工程化的抗體-干擾素突變體融合分子的制作方法
【專利摘要】本發明領域涉及基因工程融合分子，制備所述融合分子的方法，及其在抗腫瘤免疫療法中的用途。更具體而言，本發明涉及融合分子構建體，其中為了殺傷腫瘤細胞或抑制其生長或增殖的目的，將腫瘤相關抗原（TAA）抗體（Ab）充當靶向部分以選擇性地遞送細胞因子至所述腫瘤細胞。在多個實施方案中，工程化的融合分子包含融合至干擾素-α(IFN-α)突變體分子的TAA Ab。本發明的工程化的Ab-IFN-α突變體融合分子相比于Ab-野生型IFN-α融合分子顯示改進的治療指數和保留的或增加的效力，和/或相比于Ab-野生型IFN-α融合分子顯示改進的PK特性。
【專利說明】工程化的抗體-干擾素突變體融合分子
[0001] 相關申請的奪叉引用 本申請要求于2012年3月3日提交的美國臨時申請號61/634, 565的優先權和權益， 其對于所有目的以其整體通過引用并入本文。
[0002] 政府支持聲明 本發明用美國政府支持根據基金號1R43CA162762-01A1，由National Institutes of Health資助完成。美國政府在本發明中具有某些權利。
【技術領域】
[0003] 本發明領域涉及基因工程融合分子，制備所述融合分子的方法，及其在抗腫瘤免 疫療法中的用途。
【背景技術】
[0004] 干擾素是重要的細胞因子，其對免疫應答具有多種作用（Theofilopoulos 等，Annu. Rev. Immunol.，23:307-336，2005)。干擾素包括1型干擾素（例如，干擾 素 -a (IFN- α )和干擾素-MIFN- β ))和2型干擾素(例如，干擾素 -Y (IFN- Y ))。所有 1型IFN由共同的受體（IFN-a R)識別，所述受體由兩個跨膜蛋白IFN-a Rl和IFN-a R2 構成。已知 IFN-a ' s 抑制血管發生（Sidky YA 和 EC Borden, Cancer Res., 47:5155, 1987)，介導樹突細胞的刺激和分化（Santini等，J Exp Med, 191:1777，2000)，并且對于 抗原特異性⑶8+ T細胞的體內增殖、擴展和長期存活是重要的（Tough DF等，Science， 272:1947，1996)。盡管首先描述了它們抑制病毒復制的能力，但IFN-α' s具有多種特 性，展示出抗增殖性作用，誘導凋亡（Rodriguez-Villanueva J和TJ McDonnell, Int J Cancer, 61:110，1995)和誘導腫瘤細胞中的腫瘤抑制基因 P53(Takaoka A等，Nature, 424:516，2003)。因此，IFN-α' s是用于治療多種癌癥的第一重組蛋白。
[0005] 不幸的是，使用IFN-a治療癌癥已受其半衰期短和伴隨的全身性毒性而受限 (Weiss K，Semin Oncol, 25:9，1998; Jones GJ和Itri LM, Cancer, 57:1709，2006)。 由于IFN-α的體內半衰期短，所以需要頻繁施用。藥代動力學（PK)研究已顯示僅0.01%的 皮下注射的 IFN-α 到達靶腫瘤部位（Suzuki K 等，Gene Ther.，10(9):765-773, 2003)。 與IFN-α療法相關的最常見的不利事件是流感樣癥狀、疲勞、厭食、中樞神經系統和精神 病反應，并且這些副作用中的一些可以變為劑量限制性的（Jones GJ和Itri LM，Cancer, 57:1709，2006)。由于這些限制，因此難以在惡性疾病部位實現有效的IFN-α濃度而不 引起全身性毒性。全身性IFN-a療法的限制已導致探尋安全且有效地向腫瘤附近遞送 IFN-α的替代策略。
【發明內容】
[0006] 在一方面，本發明提供新型基因工程腫瘤相關抗原（TAA)抗體（Ab)-干擾素 a (IFN-α)突變體分子。
[0007] 在一方面，本發明提供包含連接至IFN-α突變體分子的TAA Ab的基因工程融 合分子，其中所述抗體直接連接至所述IFN-α突變體分子，其中所述融合分子相比于TAA Ab-野生型（wt) IFN- α融合分子顯示出改進的PK特性。
[0008] 在一方面，本發明提供包含連接至IFN-α突變體分子的TAA Ab的基因工程融合 分子，其中所述抗體直接連接至所述IFN-α突變體分子，其中所述融合分子當與腫瘤細胞 接觸時導致殺傷所述腫瘤細胞或抑制其生長或增殖。
[0009] 在本發明的多個實施方案中，基因工程融合分子的干擾素 α突變體分子包含 突變的人IFN-α 2分子，其在SEQ ID NO: 13中包含至少一個突變，其中所述突變選自 H57Y, E58N. Q61S, H57S. E58S. H57A, E58A, Q61A, R149A. RΙ62Λ, D35E, EI65D,L2(? 夂 F27AJJ35A, AI45V ;及其組合。
[0010] 在多個實施方案中，融合分子包含TAA抗體，其選自抗-HER2/neu、抗-HER3、 抗-HER4、抗-CD4、抗-CD19、抗-CD20、抗-CD22、抗-CD25、抗-CD33、抗-CD138、抗-CD200、 抗-CD276、抗-CXCR3、抗-CXCR5、抗-CCR3、抗-CCR4、抗-CCR9、抗-CRTH2、抗-PMCH 和抗-內 質蛋白抗體。
[0011] 在一個實施方案中，融合分子包含抗-HER2/neu抗體和在SEQ ID NO: 13中含有 突變F27A的突變的人IFN- α 2分子。
[0012] 在一個實施方案中，融合分子包含抗-⑶20抗體和在SEQ ID NO: 13中含有突變 F27A的突變的人IFN- α 2分子。
[0013] 在一個實施方案中，融合分子包含抗-⑶138抗體和在SEQ ID NO: 13中含有突變 F27A的突變的人IFN- α 2分子。
