管化的組織建造物，其中所述微通道具有約250微米或者更少的直徑。
14.根據權利要求1所述的3D血管化的組織建造物，其中所述細胞包括哺乳動物細胞，其中所述細胞是病理性的或者健康的哺乳動物細胞或者其組合。
15.根據權利要求1所述的3D血管化的組織建造物，其中所述細胞包括癌細胞或者癌細胞與非癌細胞的組合。
16.根據權利要求15所述的3D血管化的組織建造物，其中所述非癌細胞包括成纖維細胞、上皮細胞、人組織細胞或者其組合。
17.根據權利要求15所述的3D血管化的組織建造物，其中所述細胞包括乳腺癌細胞，并且所述細胞的3D網絡形成乳腺癌腫瘤。
18.根據權利要求15所述的3D血管化的組織建造物，其中所述細胞包括乳腺癌細胞以及非癌乳房組織細胞，并且其中所述細胞的3D網絡形成乳腺癌腫瘤。
19.根據權利要求18所述的3D血管化的組織建造物，其中所述乳腺癌細胞包括人乳腺癌上皮細胞并且其中所述非癌乳房組織細胞包括人乳房成纖維細胞。
20.一種用于支撐體外3D組織培養物的三維的(3D)血管化的生物相容的支架，所述三維的(3D)血管化的生物相容的支架包括: 3D生物相容的支架材料，所述3D生物相容的支架材料包括固體的多孔材料、凝膠基質材料或者其組合，其中所述固體的多孔材料選自由以下組成的組:氣凝膠、網狀玻璃碳、顆粒穩定的泡沫及其組合，并且其中所述凝膠基質材料選自由以下組成的凝膠基質材料的組:合成的水凝膠、自然衍生的水凝膠及其組合；以及 多個通道，所述多個通道延伸貫穿所述支架，使得所述通道的實質部分具有在所述支架的一個表面處的入口以及在所述支架的相對的表面處的出口，其中所述通道形成內腔以允許液體通過所述支架。
21.根據權利要求20所述的3D血管化的生物相容的支架，還包括至少部分地在所述內腔形成內襯的多個內皮細胞。
22.根據權利要求20所述的3D血管化的生物相容的支架，其中所述凝膠基質材料包括選自由以下組成的組的一種或者更多種水凝膠:由以下組成的合成的以及自然衍生的水凝膠:膠原、纖維蛋白、Matrigel?、細菌纖維素、HuB1gel?、藻酸鹽、聚合物基水凝膠、共聚物基水凝膠、聚乙二醇(PEG)基水凝膠、彈性蛋白以及角蛋白。
23.根據權利要求20所述的3D血管化的生物相容的支架，其中所述固體的多孔材料選自由以下組成的組:氣凝膠、顆粒穩定的生物相容的泡沫、網狀玻璃碳(RVC)、天然靜電紡聚合物、合成的靜電紡聚合物及其組合。
24.根據權利要求20所述的3D血管化的生物相容的支架，其中所述微通道具有約200微米至約450微米的直徑。
25.—種三維的(3D)體外血管化的癌癥模型，所述三維的(3D)體外血管化的癌癥模型包括3D組織建造物，所述3D組織建造物包括以下: 生物相容的支架材料； 在所述支架材料內的活細胞的3D網絡，其中所述細胞的網絡包括所述支架材料內的癌細胞或者癌細胞與非癌細胞的組合； 多個通道，所述多個通道延伸貫穿所述建造物，使得所述通道的實質部分具有在所述建造物的一個表面處的入口以及在所述建造物的相對的表面處的出口，其中所述通道形成內腔以允許流體介質通過所述建造物；以及 至少部分地在所述內腔形成內襯的多個內皮細胞。
26.根據權利要求25所述的3D血管化的癌癥模型，其中所述模型是人乳腺癌模型并且其中所述活細胞的網絡包括人乳腺癌腫瘤細胞以及非癌的人乳房成纖維細胞。
27.根據權利要求26所述的3D血管化的癌癥模型，其中所述乳腺癌腫瘤細胞形成球狀體。