[0014] 在一個實施方案中，融合分子包含抗-內質蛋白抗體和在SEQ ID NO: 13中含有 突變F27A的突變的人IFN- α 2分子。
[0015] 在一個實施方案中，融合分子包含抗-⑶33抗體和在SEQ ID NO: 13中含有突變 F27A的突變的人IFN- α 2分子。
[0016] 在一個實施方案中，融合分子包含抗-⑶276抗體和在SEQ ID NO: 13中含有突變 F27A的突變的人IFN- α 2分子。
[0017] 在一個實施方案中，融合分子包含抗_HER2/neu抗體和在SEQ ID NO: 13中含有 兩個突變R149A和R162A的突變的人IFN- α 2分子。
[0018] 在一個實施方案中，融合分子包含抗-⑶20抗體和在SEQ ID NO: 13中含有兩個 突變R149A和R162A的突變的人IFN- α 2分子。
[0019] 在一個實施方案中，融合分子包含抗-⑶138抗體和在SEQ ID NO: 13中含有兩個 突變R149A和R162A的突變的人IFN- α 2分子。
[0020] 在一個實施方案中，融合分子包含抗-內質蛋白抗體和在SEQ ID NO: 13中含有 兩個突變R149A和R162A的突變的人IFN- α 2分子。
[0021] 在一個實施方案中，融合分子包含抗-⑶33抗體和在SEQ ID NO: 13中含有兩個 突變R149A和R162A的突變的人IFN- α 2分子。
[0022] 在一個實施方案中，融合分子包含抗-⑶276抗體和在SEQ ID NO: 13中含有兩個 突變R149A和R162A的突變的人IFN- α 2分子。
[0023] 在另一個實施方案中，融合分子包含抗體，其選自完全人抗體、人源化抗體、嵌 合抗體、單克隆抗體、多克隆抗體、重組抗體、抗原結合抗體片段、Fab、Fab'、Fab2、Fab'2、 IgG、IgM、IgA、IgE、scFv、dsFv、dAb、納米抗體（nanobody)、單抗體（unibody)、和雙價抗體 (diabody)〇
[0024] 本發明的另一方面涉及藥物組合物和制備所述藥物組合物的方法，其中所述組合 物在藥學上可接受的載體中包含本發明的基因工程融合分子作為活性成分。
[0025] 本發明的另一方面涉及治療患者中的腫瘤或腫瘤轉移的方法，其包括向所述患者 施用治療有效量(作為單一療法或作為聯合治療方案的部分）的在藥學上可接受的載體中 的本發明的基因工程融合分子，其中所述施用促進腫瘤消退和/或腫瘤死亡。
[0026] 本發明的另一方面涉及本發明的基因工程融合體制備用于治療有需要的患者中 的腫瘤或腫瘤轉移的藥物的用途。
[0027] 本發明的其他方面涉及編碼本發明的基因工程融合分子的核酸；包含編碼本發 明的融合分子的核酸分子，任選地，其可操作地連接至被載體轉化的宿主細胞識別的控制 序列上；宿主細胞,其包含含有編碼本發明的融合分子的核酸分子的載體；產生本發明的 融合分子的方法，其包括培養包含含有編碼本發明的融合分子的核酸分子的載體的宿主細 胞，使得所述核酸表達，并且任選地，從宿主細胞培養基中回收融合分子。在多個實施方案 中，核酸編碼包含連接至干擾素突變體分子的腫瘤相關抗原抗體的融合分子。在多個實施 方案中，核酸編碼將抗體連接至干擾素突變體分子的肽接頭(例如，如本文所述的)。
[0028] 附圖簡沭 圖1描繪了一種提出的本發明的基因工程融合分子的設計。在圖1中，標識為VH、 Q、CH1、CH2和CH3的橢圓形代表如本文定義的全長抗體(Ab)。標識為C的橢圓形代表細胞因 子，例如IFN-α突變體。接頭由扭曲的線表示。如圖1中所示，C經接頭在兩個C h3位點處 連接至Ab。在一個可選的實施方案中，C經接頭在兩個'位點處連接至Ab。在仍另一個可 選的實施方案中，C經接頭在兩個V h位點處連接至Ab。在仍另一個可選方案中，C經接頭 在內部位點而非在Ch3、'或V h位點處連接至Ab。
[0029] 圖2描繪了另一種提出的本發明的基因工程融合分子的設計。在圖3中，標識為 '、VH、Q、CH、Chi和Ch2的橢圓形代表如本文定義的Fab 2。橢圓形標識C代表細胞因子。接 頭由扭曲的線表示。如圖3中所示，C經接頭在兩個Ch2位點處連接至Fab2。在一個可選的 實施方案中，C經接頭在兩個 '位點而非Ch2位點處連接至Fab 2。在仍另一個可選方案中，C 經接頭在兩個Vh位點而非兩個V 兩個C H2位點處連接至Fab 2。在仍另一個可選方案中， C經接頭在內部位點而非在Ch2、'或V H位點處連接至Fab 2。
[0030] 圖3描繪了另一種提出的本發明的基因工程融合分子的設計。在圖4中，標識為 '、VH、(^和C hi的橢圓形代表如本文定義的Fab。橢圓形標識C代表細胞因子。接頭由扭曲 的線表示。如圖3中所示，C經接頭在C m位點處連接至Fab。在一個可選的實施方案中，C 經接頭在'位點而非Chi處連接至Fab。在仍另一個可選方案中，C經接頭在Vdi點而非 '或Chi位點處連接至Fab。在仍另一個可選方案中，C經接頭在內部位點而非在C H1、'或 Vh位點處連接至Fab。
[0031] 序列表 列于所附的序列表中的氨基酸序列使用氨基酸的標準三字母編碼顯示，如在37 ^.1?.1.822中定義的。
[0032] SEQ ID NO: 1為抗-Her2/neu抗體的重鏈的氨基酸序列，其中氨基酸殘基1-19代 表信號肽。SEQ ID N0:2為編碼抗-Her2/neu抗體的輕鏈的氨基酸序列，其中氨基酸殘基 1-19代表信號肽。
[0033] SEQ ID NO:3為抗-⑶20抗體的重鏈的氨基酸序列，其中氨基酸殘基1-19代表信 號肽。SEQ ID N0:3為編碼抗-CD20抗體的輕鏈的氨基酸序列，其中氨基酸殘基1-19代表 信號肽。