28.一種灌注式生物反應器，所述灌注式生物反應器包括: 三維的(3D)工程化的組織建造物，所述三維的(3D)工程化的組織建造物包括: 3D生物相容的支架材料； 在所述支架材料內的活細胞的3D網絡； 多個通道，所述多個通道延伸貫穿所述建造物，使得所述通道的實質部分具有在所述建造物的一個表面處的入口以及在所述建造物的相對的表面處的出口，其中所述通道形成內腔以允許流體介質通過所述建造物；以及 至少部分地在所述內腔形成內襯的多個內皮細胞； 組織室，所述組織室被配置為容納所述組織建造物，使得所述組織建造物形成穿過所述室的介質的流上游和下游之間的屏障，導引介質的流穿過所述組織建造物的所述通道，其中所述室具有所述組織建造物的部位上游的至少一個輸入口以及所述組織建造物的部位下游的至少一個輸出口 ；以及 控制穿過所述組織室的介質的流的至少一個泵。
29.根據權利要求28所述的灌注式生物反應器，其中所述至少一個泵選自由以下組成的組:微泵、注射泵、蠕動泵及其組合。
30.一種體外制造三維的(3D)血管化的組織建造物的方法，所述方法包括: 提供3D血管化的生物相容的支架，其中所述支架包括:3D生物相容的支架材料以及多個通道，所述多個通道延伸貫穿所述支架，使得所述通道的實質部分具有在所述支架的一個表面處的入口以及在所述支架的相對的表面處的出口，其中所述通道形成內腔以允許流體通過所述支架； 用內皮細胞播種所述內腔，使得內皮細胞在所述內腔的至少一部分形成內襯； 用至少一種組織類型的細胞播種所述支架； 用細胞培養基灌注所述支架；以及 溫育已經播種了的支架， 其中所述至少一種組織類型的細胞的3D網絡在所述支架內生長。
31.根據權利要求30所述的方法，其中所述3D生物相容的支架材料包括固體的多孔材料、凝膠基質材料或者其組合，其中所述固體的多孔材料選自由以下組成的組:氣凝膠、網狀玻璃碳以及顆粒穩定的泡沫，并且其中所述凝膠基質材料選自由以下組成的組:合成的水凝膠、自然衍生的水凝膠及其組合。
32.根據權利要求31所述的方法，其中所述凝膠基質材料包括一種或者更多種水凝膠，所述一種或者更多種水凝膠選自由以下組成的合成的以及自然衍生的水凝膠的組:膠原、纖維蛋白、Matrigel?、細菌纖維素、HuB1gel?、藻酸鹽、聚合物基水凝膠、共聚物基水凝膠、聚乙二醇(PEG)基水凝膠、彈性蛋白以及角蛋白。
33.根據權利要求30所述的方法，其中至少一種類型的細胞是癌細胞。
34.根據權利要求33所述的方法，其中所述細胞包括人乳腺癌腫瘤細胞或者人乳腺癌腫瘤細胞與人乳房成纖維細胞的組合。
35.一種制造三維的(3D)血管化的支架材料的方法，所述方法包括: 提供3D生物相容的支架材料；以及 使用微通道建造物在所述支架材料中形成多個微通道，其中所述通道延伸貫穿所述支架，使得所述通道的實質部分具有在所述支架的一個表面處的入口以及在所述支架的相對的表面處的出口，其中所述通道形成內腔以允許液體通過所述支架。
36.根據權利要求35所述的方法，其中所述微通道建造物包括用于形成所述通道的多個棒或者線。
37.根據權利要求36所述的方法，其中所述多個棒或者線具有約200微米至約400微米的單獨的直徑。
38.根據權利要求35所述的方法，其中所述3D生物相容的支架材料包括固體的多孔材料、凝膠基質材料或者其組合，其中所述固體的多孔材料選自由以下組成的組:氣凝膠、網狀玻璃碳以及顆粒穩定的泡沫，并且其中所述凝膠基質材料選自由以下組成的組:合成的水凝膠、自然衍生的水凝膠及其組合。
39.根據權利要求38所述的方法，其中所述凝膠基質材料包括一種或更多種水凝膠，所述一種或者更多種水凝膠選自合成的和自然衍生的水凝膠的組，所述合成的和自然衍生的水凝膠選自由以下組成的組:膠原、纖維蛋白、Matrigel?、細菌纖維素、HuB1gel?、藻酸鹽、聚合物基水凝膠、共聚物基水凝膠、聚乙二醇(PEG)基水凝膠、彈性蛋白以及角蛋白。
40.根據權利要求38所述的方法，其中所述生物相容的支架材料包括凝膠基質材料，并且其中所述微通道建造物在所述凝膠基質材料被固化前被插入到所述支架材料中并且在所述凝膠基質材料被固化后從所述支架材料移除。