[0034] SEQ ID N0:5為抗-⑶138抗體的重鏈的氨基酸序列，其中氨基酸殘基1-19代表信 號肽。SEQ ID N0:6為編碼抗-CD138抗體的輕鏈的氨基酸序列，其中氨基酸殘基1-22代表 信號肽。
[0035] SEQ ID NO:7為抗-內質蛋白抗體的重鏈的氨基酸序列，其中氨基酸殘基1-19代 表信號肽。SEQ ID N0:8為編碼抗-內質蛋白抗體的輕鏈的氨基酸序列，其中氨基酸殘基 1-20代表信號肽。
[0036] SEQ ID N0:9為抗-⑶33抗體的重鏈的氨基酸序列，其中氨基酸殘基1-19代表信 號肽。SEQ ID N0:10為編碼抗-CD33抗體的輕鏈的氨基酸序列，其中氨基酸殘基1-20代表 信號肽。
[0037] SEQ ID NO: 11為抗-⑶276抗體的重鏈可變區的氨基酸序列，其中氨基酸殘基 1-19代表信號肽。SEQ ID NO: 12為編碼抗-CD276抗體的輕鏈可變區的氨基酸序列，其中 氨基酸殘基1-20代表信號肽。
[0038] SEQ ID NO: 13為人野生型IFN- α 2分子的氨基酸序列。
[0039] SEQ ID NO: 14為肽接頭的氨基酸序列。
[0040] SEQ ID NO: 15為肽接頭的氨基酸序列。
[0041] 講行本發明的方式 美國專利號8, 258, 263 (Morrison等）證實祀向的野生型（wt) IFN-α可以比非祀向的 wtIFN-α具有高得多的治療指數，使得以有效劑量施用它成為可能。具體而言，Morrison 等證實相比于非融合的wtIFN-a，多種腫瘤相關抗原Ab-wtIFN-a嵌合構建體顯示出顯著 改進的治療效力（更有效?100倍)，并具有全身性毒性的明顯降低。
[0042] 在本發明的多個實施方案中，制備包含經接頭連接至IFN-a突變體分子的腫瘤 相關抗原抗體的基因工程融合分子用于利用所述抗體將IFN-a突變體分子靶向腫瘤分子 的特異性的目的。
[0043] 用于制備本發明的融合分子的IFN-a突變體分子對IFNa R復合體具有不同的親 和力。本發明人評價了 IFNa R親和力和體外治療指數之間的關系，和融合蛋白體內的抗腫 瘤效力，并鑒定了相比于Ab-wtIFN-a融合分子顯示出改進的治療指數、和保持的或改進 的體內效力的Ab-IFN-a突變體融合分子。本發明人還鑒定了相比于Ab-wtIFN-a融合分 子顯示出改進的PK特性的Ab-IFN-a突變體融合分子。治療指數定義為：Ab-IFNa突變體 融合分子對表達由Ab識別的抗原且表達IFNa R的細胞("靶向的"）的EC5J余以Ab-IFNa 突變體融合分子對僅表達IFNa R的細胞("非靶向的"）的EC5tl。效力定義為融合分子殺傷 表達抗原(所述融合分子的Ab部分與其結合）的癌細胞的效能。
[0044] 用于鑒定此類Ab-IFN-a突變體融合分子的方法如下：1)制備IFN-a突變體；2) 制備結合腫瘤相關抗原的抗體；3)經化學綴合或經接頭的直接連接構建包含IFN-a突變 體和來自步驟1)和2)的抗體的幾個Ab-IFN-α突變體融合分子；4)以不同劑量在幾種體 外功能測定中系統地檢測得到的化學綴合物或融合分子，以鑒定具有改進的治療指數的那 些；和5)進行使用顯示出最佳治療指數的化學綴合物或融合分子的體內研究來測定治療 體內腫瘤的效力。具體與步驟4)相關，使用體外功能測定來測定：a)融合分子在非靶向細 胞上結合IFN-a R復合體的能力；b)融合分子結合表達IFN-a R復合體和由Ab靶向的抗 原的細胞的能力；c)融合分子結合FcRn受體的能力；d)融合分子對非祀向細胞的IFN-α 生物活性；e)融合分子對靶向細胞的抗增殖活性；和f)融合分子誘導凋亡的能力。具體與 步驟5)相關，使用體內測定來：a)確定給定的融合體治療腫瘤的效力；和b)確定給定的融 合分子的改進的PK特性。
[0045] 定義 除非本文另有定義，否則在本發明上下文中使用的科技術語均具有本領域普通技術人 員通常理解的含義。此外，除非上下文另外需要，否則單數術語也應該包括復數形式并且復 數術語也應該包括單數形式。通常，本文描述的與細胞和組織培養、分子生物學、免疫學、微 生物學、遺傳學和蛋白和核酸化學和雜交相關使用的命名法及其技術是眾所周知的且本領 域中通常使用的。本發明的方法和技術通常根據本領域中眾所周知的和如描述于多個一般 性的和在整個本說明書中引用并討論的更具體的參考文獻中的常規方法進行，除非另有說 明。參見，例如 Sambrook 等 Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第 2 版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)和 Ausubel 等， Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), 和 Harlow 和 Lane Antibodies:A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990)，其通過引用并入本文。酶反應和純化技術根據 制造商說明書進行，如同本領域中通常進行的或如本文所描述的。本文描述的與分析化學、 合成有機化學、和醫學和藥物化學相關使用的術語學和實驗室程序及技術是眾所周知的且 在本領域中經常使用。標準技術可以用于化學合成、化學分析、藥物制備、組合物、和遞送、 及患者的治療。
[0046] 術語"多肽"、"肽"和"蛋白"本文中可以互換使用來指氨基酸殘基的聚合物。優 選的"肽"、"多肽"和"蛋白"為氨基酸的鏈，其α碳經肽鍵連接。因此在鏈的一端(氨基末 端）的末端氨基酸具有游離的氨基，而在碳的另一端(羧基末端）的末端氨基酸具有游離的 羧基。如本文所用，術語"氨基末端"（縮寫為N-末端）指在肽的氨基末端處的氨基酸上的 游離α-氨基或在肽內任何其他位置處的氨基酸的α-氨基(當參與肽鍵時為亞氨基)。類 似地，術語"羧基末端"指肽的羧基末端上的游離羧基或在肽內任何其他位置處的氨基酸的 羧基。肽還包括基本上任何聚氨基酸，包括但不限于肽模擬物，諸如相對于酰胺鍵由醚連接 的氨基酸。
[0047] 如本文所用的術語"多肽片段"指相比于對應的全長蛋白具有氨基末端和/或羧 基末端缺失的多肽。例如，片段長度可以為至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、50、70、 80、90、100、150或200個氨基酸。例如，片段長度還可以為至多1000、750、500、250、200、 175、150、125、100、90、80、70、60、50、40、30、20、15、14、13、12、11 或 10 個氨基酸。片段可以 進一步在其任一端或兩端包含一個或多個另外的氨基酸，例如，來自不同的天然存在蛋白 (例如，Fc或亮氨酸拉鏈結構域）或人工氨基酸序列(例如，人工接頭序列）的氨基酸序列。
[0048] 本發明的多肽包括這樣的多肽，其已經以任何方式和任何原因進行修飾例如來： (1)降低對蛋白水解的易感性，（2)降低對氧化的易感性，（3)改變對形成的蛋白復合體的 結合親和力，（4)改變結合親和力，和（5)賦予或修飾其他物理化學或功能特性。例如，單 個或多個氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代）可以在天然存在的序列中（例如，在形成分子 間接觸的結構域外部的多肽的部分中）進行。"保守的氨基酸取代"是基本上不會改變親本 序列（parent sequence)的結構特性的氨基酸取代(例如，取代氨基酸應該趨于不打破在 親本序列中形成的螺旋，或不破壞為親本序列的特征的或對其功能性是必需的其他類型的 二級結構)。本領域技術公認的多肽二級和三級結構的實例描述于Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton,編輯，ff. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden 和 J. Tooze,編 輯，Garland Publishing, New York, N.Y. (1991));和 Thornton 等（1991) Nature 354:105)。
[0049] 多肽的"變體"包含這樣的氨基酸序列，其中相對于另一個多肽序列，一個或多個 氨基酸殘基被插入到氨基酸序列中，從其中缺失和/或取代入其中。本發明的變體包括融 合蛋白。
[0050] 多肽的"衍生物"為已經化學修飾的例如綴合至另一化學部分諸如例如聚乙二醇、 白蛋白（例如人血清白蛋白）、磷酸化和糖基化的多肽。
[0051] 術語"分離的分子"（其中所述分子例如為多肽、多核苷酸、或抗體)為這樣的分子， 由于其起源或衍生的來源，所述分子（1)不和在其天然狀態中伴隨它的天然相關組分在一 起，（2)基本上不含來自相同物種的其他分子（3)由來自不同物種的細胞表達，或（4)天然 中不存在。因此，化學合成的分子、或在與從中它天然產生的細胞不同的細胞系統中表達的 分子，將是從其天然相關組分中"分離的"。分子還可以使用本領域中熟知的純化技術通過 分離使得基本上不含天然相關組分。分子純度或同質性可以通過多種本領域中熟知的方法 測定。例如，多肽樣品的純度可以使用本領域中熟知的技術用聚丙烯酰胺凝膠電泳和凝膠 染色以顯色多肽來測定。對于某些目的，更高的分辨率可以通過使用HPLC或本領域中熟知 的用于純化的其他方法來提供。
[0052] 如本文所用，"抗體"指包含一種或多種多肽的蛋白，所述多肽基本上或部分地由 免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因的片段所編碼并具有對腫瘤抗原的特異性或對在病理 狀態中過表達的分子的特異性。公認的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、 Υ、δ、ε、和μ恒 定區基因，以及這些基因的亞型和眾多的免疫球蛋白可變區基因。將輕鏈分為κ或λ。將 重鏈分為Y、μ、a、S或ε，其繼而分別確定免疫球蛋白類別IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。 典型的免疫球蛋白（例如抗體）結構單元包含四聚體。每一四聚體由相同的兩對多肽鏈構 成，每一對具有一條"輕"鏈(約25 kD)和一條"重"鏈(約50-70 kD)。每一鏈的N-末端確 定主要負責抗原識別的約100-110或更多個氨基酸的可變區。術語可變輕鏈（VJ和可變 重鏈（V h)分別指這些輕鏈和重鏈。
[0053] 在全長抗體中，每一重鏈由重鏈可變區(本文縮寫為HCVR或Vh)和重鏈恒定區構 成。重鏈恒定區由三個結構域C H1、CH2和Ch3 (并在某些情況下為CH4)構成。每一輕鏈由輕鏈 可變區(本文縮寫為')和輕鏈恒定區構成。輕鏈恒定區由一個結構域Q構成。區 可以進一步細分為稱為互補性決定區域（CDR)的高變的區域，其散布于由稱為框架區（FR) 的更保守的區域。每一 ％和八由三個CDR和四個FR構成，從氨基端向羧基端按以下順序 排列：FR1,⑶札、FR2、CDR2、FR3、CDR 3、FR4。框架區和CDR的范圍已經確定(參見，Kabat等， Sequences of Proteins of Immunological Interest, U. S. Department of Health and Human Services, 1991，其通過參考并入本文XKabat數據庫目前在線維護，并且⑶R序列 可以被確定，例如，參見頂GT/V-QUEST程序版本：3.2. 18.，2011年3月29日，在互聯網 上可得和 fcochet, X.等，Nucl. Acids Res.，36:503-508，2008)。不同輕鏈和重鏈的 框架區的序列在物種內例如人中是相對保守的。抗體的框架區(其為組成的輕鏈和重鏈的 組合的框架區)在三維空間中提供位置并排列CDR。免疫球蛋白分子可以為任何類型(例如 IgG、IgE、IgM、IgD、IgA 和 IgY)、類別（例如，IgGl、IgG2、IgG 3、IgG4、IgAl 和 IgA2)或亞 類。