41.一種篩選測試化合物的方法，所述方法包括: 提供三維的(3D)工程化的血管化的組織建造物，所述三維的(3D)工程化的血管化的組織建造物包括:3D生物相容的支架材料；在所述支架材料內的感興趣的組織的活細胞的3D網絡；多個微通道，所述多個微通道延伸貫穿所述建造物，使得所述通道的實質部分具有在所述建造物的一個表面處的入口以及在所述建造物的相對的表面處的出口，其中所述通道形成內腔以允許液體通過所述建造物；以及至少部分地在所述內腔形成內襯的多個內皮細胞； 使所述3D組織建造物暴露于所述測試化合物；以及 監測在暴露于所述測試化合物之后所述組織建造物中的任何變化，其中所述變化選自由以下組成的組:組織學變化、生物化學變化以及生理變化以及其組合。
42.根據權利要求41所述的方法，其中在所述活細胞的3D網絡內的所述細胞的至少一部分包括患病的細胞，并且其中所述測試化合物包括用于治療所述疾病的候選藥物。
43.一種篩選潛在的癌癥治療化合物的方法，所述方法包括: 提供三維的(3D)工程化的血管化的癌癥組織建造物，所述三維的(3D)工程化的血管化的癌癥組織建造物包括:3D生物相容的支架材料；在所述支架材料內的活細胞的3D網絡，所述活細胞的3D網絡包括癌細胞或者癌細胞與非癌細胞的組合；多個微通道，所述多個微通道延伸貫穿所述建造物，使得所述通道的實質部分具有在所述建造物的一個表面處的入口以及在所述建造物的相對的表面處的出口，其中所述通道形成內腔以允許液體通過所述建造物；以及至少部分地在所述內腔形成內襯的多個內皮細胞； 使所述3D癌癥組織建造物暴露于測試化合物；以及 檢測在暴露于所述測試化合物后所述癌細胞網絡的生長或者生存能力的變化，其中所述癌細胞的生長或者生存能力的減少表明所述測試化合物是潛在的乳腺癌治療化合物。
44.根據權利要求43所述的方法，還包括檢測所述癌癥治療化合物的毒性，所述癌癥治療化合物的毒性如通過細胞網絡的組織學變化、生物化學變化、生理學變化或者其組合來衡量的。
45.根據權利要求43所述的方法，其中所述癌細胞是乳腺癌細胞。
46.根據權利要求43所述的方法，其中所述細胞的網絡包括乳腺癌細胞和非癌乳房組織細胞。
47.一種生物反應器網絡，所述生物反應器網絡包括相互連接的生物反應器的陣列以及控制穿過所述生物反應器的介質的流的至少一個泵，其中所述陣列中的所述生物反應器是互相流體連通的，并且其中每個生物反應器包括: 三維的(3D)工程化的組織建造物，所述三維的(3D)工程化的組織建造物包括: 3D生物相容的支架材料， 在所述支架材料內的活細胞的3D網絡， 多個通道，所述多個通道延伸貫穿所述建造物，使得所述通道的實質部分具有在所述建造物的一個表面處的入口以及在所述建造物的相對的表面處的出口，其中所述通道形成內腔以允許流體介質通過所述建造物，以及 至少部分地在所述內腔形成內襯的多個內皮細胞；以及 組織室，所述組織室被配置為容納所述組織建造物，使得所述組織建造物形成穿過所述室的介質的流上游和下游之間的屏障，導引介質的流穿過所述組織建造物的所述通道，其中所述室具有所述組織建造物的部位上游的至少一個輸入口以及所述組織建造物的部位下游的至少一個輸出口 ；其中在所述陣列中的至少一個生物反應器包含來自與在所述陣列中的至少一個其他生物反應器中的細胞不同的組織類型的細胞。
【文檔編號】A61L27/56GK104271168SQ201380023363
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2013年3月6日 優先權日:2012年3月6日
【發明者】喬爾·L·貝利, 蒂莫西·M·威克, 喬安妮·墨菲-烏利奇, 安德魯·D·佩爾曼, A·W·凱恩 申請人:Uab研究基金會, 南方研究所