[0054] ⑶R主要負責結合至抗原的表位上。每一鏈的⑶R通常稱為⑶R1、⑶R2、⑶R 3，從 N-末端順序編號，并且還通常由具體的⑶R位于其中的鏈所確定。因此，Vh⑶馬位于其中 發現它的抗體的重鏈的可變域中，而\ CDR1為來自其中發現它的抗體的輕鏈的可變域中的 CDR1。具有不同特異性（即對不同的抗原的不同的組合位點）的抗體具有不同的CDR。盡管 是CDR使得抗體與抗體有所不同，但在CDR中僅為有限數目的氨基酸位置直接參與抗原結 合。⑶R內的這些位置被稱為特異性決定殘基（SDR)。
[0055] 術語"Fc區"用于定義免疫球蛋白重鏈的C-末端區域，其可以通過完整抗體的木 瓜蛋白酶消化來產生。Fc區可以是天然序列Fc區或變體Fc區。免疫球蛋白的Fc區通常 包含兩個恒定區，C h2結構域和C H3結構域，并任選包含C H4結構域。抗體的Fc部分介導幾種 重要的效應子功能，例如細胞因子誘導、ADCC吞噬作用、補體依賴性細胞毒性（⑶C)和抗體 和抗原-抗體復合體的半衰期/清除速率(例如，新生FcR (FcRn)在酸性pH下在內體中結 合IgG的Fc區，并保護IgG免于降解，由此促成IgG的長的血清半衰期)。在Fc部分中替 換氨基酸殘基以改變抗體的效應子功能是本領域中已知的(例如參見Winter等，美國專利 號 5, 648, 260 和 5, 624, 821)。
[0056] 抗體作為完整的免疫球蛋白或作為許多良好表征的片段而存在。此類片段包括 ?813片段，？313'片段、？313 2、？(313)'2片段、單鏈？￥蛋白（"8〇?￥"）和二硫化物穩定的？￥蛋 白（"dsFv")，其結合靶抗原。scFv蛋白為這樣的融合蛋白，其中免疫球蛋白的輕鏈可變區 和免疫球蛋白的重鏈可變區通過接頭連接，而在dsFv中，將鏈突變以引入二硫鍵來穩定鏈 的結合。盡管多種抗體片段以消化完整片段的方式確定，但技術人員將理解此類片段可以 化學地或利用重組DNA方法重新合成。因此，術語抗體如本文所用還包括通過修飾完整抗 體產生的或使用重組DNA方法重新合成的抗體片段，包括但不限于Fab、Fab'、Fab 2、Fab' 2、 IgG、IgM、IgA、IgE、scFv、dsFv、dAb、納米抗體、單抗體、和雙價抗體。在多種實施方案中，抗 體包括但不限于Fab 2、IgG、IgM、IgA、IgE和單鏈Fv (scFv)抗體，其中可變重鏈和可變輕 鏈連接在一起(直接或經過肽接頭）以形成連續多肽。
[0057] 雙價抗體為二價抗體，其包含兩條多肽鏈，其中每一多肽鏈包含由接頭連接的Vh 和'區，所述接頭非常短使得在同一鏈上的兩個區域之間無法配對，因此允許每一區與 另一多肽鏈上的互補區配對(例如，參見Holliger等，1993，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-48 (1993)，和 Poljak 等，Structure 2:1121-23 (1994))。如果雙價抗體的兩 條多肽鏈是相同的，則由它們的配對產生的雙價抗體將具有兩個相同的抗原結合位點。具 有不同序列的多肽鏈可以用于產生具有兩個不同抗原結合位點的雙價抗體。類似地，三價 抗體（tribodies)和四價抗體（tetrabodies)是分別包含三條和四條多肽鏈的抗體，并且 分別形成三個和四個抗原結合位點，其可以是相同的或不同的。
[0058] 在某些實施方案中，在本發明的構建體中使用的抗體和抗體片段可以是雙特異性 的。雙特異性抗體或片段可以具有幾種構型。例如，雙特異性抗體可以類似單一抗體(或 抗體片段）但具有兩個不同的抗原結合位點（可變區)。在多個實施方案中，雙特性抗體可 以通過化學技術（Kranz 等，Proc.Natl.Acad.Sci·，USA, 78:5807，1981)、通過"多瘤 (polydoma) "技術（例如，參見美國專利號4, 474, 893)、或通過重組DNA技術產生。在某些 實施方案中，本發明的雙特異性抗體可以具有對至少兩種不同表位(其中至少一種為腫瘤 相關抗原)具有結合特異性。在多個實施方案中，抗體和片段還可以為異種抗體。異種抗體 是連接在一起的兩種或多種抗體、或抗體結合片段(例如Fab)，每一抗體或片段具有不同的 特異性。
[0059] 如本文所用的術語"單克隆抗體"指獲自基本上同質性抗體的群（即包含群的各個 抗體除了可能的可以以少量存在的天然發生突變外均是相同的）的抗體。單克隆抗體是高 度特異的，針對單一抗原。此外，與多克隆抗體制劑(其一般包括針對不同決定簇(表位）的 不同抗體）不同，每一單克隆抗體針對抗原上的單一決定簇。修飾語"單克隆"不應解釋為 需要通過任何特定的方法產生抗體。
[0060] 如本文所用的術語"嵌合抗體"指這樣的抗體，其具有來自一種物種諸如人的框架 殘基，和來自另一物種諸如特異性結合靶向的抗原的鼠抗體的CDR(其通常賦予抗原結合)。
[0061] 如本文所用，術語"人抗體"旨在包括具有源于人種系免疫球蛋白序列的可變區和 恒定區的抗體。本發明的人抗體可以包括例如在CDRs中并具體在CDR 3中不由人種系免疫 球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(例如，通過體外隨機或位點定向誘變或通過體內體細胞突 變引入突變)。然而，如本文所用，術語"人抗體"并不旨在包括這樣的抗體，其中來源于另 一哺乳動物物種諸如小鼠的種系的CDR序列已經連接至人框架序列上。
[0062] 如本文所用的術語"人源化抗體"指包含人源化輕鏈和人源化重鏈免疫球蛋白的 抗體。人源化抗體結合與提供CDR的供體抗體結合的相同抗原。人源化免疫球蛋白或抗體 的受體框架可以具有由取自供體框架的氨基酸的有限數目的取代。人源化或其他單克隆 抗體可以具有另外的保守的氨基酸取代，其對抗原結合或其他免疫球蛋白功能基本上無影 響。人源化的免疫球蛋白可以通過基因工程來構建(例如參見美國專利號5, 585, 089)。
[0063] 如本文所用，術語"重組人抗體"旨在包括通過重組方法制備、表達、產生或分離的 所有的人抗體，諸如使用轉染入宿主細胞內的重組表達載體表達的抗體；從重組、組合的人 抗體文庫分離的抗體；從其為人免疫球蛋白基因轉基因的動物分離的抗體；或通過涉及人 免疫球蛋白基因序列剪切為其他DNA序列的任何其他方法制備、表達、產生或分離的抗體。 此類重組人抗體具有源于人種系免疫球蛋白序列的可變區和恒定區。在某些實施方案中， 然而，將此類重組人抗體進行體外誘變(或者，當使用對人Ig序列轉基因的動物時，為體內 體細胞誘變)，并因此該重組抗體的％和^區域的氨基酸序列是這樣的序列，盡管來源于人 種系％和列或與其相關，但其并不天然存在于在體內人抗體種系所有組成成分中。所 有此類重組方法對于本領域普通技術人員是熟知的。
[0064] 如果包括抗體的抗原結合蛋白以高結合親和力如測定為至少I X KT6 M、或至少1 X 10_7 Μ、或至少I X 10_8 Μ、或至少I X 10_9 Μ、或至少I X 10_1Q Μ、或至少I X 10_n M的 離解常數（Kd，或對應的Kb，如下文定義的）值結合抗原，則它"特異性地結合"抗原。特異 性結合目的人抗原的抗原結合蛋白還可以能夠以相同或不同的親和力結合來自其他物種 的相同的目的抗原。
[0065] "表位"是由抗原結合蛋白（例如由抗體）結合的分子的部分。表位可以包含分子 的非連續的部分(例如，在多肽中，在多肽的一級序列中不連續的但在所述多肽的三級或四 級結構的情況下彼此足夠靠近使得被抗原結合蛋白所結合的氨基酸殘基)。
[0066] 術語"多核苷酸"、"寡核苷酸"和"核酸"可以在全文中互換使用并且包括DNA分子 (例如，cDNA或基因組DNA )、RNA分子(例如，mRNA )、使用核苷酸類似物(例如，肽核酸和非天 然存在的核苷酸類似物)產生的DNA或RNA的類似物、及其雜化物。核酸分子可以為單鏈的 或雙鏈的。在一個實施方案中，本發明的核酸分子包含編碼本發明的抗體、或片段、衍生物、 突變蛋白、或其變體的連續的可讀框。
[0067] 如果兩條單鏈多核苷酸的序列可以以反平行方向排列從而使得一條多核苷酸中 的每一核苷酸與另一多核苷酸中的其互補核苷酸相對而不引入缺口并且在任一序列的5' 或3'端無未配對的核苷酸，則它們是"互補的"。如果兩條多核苷酸可以在中等嚴格條件下 彼此雜交，則多核苷酸與另一條多核苷酸是"互補的"。因此，多核苷酸可以與另一多核苷酸 是互補的，而不是其補體。
[0068] "載體"是可以用于將與其連接的另一核酸引入細胞中的核酸。一種類型的載體是 "質粒"，其指另外的核酸區段可以連入其中的線性或環狀雙鏈的DNA分子。另一類型的載 體是病毒載體(例如，復制缺陷型逆轉錄病毒、腺病毒和腺相關病毒)，其中另外的DNA區段 可以引入病毒基因組中。某些載體可以在它們導入其中的宿主細胞(例如包含細菌復制起 點的細菌載體和附加型哺乳動物載體）中自主復制。其他載體(例如，非附加型哺乳動物載 體）在引入宿主細胞中時整合入宿主細胞的基因組中，并由此隨宿主基因組進行復制。"表 達載體"是可以指導所選的多核苷酸表達的一類載體。
[0069] 如果調節序列影響核苷酸序列的表達(例如，表達的水平、時機或位置)，則所述和 核苷酸為"可操作地連接"至該調節序列。"調節序列"為影響與其可操作地連接的核酸的 表達(例如，表達的水平、時機或位置）的核酸。調節序列例如可以對被調節的核酸直接或 經過一種或多種其他分子的作用（例如，結合調節序列和/或該核酸的多肽）施加其作用。 調節序列的實例包括啟動子、增強子和其他表達控制元件(例如，多腺苷酸化信號)。調節 序列的進一步的實例描述于例如 Goeddel, 1990，Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif?和 Baron 等，1995, Nucleic Acids Res. 23:3605-06。
[0070] "宿主細胞"是可以用于表達核酸例如本發明的核酸的細胞。宿主細胞可以是原核 生物，例如大腸桿菌，或者它可以是真核生物，例如，單細胞的真核生物(例如酵母或其他真 菌)、植物細胞(例如，煙草或番茄植物細胞)、動物細胞(例如，人細胞、猴細胞、倉鼠細胞、大 鼠細胞、小鼠細胞、或昆蟲細胞）或雜交瘤。通常，宿主細胞為培養的細胞，其可以用編碼多 肽的核酸轉化或轉染，其可以隨后在宿主細胞中表達。可以使用短語"重組宿主細胞"來表 示已用待表達的核酸轉化或轉染的宿主細胞。宿主細胞還可以是這樣的細胞，其包含核酸， 但不在期望的水平上表達它，除非向宿主細胞中引入調節序列使得它變為與該核酸是可操 作地連接的。應理解術語宿主細胞不僅指具體的本發明的細胞還指此類細胞的后代或潛在 后代。因為由于例如突變或環境影響，某些修飾可以在繼代中發生，所以此類后代實際上可 能與母細胞不相同，但仍包括在如本文所用的術語的范圍內。
[0071] 腫瘤相關抗原和抗體 如本文所用的術語"抗原"指化合物、組合物、或物質，其可以刺激動物中抗體產生或T 細胞應答，包括注射入或吸收入動物中的組合物。抗原與特異性體液或細胞免疫的產物(包 括由異源免疫原誘導的那些）反應。術語"抗原"包括所有相關的抗原表位。表位可以由連 續的氨基酸或由于蛋白的三級折疊而緊靠的非連續氨基酸形成。由連續的氨基酸形成的表 位通常對變性溶劑保持暴露，而由三級折疊形成的表位通常在用變性溶劑處理時喪失。表 位通常包括至少三個、至少五個、或至少八至十個處于獨特的空間構象的氨基酸。測定表位 的空間構型的方法包括例如X射線晶體學和二維核磁共振。
[0072] 至于"靶向的抗原"，事實上任何抗原可以被本發明的分子靶向。某些靶向的抗原 包括與特征在于細胞的過度增殖的病理學（即，過度增生性病癥）相關的那些。示例性的 過度增生性病癥包括但不限于銀屑病、中性白細胞增多癥、紅細胞增多癥、血小板增多和癌 癥。表征為癌癥的過度增生性病癥包括但不限于實體瘤、乳腺癌、呼吸道癌、腦癌、生殖器官 癌、消化道癌、尿道癌、眼癌、肝癌、皮膚癌、頭頸癌、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌及它們的遠端轉 移。這些病癥還包括淋巴瘤、肉瘤、多發性骨髓瘤和白血病。乳腺癌的實例包括但不限于浸 潤性導管癌、浸潤性小葉癌、原位導管癌和原位小葉癌。呼吸道癌的實例包括但不限于小細 胞和非小細胞肺癌、以及支氣管腺瘤和胸膜肺母細胞瘤。腦癌的實例包括但不限于腦干和 下丘腦（hypophtalmic)膠質瘤、小腦和大腦星形細胞瘤、髓母細胞瘤、室管膜瘤以及神經 外胚層和松果體瘤。男性生殖器官腫瘤包括但不限于前列腺和睪丸癌。女性生殖器官腫瘤 包括但不限于子宮內膜癌、宮頸癌、卵巢癌、陰道癌、和外陰癌、以及子宮肉瘤。消化道腫瘤 包括但不限于肛門癌、結腸癌、結腸直腸癌、食管癌、膽囊癌、胃癌、胰腺癌、直腸癌、小腸癌、 和唾液腺癌。尿道腫瘤包括但不限于膀胱癌、陰莖癌、腎癌、腎盂癌、輸尿管癌、和尿道癌。目艮 癌包括但不限于眼內黑素瘤和視網膜母細胞瘤。肝癌的實例包括但不限于肝細胞癌（具有 或不具有纖維板層變體的肝細胞癌)、膽管癌(肝內膽管癌)、和混合型肝細胞膽管癌。皮膚 癌包括但不限于鱗狀細胞癌、卡波濟氏肉瘤、惡性黑素瘤、Merkel細胞皮膚癌和非黑素瘤皮 膚癌。淋巴瘤包括但不限于AIDS相關淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、皮膚T細胞淋巴瘤、霍奇金 病、和中樞神經系統的淋巴瘤。肉瘤包括但不限于軟組織肉瘤、骨肉瘤、惡性纖維組織細胞 瘤、淋巴肉瘤、和橫紋肌肉瘤。白血病包括但不限于急性髓細胞性白血病、急性成淋巴細胞 性白血病、慢性淋巴細胞性白血病、慢性髓細胞性白血病和毛細胞白血病。
[0073] 在本發明的多個實施方案中，靶向部分是結合癌癥標志物例如腫瘤相關抗原 (TAA)的部分。許多種癌癥標志物是本領域技術人員已知的。癌癥標志物對于癌細胞 需要不僅是獨特的，而且還是有效的，其中癌癥標志物的表達在癌細胞中（相比于正常健 康細胞）升高或者其中癌癥標志物不以相當的水平存在于周圍組織中（尤其是其中融合 分子局部遞送)。在多種實施方案中，癌癥標志物包括：Her2/neu (Lewis等，Semin. Cancer Biol.，6(6) :321-327, 1995)、Her3、EGF、Her4、B7 家族成員（Collins 等， Genome Biol.，6:223. 1-223. 7，2005)、TNF 超家族成員（參見例如 "Therapeutic Targets of the TNF SuperfamiIy^,由 Iqbal S. Grewal 編輯，Landes Bioscience/ Springer Science+Business Media, LLC dual imprint / Springer series:Advances in Experimental Medicine and Biology, 2009)、CD1、CD2、CD3、CD5、CD7、CD13、CD14、CD15、 CD19、CD20 (Cragg等，Curr. Dir. Autoimmun·, 8:140-174，2005)、CD21、CD23、CD25、CD33 (Nakase 等，Am J Clin Pathol·, 105(6):761-768, 1996)、CD34、CD38、CD46、CD55、CD59、 CD123、CD138 (O'Connell,等，Am. J. Clin. Pathol·，121(2):254-263, 2004)、CD200、 CD276 (Hofmeyer 等，Proc. Natl. Acad. Sci.(U.S. A. ) 105 (30) :10277-10278, 2008)、 5E10、CEA、內質蛋白（美國專利申請號 US20120009194 (Ferrone 等））、HLA-DR、HM 1.24、 HMB 45、Ia、Leu-Ml、MUCl、PMSA、EGFR、鞘糖脂⑶2、SLAM家族成員、gpl00、酪氨酸酶、MAGE、 TAG-72、SE10、磷脂酰絲氨酸抗原等。本發明的基因工程融合分子可以結合一種抗原或多種 癌癥標志物。
[0074] 針對這些和其他癌癥標志物的抗體是本領域技術人員已知的并且可以商購獲得 或容易地產生。例如，抗體可以通過用靶抗原或其免疫原性片段免疫動物并在該動物中 產生抗體來產生，并且單鏈抗體可以根據本領域技術人員熟知的方法使用噬菌體展示技術 來產生。考慮用作本發明的融合分子中的靶向部分的抗體包括針對特定腫瘤相關抗原的 消耗性抗體（depleting antibodies)，包括但不限于抗 _HER2/neu、抗-HER3、抗-HER4、 抗-CD20、抗-CD19、抗-CD22、抗-CD33、抗-CXCR3、抗-CXCR5、抗-CCR3、抗-CCR4、抗-CCR9、 抗-CRTH2、抗-PMCH、抗-CD4、抗-CD25、抗-CD200、抗-CD138、抗-CD276 和抗-內質蛋白抗 體。所述此類腫瘤和炎癥細胞特異性的、消耗性抗體已充分描述于文獻中。
[0075] 在多個實施方案中，抗體是抗-Her2/neu抗體，其包含具有如SEQ ID NO: 1中描 述的氨基酸序列的重鏈：
【權利要求】
1. 基因工程融合分子，其包含連接至干擾素α(IFN-α)突變體分子的腫瘤相關抗原 (TAA)抗體（Ab)，其中所述抗體直接連接至所述IFN-α突變體分子。
2. 權利要求1的融合分子，其中所述融合分子相比于TAAAb-野生型IFN-α融合分子 顯示改進的PK特性。
3. 權利要求1的融合分子，其中所述融合分子當接觸腫瘤細胞時，導致殺傷所述腫瘤 細胞或抑制其生長或增殖。
4. 權利要求1-3中任一項的融合分子，其中所述干擾素突變體分子包含在 SEQIDNO: 13中含有至少一個突變的突變的人IFN-a2分子，其中所述突變選自 H57Y.E58N.Q61S. II57S. E58S. Ι157Λ. Ε58Λ.〇C>IA.RlMA.RlfOA,IMA.P35K. HI65D. Ι.26Λ. 1.Ι35Λ. A145V;及其組合。
5. 權利要求1-4中任一項的融合分子，其中所述TAA抗體為選自以下的抗體： 抗-HER2/neu、抗-HER3、抗-HER4、抗-CD4、抗-CD19、抗-CD20、抗-CD22、抗-CD25、抗-CD33、 抗-CD138、抗-CD200、抗-CD276、抗-CXCR3、抗-CXCR5、抗-CCR3、抗-CCR4、抗-CCR9、 抗-CRTH2、抗-PMCH、和抗-內質蛋白抗體。
6. 權利要求1-5中任一項的融合分子，其中所述TAA抗體為選自以下的抗體：完全人 抗體、人源化抗體、嵌合抗體、單克隆抗體、多克隆抗體、重組抗體、抗原結合抗體片段、Fab、 Fab'、Fab2、Fab' 2、IgG、IgM、IgA、IgE、scFv、dsFv、dAb、納米抗體、單抗體、和雙價抗體。
7. 權利要求1的融合分子，其中所述TAA抗體為抗-HER2/neu抗體，并且其中所述突變 的人IFN-α2分子在SEQIDNO: 13中包含突變F27A。
8. 權利要求1的融合分子，其中所述TAA抗體為抗-CD20抗體，并且其中所述突變的人 IFN-α2分子在SEQIDNO: 13中包含突變F27A。
9. 權利要求1的融合分子，其中所述TAA抗體為抗-CD138抗體，并且其中所述突變的 人IFN-α2分子在SEQIDNO: 13中包含突變F27A。
10. 權利要求1的融合分子，其中所述TAA抗體為抗-內質蛋白抗體，并且其中所述突 變的人IFN-α2分子在SEQIDNO: 13中包含突變F27A。
11. 權利要求1的融合分子，其中所述TAA抗體為抗-CD33抗體，并且其中所述突變的 人IFN-α2分子在SEQIDNO: 13中包含突變F27A。
12. 權利要求1的融合分子，其中所述TAA抗體為抗-CD276抗體，并且其中所述突變的 人IFN-α2分子在SEQIDNO: 13中包含突變F27A。
13. 權利要求1的融合分子，其中所述TAA抗體為抗-HER2/neu抗體，并且其中所述突 變的人IFN-α2分子在SEQIDNO: 13中包含兩個突變R149A和R162A。
14. 權利要求1的融合分子，其中所述TAA抗體為抗-CD20抗體，并且其中所述突變的 人IFN-α2分子在SEQIDNO: 13中包含兩個突變R149A和R162A。
15. 權利要求1的融合分子，其中所述TAA抗體為抗-CD138抗體，并且其中所述突變的 人IFN-α2分子在SEQIDNO: 13中包含兩個突變R149A和R162A。
16. 權利要求1的融合分子，其中所述TAA抗體為抗-內質蛋白抗體，并且其中所述突 變的人IFN-α2分子在SEQIDNO: 13中包含兩個突變R149A和R162A。
17. 權利要求1的融合分子，其中所述TAA抗體為抗-CD33抗體，并且其中所述突變的 人IFN-α2分子在SEQIDNO: 13中包含兩個突變R149A和R162A。
18. 權利要求1的融合分子，其中所述TAA抗體為抗-CD276抗體，并且其中所述突變的 人IFN-α2分子在SEQIDNO: 13中包含兩個突變R149A和R162A。
19. 權利要求1-18中任一項的融合分子，其中所述抗體用肽接頭直接連接至所述干擾 素突變體分子。
20. 權利要求19的融合分子，其中所述肽接頭選自SGGGGS和AEAAAKEAAAKAGS。
21. 藥物組合物，其包含在藥學上可接受的載體中的權利要求1-20中任一項的融合分 子。
22. 權利要求21的藥物組合物，其中配制所述組合物用于經選自以下的途徑來施用： 口服施用、肌內施用、靜脈內施用、直接腫瘤施用、吸入、經皮施用、和皮下儲存施用。
23. 治療患者中的腫瘤或腫瘤轉移的方法，其包括向所述患者施用治療有效量(作為單 一療法或作為聯合治療方案的部分）的權利要求21的藥物組合物，其中此類施用促進腫瘤 消退和/或腫瘤死亡。
24. 權利要求1-20中任一項的融合分子在制造用于殺傷癌細胞或抑制其生長或增殖 的藥物中的用途。
【文檔編號】A61K38/21GK104470536SQ201380023287
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2013年3月4日 優先權日:2012年3月3日
【發明者】伊克巴爾·格雷沃, 桑杰伊·D·卡雷, 邁克爾·格雷瑟, 拉希德·賽伊德 申請人:免疫基因公司